ভিট্রোতে বোভাইন ওসাইটের উপর ইউরোলিথিন এ-এর অ্যান্টি-এজিং প্রভাব

অনুগ্রহ করে যোগাযোগ করুনoscar.xiao@wecistanche.comআরও তথ্যের জন্য

বিমূর্ত:অক্সিডেটিভ স্ট্রেস এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা oocyte মানের বয়স-সম্পর্কিত পতনের সাথে যুক্ত হয়েছে এবং তাদের প্রতিরোধের জন্য কৌশলগুলি বর্তমানে অনুসন্ধান করা হয়েছে। ইউরোলিথিন এ (ইউএ) প্রো-অ্যাপোপ্টোটিক এবং অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট প্রভাব সহ একটি প্রাকৃতিক বিপাক, যা বিভিন্ন বয়সী কোষে অকার্যকর মাইটোকন্ড্রিয়া জমা হওয়া প্রতিরোধ করতে সক্ষম। UA কখনও বোভাইন oocytes পরীক্ষা করা হয়নি. আমাদের লক্ষ্য ছিল কিউমুলাস-ওসাইট-কমপ্লেক্স (সিওসি) এবং গ্রানুলোসা কোষ (জিসি) প্রজনন দক্ষতার সাথে সম্পর্কিত গুরুত্বপূর্ণ জিনের অভিব্যক্তির বিকাশের সম্ভাবনার উপর UA-এর প্রভাব অধ্যয়ন করা। নিউক্লিয়ার পরিপক্কতা অগ্রগতি, মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেন পটেনশিয়াল (এমএমপি), এবং প্রিপিউবারটাল এবং প্রাপ্তবয়স্ক মহিলাদের থেকে প্রাপ্ত শারীরবৃত্তীয়ভাবে পরিপক্ক (22 ঘন্টা) এবং ইন ভিট্রো বয়সী oocytes (আইভিএম-এর 30 ঘন্টা) বিকাশগত দক্ষতা, হয় UA এর সাথে সম্পূরক বা না মূল্যায়ন করা হয়েছিল। অতিরিক্তভাবে, বেশ কয়েকটি জিনের mRNA এর পরিমাণ (NFE2L2, NQO1, এবং mt-DN5) এবং mt-ND5 DNA কপির সংখ্যা প্রিপুবার্টাল এবং প্রাপ্তবয়স্ক মহিলাদের থেকে সংস্কৃত GC-তে পরিমাপ করা হয়েছিল, হয় UA এর সাথে সম্পূরক বা না। আমাদের অধ্যয়ন পারমাণবিক পরিপক্কতা অগ্রগতি, এমএমপি, উন্নয়নমূলক দক্ষতা এবং জিনের অভিব্যক্তি স্তরে ওসাইট বার্ধক্যের ক্ষতিকারক প্রভাব নিশ্চিত করেছে। ইন ভিট্রো পরিপক্কতার সময় UA চিকিত্সা উন্নত (p<0.05) the="" maturation="" rate="" and="" subsequent="" developmental="" capacity="" of="" aged="" oocytes.="" a="" positive="" effect="">< 0.05)="" of="" ua="" on="" physiological="" maturation,="" mmp,="" and="" embryonic="" development="" was="" also="" identified.="" ua="" also="" interfered="" with="" the="" expression="" profile="" of="" nfe2l2="" and="" nqo1="" genes="" in="" gcs="" cultures.="" our="" findings="" demonstrate="" that="" ua="" supplementation="" is="" an="" effective="" way="" to="" prevent="" oocyte="" aging="" and="" improves="" the="" subsequent="" bovine="" embryonic="">

KSL01

আরো জানতে এখানে ক্লিক করুন

কীওয়ার্ড:oocyte; বার্ধক্য; ইউরোলিথিন এ; সহায়ক প্রজনন প্রযুক্তি

1। পরিচিতি

মহিলাদের প্রজনন ক্ষমতা হ্রাস বার্ধক্য দ্বারা প্রতিকূলভাবে প্রভাবিত প্রথম শারীরবৃত্তীয় ক্রিয়াগুলির মধ্যে একটি এবং এইভাবে বিশ্বব্যাপী একটি উদীয়মান স্বাস্থ্য সমস্যা হিসাবে বিবেচিত হয় [1,2]। বিভিন্ন রোগগত সমস্যা ছাড়াও, মহিলাদের উর্বরতার বয়স-সম্পর্কিত হ্রাস মূলত oocytes [1,3-5]এর ডিম্বাশয়ের রিজার্ভের হ্রাসের জন্য দায়ী করা হয় যা তাদের গুণমানের সময়-নির্ভর অবনতির সাথে যুক্ত [2]। ডিম্বস্ফোটনের আগে একটি বয়স্ক ডিম্বাশয়ের মাইক্রোএনভায়রনমেন্টে ওসাইটের সংস্পর্শে আসার কারণে এই অবনতি প্রক্রিয়া ঘটতে পারে। এছাড়াও, মহিলা গ্যামেট প্রায়শই ডিম্বস্ফোটন-পরবর্তী বার্ধক্যের শিকার হয় যখন নিষিক্তকরণ প্রক্রিয়া সর্বোত্তম সর্বোত্তম সময়ের মধ্যে ঘটে না এবং নিষিক্ত ওসাইট ডিম্বনালীতে থাকে বা বর্ধিত সময়ের জন্য গর্ভধারণের আগে ভিট্রোপিন্ডে থাকে। oocyte গুণমান একটি গুরুত্বপূর্ণ ফ্যাক্টর যা সহায়ক প্রজনন প্রযুক্তি (ART) এর ব্যর্থতার সাথে যুক্ত কারণ এর গুণমান নিষিক্তকরণের পরে ভ্রূণের বিকাশের সম্ভাবনার জন্য প্রধান নির্ধারক [7,8]। ডিম্বস্ফোটন অ্যাসিঙ্ক্রোনি এবং বয়স্ক ওসাইটগুলি প্রায়শই ঘোড়া, গবাদি পশু এবং ভেড়াগুলিতে কৃত্রিম গর্ভধারণ এবং ভ্রূণ উৎপাদন কর্মসূচির সাফল্যকে ক্ষতিগ্রস্ত করে যা গুরুত্বপূর্ণ অর্থনৈতিক ক্ষতির ইঙ্গিত দেয়[1,9,10]। সুতরাং, মানুষ সহ বিভিন্ন প্রজাতির উর্বরতা উদ্ধারের জন্য এবং পশুসম্পদে জেনেটিক উন্নতির একটি হাতিয়ার হিসাবে আরও ভাল থেরাপিউটিক পদ্ধতির ডিজাইন করার জন্য, oocyte বার্ধক্যের অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়াগুলি অধ্যয়ন করা প্রাথমিক গুরুত্বপূর্ণ।cistanche wirkungবিশেষ মনোযোগ প্রিপুবার্টাল গবাদি পশু থেকে oocytes এর উন্নয়নশীল ক্ষমতার উন্নতির জন্য নিবেদিত করা উচিত, যা প্রায়ই জেনেটিক লাভ ত্বরান্বিত করতে এবং প্রজন্মের ব্যবধান কমাতে ব্যবহৃত হয়।

