যোগাযোগ:jerry.he@wecistanche.com

Yuto Mitsuhata1, Takaya Abe2, Kazuyo Misaki3, Yuna Nakajima1, Keita Kiriya1,

Miwa Kawasaki4, Hiroshi Kiyonari2, Masatoshi Takeichi4*, Mika Toya1,4,5,6*&

মাসামিতসু সাটো 1,6,7

Cistanche কিডনির কার্যকারিতা উন্নত করতে পারে

এপিথেলিয়াল কোষগুলি অ-সেন্ট্রোসোমাল মাইক্রোটিউবিউলগুলির একটি ক্রমানুসারে সংগঠিত করে, যার বিয়োগ প্রান্তগুলি CAMSAP3 দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়। এপিথেলিয়াল ফাংশনে এই মাইক্রোটিউবিউলগুলির ভূমিকা, তবে, খুব কম বোঝা যায় না। এখানে, আমরা দেখান যেকিডনিইঁদুরের মধ্যে যার মধ্যে Camsap3 পরিবর্তিত হয়সিস্টপ্রক্সিমাল কনভোলুটেড টিউবুলে (পিসিটি)। মিউট্যান্টে পিসিটিগুলি মারাত্মকভাবে প্রসারিত হয়েছিলকিডনি, এবং তারা বর্ধিত কোষের বিস্তারও প্রদর্শন করেছে। এই পিসিটি-তে, মাইক্রোটিউবুল অ্যারে এবং আন্তঃডিজিটেটিং বেসাল প্রক্রিয়াগুলির মতো নির্দিষ্ট উপকোষীয় কাঠামোর বিক্ষিপ্ততার সাথে এপিথেলিয়াল কোষগুলি মোটা হয়ে যায়। অধিকন্তু, YAP এবং PIEZO1, যা কোষের আকার এবং বিস্তারের জন্য যান্ত্রিক সংবেদনশীল নিয়ন্ত্রক হিসাবে পরিচিত, এই মিউট্যান্ট পিসিটি কোষগুলিতে সক্রিয় করা হয়েছিল। এই পর্যবেক্ষণগুলি পরামর্শ দেয় যে CAMSAP3 - মধ্যস্থতাযুক্ত মাইক্রোটিউবুল নেটওয়ার্কগুলি PCT কোষগুলির সঠিক যান্ত্রিক বৈশিষ্ট্য বজায় রাখার জন্য গুরুত্বপূর্ণ, এবং এর ক্ষতি মেকানোসেন্সর সক্রিয়করণের মাধ্যমে কোষের বিকৃতি এবং বিস্তারকে ট্রিগার করে, যার ফলে PCT এর প্রসারণ ঘটে।

এপিথেলিয়াল কোষ বিভিন্ন অঙ্গের প্রধান উপাদান। Tey apical-to-basal polarity দেখায় যা তাদের ফাংশনের সাথে যুক্ত, যেমন শোষণ এবং ক্ষরণ। ডিফারেনিয়েটেড এপিথেলিয়াল কোষে, বেশিরভাগ মাইক্রোটিউবিউল অ-সেন্ট্রোসোমাল এবং এপিকাল-টু-বেসাল অক্ষ 1–3 বরাবর সারিবদ্ধ থাকে। CAMSAP3 হল ক্যালমোডুলিন-নিয়ন্ত্রিত স্পেকট্রিন-অ্যাসোসিয়েটেড প্রোটিন (CAMSAP)/Nezha/Patronin প্রোটিন পরিবারের সদস্য এবং এটি এপিথেলিয়াল মাইক্রোটিউবুল সংগঠন 4–8 এর জন্য গুরুত্বপূর্ণ। CAMSAP3 মাইক্রোটিউবুলস4,6,9 এর বিয়োগ প্রান্তগুলিকে আবদ্ধ করে এবং স্থিতিশীল করে। ইঁদুরের ছোট অন্ত্রের কোষে, CAMSAP3 apical cortical অঞ্চলে কেন্দ্রীভূত হয়, এই সাইটগুলিতে নন-সেন্ট্রোসোমাল মাইক্রোটিউবুলের বিয়োগ প্রান্তগুলিকে নোঙ্গর করে 10,11, ফলে মাইক্রোটিউবুল অ্যারে তৈরি হয় যা এপিকোবাসাল দিকের দিকে অভিমুখে প্লাস প্রান্ত বিন্দুযুক্ত। . যাইহোক, এই বৈশিষ্ট্যযুক্ত মাইক্রোটিউবুল সংগঠনটি একটি মিউট্যান্ট জিন বহনকারী ইঁদুরের মধ্যে হারিয়ে যায় যা একটি ছাঁটাই করা Camsap3 (Camsap3dc/dc ইঁদুর) এনকোডিং করে, যেখানে C-টার্মিনাল মাইক্রোটিউবুল-বাইন্ডিং ডোমেন মুছে ফেলা হয়। এই ইঁদুরগুলির অন্ত্রের এপিথেলিয়াল কোষগুলিতে কোষের উচ্চতা হ্রাস এবং নিউক্লিয়াস এবং গলগি 10 এর মতো ভুল অবস্থানে থাকা অর্গানেল সহ বিভিন্ন সাইটোলজিকাল ত্রুটি রয়েছে। অন্তঃকোষীয় স্থাপত্যে এত বড় বিড়ম্বনা সত্ত্বেও, এপিথেলিয়াল কোষগুলি স্বাভাবিক চেহারার দ্বি-মাত্রিক শীটগুলি বজায় রাখে 10,12, এবং পরিবর্তিত অন্ত্রগুলির কোনও স্পষ্ট শারীরবৃত্তীয় ত্রুটি ছিল না।

টিউবুলস (পিসিটি), হেনলের লুপ, দূরবর্তী আবর্তিত টিউবুলস এবং সংগ্রহ নালী। টেস নেফ্রন সাবস্ট্রাকচারগুলি এপিথেলিয়ামের একটি একক স্তর নিয়ে গঠিত, যা পরিস্রাবণ, পুনর্শোষণ এবং নিঃসরণের জন্য কাজ করে।

A রেনাল সিস্টএর একটি সাধারণ রোগগত ক্ষতকিডনি. টি সিস্টিক ক্ষত পরিবর্তনশীল; হয় ফোকাল বা একাধিক সিস্ট একদিকে বা দ্বিপাক্ষিকভাবে কিডনিতে তৈরি হয়, যা বিভিন্ন মাত্রার উপসর্গ দেখায় 13-15। বেশ কিছু জন্মগত সিস্টিকরেনালপলিসিস্টিক সহ রোগকিডনিরোগ (PKD), গ্লোমেরুলোসিস্টিক কিডনি রোগ (GCKD) এবং মেডুলারি সিস্টিককিডনিরোগ (MCKD), একাধিক কারণ হিসাবে পরিচিতরেনালদ্বিপাক্ষিক কিডনিতে সিস্ট। PKD-তে, সিস্টগুলি PCT সহ সমগ্র অঙ্গে সমানভাবে বিতরণ করা হয়, যেখানে GCKD এবং MCKD যথাক্রমে বোম্যানের ক্যাপসুল এবং সংগ্রহ নালীতে (প্রধানত মেডুলা অঞ্চলে) সিস্টের বিকাশ ঘটায় 16-19।

PKD হিসাবে, দুটি প্রধান কারণ জানা যায়: 1) Pkd1 বা Pkd2 জিনে মিউটেশন এবং 2) প্রাথমিক সিলিয়াম বায়োজেনেসিসের জন্য প্রয়োজনীয় জিনে মিউটেশন। Pkd1 এবং Pkd2 যথাক্রমে পলিসিস্টিন1 এবং পলিসিস্টিন2 এনকোড করে, যা নন-সিলেক্টিভ ক্যাটেশন চ্যানেল20 যা প্রাথমিক সিলিয়া21,22 সহ বিভিন্ন সেলুলার কম্পার্টমেন্টে স্থানীয়করণ করে। PKD1 বা PKD2 এর মিউট্যান্ট ফর্ম বহনকারী ইঁদুরগুলিতে, পলিসিস্টিন প্রোটিনগুলি সিলিয়া 23-তে স্থানীয়করণ করে না। প্রাথমিক সিলিয়ার বায়োজেনেসিসের জন্য প্রয়োজনীয় জিনগুলির মধ্যে রয়েছে If88 এবং Kif3a, যা ইন্ট্রাফেজেলার পরিবহনে জড়িত 24-26। এই জিনেও মিউটেশন হয়রেনালসিস্টিক রোগ 24-27। যদিও এই দুটি কার্যকারণ পথের মধ্যে সম্পর্ক জটিল 23, একটি পথ যা PKD প্ররোচিত করার জন্য প্রদর্শিত হয়েছে তাতে Hippo সিগন্যালিং ইফেক্টর Yap28 জড়িত। Pkd1 মিউট্যান্ট ইঁদুরে, ট্রান্সক্রিপশন কো-অ্যাক্টিভেটর YAP/TAZ এবং এর প্রভাবক c-Myc সক্রিয় হয় এবং সিস্টোজেনেসিস28 প্রচার করে। তবুও, পলিসিস্টিক বিকাশের অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়াগুলিকিডনিঅনেকাংশে অজানা থেকে যায়।

বর্তমান গবেষণায়, আমরা CAMSAP3 এর ভূমিকাগুলি তদন্ত করেছিকিডনিগঠন এবং ফাংশন। আমাদের পর্যবেক্ষণগুলি দেখায় যে apically স্থানীয় CAMSAP3 নন-সেন্ট্রোসোমাল মাইক্রোটিউবিউলগুলির সঠিক অভিযোজন এবং সেইসাথে পিসিটি-তে এপিথেলিয়াল কোষগুলির অন্তঃকোষীয় আর্কিটেকচার প্রতিষ্ঠায় অবদান রাখে, যেমনটি ছোট অন্ত্রে দেখা যায়। অন্ত্রের এপিথেলিয়ার বিপরীতে, তবে, CAMSAP3কর্মহীনতাদ্বিপাক্ষিক কিডনিতে অঙ্গ-স্তরের অস্বাভাবিকতা সৃষ্টি করে—অর্থাৎ, পিসিটি-তে সিস্ট গঠন। CAMSAP3 ফাংশন হারানোর ফলে যান্ত্রিক সংবেদনশীল নিয়ন্ত্রক সক্রিয় হয় যা সাধারণত টিস্যুর অখণ্ডতা রক্ষা করতে সাহায্য করে। আমাদের অধ্যয়ন পরামর্শ দেয় যে CAMSAP3-মধ্যস্থিত নন-সেন্ট্রোসোমাল মাইক্রোটিউবিউল সংস্থা PCT-এর যান্ত্রিক সংবেদনশীল বৈশিষ্ট্য বজায় রাখার জন্য গুরুত্বপূর্ণ, এবং এই সিস্টেমের ক্ষতি কিডনিতে আঞ্চলিক সিস্ট গঠনের কারণ হয়।