বয়স্ক ওসাইটের প্রতিবন্ধী বিকাশের দক্ষতার একটি প্রধান কারণ হল অক্সিডেটিভ স্ট্রেস বৃদ্ধি, যা মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা, ডিএনএ ক্ষতি এবং স্পিন্ডল গঠনের ত্রুটিগুলিকে প্ররোচিত করে, যা ওসাইটের গুণমানকে প্রভাবিত করে [1]। এটা সুপ্রতিষ্ঠিত যে ফ্রি র‌্যাডিক্যালের বর্ধিত উৎপাদন বিভিন্ন দীর্ঘস্থায়ী রোগে কোষীয় বার্ধক্যের একটি কারণ এবং প্রজনন জীববিজ্ঞানেও, যার ফলে উর্বরতার ফলাফল খারাপ হয় [১২]। ওভারিয়ান মাইক্রোএনভায়রনমেন্ট, যার মধ্যে oocytes এবং granulosa কোষ (GCs) রয়েছে, একটি অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট প্রতিরক্ষা ব্যবস্থা প্রদান করে যা অক্সিডেটিভ অবস্থাকে নিয়ন্ত্রণ করতে এবং অক্সিডেন্ট/অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট ভারসাম্য বজায় রাখতে সক্ষম হয় [13]। যাইহোক, বার্ধক্য প্রক্রিয়ার সময়, প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতি (ROS) নিরপেক্ষ করার জন্য অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট প্রতিরক্ষার দক্ষতা হ্রাস পায়, এইভাবে অক্সিডেটিভ স্ট্রেসের মাত্রা বৃদ্ধি পায়। নিউক্লিয়ার ফ্যাক্টর-E2-সম্পর্কিত ফ্যাক্টর2(Nrf2 বা NFE2L2), যা Nrf2/Kelch-এর মতো ECH-সংযুক্ত প্রোটিন 1 (Keap1) পথ নামেও পরিচিত, একটি প্রভাবশালী প্রতিক্রিয়া ক্যাসকেড যা অক্সিডেটিভ স্ট্রেস দ্বারা সক্রিয় হয়[14]। এই পথটি একটি সেলুলার প্রতিরক্ষা ব্যবস্থা যা কোষগুলি অক্সিডেটিভ স্ট্রেসের ক্ষতিকারক প্রভাবগুলির সাথে মোকাবিলা করার জন্য তৈরি করেছে। স্বাভাবিক অবস্থার অধীনে, Nrf2 কেপ1 দ্বারা নেতিবাচকভাবে নিয়ন্ত্রিত হয়, সাইটোপ্লাজমে রাখা হয় এবং নিম্ন স্তরে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়। অক্সিডেন্টের সংস্পর্শে এলে, Nrf2 কেপল থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়, যার ফলে নিউক্লিয়াসে এটি স্থানান্তরিত হয় যেখানে এটি নির্দিষ্ট ডিএনএ ক্রমগুলির সাথে আবদ্ধ হয়। অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট রেসপন্স এলিমেন্টস(ARE) নামের এই সিকোয়েন্সগুলি সাইটোপ্রোটেক্টিভ জিনের ট্রান্সক্রিপশনাল অ্যাক্টিভেশনের দিকে পরিচালিত করে, যেমন NAD(P)H:quinone-oxidoreductase-1 (NQO1), হেম অক্সিজেনেস-1 (HMOX1) , এবং গ্লুটামেট-সিস্টাইন লিগেস ক্যাটালিটিক সাবুনিট (GCLC)[15,16]। পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে Nrf2-কিপল সিগন্যালিং পাথওয়ের সক্রিয়করণ মানুষের জিসি এবং মাউস ডিম্বাশয়ে অ্যান্টিঅক্সিডেন্টের মাত্রা বাড়িয়ে অক্সিডেটিভ স্ট্রেসের ক্ষতি হ্রাস করে[17,18]। যাইহোক, মহিলা গ্যামেট বার্ধক্য প্রক্রিয়ায় এর ভূমিকা অধরা রয়ে গেছে, যদিও এটি স্পষ্টভাবে প্রতিষ্ঠিত হয়েছে যে মাইটোকন্ড্রিয়া এই প্রক্রিয়া চলাকালীন ROS এর জন্য প্রধান উত্পাদন সাইট [9,10]।

KSL02

Cistanche বিরোধী বার্ধক্য করতে পারেন

বিপরীতভাবে, মাইটোকন্ড্রিয়া বেশ কয়েকটি গুরুত্বপূর্ণ সেলুলার ফাংশনের সাথে জড়িত এবং oocyte পরিপক্কতা এবং পরবর্তী ভ্রূণ বিকাশের সময় প্রয়োজনীয় শক্তি উৎপাদনের চাহিদা মেটানোর জন্য মৌলিক [19]। উপযুক্ত মাইটোকন্ড্রিয়াল ক্রিয়াকলাপটি মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ (এমটি-ডিএনএ) এবং এটিপি জেনারেশনের উচ্চতর বিষয়বস্তু [20], উচ্চতর মাইটোকন্ড্রিয়াল ঝিল্লি সম্ভাবনা [21], এবং মাইটোফ্যাজি [22] এর মাধ্যমে মাইটোকন্ড্রিয়ার গুণমান এবং পরিমাণ রক্ষণাবেক্ষণের সাথে অত্যন্ত যুক্ত হয়েছে। তদুপরি, মাইটোকন্ড্রিয়াল ক্রিয়াকলাপকে ভ্রূণের কার্যক্ষমতা এবং উন্নত উর্বরতার ফলাফলের সাথে সরাসরি সম্পর্কযুক্ত হওয়ার পরামর্শ দেওয়া হয়েছে [২৩]। ক্রমবর্ধমান প্রমাণগুলি সমর্থন করে যে বয়স-সম্পর্কিত মাইটোকন্ড্রিয়াল পরিবর্তনগুলি ডিম্বাশয়ের বার্ধক্যের দিকে পরিচালিত করে এবং পরবর্তীকালে ভ্রূণের কার্যকারিতা এবং ইমপ্লান্টেশন সম্ভাবনা হ্রাস করে। এই পরিবর্তনগুলির মধ্যে রয়েছে mt-DNA কপি সংখ্যা হ্রাস, ATP জেনারেশন হ্রাস [20], মাইটোকন্ড্রিয়াল জিন এক্সপ্রেশনের পরিবর্তন [24,mt-DNA ক্ষতি [25], এবং হ্রাস মাইটোকন্ড্রিয়াল ঝিল্লি সম্ভাবনা [26]।

KSL03

মাইটোকন্ড্রিয়া-লক্ষ্যযুক্ত থেরাপিউটিক পন্থাগুলি মাইটোকন্ড্রিয়াল ফাংশন বাড়ানোর ক্ষেত্রে তাদের দুর্দান্ত সম্ভাবনার কারণে বার্ধক্যজনিত বিভিন্ন প্যাথলজিতে একটি বিশাল আগ্রহের কারণ হয়েছিল [27]। এই কাঠামোর মধ্যে, ইউরোলিথিন এ (ইউএ)- একটি প্রাকৃতিক বিপাক যা ডালিমের মতো খাদ্য গ্রহণের পরে প্রাপ্ত হয় এবং তার পরে অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটা দ্বারা রূপান্তরিত হয়- যা বয়সের সাথে অকার্যকর মাইটোকন্ড্রিয়া জমা হওয়া রোধ করার জন্য, মাইটোফ্যাজিকে প্ররোচিত করে এবং এছাড়াও রক্ষণাবেক্ষণের জন্য দেখানো হয়েছে। বায়োজেনেসিস এবং শ্বাসযন্ত্রের ক্ষমতা [২৮,২৯]। কলোরেক্টাল এবং প্রোস্টেট ক্যান্সারের মতো কিছু ক্যান্সার প্রতিরোধ করার জন্য UA একটি প্রতিশ্রুতিবদ্ধ থেরাপিউটিক ড্রাগ হিসাবে প্রয়োগ করা হয়েছে [30,31]। উপরন্তু, UA-এ প্রদাহ-বিরোধী [32], স্থূলতা-বিরোধী [33], অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট [34] এবং অ্যান্টি-এজিং বৈশিষ্ট্য রয়েছে [35]।সাইট্রাস বায়োফ্ল্যাভোনয়েডসএকটি সাম্প্রতিক গবেষণায় এনআরএফ2-কিপল পাথওয়ের অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট ক্ষমতা বৃদ্ধিতে সক্রিয়করণের উপর সংবেদনশীল মানুষের ত্বকের ফাইব্রোব্লাস্টগুলিতে UA সম্পূরক প্রভাবগুলি তুলে ধরা হয়েছে। Nrf2-কিপল পাথওয়ের এই সক্রিয়করণটি কার্যকরভাবে ROS স্তরকে প্রশমিত করে, Nrf2 ডাউনস্ট্রিম ARE-প্রতিক্রিয়া জিন (SOD, NQO1, GCLC, এবং HMOX1) এর অভিব্যক্তিকে উন্নীত করার মাধ্যমে, একটি প্রতিশ্রুতিশীল অ্যান্টি-এজিং প্রভাব নির্দেশ করে [ 35]।

KSL04

ডিম্বাশয়ের বার্ধক্য বিলম্বিত করার লক্ষ্যে বেশ কিছু গবেষণা করা হয়েছে, ফলস্বরূপ oocyte গুণমান এবং উর্বরতার ফলাফলের উন্নতি। ডিম্বাশয়ের বার্ধক্য প্রক্রিয়ায় অক্সিডেটিভ স্ট্রেসের অবদানের কারণে, সেইসাথে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার জন্য, অ্যান্টিঅক্সিডেন্টগুলির সাথে সম্পূরক একটি প্রতিশ্রুতিশীল থেরাপি হিসাবে উপস্থিত হয়েছে [36,37]। যাইহোক, এটি অজানা যে ইউরোলিথিন এ সম্পূরক ডিম্বাশয় বার্ধক্যের সময় ঘটে যাওয়া ক্ষতি পুনরুদ্ধার করতে পারে যা বন্ধ্যাত্ব সমস্যা প্রতিরোধে অবদান রাখে। অতএব, এই অধ্যয়নের লক্ষ্য ছিল:(1) প্রদর্শন করা যে বার্ধক্য কিউমুলাস-ওসাইট কমপ্লেক্স (সিওসি) বিকাশের সম্ভাবনা এবং এনআরএফ 2 সংকেত পথের সাথে জড়িত গুরুত্বপূর্ণ জিনের GC-এর অভিব্যক্তিকে পরিবর্তন করতে পারে; (2) UA উদ্ধার করতে পারে কিনা তা নির্ধারণ করতে মহিলাদের উর্বরতা বয়স্ক COC এবং GC-তে বার্ধক্য বিরোধী প্রভাব প্রদর্শন করে; এবং (3) Nrf2 সিগন্যালিং পাথওয়ের সাথে সাথে oocyte মানের সাথে জড়িত জিনের অভিব্যক্তি স্তরের উপর UA প্রভাব মূল্যায়ন করা।