ফলাফল

সিস্টমধ্যে গঠনকিডনিCamsap3 মিউট্যান্ট ইঁদুরের। Camsap3dc/dc মিউট্যান্ট ইঁদুরের ফেনোটাইপিক বিশ্লেষণ তা প্রকাশ করেছেকিডনিবয়স্কদের (~ 2 বছর বয়সী) Camsap3dc/dc ইঁদুর হাইপারট্রফিক এবং বিবর্ণ ছিল (চিত্র 1a)। Camsap3dc/dc-এ অস্বাভাবিকতা আরও বিশ্লেষণ করতেকিডনি, আমরা ছোট ইঁদুর পরীক্ষা করেছি। প্রসবোত্তর দিন 21 (P21), Camsap3dc/dc কিডনি একটি স্বাভাবিক চেহারা ছিল. যাইহোক, কিডনির সেকশনিং কর্টিকাল অঞ্চলে সিস্টিক কাঠামো প্রকাশ করেছে (চিত্র 1b এবং পরিপূরক চিত্র S1a), সিস্টিক সূচক গণনা করে নিশ্চিত করা হয়েছে, যা মোট কিডনি এলাকার সাথে সিস্টযুক্ত অঞ্চলগুলির অনুপাত (চিত্র। 1গ)। আমরা মিউট্যান্ট ভ্রূণ পরীক্ষা করেছিলাম যে কখন সিস্টগুলি বিকাশের সময় তৈরি হতে শুরু করে, যা প্রায় 17.5 (E17.5) (পরিপূরক চিত্র S1a, তীর) এ সিস্ট গঠনের বৃদ্ধির লক্ষণ প্রকাশ করে। P0-এ, কর্টিকাল সিস্টগুলি সহজেই বোঝা যায় (পরিপূরক চিত্র S1a, তীর), এবং তাদের আকার এবং সংখ্যা P21 দ্বারা বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 1b, পরিপূরক চিত্র। S1a, তীর)। ইঁদুরের বয়স বাড়ার সাথে সাথে সিস্টিক ফেনোটাইপগুলি আরও স্পষ্ট হয়ে ওঠে, যদিও সিস্ট গঠনের মাত্রা ব্যক্তিদের মধ্যে পরিবর্তিত হয় (চিত্র 1c এবং পরিপূরক চিত্র। S1b)। এছাড়াও, কিডনি-থেকে-শরীরের ওজনের অনুপাত Camsap3dc/dc ইঁদুরের জন্য তাদের জীবদ্দশায় ওয়াইল্ড-টাইপ (WT) ইঁদুরের চেয়ে বেশি ছিল (চিত্র 1d এবং পরিপূরক চিত্র। S1c, d)। তাই, Camsap3dc/dc কিডনি সিস্ট গঠন প্রদর্শন করেছে, যা সময়ের সাথে সাথে বৃদ্ধি পেয়েছে, যার ফলে বয়স্ক কিডনিতে হাইপারট্রফি হয়েছে।

Camsap3dc/dc ইঁদুর একটি সি-টার্মিনাল ডোমেন প্রকাশ করে–কাটা CAMSAP3 (CAMSAP3-dc)10, যা মাউসের কিডনির পর্যবেক্ষণ করা সিস্টিক ফেনোটাইপের সাথে জড়িত হতে পারে। এই সম্ভাবনার তদন্ত করার জন্য, আমরা একটি Camsap3–/– (Camsap3-নাল) মাউস (পরিপূরক চিত্র S2a,b) তৈরি করেছি (বিস্তারিত পদ্ধতিগুলিও দেখুন)। এই ইঁদুরগুলিও ছিলকিডনিএকাধিক সিস্টের সাথে, এবং তাদের ফেনোটাইপ Camsap3dc/dc ইঁদুরে পরিলক্ষিত হওয়া থেকে আলাদা করা যায় না; উল্লেখযোগ্যভাবে, হেটেরোজাইগাস (Camsap3 প্লাস /-) ইঁদুরে পলিসিস্টিক কিডনির কোনো লক্ষণ দেখা যায়নি (পরিপূরক চিত্র S2c)।

Camsap3dc/dc-এর PCT-তে সিস্ট গঠনকিডনি. মিউট্যান্টের মধ্যে কোন কাঠামো সিস্টিক হয়ে উঠেছে তা নির্ধারণ করতেকিডনি, আমরা তিনটি প্রোটিনের জন্য তিনটি নেফ্রন সেগমেন্টের ইমিউনোস্টেইনিং করেছি, যেমন মেগালিন (পিসিটি-তে স্থানীয়করণ করে), একটি Na প্লাস /Cl– কোট্রান্সপোর্টার (দূরবর্তী কনভল্যুটেড টিউবুলস), এবং অ্যাকোয়াপোরিন-2 (সংগ্রহ নালী)। Te ফলাফলগুলি দেখিয়েছে যে P21 (চিত্র 1e এবং পরিপূরক চিত্র S1e) এ মেগালিন-পজিটিভ টিউবুলে একচেটিয়াভাবে প্রসারণ ঘটেছে, যা ইঙ্গিত করে যে সিস্টোজেনেসিস PCT এর মধ্যে সীমাবদ্ধ ছিল। PCT গুলিকে S1, S2 এবং S3 নামে তিনটি সেগমেন্টে বিভক্ত করা হয়েছে এবং আমরা গ্লুকোজ ট্রান্সপোর্টার SGLT1 এবং SGLT2 এর জন্য ইমিউনোস্টেইনিং করে তাদের মধ্যে পার্থক্য করেছি, যা যথাক্রমে S3 এবং S1/S2 সেগমেন্টে স্থানীয়করণ করে 29,30। Te dilated tubules শুধুমাত্র SGLT2 (চিত্র 1f) দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছে, যা নির্দেশ করে যে সিস্টোজেনেসিস S1/S2 সেগমেন্টে ঘটে। বয়স্ক মিউট্যান্ট ইঁদুরের ক্ষেত্রে, সিস্ট গঠনও বোম্যানের ক্যাপসুলে (চিত্র 1g) প্রসারিত হয়।

সিস্টিক পিসিটিতে অসংগঠিত সেলুলার আর্কিটেকচার। সিস্টিক পিসিটি-তে সেলুলার-স্তরের ত্রুটিগুলি অন্বেষণ করতে, আমরা প্রথমে ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি স্ক্যান করে সেগুলি পরীক্ষা করে দেখেছি যে জনসংখ্যারেনালCamsap3dc/dc কিডনিতে টিউবুলগুলি স্পষ্টভাবে ফুলে গেছে (চিত্র 2a), যদিও ফোলার মাত্রা টিউবিউলের অবস্থান থেকে অবস্থানে পরিবর্তিত হয়। ক্রস-সেকশনগুলি প্রকাশ করে যে, একটি টিউবুলের ফুলে যাওয়া অংশে, টিউবুলগুলি রচনাকারী এপিথেলিয়াল স্তরটি পাতলা করার সাথে এর লুমেনটি প্রসারিত হয়েছিল (চিত্র 2a)। হেমাটোক্সিলিন এবং ইওসিন-দাগযুক্ত নমুনাগুলি ব্যবহার করে পরিমাপ নিশ্চিত করেছে যে প্রসারিত টিউবুলে কোষের উচ্চতা হ্রাস পেয়েছে (চিত্র 2বি), যেখানে প্রতিটি কোষের এপিকাল পরিধি বৃদ্ধি করা হয়েছিল (চিত্র 2c), নির্দেশ করে যে মিউট্যান্ট কোষগুলি WT-এর তুলনায় মোটা ছিল।কিডনি.

আমরা পরবর্তীতে পরীক্ষা করেছি যে সেল আর্কিটেকচার এবং/অথবা পিসিটিগুলির উপকোষীয় কাঠামো Camsap3 মিউটেশন দ্বারা প্রভাবিত হয়েছিল কিনা। ডিপিপি IV এর জন্য ইমিউনোস্টেইনিং, একটি এপিকাল মেমব্রেন মার্কার, এবং Na plus/K plus-ATPase, একটি বেসোল্যাটারাল মেমব্রেন মার্কার, ইঙ্গিত দেয় যে প্রতিটি কোষের সামগ্রিক মেরুতা স্বাভাবিক ছিলরেনালCamsap3dc/dc এর টিউবুল সেল

চিত্র 1. Camsap3dc/dc-এর প্রক্সিমাল কনভোলুটেড টিউবুলে সিস্ট গঠনকিডনি. (a) WT ( প্লাস / প্লাস ) এবং P666 এ Camsap3 মিউট্যান্ট (Camsap3dc/dc) ইঁদুরের কিডনির রূপবিদ্যা। (b) P21 এ WT এবং Camsap3dc/dc কিডনির H&E স্টেনিং। Camsap3dc/dc কিডনির কর্টেক্সে একাধিক সিস্ট গঠিত হয়। (c) সময়ের সাথে সাথে WT এবং Camsap3dc/dc ইঁদুরের সিস্টিক সূচকের পরিবর্তন। 9 টি ইঁদুর WT বা Camsap3dc/dc এর জন্য পরীক্ষা করা হয়েছিল। সিস্টিক সূচকের সংজ্ঞার জন্য উপকরণ এবং পদ্ধতি দেখুন। (d) কিডনি এবং শরীরের ওজনের অনুপাত। 11টি ইঁদুর WT বা Camsap3dc/dc-এর জন্য পরীক্ষা করা হয়েছিল। (ঙ) প্রক্সিমাল কনভলুটেড টিউবুলস (পিসিটি) (মেগালিন), ডিস্টাল কনভোলুটেড টিউবুলস (ডিসিটি), NaCl কো-ট্রান্সপোর্টার এবং ডাব্লুটি এবং ক্যামসাপ3ডিসি/তে সংগ্রহ নালী (সিডি) (অ্যাকোয়াপোরিন-2; AQP2) এর মার্কারগুলির জন্য ইমিউনোস্টেইনিং ডিসিকিডনিP21 এ। মেগালিনের বিবর্ধিত দৃশ্যের চিত্রগুলি ক্যামসাপ3ডিসি/ডিসি কিডনিতে সিস্টিক কোষগুলিতে ডিলোকালাইজড মেগালিন দেখায়, যেমন তীরের মাথা দ্বারা নির্দেশিত। ভাঙা এবং অবিচ্ছিন্ন রেখাগুলি যথাক্রমে কোষের apical এবং বেসাল মার্জিন নির্দেশ করে। (f) WT-এ S1/S2 সেগমেন্ট (SGLT2, সবুজ) এবং S3 সেগমেন্ট (SGLT1, লাল) এবং P21-এ Camsap3dc/dc কিডনির চিহ্নিতকারীর জন্য ইমিউনোস্টেইনিং। SGLT2 এর বিবর্ধিত দৃশ্যের চিত্রগুলি ক্যামসাপ3dc/dc কিডনির সিস্টিক কোষগুলিতে SGLT2 সংকেতের তীব্রতা হ্রাস করে, যেমন তীরচিহ্ন দ্বারা নির্দেশিত। (g) P21 এবং P487-এ গ্লোমেরুলাসের রূপবিদ্যা। তীরচিহ্নগুলি প্রসারিত গ্লোমেরুলাস নির্দেশ করে। এছাড়াও চিত্র S1 এবং S2 দেখুন।

চিত্র 2. সিস্টিক পিসিটি কোষে অসংগঠিত সেলুলার আর্কিটেকচার। (a) ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি ছবি স্ক্যান করা ▸