2। সামগ্রী ও পদ্ধতি

2.1। পরীক্ষামূলক অলঙ্করণ

এই গবেষণাটি ইউরোপীয় ইউনিয়নের নির্দেশিকা অনুসরণ করে (নং।{1}}/609/EEC) জাতীয় ভেটেরিনারি অথরিটির (N ডিগ্রি 08965DGAV) পশু যত্ন কমিটি দ্বারা অনুমোদিত হয়েছে। oocyte গুণমান পরিবর্তনের উপর বার্ধক্যের প্রভাব এবং UA-এর সম্ভাব্য অ্যান্টি-বার্ধক্য প্রভাব তদন্ত করার জন্য, প্রিপুবার্টাল এবং প্রাপ্তবয়স্ক গরু থেকে সংগ্রহ করা COC ব্যবহার করে একটি মডেল ভিট্রো বার্ধক্য (30 ঘন্টা পরিপক্কতা) বা শারীরবৃত্তীয় পরিপক্কতা (22) এর কাছে জমা দেওয়া হয়েছে। জ) প্রক্রিয়াগুলি প্রয়োগ করা হয়েছিল।

2.1.1.আগের অ্যাস-ডোজ-প্রতিক্রিয়া স্টাডি

UA এর ঘনত্ব নির্ধারণের জন্য একটি পূর্ববর্তী অ্যাস যা বোভাইন COCs পরিপক্কতা প্রক্রিয়ার সময় ব্যবহার করা উচিত চারটি সেশনে একটি ডোজ-প্রতিক্রিয়া অধ্যয়নের ভিত্তিতে সঞ্চালিত হয়েছিল। যেহেতু UA কখনোই বোভাইন ওসাইটে পরীক্ষা করা হয়নি, তাই কিছু ক্যান্সার প্রতিরোধ ও প্রশমনের জন্য পূর্ববর্তী ডোজ সফলভাবে প্রয়োগ করা হয়েছিল এবং বিভিন্ন সেল লাইনে UA-এর অ্যান্টি-বার্ধক্য প্রভাব প্রদর্শনের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল [28,39]। প্রিপুবার্টাল এবং পরিপক্ক প্রাপ্তবয়স্ক গরু (n=978) থেকে প্রাপ্ত COC নির্বাচন করা হয়েছিল এবং তারপর UA-এর বিভিন্ন ডোজ পরীক্ষা করার জন্য এলোমেলোভাবে পাঁচটি গ্রুপে বিভক্ত করা হয়েছিল: শারীরবৃত্তীয় ইন ভিট্রো পরিপক্কতার সময় নিয়ন্ত্রণ,1,10,25, এবং 50 uM। পরিপক্কতার সময়কালের পরে, কিছু oocytes (n=154) ক্রোমোসোমাল কনফিগারেশন এবং পরিপক্কতার পর্যায়গুলি নির্ধারণ করতে দাগ দেওয়া হয়েছিল। অবশিষ্ট পরিপক্ক ওসাইটগুলি হিমায়িত/গলানো বীর্যের সাথে ভিট্রো গর্ভধারণে জমা দেওয়া হয়েছিল। অনুমানমূলক জাইগোটগুলিকে সংস্কৃত করা হয়েছিল, এবং ক্লিভেজ এবং ব্লাস্টোসিস্টের হারগুলি যথাক্রমে সংস্কৃতির 2 এবং দিন 7-এ নির্ধারিত হয়েছিল। প্রাপ্ত ফলাফলের উপর ভিত্তি করে, যেমন ক্ষতিকারক প্রভাবের অনুপস্থিতি এবং পরিপক্কতা এবং ব্লাস্টোসিস্টের বিকাশের প্রচার, UA এর 1 ইউএম ঘনত্ব নির্বাচন করা হয়েছিল।

2.1.2.পরীক্ষা 1

এই পরীক্ষায়, ছয়টি সেশনে সম্পাদিত, উভয় প্রিপুবার্টাল (মানে বয়স=9 মাস, n=660) এবং প্রাপ্তবয়স্কদের (মান বয়স =39মাস,n=674) উভয়ের COC বয়স্ক এবং শারীরবৃত্তীয়ভাবে পরিপক্ক ওসাইটের oocyte গুণমান এবং বিকাশের সম্ভাব্যতা মূল্যায়নের জন্য এবং সেইসাথে মহিলাদের উর্বরতা উদ্ধারের জন্য UA প্রভাব মূল্যায়নের জন্য গরু সংগ্রহ করা হয়েছিল। COCগুলি এলোমেলোভাবে 8 টি গ্রুপে বিভক্ত ছিল: (1) নিয়ন্ত্রণ প্রিপুবার্টাল গ্রুপ, 22 ঘন্টা (n=148) জন্য পরিপক্ক হওয়া প্রিপুবার্টাল বাছুর থেকে COC; (2)UA প্রিপুবার্টাল গ্রুপ, 1 uM এর সাথে সম্পূরক মাঝারিভাবে পরিপক্ক প্রিপুবার্টাল বাছুর থেকে COCs 22 ঘন্টার জন্য UA (n=155); (3) 30 ঘন্টা বয়সী প্রিপুবার্টাল গ্রুপ নিয়ন্ত্রণ করুন, 30 ঘন্টা বয়সের প্রিপুবার্টাল বাছুর থেকে COC গুলি ইন ওইট্রো পরিপক্কতা (n=149); (4) 30 ঘন্টা বয়সী UA প্রিপুবার্টাল গ্রুপ, প্রিপুবার্টাল বাছুর থেকে 30 ঘন্টার জন্য পরিপক্কতা মাঝারি বয়সে 1 uM UA(n=144);(5) নিয়ন্ত্রণ প্রাপ্তবয়স্কদের গ্রুপ, 22 ঘন্টার জন্য পরিপক্ক প্রাপ্তবয়স্ক গাভী থেকে COCs পরিপক্কতা (n=155) );(6) UA প্রাপ্তবয়স্ক গোষ্ঠী, 22 ঘন্টা (n=129) জন্য 1 uM UA দিয়ে পরিপূরক মাঝারি পরিপক্ক প্রাপ্তবয়স্ক গাভী থেকে COC; 30 h in oitro maturation (n=148); এবং (8) UA 30 ঘন্টা বয়স্ক প্রাপ্তবয়স্ক গোষ্ঠী, 30 ঘন্টার জন্য ওইট্রো বয়সী প্রাপ্তবয়স্ক গাভী থেকে COC 1 uM UA(n=138) এর সাথে পরিপূরক পরিপক্কতা মাঝারি।সাইনোমোরিয়াম সুবিধাসংশ্লিষ্ট ইন ভিট্রো পরিপক্কতা সময়কালের পরে, গলিত ক্যাপাসিটেটেড ষাঁড়ের বীর্য দিয়ে oocytes গর্ভধারণ করা হয়েছিল। পরবর্তীকালে, ভ্রূণের বিকাশ মূল্যায়ন করা হয়েছিল, ক্লিভড এবং উত্পাদিত ভ্রূণের হারের পাশাপাশি তাদের গুণমান উভয়ই মূল্যায়ন করে।

অতিরিক্তভাবে, এই পরীক্ষায়, প্রতিটি গ্রুপ থেকে COCগুলি তাদের পারমাণবিক পরিপক্কতার পর্যায়ে মূল্যায়ন করার জন্য পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল (নিয়ন্ত্রণ প্রিপুবার্টাল গ্রুপ, n=7; UA প্রিপুবার্টাল গ্রুপ, n =7; 30 ঘন্টা বয়সের প্রিপুবার্টাল গ্রুপ নিয়ন্ত্রণ, n{ {3}}; UA বয়স 30 ঘন্টা প্রিপুবার্টাল গ্রুপ, n=6; প্রাপ্তবয়স্ক গোষ্ঠী নিয়ন্ত্রণ করুন, n=16;UA প্রাপ্তবয়স্ক গোষ্ঠী, n=21;30 ঘন্টা বয়সী প্রাপ্তবয়স্ক গোষ্ঠী নিয়ন্ত্রণ করুন, n{ {9}}; UA 30 ঘন্টা বয়স্ক প্রাপ্তবয়স্ক গ্রুপ, n=18)। COCs-এর মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেন পটেনশিয়াল (MP)ও মূল্যায়ন করা হয়েছিল (কন্ট্রোল প্রিপুবার্টাল গ্রুপ, n=10; UA প্রিপুবার্টাল গ্রুপ, n{ {13}};নিয়ন্ত্রন 30 ঘন্টা বয়সী প্রিপুবার্টাল গ্রুপ, n=9;UA বয়সী 30 ঘন্টা প্রিপুবার্টাল গ্রুপ, n=9;কন্ট্রোল প্রাপ্তবয়স্ক গ্রুপ, n=15; UA প্রাপ্তবয়স্ক গ্রুপ, n{ {19}}; 30 ঘন্টা বয়স্ক প্রাপ্তবয়স্ক গোষ্ঠী নিয়ন্ত্রণ করুন, n=10;UA বয়সী 30 ঘন্টা প্রাপ্তবয়স্ক গোষ্ঠী, n=14)।

2.1.3.পরীক্ষা2

যেহেতু GCগুলি ফলিকুলার বৃদ্ধি এবং oocyte বিকাশে একটি অপরিহার্য ভূমিকা পালন করে, তাই NFE2L2, NQO1, এবং mt-ND5 এর অভিব্যক্তিতে বয়স এবং UA এর প্রভাব আরও অধ্যয়নের জন্য পাঁচটি সেশনে একটি দ্বিতীয় পরীক্ষা করা হয়েছিল। এমটি-এনডি 5 জিনের অনুলিপিগুলির সংখ্যাও মূল্যায়ন করা হয়েছিল। প্রিপুবার্টাল (মানে বয়স=10 মাস) এবং প্রাপ্তবয়স্ক গরুর (মানে বয়স =62মাস) ডিম্বাশয় থেকে আসা ফলিকুলার ফ্লুইডের সেন্ট্রিফিউগেশনের পরে GC প্রাপ্ত হয়েছিল। এই কোষগুলিকে নিম্নলিখিত পরিস্থিতিতে সংষ্কৃত করা হয়েছিল: (1) প্রিপিউবার্টাল কন্ট্রোল, প্রিপুবার্টাল বাছুরের জিসিগুলির সংস্কৃতি; (2) প্রিপিউবারটাল ইউএ, 1 ইউএম ইউএ দিয়ে পরিপূরক প্রিপুবার্টাল বাছুরের জিসিগুলির সংস্কৃতি; (3) প্রাপ্তবয়স্কদের নিয়ন্ত্রণ, প্রাপ্তবয়স্ক গরুর জিসিগুলির সংস্কৃতি; এবং (4) প্রাপ্তবয়স্ক UA, প্রাপ্তবয়স্ক গরুর GC এর সংস্কৃতি 1 uM UA এর সাথে পরিপূরক। সংস্কৃতির 5 তম দিনে GCs সঙ্গমের পরে, সেগুলিকে তরল নাইট্রোজেনে হিমায়িত করা হয়েছিল, এবং পরে DNA এবং RNA বের করা হয়েছিল, যা পরবর্তীতে NFE2L2, NQO1, এবং mt-ND5 mRNA ট্রান্সক্রিপ্ট এবং mt-ND5 অনুলিপি নম্বরের পরিমাণ নির্ধারণ করতে দেয়।