Cistanche কিডনির কার্যকারিতা উন্নত করতে পারে

WT এবং Camsap3dc/dc এরকিডনিP21 এ। ক্যামসাপ৩ডিসি/ডিসি-তে রেনাল টিউবুলকিডনিআংশিকভাবে ফুলে গেছে। (b) কর্টেক্স [ প্লাস / প্লাস , n=121 কোষে কোষের উচ্চতার পরিমাণ; dc/dc (প্রসারিত), n=128 কোষ; dc/dc (অ-প্রসারিত), n=66 কোষ]। ত্রুটি বার SD ***p নির্দেশ করে<0.001, t-test.="" see="" materials="" and="" methods="" for="" the="" defnition="" of="" dilated="" and="" non-dilated="" tubules.="" (c)="" quantifcation="" of="" cell="" width="" in="" the="" cortex="" [+="" +="" ,="" n="26" tubules;="" dc/="" dc="" (dilated),="" n="8" tubules;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="14" tubules].="" error="" bars="" indicate="" s.d.="" ***p=""><0.001, t-test.="" (d)="" cell="" polarity="" markers="" were="" visualized:="" dpp="" iv="" (apical="" marker)="" and="" na+/k+-atpase="" (basal="" marker).="" te="" localization="" of="" cell="" polarity="" markers="" in="" camsap3dc/dc="" kidney="" is="" overall="" normal.="" te="" arrowhead="" indicates="" basal="" plasma="" membranes,="" whose="" invagination="" is="" not="" normal.="" (e)="" apical="" structures="" (actin="" and="" ezrin)="" and="" the="" golgi="" were="" visualized.="" arrowheads="" indicate="" disrupted="" structures="" such="" as="" the="" lack="" of="" actin="" signal="" and="" misplacement="" of="" the="" golgi.="" broken="" and="" continuous="" lines="" indicate="" the="" apical="" and="" basal="" margin="" of="" the="" cell,="" respectively,="" in="" d="" and="" e.="" (f)="" transmission="" electron="" microscopy="" images="" of="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" subcellular="" defects="" such="" as="" a="" fattened="" nucleus="" and="" misaligned="" mitochondria="" are="" observed="" in="" camsap3dc/dc="" kidneys.="" arrowheads="" indicate="" invaginated="" basal="" membranes.="" note="" that="" their="" extensive="" invagination="" is="" suppressed="" in="" camsap3dc/dc.="" asterisks="" denote="" mitochondria.="" drawings="" are="" the="" traced="" invagination="" in="" electron="" microscopy="" images.="" (g)="" quantifcation="" of="" the="" shape="" of="" the="" nucleus="" [+="" +="" ,="" n="72" cells;="" dc/dc="" (dilated),="" n="72" cells;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="71" cells].="" (h)="" immunostaining="" for="" acetylated="" tubulin,="" a="" marker="" for="" the="" primary="" cilium,="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" te="" primary="" cilium="" was="" present="" in="" both="" wt="" and="" camsap3dc/dc="">কিডনি. (i) PCT-এ প্রাথমিক সিলিয়ার সংখ্যা। প্রাথমিক সিলিয়ার সংখ্যা প্রাথমিক সিলিয়া এবং নিউক্লিয়াসের সংখ্যা সহ PCT এর ক্রস বিভাগের apical পরিধি দৈর্ঘ্য ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল। [ প্লাস / প্লাস , N=340 কোষ, PCT এর 63টি ক্রস বিভাগ, প্রাথমিক সিলিয়ার সংখ্যা=268; dc/dc, N=221 কোষ, PCT এর 29টি ক্রস বিভাগ, প্রাথমিক সিলিয়ার সংখ্যা=133]।

ইঁদুর (চিত্র 2d)। বিপরীতে, যদিও মেগালিন ডাব্লুটি কোষের apical অঞ্চলে জমা হয়েছিল, তবে এটি কিছু সিস্টিক Camsap3dc/dc কোষে সাইটোপ্লাজমে ছড়িয়ে পড়ে (চিত্র 1e ম্যাগনিফাইড ভিউ, এবং চিত্র 2d)। এফ-অ্যাক্টিনের জন্য ফ্লুরোসেন্স স্টেনিং, যা এপিকাল মাইক্রোভিলিতে উচ্চ ঘনত্বে জমা হয়, পরামর্শ দেয় যে মাইক্রোভিলি মাঝে মাঝে মিউট্যান্টের চর্বিযুক্ত কোষগুলিতে বিশৃঙ্খল ছিল।কিডনি(চিত্র 2e অ্যারোহেড), ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি (চিত্র 2f) দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছে। Ezrin, ERM-কমপ্লেক্সের একটি অংশ যা apical plasma membrane31 এর সাথে যুক্ত, Camsap3dc/dc-এর সিস্টিক কোষে হ্রাস পেয়েছে বা হারিয়ে গেছেকিডনি(চিত্র 2e), পরামর্শ দিচ্ছে যে মিউট্যান্ট কোষে সাইটোআর্কিটেকচার অস্বাভাবিক ছিল। উপরন্তু, যেখানে জায়ান্টিন-পজিটিভ গলগি যন্ত্রপাতি সাধারণত ডাব্লুটি কোষে নিউক্লিয়াসের সাথে সংযুক্ত পাতলা স্ট্র্যান্ড হিসাবে বিতরণ করা হয়, সেখানে গলগি মাঝে মাঝে Camsap3dc/dc কোষে ঘনীভূত হয় (চিত্র 2e)। ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি Camsap3dc/dc-এর প্রসারিত PCT-তে অতিরিক্ত উপকোষীয় ত্রুটি প্রকাশ করেছেকিডনি. ডাব্লুটি পিসিটি কোষে, মাইটোকন্ড্রিয়া দীর্ঘায়িত ছিল, যা কোষের অ্যাপিকো-বেসাল অক্ষ বরাবর একটি ক্রমবর্ধমান অভিযোজন দেখায়, যেখানে সিস্টিক পিসিটি কোষে, মাইটোকন্ড্রিয়া বৃত্তাকার হওয়ার প্রবণতা দেখায় — আর কোনো আদেশকৃত অভিযোজন প্রদর্শন করে না (চিত্র 2f)। এই কোষগুলিতে, বেসাল স্ট্রিয়েশনগুলিও বিশৃঙ্খল ছিল, তাদের সমান্তরাল এবং গভীর আক্রমণগুলি হারিয়েছিল যা WT কোষগুলিতে সাধারণ (চিত্র 2f তীরচিহ্ন এবং ট্রেসড অঙ্কন), যেমনটি Na plus /K প্লাস -ATPase (চিত্র 2) এর জন্য ইমিউনোস্টেইনিং দ্বারা দেখানো হয়েছে 2d তীরের মাথা)। অধিকন্তু, ডাব্লুটি কোষে তাদের গোলাকার আকারের তুলনায় (চিত্র 2f,g) সিস্টিক কোষগুলিতে নিউক্লিয়াস মোটাতাজা করা হয়েছিল। প্রাথমিক সিলিয়া WT এবং মিউট্যান্ট কিডনি উভয়ের PCT কোষের লুমিনাল সাইডে সনাক্ত করা যায় (চিত্র 2h,i), মিউট্যান্ট ইঁদুরের ক্ষেত্রে ভিন্ন যেগুলি সিলিওজেনেসিসের জন্য ত্রুটিযুক্ত, যা পলিসিস্টিক কিডনি 24-27 ঘটায়, পরামর্শ দেয় যে সিলিওজেনেসিসের প্রতিবন্ধকতা এর সম্ভাব্য কারণ নয়

Camsap3dc/dc ইঁদুরগুলিতে পলিসিস্টিক ফেনোটাইপগুলি পর্যবেক্ষণ করা হয়েছে। সম্মিলিতভাবে, এই পর্যবেক্ষণগুলি ইঙ্গিত করেছে যেকর্মহীনতাCAMSAP3 এর PCT সিস্টিক কোষের উপকোষীয় স্থাপত্যকে বিরক্ত করে।

Camsap3dc/dc ইঁদুর কিছু শারীরবৃত্তীয় ত্রুটি দেখায়। আমরা পরবর্তীতে Camsap3dc/dc কিডনির কোনো শারীরবৃত্তীয় ত্রুটি আছে কিনা তা পরীক্ষা করে দেখেছি। উপরে উল্লিখিত ইমিউনোসাইটোলজিকাল গবেষণায় দেখা গেছে যে মেগালিন, যা একটি মাল্টিলিগ্যান্ড এন্ডোসাইটিক রিসেপ্টর হিসাবে কাজ করে 32,33, ক্যামসাপ3ডিসি/ডিসি পিসিটি কোষের সাইটোপ্লাজমে বিচ্ছুরিত হওয়ার প্রবণতা দেখায় (চিত্র 1e অ্যারোহেড, এবং চিত্র 2d), এর স্পষ্ট স্থানীয়করণের বিপরীতে। WT PCT কোষ। তদ্ব্যতীত, যদিও গ্লুকোজ ট্রান্সপোর্টার SGLT2, যা 90 শতাংশ গ্লুকোজ পুনঃশোষণ29 এর জন্য দায়ী, প্রাথমিকভাবে Camsap3dc/dc কোষের apical অঞ্চলে স্থানীয়করণ করা হয়েছে (যেমন WT কোষেও দেখা যায়), সিস্টিক টিউবুলেসের নির্দিষ্ট অঞ্চলে এর সংকেতের তীব্রতা হ্রাস পেয়েছে ( Fig. 1f arrowheads), প্রস্তাব করে যে মিউট্যান্ট টিউবুলের শারীরবৃত্ত নেতিবাচকভাবে প্রভাবিত হতে পারে। তাই, আমরা P396- থেকে P424-পুরানো ইঁদুর ব্যবহার করে প্রস্রাব এবং রক্ত ​​পরীক্ষা করেছি। প্রস্রাব পরীক্ষা Camsap3dc/dc ইঁদুরে K প্লাস, Mg2 প্লাস এবং ইউরিয়া নাইট্রোজেনের অত্যধিক বহিঃপ্রবাহের প্রবণতা প্রকাশ করেছে (পরিপূরক চিত্র S3a)। রক্ত পরীক্ষা আরও দৃঢ়ভাবে প্রমাণ করেছে যে Camsap3dc/dc ইঁদুরে WT বা Camsap3 plus/dc ইঁদুরের তুলনায় K plus এবং Mg2 প্লাসের মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে কম ছিল, যদিও ইউরিয়া নাইট্রোজেন এবং গ্লুকোজের মাত্রায় কোনো পরিবর্তন ধরা পড়েনি (পরিপূরক চিত্র 3)। . প্রস্রাব এবং রক্তের ক্রিয়েটিনিনের মাত্রা WT এবং মিউট্যান্ট ইঁদুরের মধ্যে পার্থক্য ছিল না (পরিপূরক চিত্র S3c)। তাই, আমরা Cam-sap3dc/dc ইঁদুরগুলিতে শুধুমাত্র আংশিক শারীরবৃত্তীয় ত্রুটিগুলি লক্ষ্য করেছি।

মাইক্রোটিউবিউল সংস্থারেনালটিউবুল এপিথেলিয়াল কোষ। যেহেতু Camsap3 মিউটেশন ছোট অন্ত্রের 10,12 এপিথেলিয়াল কোষে মাইক্রোটিউবিউলগুলির বিভ্রান্তির দিকে পরিচালিত করে, আমরা পরীক্ষা করেছি যে এটিও ঘটে কিনাকিডনিএপিথেলিয়াল কোষের. আমরা মেগালিনের সাথে একসাথে টিউবুলিন ইমিউনোস্টেইন করেছি। উল্লেখযোগ্যভাবে, WT এবং Camsap3dc/dc উভয় কিডনিতে, মেগালিন-নেগেটিভ টিউবুলস, অর্থাৎ দূরবর্তী সংকোচিত টিউবুল বা সংগ্রহ নালী, মেগালিন-পজিটিভ PCT-তে -টিউবুলিনের জন্য পর্যবেক্ষণের চেয়ে শক্তিশালী -টিউবুলিন ইমিউনোস্টেইনিং তীব্রতা দেখায় (চিত্র 3a, b) . ছোট অন্ত্রে পাওয়া যায় 10, CAMSAP3 ডাব্লুটি-এর সমস্ত এপিথেলিয়াল কোষে apically স্থানীয়করণকিডনি, এপিকো-বেসাল অক্ষ বরাবর সারিবদ্ধ মাইক্রোটিউবুলের এপিকাল প্রান্তকে ওভারল্যাপ করে (চিত্র 3c লেফ)। Camsap3dc/dc কিডনি এপিথেলিয়াল কোষগুলিও CAMSAP3-এর জন্য কিছুটা ইমিউনোপজিটিভ ছিল কিন্তু অনিয়মিত অবস্থানে (চিত্র 3c ডানদিকে, তীরচিহ্ন), পরামর্শ দেয় যে পরিবর্তিত CAMSAP3 কোষে ধরে রাখা হয়েছে, কিছু অজ্ঞাত কাঠামোতে নোঙর করা হয়েছে। মিউট্যান্ট কিডনির সিস্টিক কোষে, মাইক্রোটিউবুলের অ্যারে জট ছিল এবং বিশৃঙ্খল ছিল (চিত্র 3c ডানে), যেমনটি Camsap3dc/dc ইঁদুরের অন্ত্রের কোষগুলিতে দেখা গেছে। নন-সিস্টিক কোষগুলিতে, তবে, মাইক্রোটিউবুল সংগঠন প্রভাবিত হয়নি