2.2। Oocyte সংগ্রহ এবং ইন ভিট্রো পরিপক্কতা

প্রাপ্তবয়স্ক এবং প্রিপুবার্টাল গাভী থেকে ডিম্বাশয় (আগের পরীক্ষা, n {{0}} এবং এক্সপ্রেস 1, n=1334) স্থানীয় কসাইখানায় সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং 35-37 ডিগ্রিতে রাখা হয়েছিল একটি ফসফেট-বাফারযুক্ত স্যালাইন (PBS) 0.15 শতাংশ বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন (w/v, BSA) 0.05 mg mL-l কানামাইসিনের সাথে পরিপূরক। পরীক্ষাগারে, 2-8 মিমি ব্যাসের ডিম্বাশয়ের ফলিকলগুলিকে একটি 19-গজ সুই দিয়ে অ্যাসপিরেট করা হয়েছিল৷ কমপ্যাক্ট কিউমুলাস কোষের কমপক্ষে তিনটি স্তর এবং একটি সমজাতীয় ওওপ্লাজম সহ কেবলমাত্র COC গুলিকে পরীক্ষামূলক নকশা অনুসারে পরিপক্কতার জন্য ধুয়ে এবং নির্বাচিত করা হয়েছিল।মরুভূমির হাইসিন্থপরিপক্কতা একটি ইনকিউবেটরে 38.8 ডিগ্রিতে 5 শতাংশ CO2 আর্দ্র বাতাসে 22 বা 30 ঘন্টার জন্য টিস্যু কালচার মিডিয়াম 199 (TCM) এর 10 শতাংশ ভ্রূণ বোভাইন সিরাম, 0.2 মিমি সোডিয়াম দিয়ে গঠিত একটি পরিপক্কতা মাধ্যমে সম্পন্ন হয়েছিল পাইরুভেট, এপিডার্মাল গ্রোথ ফ্যাক্টরের 10 এনজি mL-l এবং জেন্টামাইসিনের 10 μL mL-l【40】।

2.3.গ্রানুলোসা কোষ সংগ্রহ এবং সংস্কৃতি

গ্রানুলোসা কোষগুলি 200x g[41] এ 10 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউগেশনের পরে পুনরুদ্ধারকৃত ফলিকুলার তরল থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। 5 মিনিটের জন্য আরেকটি সেন্ট্রিফিউগেশন করার জন্য পেলেটটিকে 1 মিলি কালচার মিডিয়ামে (টিসিএম 199 প্লাস 10 শতাংশ সিরাম) সাসপেন্ড করা হয়েছিল। নতুন পেলেটটিকে 1 এমএল কালচার মিডিয়ামে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল হয় 1 ইউএম ইউএ দিয়ে পরিপূরক করা হয়েছিল বা পরীক্ষামূলক নকশা অনুসারে নয় এবং কোষগুলিকে বিচ্ছিন্ন করার জন্য কমপক্ষে 30 বার একটি 19G-সুই সংযুক্ত একটি সিরিঞ্জের সাথে একত্রিত করা হয়েছিল। GC কার্যকারিতা মূল্যায়নের পর (ট্রাইপ্যান ব্লু ডাই, 0.4 শতাংশ w/v), কোষগুলিকে 2×105 কার্যক্ষম কোষ mL-1 এর ঘনত্বে বীজ করা হয়েছিল এবং আর্দ্রতায় 38.8 ডিগ্রি,5 শতাংশ CO2 এ পাঁচ দিনের জন্য সংষ্কৃত করা হয়েছিল সঙ্গম পর্যন্ত বায়ুমণ্ডল। প্রতি 48 ঘন্টায়, সংস্কৃতির মাধ্যমটি একটি নতুন দিয়ে ডিসচার্জ এবং রিফ্রেশ করা হয়েছিল। ডিএনএ এবং আরএনএ নিষ্কাশনের জন্য, জিসিগুলি 10 মিনিটের জন্য 200x গ্রাম সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা সংগ্রহ এবং ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। সেল পেলেটগুলি 1 মিলি পিবিএস-এ পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল, অবিলম্বে তরল নাইট্রোজেনে হিমায়িত হয়ে যায় এবং -80 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়।

2.4। Oocyte নিউক্লিয়ার পরিপক্কতা

ভিট্রো পরিপক্কতার 22 ঘন্টা বা 30 ঘন্টা সময়কালের পরে পারমাণবিক পরিপক্কতার পর্যায়গুলি মূল্যায়ন করা হয়েছিল।ফ্ল্যাভোনয়েড নিষ্কাশন পদ্ধতি পিডিএফডিনুডেড ওসাইটগুলিকে অ্যাসিটিক অ্যাসিড/ইথানল (1:3, v/v) দ্রবণে স্থির করা হয়েছিল এবং 48 ঘন্টার জন্য 4 ডিগ্রিতে বজায় রাখা হয়েছিল। তারপর ওসাইটগুলিকে 1 শতাংশ অ্যাসিটো-ল্যাকময়েড দ্রবণ দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল, একটি নিউবাউয়ার চেম্বারে মাউন্ট করা হয়েছিল এবং একটি ফেজ কনট্রাস্ট মাইক্রোস্কোপের (অলিম্পাস বিএক্স41) অধীনে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। ওসাইটগুলিকে নিম্নরূপ শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল: জার্মিনাল ভেসিকল (জিভি), কনডেনসিং ক্রোমো-সোমস আই (সিসিআই), কনডেনসিং ক্রোমোজোম II (সিসিআইআই), ডায়াকিনেসিস, অ্যানাফেজ-আই/টেলোফেজ-আই (এআই/টিআই), এবং এমআইআই (মেটাফেজ-II) . দৃশ্যমান ক্রোমাটিন স্টেনিং সহ শুধুমাত্র oocytes বিবেচনায় নেওয়া হয়েছিল [42]।

2.5। মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেন সম্ভাব্য মূল্যায়ন

মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেন পটেনশিয়াল (এমপি) পরিমাপ করতে, মাইটোকন্ড্রিয়াল কার্যকলাপের একটি সূচক, মাইটোকন্ড্রিয়া 5, 6, 6'-টেট্রাক্লোরো-1, 1', 3, 3'টেট্রাইথিলবেনজিমিডাজলকারবোসায়ানাইন আয়োডাইড (JC{{8}) দিয়ে দাগযুক্ত ছিল , Invitrogen, Waltham, MA, USA)। ডিনুডেড ওসাইটগুলিকে 5 ug mL-l JC-1 [37] দিয়ে 30 মিনিটের জন্য 38.8 ডিগ্রিতে এবং অন্ধকারে আর্দ্র বাতাসে 5 শতাংশ CO2 পরিপক্কতার মাধ্যমে ধূপিত করা হয়েছিল। ওসাইটগুলি পিবিএস-এ দুবার ধোয়া হয়েছিল এবং অবিলম্বে একটি প্রি-হিটেড স্লাইড গ্লাসে স্থানান্তরিত হয়েছিল এবং নীল ফ্লুরোসেন্স ফিল্টার (BP 470-490 উদ্দেশ্য UPlanFI 20×/0.50) ব্যবহার করে একটি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের (অলিম্পাস BX51) অধীনে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেন পটেনশিয়াল তখন ইমেজ] সফ্টওয়্যার (ন্যাশনাল ইনস্টিটিউট অফ হেলথ, বেথেসডা, এমডি, ইউএসএ) ব্যবহার করে পরিমাপকৃত লাল/সবুজ ফ্লুরোসেন্সের অনুপাত হিসাবে গণনা করা হয়েছিল। 2.6. ইন ভিট্রো ফার্টিলাইজেশন এবং ভ্রূণ সংস্কৃতি

ইন ভিট্রো ফার্টিলাইজেশন হলস্টেইন-ফ্রিসিয়ান ষাঁড়ের হিমায়িত-গলে যাওয়া শুক্রাণু দিয়ে সঞ্চালিত হয়েছিল, পূর্বে 2 x 10 ডিগ্রি স্পার্মাটোজোয়া mL-4.COCs এর ঘনত্বে পারকল গ্রেডিয়েন্ট (45 এবং 90) পদ্ধতি ব্যবহার করে ক্যাপাসিটেশনে জমা দেওয়া হয়েছিল। শুক্রাণু 20 ঘন্টার জন্য 38.8 ডিগ্রিতে এবং আর্দ্র বাতাসে 5 শতাংশ CO2 সহ-ইনকিউবেট করা হয়েছিল। অনুমানমূলক জাইগোটগুলি তারপরে বিএমই এবং এমইএম অ্যামিনো অ্যাসিড, গ্লুটামিন, গ্লুটাথিয়ন এবং বিএসএ [৪০] এর সাথে সম্পূরক সিন্থেটিক ডিম্বাশয় তরল (এসওএফ) মাধ্যমের ফোঁটাগুলিতে স্থানান্তরিত হয়েছিল। গর্ভধারণের 48 ঘন্টা পরে, ক্লিভেজ রেট (মোট গর্ভধারণকৃত oocytes প্রতি ক্লিভড ভ্রূণ) পাস করা হয়েছিল, এবং ক্লিভড ভ্রূণগুলি BSA এবং 10 শতাংশ ভ্রূণ বোভাইন সিরাম (FBS) এর সাথে সম্পূরক SOF-তে বজায় রাখা হয়েছিল। ব্লাস্টোসিস্টের বিকাশের হার (দিন 7,9, এবং 12; প্রতি ক্লিভড ভ্রূণ প্রতি D7 ভ্রূণ) এবং হ্যাচড ভ্রূণ হার (প্রতি D7 ভ্রূণে হ্যাচড ভ্রূণ) এবং তাদের গুণমান মূল্যায়নের জন্য ভ্রূণগুলিকে 12 দিনের [41,43] জন্য সংষ্কৃত করা হয়েছিল। দিন 7 ভ্রূণ গ্রেড 1 (ভাল মানের), 2 (ন্যায্য মানের), এবং গ্রেড 3 (খারাপ মানের) হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল [4]।

2.7.DNA এবং RNA নিষ্কাশন এবং পরিমাণ নির্ধারণ

প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে, যথাক্রমে উচ্চ বিশুদ্ধ পিসিআর টেমপ্লেট প্রস্তুতি কিট (রোচে, বাসেল, সুইজারল্যান্ড) এবং পিউরলিংকটিএম আরএনএ মিনি কিট (ইনভিট্রোজেনটিএম, ওয়ালথাম, এমএ, ইউএসএ) ব্যবহার করে মোট ডিএনএ এবং আরএনএ জিসি থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। এই প্রোটোকলগুলির মধ্যে উচ্চ-মানের মোট ডিএনএ এবং আরএনএ এবং ডিএনএকে আরএনএ থেকে জিনোমিক ডিএনএ অপসারণের চিকিত্সা হিসাবে বিচ্ছিন্ন করতে ব্যবহৃত স্পিন কলামগুলির ব্যবহার অন্তর্ভুক্ত ছিল[40]। নিষ্কাশনের পরে, নমুনাগুলি -80 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়েছিল। DNA এবং RNA এর ঘনত্ব এবং গুণমান একটি NanoDropTM One/OneC স্পেকট্রোফোটোমিটার (থার্মোফিশার সায়েন্টিফিকটিএম, ওয়ালথাম, এমএ, ইউএসএ) ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল।