চিত্র 3. রেনাল টিউবুল এপিথেলিয়াল কোষে মাইক্রোটিউবুলস। (ক) ডব্লিউটি-তে টিউবুলিন, মেগালিন এবং নিউক্লিয়াসের জন্য ইমিউনোস্টেইনিং এবং P21-এ Camsap3dc/dc কিডনি। (b) WT কিডনি (PCT, n=28 টিউবুলস; DCT/CD, n=18 টিউবুলস) এবং Camsap3dc/dc কিডনি (PCT, n { {8}} টিউবুলস; ডিসিটি/ সিডি, এন=9 টিউবুল)। ত্রুটি বার SD ***p নির্দেশ করে<0.001, t-test.="" (c)="" immunostaining="" for="" α-tubulin,="" camsap3,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" arrowheads="" indicate="" camsap3-dc="" proteins="" anchoring="" to="" unidentifed="" structures.="" te="" apical="" localization="" of="" camsap3="" was="" absent="" in="" camsap3dc/dc="" cells.="" see="" also="" figure="">

এমনকি কার্যকরী CAMSAP3 এর অনুপস্থিতিতেও, যা ব্যাখ্যা করতে পারে কেন এই কোষগুলি কোন সাইটোলজিকাল অস্বাভাবিকতা দেখায়নি। এছাড়াও, ক্যামসাপ3-নাল কিডনি এপিথেলিয়াল কোষগুলিও অনুরূপ মাইক্রোটিউবুলের ত্রুটি দেখায় তবে শুধুমাত্র সিস্টিক কোষগুলিতে (পরিপূরক চিত্র S2d)। সম্মিলিতভাবে, এই ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে CAMSAP3 শুধুমাত্র কিডনি এপিথেলিয়াল কোষগুলির উপ-জনসংখ্যার জন্য মাইক্রোটিউবুলসের অ্যাপিকো-বেসাল সংস্থা বজায় রাখতে ভূমিকা পালন করে।

Camsap3dc/dc PCT-এ বর্ধিত কোষের বিস্তার। কিডনিতে সিস্ট গঠন বর্ধিত রেনাল কোষের বিস্তারের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত। Camsap3dc/dc কিডনিতে কোষের বিস্তার পরিবর্তিত হয়েছে কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য, আমরা মেগালিন এবং কি-67, কোষের বিস্তারের জন্য চিহ্নিতকারীর জন্য সহ-ইমিউনোস্টেইনিং দ্বারা WT এবং মিউট্যান্ট কিডনির মধ্যে PCT কোষের বিস্তারের তুলনা করি। কি-67–পজিটিভ কোষগুলি খুব কমই ডব্লিউটি কিডনির PCT-তে পরিলক্ষিত হয়েছিল, যেখানে তারা Camsap3dc/dc কিডনির PCT কোষগুলিতে সহজেই স্পষ্ট ছিল। যাইহোক, কি-67 নন-প্রসারিত এবং প্রসারিত উভয় টিউবুলে সনাক্ত করা হয়েছিল (চিত্র 4a,b), কোষের বিস্তার এবং সিস্ট গঠনের মধ্যে কোনো সম্পর্ক নেই। Tus, CAMSAP3কর্মহীনতাকোষের বিস্তারকে উন্নীত করে, কিন্তু এই প্রক্রিয়াটি সবসময় সিস্ট গঠনের সাথে যুক্ত ছিল না।

YAP এবং নন-পেশী মায়োসিনের স্থানীয়করণে পরিবর্তনগুলি কোষের বিকৃতির সাথে যুক্ত। YAP হল একটি ট্রান্সক্রিপশনাল অ্যাক্টিভেটর যা কোষের বিস্তার নিয়ন্ত্রণ করে 35 সেইসাথে যান্ত্রিক টান-নির্ভর কোষের আকার 36। YAP সক্রিয় করা হয় তার নিউক্লিয়ার লোকালাইজেশনের সাথে Pkd1-এর ঘাটতিপূর্ণ ইঁদুরের কিডনিতে, PKD37-এর একটি মডেল, এবং ইয়াপ অ্যাক্টিভেশন কিডনিতে কোষের বিস্তার এবং টিউবুলার প্রসারণকে উৎসাহিত করে। তাই আমরা পরীক্ষা করেছি যে ক্যামসাপ 3 ডিসি/ডিসি কিডনির PCT তেও YAP সক্রিয় করা হয়েছিল। YAP-এর জন্য ইমিউনোস্টেইনিং WT কিডনির PCT-তে সাইটোপ্লাজমিক স্থানীয়করণ প্রকাশ করেছে। লক্ষণীয়ভাবে, YAP Camsap3dc/dc PCT-এর নিউক্লিয়াসে ঘনীভূত হয়েছিল, কিন্তু শুধুমাত্র তাদের প্রসারিত অংশে (চিত্র 5a), যেমন কোয়ান্টিফিকেশন (চিত্র 5b) দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছে, পরামর্শ দেয় যে পর্যবেক্ষণ করা YAP পুনঃবন্টন কোষের পরিবর্তনের প্রতিক্রিয়ায় ঘটেছে। CAMSAP3 এর পরিবর্তে রূপবিদ্যাকর্মহীনতাপ্রতি

YAP হল হিপ্পো পথের একটি ডাউনস্ট্রীম ইফেক্টর, যা যান্ত্রিক সংকেত দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়38। প্রকৃতপক্ষে, Camsap3dc/dc কিডনিতে সিস্টিক কোষগুলি প্রসারিত দেখা যায়, যা পরামর্শ দেয় যে তারা বর্ধিত উত্তেজনার সংস্পর্শে এসেছে।

চিত্র 4. Camsap3dc/dc PCT-তে কোষের বিস্তার। (a) WT-তে Ki-67, Megalin, এবং DAPI এবং P22-এ Camsap3dc/dc কিডনির জন্য ইমিউনোস্টেইনিং। তীরচিহ্নগুলি সিস্টিক টিউবুলে কি-67–পজিটিভ কোষ নির্দেশ করে। (b) PCT এপিথেলিয়াল কোষের মধ্যে Ki-67–ধনাত্মক কোষের শতাংশ [ প্লাস / প্লাস , n=700 কোষ; dc/dc (প্রসারিত), n=224 কোষ; dc/dc (অ-প্রসারিত), n=396 কোষ]। ত্রুটি বার SD *p নির্দেশ করে<0.05,>

তাই আমরা তদন্ত করেছি যে সিস্ট গঠনের সাথে কনসার্টে কোন যান্ত্রিক পরিবর্তন ঘটেছে কিনা। যেহেতু অ-পেশী মায়োসিন II অ্যাক্টিভেশন একটি উত্তেজনা-সংবেদনশীল প্রক্রিয়া39, আমরা মায়োসিন লাইট চেইন 2 (MLC2) এর বিতরণ মূল্যায়ন করেছি, যা কিডনিতে মায়োসিন II সক্রিয়করণের সাথে জড়িত। যদিও MLC2 ডাব্লুটি টিউবুল কোষে সাইটোপ্লাজমে ছড়িয়ে পড়ে, এটি ক্যামসাপ3ডিসি/ডিসি কিডনিতে (চিত্র 5c অ্যারোহেড) সিস্টিক কোষের এপিকাল অংশের কাছে ঘনীভূত হয়, যা পরামর্শ দেয় যে এই কোষগুলি প্রসার্য বলের শিকার হয়েছিল। নন-ডাইলেটেড পিসিটিতে কোষগুলি এই জাতীয় এমসিএল 2 ঘনত্ব দেখায়নি। Tese fndings এই ধারণা অনুসারে ছিল যে YAP যখন কোষগুলি যান্ত্রিকভাবে প্রসারিত হয় 40,41 তখন নিউক্লিয়াসে প্রবেশ করে।

Camsap3dc/dc PCT-এ PIEZO1 বিতরণে পরিবর্তন। সিস্টিক কোষগুলি প্রসারিত শক্তির সংস্পর্শে এসেছে কিনা তা আরও পরীক্ষা করার জন্য, আমরা PIEZO1 এর সাবসেলুলার ডিস্ট্রিবিউশন পরীক্ষা করেছি, একটি যান্ত্রিক সংবেদনশীল আয়ন চ্যানেল 42–45, কারণ এটি যান্ত্রিক প্রসারণের জন্য একটি সাধারণ চিহ্নিতকারী; PIEZO1 স্থানীয়করণ প্লাজমা মেমব্রেন/সাইটোপ্লাজম থেকে পারমাণবিক খামে স্থানান্তরিত হয় যখন এটি প্রসারিত সংকেতগুলি অনুভব করে46। PIEZO1-এর জন্য ইমিউনোস্টেইনিং দেখায় যে PIEZO1 বেশিরভাগ WT PCT কোষের সাইটোপ্লাজমে স্থানীয়করণ করে, যেখানে এর স্থানীয়করণ Camsap3dc/dc PCTs (চিত্র 6a) এর সিস্টিক কোষের নিউক্লিয়াসের সাথে ওভারল্যাপ করে। অনুক্রমিক বিভাগে YAP এবং PIEZO1-এর জন্য ইমিউনোস্টেইনিং এও পরামর্শ দেয় যে তাদের পারমাণবিক স্থানীয়করণ প্রসারিত PCT-এর সাথে মিলে যায় (পরিপূরক চিত্র S4, তীরচিহ্ন)। অন্যদিকে, নন-ডাইলেটেড Camsap3dc/dc PCT-এ, PIEZO1 বিতরণ সাইটোপ্লাজমিক দেখায় (চিত্র 6a)। যাইহোক, ইমিউনোফিউরোসেন্স ইমেজের পাশাপাশি কোয়ান্টিফিকেশনের ঘনিষ্ঠ পর্যবেক্ষণগুলি নির্দেশ করে যে এর পারমাণবিক স্থানীয়করণ WT কোষের (চিত্র 6a,b) তুলনায় কিছুটা বৃদ্ধির প্রবণতা ছিল। তাই, YAP-এর বিপরীতে, মনে হচ্ছে Camsap3dc/dc PCT-তে কোষগুলির সনাক্তযোগ্য বিকৃতির আগে PIEZO1 সক্রিয় হতে শুরু করে।

আলোচনা

এই গবেষণায়, আমরা দেখেছি যে CAMSAP3 মিউটেশন বা এর ক্ষতির ফলে PCT কোষগুলি প্রসারিত হয়েছে, যার ফলে টিউবুলের ক্রস-সেকশনগুলি সিস্টিক চেহারা নিয়েছে। সিস্টোজেনেসিসের একটি চিহ্ন ইতিমধ্যেই E17.5 এর প্রথম দিকে পরিলক্ষিত হয়েছিল, বার্ধক্যের সময় ধীরে ধীরে প্রসারণ বৃদ্ধি এবং বোম্যানের ক্যাপসুলে এর শেষ সম্প্রসারণ। প্রসারিত অঞ্চলের এপিথেলিয়াল কোষগুলি পাতলা হয়ে ওঠে, বিভিন্ন সাইটোলজিকাল ত্রুটি প্রদর্শন করে, যেমন Camsap3dc/dc ইঁদুরের ছোট অন্ত্রের কোষগুলিতে দেখা যায় 10,12৷ মাইটোকন্ড্রিয়া অ্যালাইনমেন্ট এবং বেসাল প্লাজমা মেমব্রেন প্যাটার্নিং সহ কিছু কিডনি-নির্দিষ্ট ত্রুটিও পরিলক্ষিত হয়েছে। টেস পরিবর্তনগুলি মাইক্রোটিউবিউলগুলির বিন্যাসের বিশৃঙ্খলার সাথে মিলে যায়, পরামর্শ দেয় যে CAMSAP3-মধ্যস্থ মাইক্রোটিউবুল নেটওয়ার্কগুলি PCT কোষে এই উপকোষীয় কাঠামোর স্বাভাবিক সংগঠনের জন্য দায়ী, যেমনটি অন্যান্য কোষের প্রকারে পাওয়া যায়। অন্যদিকে, যদিও CAMSAP3 সমস্ত রেনাল টিউবিউল এপিথেলিয়াল কোষে প্রকাশ করা হয়েছে বলে মনে হয়েছিল, তবে CAMSAP3-এর অনুপস্থিতিতে মাইক্রোটিউবুল নেটওয়ার্কগুলি বজায় রাখার জন্য একটি অপ্রয়োজনীয় প্রক্রিয়া(গুলি) এর অস্তিত্বের পরামর্শ দিয়ে শুধুমাত্র PCT-তে পরিলক্ষিত হয়েছিল। এটা সম্ভব যে CAMSAP3 ব্যতীত অন্যান্য অণু, যেমন অন্যান্য CAMSAP, এই কোষগুলিতে মাইক্রোটিউবুল নেটওয়ার্কগুলির অখণ্ডতা বজায় রাখতে অংশগ্রহণ করতে পারে। পিসিটি কোষের অন্যান্য টিউবুল কোষের তুলনায় অপেক্ষাকৃত কম মাইক্রোটিউবুলের ঘনত্ব ছিল। এটি সম্ভবত কোষের বিকৃতিকে সহজতর করেছে, কারণ মাইক্রোটিউবিউল নেটওয়ার্কগুলি যা CAMSAP3 ক্ষতি থেকে দূরে থাকবে তা বজায় রাখার জন্য অপর্যাপ্ত হতে পারে।

সঠিক সেল আর্কিটেকচার। এমনকি পিসিটি কোষেও, তবে, এমন পদ্ধতি বিদ্যমান বলে মনে হয় যা CAMSAP3 এর ক্ষতির জন্য ক্ষতিপূরণ দেয়, কারণ PCT-এর প্রসারণ সমানভাবে ঘটেনি।

চিত্র 5. কোষের বিকৃতির সাথে যুক্ত YAP এবং অ-পেশী মায়োসিনের স্থানীয়করণ। (a) WT-তে YAP, Megalin এবং DAPI এবং P22-এ Camsap3dc/dc কিডনির জন্য ইমিউনোস্টেইনিং। DAPI এবং YAP-এর ফ্লুরোসেন্স সংকেতগুলি বর্ধিত চিত্রগুলিতে আঁকা লাইন বরাবর স্ক্যান করা হয়েছিল এবং ফুরোসেন্স তীব্রতার স্থানিক পরিবর্তনগুলি DAPI-এর জন্য নীল এবং YAP-এর জন্য সবুজে দেখানো হয়েছে। ড্যাশড লাইনগুলি নিউক্লিয়াসের আনুমানিক এলাকা নির্দেশ করে। তীরচিহ্নগুলি প্রতিনিধি কোষে নিউক্লিয়াসের অবস্থান নির্দেশ করে। (b) নিউক্লিয়ার YAP তীব্রতা থেকে সাইটোপ্লাজমিক YAP তীব্রতার অনুপাত [ প্লাস / প্লাস , n=81 কোষ; dc/dc (প্রসারিত), n =43 কোষ; dc/dc (অ-প্রসারিত), n=53 কোষ]। বক্স প্লট প্রথম চতুর্থ, মধ্য এবং তৃতীয় চতুর্থিক মান নির্দেশ করে। *** পি<0.001, t-test.="" (b)="" immunostaining="" for="" mlc2,="" actin,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p22.="" arrowheads="" indicate="" apical="" accumulation="" of="" mlc2="" in="" cystic="">

চিত্র 6. Camsap3dc/dc PCT-এ PIEZO1 বিতরণে পরিবর্তন। (a) WT-তে PIEZO1, Megalin এবং DAPI এবং P22-এ Camsap3dc/dc কিডনির জন্য ইমিউনোস্টেইনিং। DAPI এবং PIEZO1 এর ফ্লুরোসেন্স সংকেতগুলি বর্ধিত চিত্রগুলিতে আঁকা লাইন বরাবর স্ক্যান করা হয়েছিল এবং ফিউরোসেন্স তীব্রতার স্থানিক পরিবর্তনগুলি DAPI-এর জন্য নীল এবং PIEZO1-এর জন্য সবুজে দেখানো হয়েছে। ড্যাশড লাইনগুলি নিউক্লিয়াসের আনুমানিক এলাকা নির্দেশ করে। তীরচিহ্নগুলি প্রতিনিধি কোষে নিউক্লিয়াসের অবস্থান নির্দেশ করে। (b) সাইটোপ্লাজমিক পাইজো১ তীব্রতার সাথে নিউক্লিয়ার পাইজো১ তীব্রতার অনুপাত [ প্লাস / প্লাস , n=66 কোষ; dc/dc (প্রসারিত), n =44 কোষ; dc/dc (অ-প্রসারিত), n=81 কোষ]। বক্স প্লট প্রথম চতুর্থ, মধ্য এবং তৃতীয় চতুর্থিক মান নির্দেশ করে। *** পি<0.001, **p=""><0.01, t-test.="" see="" also="" figure="">

তাহলে, পিসিটিগুলি কীভাবে আঞ্চলিক পদ্ধতিতে প্রসারিত হয়েছিল, এপিথেলিয়াল-সেল ফ্যাটেনিং সহ? উল্লেখযোগ্যভাবে, সিস্ট গঠন E17.5 এ সনাক্তযোগ্য হয়ে ওঠে এবং এই সময়টি ইঁদুরের আদিম প্রস্রাব উত্পাদন শুরুর সাথে সম্পর্কযুক্ত। তাই, আমরা অনুমান করতে পারি যে 'প্রস্রাব ফাউ' একটি সম্ভাব্য যান্ত্রিক ফ্যাক্টর যা রেনাল টিউবুলের প্রসারণকে প্ররোচিত করে। এটা সম্ভব যে পিসিটি কোষগুলি যেগুলি CAMSAP3-মধ্যস্থ মাইক্রোটিউবুল সাইটোস্কেলটন হারিয়েছিল তারা যান্ত্রিকভাবে বাহ্যিক শক্তির জন্য বেশি সংবেদনশীল ছিল, অর্থাৎ, WT PCT কোষের তুলনায় আরও বিকৃত হয়। কিন্তু, রেনাল টিউবুলে প্রস্রাব দ্বারা উত্পাদিত বলগুলি নলকার প্রসারণ ঘটাতে পারে, তাদের মোটাতাজাকরণ নিয়ে আসে। এই ধরনের বাহিনী অভিন্ন নাও হতে পারে, যার ফলে PCTs বরাবর প্রসারণের পরিবর্তনশীল ডিগ্রী হতে পারে। এই ধারণা, বলা বাহুল্য, PCT প্রসারণের জন্য অন্যান্য সম্ভাব্য প্রক্রিয়াগুলিকে বাদ দেয় না।

আমাদের পর্যবেক্ষণগুলি দেখিয়েছে যে PIEZO1 কে Camsap3dc/dc কিডনির প্রসারিত পিসিটি কোষগুলিতে সাইটোপ্লাজম থেকে পারমাণবিক অঞ্চলে স্থানান্তরিত করা হয়েছে, পরামর্শ দেয় যে এই মেকানোসেন্সরটি কোষের বিকৃতির প্রতিক্রিয়া হিসাবে সক্রিয় হয়েছিল, সম্ভবত পূর্বে রিপোর্ট করা হিসাবে কোষগুলির 'প্রসারিত'। প্রসারিত পিসিটি কোষগুলির প্রসারিত অবস্থা পর্যবেক্ষণের দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল যে তাদের কর্টিকাল অঞ্চলে MLC2 বৃদ্ধি পেয়েছে। আমাদের বিশ্লেষণে আরও ইঙ্গিত করা হয়েছে যে PIEZO1 ইতিমধ্যেই কিছু পরিমাণে অ-প্রসারিত পিসিটি কোষগুলিতে সক্রিয় ছিল, এটি পরামর্শ দেয় যে এমনকি এই কোষগুলি তাদের স্বাভাবিক চেহারা সত্ত্বেও যান্ত্রিক পরিবর্তনের মধ্য দিয়ে যাচ্ছিল। আরেকটি মেকানোসেন্সর, YAP, PCT কোষেও সক্রিয় করা হয়েছিল, কিন্তু এটির সক্রিয়করণ শুধুমাত্র প্রসারিত কোষে ঘটতে দেখা গেছে।

তাহলে, কিভাবে এই যান্ত্রিক সংবেদনশীল নিয়ন্ত্রকগুলি কোষের বিকৃতিতে অবদান রাখে, সেইসাথে কোষের বিস্তার যা CAMSAP3 এর অনুপস্থিতিতে প্রচারিত হয়েছিল? এটি দেখানো হয়েছে যে PIEZO1 এর প্রসারিত-প্ররোচিত সক্রিয়করণ এপিথেলিয়াল কোষে কোষের বিস্তারকে উৎসাহিত করে 46, পরামর্শ দেয় যে এই প্রক্রিয়াটি Camsap3dc/dc কিডনির PCT কোষেও কাজ করে। টিআইএস ধারণাটি আমাদের পর্যবেক্ষণের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যে বর্ধিত কোষের বিস্তার এবং আংশিক PIEZO1 অ্যাক্টিভেশন একসাথে ঘটেছে, এমনকি Camsap3dc/dc PCT-এর অ-প্রসারিত কোষগুলিতেও। YAP সম্পর্কিত, এর সক্রিয়করণ বিলম্বিত হয়েছিল, কোষের বিস্তার বৃদ্ধির সূত্রপাতের সাথে একটি স্পষ্ট সম্পর্ক দেখায়নি। YAP শুধুমাত্র কোষের বৃদ্ধির ফ্যাক্টর হিসেবেই নয় বরং যান্ত্রিক হোমিওস্টেসিসের নিয়ন্ত্রক হিসেবেও পরিচিত, যেমনটি পূর্বে প্রদর্শিত হয়েছে ৩৬,৪৮। তাই এটা সম্ভব যে YAP, যা PCT কোষের বিকৃতির সাথে নিউক্লিয়াসে স্থানান্তরিত হয়েছিল, তাদের আকৃতি নিয়ন্ত্রণ করতে কাজ করতে পারে, অর্থাৎ, এই কোষগুলির ক্ষতিগ্রস্থ আকৃতি পুনরুদ্ধার করতে। অন্যথায়, YAP প্রসারিত কোষের বিস্তার বৃদ্ধিতে PIEZO1-এর সাথে সহযোগিতা করতে পারে, কারণ YAP কোষের বিস্তার বৃদ্ধির মাধ্যমে পলিসিস্টিক কিডনি গঠনে জড়িত বলে পরিচিত।

আমরা দেখেছি যে Camsap3dc/dc ইঁদুরের রক্তে K plus এবং Mg2 plus এর মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে কম ছিল, যা পরামর্শ দেয় যে তাদের কিডনি কিছু অস্বাভাবিক কার্যকারিতা থেকে ক্ষতিগ্রস্ত হতে পারে। গুরুতর সাইটোলজিকাল ত্রুটিগুলি যা আমরা পিসিটি কোষের এপিকাল এবং বেসাল প্লাজমা ঝিল্লিতে দেখেছি, যেখানে সক্রিয় পরিবহন যন্ত্রপাতি অবস্থিত, এই অস্বাভাবিকতার সাথে সম্পর্কিত হতে পারে। যাইহোক, আমরা এই সম্ভাবনাকে বাদ দিতে পারি না যে রেনাল টিউবুলের অন্যান্য অংশ বা অন্যান্য অঙ্গগুলিও কার্যকরীভাবে ত্রুটিযুক্ত হতে পারে, এই ফেনোটাইপকে প্ররোচিত করে। উপরন্তু, আমরা এমন কোনো প্রমাণ পাইনি যে গ্লোমেরুলাসের ফ্লটারিং ফাংশনগুলি ক্ষতিগ্রস্ত হয়েছিল, কারণ ক্রিয়েটিনিন এবং ইউরিয়া নাইট্রোজেনের রক্তের মাত্রা, যা গ্লোমেরুলাসের মাধ্যমে নির্গত হয়, স্বাভাবিক ছিল।

প্রাথমিক সিলিয়াম বায়োজেনেসিসের ব্যাঘাত PKD24-27 এর দিকে পরিচালিত করে। Camsap3 মিউটেশনের ক্ষেত্রে, প্রাথমিক সিলিয়ার গঠন অপ্রতিরোধ্য বলে মনে হয়। সাম্প্রতিক একটি সমীক্ষায় দেখা গেছে যে নাকের মাল্টি-সিলিয়েটেড এপিথেলিয়াল কোষে CAMSAP3 এর ক্ষতি অ্যাক্সোনিমের কেন্দ্রীয় জোড়া মাইক্রোটিউবুলের গঠনকে প্রভাবিত করে, যার ফলে গতিশীল সিলিয়া 49-এ অস্বাভাবিক গতিশীলতা ঘটে। যদিও এপিথেলিয়াল কোষের প্রাথমিক সিলিয়া নন-মোটাইল এবং মাইক্রোটিউবুলের কেন্দ্রীয় জোড়ার অভাব রয়েছে 50, তবে এটি অনিশ্চিত রয়ে গেছে যে Camsap3 মিউট্যান্ট ইঁদুরের প্রাথমিক সিলিয়া এখনও কার্যকর কিনা। এই অনিশ্চয়তা সত্ত্বেও, PKD এবং Camsap3 মিউট্যান্টের অস্বাভাবিকতাগুলি বেশ আলাদা, কারণ পূর্বে পুরো কিডনিতে সিস্ট গঠন একইভাবে ঘটে, যেখানে এটি পরবর্তীতে একটি স্থানীয় ঘটনা। টিস পার্থক্য সম্ভবত তাদের মধ্যে সিস্ট গঠনের স্বতন্ত্র আণবিক পটভূমির জন্য দায়ী।

সংক্ষেপে, আমাদের অধ্যয়নটি প্রকাশ করে যে CAMSAP3 প্রক্সিমাল অঞ্চলে রেনাল টিউবুলের গঠন এবং কার্যকারিতা বজায় রাখার জন্য গুরুত্বপূর্ণ, সম্ভবত নন-সেন্ট্রোসোমাল মাইক্রোটিউবুল সমাবেশের নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে। এই মাইক্রোটিউবিউল অর্গানাইজেশন সিস্টেমের ক্ষতি কীভাবে কিডনির শারীরবৃত্তীয় ক্রিয়াকলাপে হস্তক্ষেপ করে তা পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে বোঝার জন্য আরও গবেষণার প্রয়োজন হবে।

উপকরণ এবং পদ্ধতিসমূহ

সমস্ত পরীক্ষা-নিরীক্ষা প্রাসঙ্গিক নির্দেশিকা, প্রবিধান অনুসারে সম্পাদিত হয়েছিল এবং RIKEN সেন্টার ফর বায়োসিস্টেম ডায়নামিক্স রিসার্চ এবং/অথবা ওয়াসেদা ইউনিভার্সিটির ইনস্টিটিউশনাল বায়োসেফটি কমিটি দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল।

ইঁদুর। এই গবেষণায় ব্যবহৃত Camsap3 মিউট্যান্ট (Camsap3dc/dc) ইঁদুরগুলি আমাদের পূর্ববর্তী অধ্যয়ন 10 এ তৈরি করা হয়েছিল (অ্যাক্সেস- সিন নম্বর CDB0716K; http://www2.clst.riken.jp/arg/mutant শতাংশ 20mice শতাংশ 20list.html)। সেই ইঁদুরগুলিতে, ক্যামসাপ 3-এর সি-টার্মিনাল অঞ্চল, যেমন এক্সন 14-17, সরানো হয়েছিল, এবং আমরা পূর্বে নিশ্চিত করেছি যে মাউস কোষগুলি একটি অ-কার্যকর সি-টার্মিনাল ট্রাঙ্কেটেড CAMSAP3 (CAMSAP3-dc)10 প্রকাশ করে। বর্তমান গবেষণায়, N4 এবং 5 প্রজন্মের ইঁদুর পরীক্ষায় ব্যবহার করা হয়েছিল।

Camsap3 নকআউট (Camsap3–/–) ইঁদুর (অ্যাক্সেশন নং. CDB0033E), যার পুরো 22-kb Camsap3 কোডিং অঞ্চলের অভাব ছিল, CRISPR/Cas9-মধ্যস্থ জিনোম সম্পাদনা জাইগোট ইলেক্ট্রোপোরেশন 51 এর মাধ্যমে তৈরি করা হয়েছিল৷ সংক্ষেপে, দুটি গাইড RNA এবং একটি একক-স্ট্র্যান্ড অলিগোডিঅক্সিনিউক্লিওটাইড (ssODN) ডিজাইন করা হয়েছিল 22-kb অঞ্চল মুছে ফেলার জন্য, এবং মিউট্যান্ট ইঁদুরের সফল সন্নিবেশের স্বীকৃতির উদ্দেশ্যে একটি EcoRI সাইট যুক্ত করা হয়েছিল। ইলেক্ট্রোপোরেশনের জন্য, cRNAs, tracrRNA, ssODN এবং Cas9 প্রোটিন C57BL/6 জাইগোটে প্রবর্তন করা হয়েছিল। ইলেক্ট্রোপোরেশনের পরে, জাইগোটগুলি সিউডোপ্রেগন্যান্ট আইসিআর মহিলা ইঁদুরগুলিতে স্থানান্তরিত হয়েছিল এবং প্রতিষ্ঠাতা ইঁদুরগুলি পিসিআর এবং ডিএনএ সিকোয়েন্সিং দ্বারা স্ক্রীন করা হয়েছিল। ট্রি নকআউট মাউস (#4, #10, #23) প্রাপ্ত হয়েছিল এবং তাদের মধ্যে একটির (#23) ডিজাইন করা ইকোআরআই নক-ইন অ্যালিল ছিল। গাইড RNA ক্রমগুলি CRISPRdirect (https://crispr.dbcls.jp) দ্বারা ডিজাইন করা হয়েছিল। জিনোম সম্পাদনার জন্য ব্যবহৃত Te crRNAs, tracrRNA, এবং ssODN ক্রমগুলি নিম্নরূপ সংশ্লেষিত হয়েছিল: 5′-cRNA, 5′-UGA UCC CAC ACA UAU GCA GGg uuu uag agc uau gcu guu uug{{22}′-RNAc, , 5′-CAGCCACCUCUGAUC UGACCguuuuaagagcuaugcuguuuug-3′; tracrRNA, 5′-AAACAGCAUAGCAAGUAAAAUAAGGCUAGUCC

GUUAUCAACUUGAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU-3′; ssODN, 5′-TAGAACTTACTGTATAGTAAT

AGCCACAAACTCCATGCATATGTGAACTCCACCTGAATTCACCTGGCAAGAGATTCCAGACCAG

CTCTCCTCTCCTGGGCCTCCCACCCCCACAT-3′ । Te বড় হাতের এবং ছোট হাতের অক্ষরগুলি যথাক্রমে কোডিং এবং সহায়ক ক্রম নির্দেশ করে। Te মাউস #23 লাইন C57BL/6 দিয়ে তিনবার অতিক্রম করা হয়েছিল এবং N3 প্রজন্মের ইঁদুরগুলি পরীক্ষায় ব্যবহার করা হয়েছিল।

ইঁদুর ব্যবহার করে পরীক্ষাগুলি RIKEN সেন্টার ফর বায়োসিস্টেম ডায়নামিক্স রিসার্চ বা ওয়াসেদা ইউনিভার্সিটির ইনস্টিটিউশনাল অ্যানিমাল কেয়ার অ্যান্ড ইউজ কমিটি দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল এবং সেই কমিটিগুলির দ্বারা প্রদত্ত প্রোটোকল অনুসারে সম্পাদিত হয়েছিল। আপনার অধ্যয়নটি ARRIVE নির্দেশিকা মেনে করা হয়েছিল: https://arriveguidelines.org৷

জিনোটাইপিং। ইঁদুরের জন্য জিনোটাইপিং পিসিআর দ্বারা সঞ্চালিত হয়েছিল। Camsap3dc/dc ইঁদুরের জন্য, আমরা Toya et al-এ বর্ণিত প্রাইমার ব্যবহার করেছি। (2016)। Camsap3–/– ইঁদুরের জন্য, আমরা বন্য-টাইপ (WT) (P1/P2, 411 bp) বা Camsap3–/– (P1/P3, 614 bp) অ্যালিল (পরিপূরক চিত্র S2a,b) সনাক্ত করতে নিম্নলিখিত প্রাইমারগুলি ব্যবহার করেছি। : P1, 5′- CATGTACCTACCACAC ATCC-3′; P2, 5′- GGACCCTGGAGAGGCTTAG-3′; P3, 5′- GCAAGGCTGTAGTGAGCC-3′ । ডব্লিউটি-তে Te P1/P3 অঞ্চল ব্যবহৃত পিসিআর অবস্থার অধীনে প্রশস্ত করা হয়নি।

হিস্টোলজি: হিমায়িত টিস্যু বিভাগের প্রস্তুতি। ছিন্ন কিডনি টিস্যু 2 শতাংশ প্যারাফর্ম-অ্যালডিহাইড (টার্মো ফিশার) / 0.1 এম সরবিটল (নাকালাই টেস্ক) / পিইএম বাফারে 1 ঘন্টার জন্য ঘরের তাপমাত্রায় fx করা হয়েছিল। PEM-এর রেসিপি হল: 100 mM PIPES (Nacalai Tesque), 5 mM EGTA (Nacalai Tesque), এবং 5 mM MgCl2 (Wako), 2 M KOH এর সাথে pH 6.9-এ সামঞ্জস্য করা হয়েছে। Fxation এর পরে, কিডনি টিস্যু 10 মিনিটের জন্য PEM দিয়ে তিনবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। দশ, সুক্রোজ/পিইএম দিয়ে ক্রায়োপ্রোটেকশন করা হয়েছিল: পিইএম দ্রবণে 15 শতাংশ সুক্রোজ 4 ডিগ্রিতে 2 ঘন্টার জন্য, তারপরে 4 ডিগ্রিতে রাতারাতি পিইএম দ্রবণে 20 শতাংশ সুক্রোজ এবং 2 ঘন্টার জন্য পিইএম দ্রবণে 30 শতাংশ সুক্রোজ দিয়ে প্রতিস্থাপন করা হয়েছিল। 4 ডিগ্রিতে। Te কিডনি টিস্যু OCT যৌগে একটি এমবেডিং ছাঁচে (Polysciences, Inc.) তরল নাইট্রোজেনে হিমায়িত করা হয়েছিল এবং −80 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়েছিল। হিমায়িত নমুনাগুলি একটি CM1850 Cryostat (Leica) দিয়ে 5 µm পুরুত্বে কাটা হয়েছিল। কাচের স্লাইডের অংশগুলি দাগ না হওয়া পর্যন্ত −80 ডিগ্রিতে রাখা হয়েছিল।

হিস্টোলজি: প্যারাফন এমবেডেড টিস্যু বিভাগের প্রস্তুতি। বিচ্ছিন্ন কিডনি টিস্যু সুপার ফিক্স দ্রবণে (কুরাবো) ঘরের তাপমাত্রায় 2 ঘন্টার জন্য fx করা হয়েছিল, তারপর রাতারাতি 4 ডিগ্রিতে স্থানান্তরিত হয়েছিল। প্রতিটি নমুনা ঘরের তাপমাত্রায় ক্রমবর্ধমান ঘনত্বের তিনটি জলীয় ইথানল দ্রবণের সংস্পর্শে এসেছিল: 30 শতাংশ ইথানল 3{{20}} মিনিটের জন্য দুবার, 50 শতাংশ ইথানল 3{ {35}} মিনিট, এবং শেষ পর্যন্ত 30 মিনিটের জন্য 70 শতাংশ ইথানল। প্রতিটি নমুনা একটি ASP300 টিস্যু প্রসেসর (Leica) দিয়ে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল। দশ, কিডনি টিস্যুর নমুনাগুলি প্যারাফন ওয়াক্স (সাকুরা ফাইন-টেক) এর সাথে একটি EG1160 (Leica) এর সাথে এম্বেড করা হয়েছিল এবং 4 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়েছিল। প্যারাফন-এম্বেড করা নমুনাগুলি একটি RV240 রোটারি মাইক্রোটোম (ইয়ামাতো কোহকি) দিয়ে 6 µm পুরুত্বে কাটা হয়েছিল। কাচের স্লাইডের অংশগুলি দাগ না হওয়া পর্যন্ত 4 ডিগ্রিতে রাখা হয়েছিল। ইমিউনোফুওরোসেন্ট স্টেনিং। হিমায়িত কিডনির অংশগুলি 0.1 শতাংশ ট্রাইটন এক্স-100 (নাকালাই টেস্ক) / পিইএম-এ 10 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় ডুবিয়ে রাখা হয়েছিল। দশ, ঘরের তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য 0.2 শতাংশ Triton X-100 / PEM প্রয়োগ করে নমুনাগুলিকে প্রবেশ করানো হয়েছিল৷ আবার, নমুনাগুলিকে ঘরের তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য 0.1 শতাংশ Triton X-100 / PEM-এ ডুবিয়ে রাখা হয়েছিল৷ এরপর, ঘরের তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য 3 শতাংশ বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন (BSA; Roche) / 0.1 শতাংশ Triton X-100 / PEM দিয়ে নমুনাগুলি ব্লক করা হয়েছিল, তারপরে 4 ডিগ্রিতে রাতারাতি প্রাথমিক অ্যান্টিবডি বিক্রিয়া হয়েছিল৷ প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলি 3 শতাংশ BSA / 0.1 শতাংশ Triton X-100 / PEM-এ পাতলা করা হয়েছিল। ইঁদুরে উত্থিত প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলির জন্য, 3 শতাংশ BSA / 0.1 শতাংশ Triton X-100 / PEM-এ ব্লক করার আগে MOM ব্লকিং রিএজেন্ট (ভেক্টর ল্যাবরেটরিজ) দিয়ে অতিরিক্ত ব্লক করা হয়েছিল। MOM ব্লকিং রিএজেন্ট 0.1 শতাংশ Triton X-100 / PEM-এ পাতলা করা হয়েছিল এবং ঘরের তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য নমুনাগুলিতে প্রয়োগ করা হয়েছিল। MOM চিকিত্সার পরে, নমুনাগুলি ঘরের তাপমাত্রায় 5, 10 এবং 15 মিনিটের জন্য তিনবার 0.1 শতাংশ Triton X-100 / PEM দিয়ে ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল। প্রাথমিক অ্যান্টিবডি প্রতিক্রিয়ার পরে, নমুনাগুলি 15 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় 0.1 শতাংশ Triton X-100 / PEM দিয়ে তিনবার ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল। অন্ধকারে ঘরের তাপমাত্রায় 2 ঘন্টার জন্য Te সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি প্রতিক্রিয়া চালানো হয়েছিল। সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলি 3 শতাংশ BSA / 0.1 শতাংশ Triton X-100 / PEM-এ পাতলা করা হয়েছিল। প্রতিক্রিয়ার পরে, নমুনাগুলি ঘরের তাপমাত্রায় 5, 10 এবং 15 মিনিটের জন্য তিনবার 0.1 শতাংশ Triton X-100 / PEM দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং VECTASHIELD মাউন্টিং মিডিয়াম (ভেক্টর ল্যাবরেটরি) দিয়ে সিল করা হয়েছিল। অ্যান্টিবডি এবং বিকারক। ডিএনএ DAPI দ্রবণ দিয়ে দাগযুক্ত ছিল (Dojindo, D523, 1:1000)। এফ-অ্যাক্টিনকে আলেক্সা ফ্লুর 594 ফ্যালোইডিন (টার্মো ফিশার, এ12381, 1:400) দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল। মাইক্রোটিউবুলগুলিকে মাউস অ্যান্টি- -টিউবুলিন-এফআইটিসি (DM1A; সিগমা অ্যালড্রিচ, F2168, 1:200) দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল। নিম্নলিখিত প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলি ব্যবহার করা হয়েছিল: ছাগল অ্যান্টি-মেগালিন (P-20; সান্তা ক্রুজ বায়োটেকনোলজি, sc-16478, 1:200), খরগোশ অ্যান্টি-NaCl সহ-পরিবহনকারী (MERCK, AB3533, 1:500) ), খরগোশ অ্যান্টি-অ্যাকোয়াপোরিন-2 (abcam, AB3274, 1:400), ছাগল অ্যান্টি-SGLT1 (M-19; সান্তা ক্রুজ বায়োটেকনোলজি, sc{101}}, 1:200) , খরগোশ অ্যান্টি-SGLT2 (নোভাস বায়োলজিক্যালস, NBP1-92384, 1:200), মাউস অ্যান্টি-ইজরিন (3C12; abcam, ab4069, 1:500), খরগোশ অ্যান্টি-জায়ান্টিন (কোভেন্স, PRB-114 C, 1:700), খরগোশ-বিরোধী aPKC (সান্তা ক্রুজ বায়োটেকনোলজি, sc{121}}, 1:400), ছাগল-বিরোধী DPP IV (R&D Systems, AF954, 1:100), মাউস অ্যান্টি-Na প্লাস /কে প্লাস -ATPase (abcam, ab7671, 1:100), মাউস অ্যান্টি-অ্যাসিটিলেটেড টিউবুলিন (সিগমা অ্যালড্রিচ, T6793, 1:200), খরগোশ অ্যান্টি-CAMSAP3 (Tanaka et al., 2012, 1:400), মাউস অ্যান্টি-টাইরোসিনেটেড টিউবুলিন (সিগমা অ্যালড্রিচ, T9028, 1:200), খরগোশ অ্যান্টি-কি-67 (SP6; abcam, ab16667, 1:250), খরগোশ অ্যান্টি-YAP (সেল সিগন্যালিং, #4912, 1:100) ), খরগোশ অ্যান্টি-মায়োসিন লাইট চেইন 2 (সেল সিগন্যালিং, #8505, 1:100), খরগোশ অ্যান্টি-পিজো 1 (নোভাস বায়োলজিক্যালস, এন BP1-78446, 1:100), র‍্যাট-এ-ক্যাডেরিন (52, 1:400), এবং খরগোশ অ্যান্টি-মারলিন (সিগমা অ্যালড্রিচ, HPA003097, 1:100)। নিম্নলিখিত সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলি ব্যবহার করা হয়েছিল: ডন-কি ডাইলাইট 594–কনজুগেটেড অ্যান্টি-গোট আইজিজি (জ্যাকসন, 1:500), ছাগল অ্যালেক্সা ফ্লুর 488/594–কঞ্জুগেটেড অ্যান্টি-র্যাবিট আইজিজি (টার্মো ফিশার, এ-11034, এ -11037, 1:500), ছাগল অ্যালেক্সা ফ্লুর 488/594–কঞ্জুগেটেড অ্যান্টি-মাউস IgG (Termo Fisher, A-11029, A-11032, 1:500), এবং ছাগল Alexa Fluor 488–সংযোজিত অ্যান্টি-ইঁদুর IgG (টার্মো ফিশার, A-11006,

1:400)। গবেষণায় ব্যবহৃত অ্যান্টি-YAP (সেল সিগন্যালিং, #4912) এবং অ্যান্টি-PIEZO1 (নোভাস বায়োলজিক্যালস, এনবিপি1-78446) অ্যান্টিবডিগুলির টে বাইন্ডিং স্পেসিফিসিটি পূর্ববর্তী কাজ দ্বারা যাচাই করা হয়েছিল 46,53। হেমাটোক্সিলিন এবং ইওসিন (H&E) দাগ। কিডনি বিভাগ সহ কাচের স্লাইডগুলি প্যারাফন প্রসারিত করার জন্য 30 মিনিটের জন্য 55 ডিগ্রি প্লেটে স্থাপন করা হয়েছিল। তারপরে নমুনাগুলিকে 15 মিনিটের জন্য দুবার জাইলিনের মধ্যে নিমজ্জিত করা হয়েছিল তারপরে 70-100 শতাংশ ইথানলের সিরিজে নিমজ্জিত করা হয়েছিল: 5 মিনিটের জন্য 100 শতাংশ ইথানল দুবার, 5 মিনিটের জন্য 90 শতাংশ ইথানল, 5 মিনিটের জন্য 80 শতাংশ ইথানল এবং 70 শতাংশ 5 মিনিটের জন্য ইথানল। 20 মিনিটের জন্য জলে এবং 1 মিনিটের জন্য পাতিত/ডিয়োনাইজড H2O (ddH2O) তে ধুলে, নমুনাগুলি 5 মিনিটের জন্য মায়ারের হেমাটোক্সিলিন দ্রবণে (ওয়াকো) দাগ দেওয়া হয়েছিল। নমুনাগুলি দুবার ddH2O তে ডুবানো হয়েছিল, তারপর 10 মিনিটের জন্য ddH2O দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। নমুনাগুলি আবার ddH2O তে ডুবানো হয়েছিল এবং তারপরে 2 মিনিটের জন্য ইওসিন দ্রবণে (মার্কে) দাগ দেওয়া হয়েছিল। ওয়াশআউটের জন্য, নমুনাগুলি 30 সেকেন্ডের জন্য ddH2O তে নিমজ্জিত করা হয়েছিল, তারপরে 70-100 শতাংশ ইথানল এবং জাইলিনের সিরিজে নিমজ্জিত করা হয়েছিল: 5 সেকেন্ডের জন্য 70 শতাংশ ইথানল, 5 সেকেন্ডের জন্য 80 শতাংশ ইথানল, 5 সেকেন্ডের জন্য 90 শতাংশ ইথানল, 100 শতাংশ ইথানল 5 সেকেন্ডের জন্য দুবার এবং জাইলিন 10 মিনিটের জন্য। অবশেষে, নমুনাগুলি গ্লিসারলে সিল করা হয়েছিল। মাইক্রোস্কোপি। চিত্রগুলি BZ-X710 অল-ইন-ওয়ান ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ (কিয়েন্স) বা LSM880 লেজার স্ক্যানিং কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ (জিস) দিয়ে অর্জিত হয়েছিল। BZ-X710 এর জন্য, নিকন CFI প্ল্যান Apo λ 2 × , 10 × , 40 × , 100 × এবং Nikon CFI প্ল্যান ফ্লুর 4 × ব্যবহার করা উদ্দেশ্যমূলক লেন্সগুলি। প্রাপ্ত চিত্রগুলি BZ-X বিশ্লেষক সফ্টওয়্যার দিয়ে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল। Te LSM880 একটি Axio Observer Z1 ইনভার্টেড মাইক্রোস্কোপের সাথে একটি প্ল্যান- অ্যাপোক্রোম্যাট 63 × /1.40 NA তেল নিমজ্জন উদ্দেশ্য লেন্স (Zeiss) দিয়ে সজ্জিত ছিল। ইমেজজে এবং অ্যাডোব ফটোশপ CC2019 ব্যবহার করে চিত্রগুলি প্রক্রিয়া করা এবং বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সিস্টিক সূচক বিশ্লেষণ। কিডনির অনুভূমিক অংশের H&E-দাগযুক্ত চিত্র ব্যবহার করে ইমেজজে দ্বারা সিস্টিক সূচক বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সিস্ট-ধারণকারী এলাকার পরিমাপ হিসাবে, প্রসারিত টিউবুলার লুমেনের পরিধি "ফ্রিহ্যান্ড সিলেকশন" ফাংশন ব্যবহার করে চিহ্নিত করা হয়েছিল এবং এর ক্ষেত্রফল "মেজার" ফাংশন দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল। টিস কাজ কিডনি বিভাগের মধ্যে সমস্ত সিস্টের জন্য সঞ্চালিত হয়েছিল এবং সিস্ট-ধারণকারী এলাকা নির্ধারণের জন্য সমস্ত সিস্টের অঞ্চলগুলি একসাথে যুক্ত করা হয়েছিল। আপনার মোট কিডনি এলাকা একই ভাবে পরিমাপ করা হয়েছিল। "ফ্রিহ্যান্ড সিলেকশন" ফাংশন ব্যবহার করে কিডনির বাইরের পরিধি সনাক্ত করা হয়েছিল এবং এর ক্ষেত্রফল মূল্যায়ন করা হয়েছিল। অবশেষে, আমরা মোট কিডনি এলাকা দ্বারা সিস্ট-ধারণকারী এলাকা ভাগ করে সিস্টিক সূচক গণনা করেছি।

প্রসারিত টিউবুল এবং অ-প্রসারিত টিউবুলের সংজ্ঞা। এই গবেষণায়, 500 µm2 এর চেয়ে বেশি বা সমান লুমেন ক্ষেত্রফলযুক্ত টিউবুলগুলিকে "প্রসারিত" হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছে, যেখানে একটি লুমেন ক্ষেত্রফল সহ<500 µm2="" have="" been="" defned="" as"non-dilated".="" when="" selecting="" a="" "dilated"="" tubule="" in="" camsap3dc/dc="" samples,="" we="" frst="" visually="" picked="" up="" a="" cyst="" that="" was="" not="" recognized="" in="" wt="" samples="" and="" then="" roughly="" measured="" its="" lumen="" area="" using="" imagej.="" if="" the="" value="" was="" ≧500="" µm2,="" it="" was="" regarded="" as="">

ইলেক্ট্রন অনুবীক্ষণ. ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপির জন্য, P21 পুরুষ ইঁদুর পরীক্ষা করা হয়েছিল। ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপি স্ক্যান করার জন্য নমুনাগুলি তাকাহাশি-ইওয়ানাগা 54 অনুসারে কিছু পরিবর্তনের সাথে প্রস্তুত করা হয়েছিল, নিম্নরূপ। ইঁদুরকে আইসোফিউরেন দিয়ে চেতনানাশক করা হয়েছিল এবং 0.1 এম ক্যাকোডিলেট বাফার, pH 7.4-এ 2 শতাংশ (w/vol) ফর্মালডিহাইড এবং 2.5 শতাংশ (vol/vol) glutaralde-hyde দিয়ে পারফিউজ করা হয়েছিল। প্রতিটি কিডনি কেটে ফেলা হয়েছিল এবং কিউব করে কাটা হয়েছিল যেগুলিকে রাতারাতি একই fxative-এ ডুবিয়ে রাখা হয়েছিল, এবং তারপর 0.1 M cacodylate বাফার দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। Te fxed নমুনাগুলি ডাইমিথাইল সালফক্সাইডের 30 শতাংশ জলীয় দ্রবণের মাধ্যমে 60 শতাংশ ডাইমিথাইল সালফক্সাইডে স্থানান্তরিত হয়েছিল, এবং তারপরে তরল N2-এ ভাঙা হয়েছিল। ভাঙ্গা নমুনাগুলিকে 0.1 এম ক্যাকোডিলেট বাফার দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং 60 ডিগ্রীতে 1{{30}}–20 মিনিটের জন্য 6 N NaOH এ রাখা হয়েছিল। NaOH দ্রবণে Afer maceration, প্রতিটি নমুনা 0.1 M cacodylate বাফার দিয়ে ধুয়ে 0.05 শতাংশ টুইন 20 এবং 1 শতাংশ OsO4 দিয়ে 2 ঘন্টার জন্য বরফের উপর 0.1 M cacodylate বাফার দিয়ে পোস্টফক্স করা হয়েছিল। পোস্টএফক্স করা নমুনাগুলি ছিল: (1) ddH2O দিয়ে ধুয়ে 1 শতাংশ জলীয় থায়োকারবোহাইড্রাইজাইডে 20 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় রাখা হয়, এবং (2) ddH2O দিয়ে ধুয়ে আবার 1 শতাংশ OsO4 তে 0.1 M cacodylate বাফারে 1 ঘন্টার জন্য কক্ষ তাপমাত্রায় পোস্টএফক্স করা হয়। . (1) এবং (2) ধাপগুলি পুনরাবৃত্তি করার পরে, নমুনাগুলি ddH2O দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং ঘরের তাপমাত্রায় রাতারাতি 0.5 শতাংশ ইউরানাইল অ্যাসিটেট দ্রবণ দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল। Te টিস্যু ব্লকগুলি ddH2O দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয় এবং ইথানলের গ্রেডেড সিরিজের মাধ্যমে ডিহাইড্রেট করা হয়, আইসোপেন্টাইল অ্যাসিটেটে স্থানান্তরিত করা হয় এবং তরল CO2 ব্যবহার করে ক্রিটিক্যাল পয়েন্ট-ড্রাই করা হয়। আপনার শুকনো নমুনাগুলিকে অসমিয়াম দিয়ে বাষ্পীভূত করা হয়েছিল এবং একটি JSM-5600এলভি স্ক্যানিং ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপ দিয়ে 10 কেভির ত্বরিত ভোল্টেজে পরীক্ষা করা হয়েছিল। ছবিগুলি অ্যাডোব ফটোশপের মাধ্যমে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল।

ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপির জন্য, ঘরের তাপমাত্রায় 0.1 M ক্যাকোডিলেট বাফারে 2 শতাংশ (w/vol) ফর্মালডিহাইড এবং 2.5 শতাংশ (vol/vol) গ্লুটারালডিহাইডে ছেদ করা কিডনির কিউবগুলি কমপক্ষে 2 ঘন্টার জন্য fx করা হয়েছিল। Te নমুনাগুলি 0.1 M cacodylate বাফার দিয়ে ধুয়ে {{10}}-এ 1 শতাংশ OsO4 দিয়ে পোস্টএফএক্স করা হয়েছিল। 2 ঘন্টার জন্য বরফের উপর 1 M ক্যাকোডিলেট বাফার। তারপরে নমুনাগুলি ddH2O দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং ঘরের তাপমাত্রায় 0.5 শতাংশ জলীয় ইউরানাইল অ্যাসিটেট দিয়ে রাতারাতি দাগ দেওয়া হয়েছিল। টি দাগযুক্ত নমুনাগুলি ইথানলের গ্রেডেড সিরিজ দিয়ে ডিহাইড্রেট করা হয়েছিল, প্রোপিলিন অক্সাইডে স্থানান্তরিত হয়েছিল এবং পলিবেড 812 (পলিসায়েন্স) এ এমবেড করা হয়েছিল। আল্ট্রাথিন অংশগুলি একটি হীরার ছুরি দিয়ে কাটা হয়েছিল, ইউরানাইল অ্যাসিটেট এবং সীসা সাইট্রেট দিয়ে ডাবল-দাগ করা হয়েছিল এবং চার্জ-কাপল্ড ডিভাইস ক্যামেরা দিয়ে সজ্জিত একটি ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপ (JEM-1010; JEOL) ব্যবহার করে 100 kV ত্বরিত ভোল্টেজে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল ( বায়োস্ক্যান মডেল 792; গাটান)। ছবিগুলি অ্যাডোব ফটোশপের মাধ্যমে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল।

প্রস্রাব পরীক্ষা এবং রক্ত ​​পরীক্ষা। Camsap3dc/dc ইঁদুরের সাথে তুলনা করার জন্য, WT ( প্লাস / প্লাস ) এবং হেটেরোজাইগাস ( প্লাস / ডিসি) ইঁদুরগুলি এই অ্যাসেগুলিতে নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। হেটেরোজাইগাস ইঁদুর ক্যামসাপ 3 এর কোন লক্ষণ দেখায় নাকর্মহীনতা10এবং মাইক্রোটিউবুলের অ্যাপিকো-বেসাল অ্যারে সংগঠিত করেছে। ইঁদুরের বয়স ছিল 56-60 সপ্তাহ।

ইঁদুরকে একটি বিপাকীয় খাঁচায় (টেকনিপ্লাস্ট) রাখা হয়েছিল। প্রস্রাবের নমুনা প্রতিদিন পাঁচ দিনের জন্য সংগ্রহ করা হয়েছিল, এবং সংগৃহীত নমুনাগুলি −80 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়েছিল। অবশেষে, প্রতিটি মাউসের জন্য সমস্ত fve নমুনা মিশ্রিত করা হয়েছিল যাতে fnal মিশ্রণটি সেই সময়ের মধ্যে প্রতিটি মাউসের গড় অবস্থাকে প্রতিফলিত করে।

রক্ত সংগ্রহের জন্য, ইঁদুর প্রতি গ্রাম শরীরের ওজনে {{0}}.02 মিলি অ্যানেস্থেসিয়া দিয়েছে। অ্যানেস্থেশিয়ার সংমিশ্রণ ছিল ডমিটর (জেনোএকিউ) 30 μL, মিডাজোলাম (স্যান্ডোজ) 80 μL, ভেটরফেল (মেইজি সিকা ফার্মা) 100 μL এবং 0.9 শতাংশ জলীয় NaCl থেকে 1 মিলি। কার্ডিয়াক পাংচার দ্বারা রক্ত ​​সংগ্রহ করা হয়েছিল। হিমোলাইসিস এড়াতে, সিরিঞ্জটি আলতো করে ঢোকানো হয়েছিল এবং বের করে আনা হয়েছিল। প্রতিটি রক্তের নমুনা জমাট বাঁধতে 1 ঘন্টার জন্য ঘরের তাপমাত্রায় রাখা হয়েছিল। প্রতিটি নমুনা তখন সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল (10,000×g, 25 ডিগ্রি, 15 মিনিট), এবং সিরাম সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং −80 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়েছিল। সমস্ত প্রস্রাব এবং রক্তের নমুনা ওরিয়েন্টাল ইস্ট কোং দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।