2.7.1। পরিপূরক ডিএনএ সংশ্লেষণ

প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে, Xpert cDNA সংশ্লেষণ মাস্টারমিক্স কিট (GRiSP, Porto, Portugal) ব্যবহার করে RNA বিচ্ছিন্ন থেকে পরিপূরক DNA (cDNA) এর সংশ্লেষণ করা হয়েছিল। cDNA সংশ্লেষণ করতে প্রতিটি নমুনা থেকে 500 ng নিষ্কাশিত RNA ব্যবহার করে RNA বিপরীত প্রতিলিপি করা হয়েছিল, যা একটি থার্মোসাইক্লার (T100 থার্মাল সাইক্লার, বায়ো-র্যাড, হারকিউলিস, CA, USA) ব্যবহার করে সম্পাদিত হয়েছিল৷ ফলস্বরূপ সিডিএনএগুলি পরবর্তী পরীক্ষার জন্য ব্যবহার না করা পর্যন্ত -20 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়েছিল৷ 2.7.2.প্রাইমার ডিজাইন

এই গবেষণার জন্য, ন্যাশনাল সেন্টার ফর বায়োটেকনোলজি ইনফরমেশন (এনসিবিআই) (http://www. .ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/, 6 মার্চ 2020-এ অ্যাক্সেস করা হয়েছে)। রেফারেন্স জিন এবং টার্গেট জিনগুলির জন্য প্রাইমারগুলির ক্রমগুলি সারণি 1 এ চিত্রিত করা হয়েছে। অতিরিক্তভাবে, এই কাজে mt-ND5 জিন ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং mt-ND5 প্রাইমারগুলির বিশদ পূর্ববর্তী গবেষণা থেকে পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল [45]।

2.7.3.পরিমাণগত বিপরীত-প্রতিলিপি পলিমারেজ চেইন প্রতিক্রিয়া

QuantStudio 3 থার্মোসাইক্লারে (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA) 25 ng uL-l ঘনত্বে cDNA ব্যবহার করে Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X ব্যবহার করে রিয়েল-টাইম পিসিআর বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ND5 জিনের মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ (mt-DNA) অনুলিপি সংখ্যার মূল্যায়ন qPCR দ্বারা পূর্বে নিষ্কাশিত DNA-এর মাধ্যমে জিনের পরিমাণ নির্ধারণের জন্য একই সরঞ্জাম ব্যবহার করে করা হয়েছিল। প্রতিটি অপ্টিমাইজ করা প্রতিক্রিয়া সম্পাদিত হয়েছিল, যার মধ্যে রয়েছে এক্সপার্ট ফাস্ট এসওয়াইবিআর গ্রীন মাস্টারমিক্স 2এক্স সহ ROX, প্রতিটি টার্গেট জিনের প্রাইমার (ফরওয়ার্ড এবং রিভার্স), নমুনা (cDNA/DNA), এবং RNase-মুক্ত জলের মোট আয়তন 10 μL। নমুনাগুলি সদৃশভাবে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং টেমপ্লেটের পরিবর্তে জল ধারণকারী প্রতিক্রিয়াগুলি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল। নমুনাগুলি একটি পরিবর্ধন প্রোটোকলের অধীন ছিল যা 2 মিনিটের বিকৃতকরণ পর্বের জন্য 95 ডিগ্রীতে একটি প্রাথমিক চক্র নিয়ে গঠিত, তারপরে 55 সেকেন্ডের জন্য 95 ডিগ্রিতে 40টি বিকৃতকরণ চক্র, 60 ডিগ্রিতে 30 সেকেন্ডের জন্য 40টি অ্যানিলিং চক্র (এর গলিত তাপমাত্রার উপর নির্ভর করে) প্রাইমার সিকোয়েন্স) এবং 30 সেকেন্ডের জন্য 72 ডিগ্রীতে এক্সটেনশন ফেজ এবং সবশেষে, 10 মিনিটের জন্য 72 ডিগ্রীতে একটি চূড়ান্ত এক্সটেনশন পিরিয়ড।

জিনের অভিব্যক্তির পরিমাণ নির্ধারণের জন্য, আপেক্ষিক পরিমাণ নির্ধারণ পদ্ধতি ব্যবহার করা হয়েছিল। জিনের অভিব্যক্তির আপেক্ষিক পরিমাণ নির্ধারণের এই পদ্ধতিটি অধ্যয়নের অধীনে লক্ষ্য জিনের অভিব্যক্তি স্তরের সাথে পরিচালিত হয়েছিল, যা CT তুলনামূলক পদ্ধতি দ্বারা হাউসকিপিং জিনের সাথে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। যেহেতু RT-qPCR দ্বারা পরিবর্ধনটি সদৃশভাবে সঞ্চালিত হয়েছিল, প্রতিটি জিনের জন্য গড় CT মানগুলি নির্ধারণ করা হয়েছিল এবং নিম্নলিখিত সূত্রটি ব্যবহার করে অভিব্যক্তি স্তরগুলি গণনা করা হয়েছিল:

যেখানে △Ct=Ct টার্গেট জিন -Ct এন্ডোজেনাস কন্ট্রোল জিন।

কপির mt-DNA সংখ্যার পরিমাপের জন্য, ইউনিট ভর পদ্ধতির বিপরীতে আপেক্ষিক পরিমাপ স্বাভাবিক করা হয়েছিল। এই পদ্ধতিটি UA (পরীক্ষা হিসাবে নামকরণ করা হয়েছে) দ্বারা চিকিত্সা করা GC-এর সিটি মানগুলির সাথে পরিচালিত হয়েছিল, যা নিয়ন্ত্রণ নমুনাগুলির সাথে স্বাভাবিক করা হয়েছিল (বর্তমানে ক্যালিব্রেটর হিসাবে মনোনীত)। যেহেতু mt-ND5 কপি নম্বরটি qPCR দ্বারা মূল্যায়ন করা হয়েছিল এবং সদৃশভাবে সঞ্চালিত হয়েছিল, পরীক্ষা এবং ক্যালিব্রেটর নমুনার জন্য গড় CT মান নির্ধারণ করা হয়েছিল এবং অনুপাতগুলি নিম্নলিখিত সূত্র ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল: