C57BL/6 ইঁদুরের NKCC2 এ পাঁচটি অ্যামিনো অ্যাসিড অপসারণ NKCC2 ফসফোরিলেশন বিশ্লেষণকে প্রভাবিত করে কিন্তু কিডনির কার্যকারিতাকে প্রভাবিত করে না
Feb 19, 2022
ভূমিকা
স্তন্যপায়ী প্রাণীর পুরু আরোহী অঙ্গ (TAL)কিডনিবহির্মুখী তরল পরিমাণ, ইউরি-নারী ঘনত্ব, ক্যালসিয়াম (Ca 2 প্লাস) এবং ম্যাগনেসিয়াম (Mg 2 প্লাস) হোমিওস্টেসিস, সেইসাথে pH ব্যালেন্স নিয়ন্ত্রণের জন্য অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ। 1 টিএএল-এর প্রধান Na প্লাস পরিবহন পথ হল Na plus - K plus - 2Cl − cotransporter (NKCC2), যা বিশেষভাবে লুপ-ডাইউরিটিক্স দ্বারা বাধাপ্রাপ্ত। 1 NKCC2 এর মাধ্যমে Na plus , K plus , এবং 2Cl − আয়নের কোট্রান্সপোর্ট ইলেক্ট্রোনিউট্রাল কিন্তু apical এর মাধ্যমে ইলেক্ট্রোজেনিক K প্লাস নিঃসরণ নির্ভর করে রেনালবাইরের মেডুলা কে প্লাস চ্যানেল ROMK। 2 ROMK-এর সাথে NKCC2-এর ইন্টারপ্লে একটি লুমেন-পজিটিভ ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল গ্রেডিয়েন্ট তৈরি করে, যা Na প্লাস পুনর্শোষণকে উন্নত করে এবং Ca 2 প্লাস এবং Mg 2 প্লাসের প্যারাসেলুলার ট্রান্সপোর্ট চালায়। 3 TAL এর জন্য NKCC2 এর তাৎপর্য এবংকিডনি ফাংশনবার্টার টাইপ I সিন্ড্রোম দ্বারা উদাহরণ দেওয়া হয়েছে, একটি জেনেটিক ব্যাধি যা NKCC2 এর কার্যকারিতা ক্ষতির কারণে সৃষ্ট হয়, যা গুরুতরভাবে প্রকাশ পায়রেনাললবণ এবং তরল অপচয়, হাইপোক্যালেমিক মেটাবলিক অ্যালকালোসিস এবং হাইপারক্যালসিউরিয়া। 3
NKCC2 হল মেমব্রেন ট্রান্সপোর্ট প্রোটিনের দ্রাবক বাহক পরিবার 12 (Slc12) এর সদস্য যাতে সর্বব্যাপী প্রকাশ করা NKCC1 এবং ডিস্টাল কনভোলুটেড টিউবিউল (DCT) নির্দিষ্ট Na plus - Cl − cotransporter (NCC) অন্তর্ভুক্ত থাকে। 2 NKCC2 এর কার্যকলাপ ইতিবাচকভাবে সাইটোপ্লাজমিক এন-টার্মিনাল টেইলে বেশ কয়েকটি সেরিন এবং থ্রোনাইন অবশিষ্টাংশে কোট্রান্সপোর্টারের ফসফোরিলেশনের সাথে সম্পর্কযুক্ত। 4 এই ফসফোরিলেশন সাইটগুলির আশেপাশের অ্যামিনো অ্যাসিডের ক্রমগুলি অত্যন্ত সংরক্ষিত এবং NKCC2, NKCC1 এবং NCC-এর মধ্যে উচ্চ মাত্রার মিল দেখায়। 2 NKCC2-এর ফসফোরিলেশন বিভিন্ন হরমোনাল এবং অ-হরমোনাল পথ দ্বারা উদ্দীপিত হয়। আর্জিনাইন ভাসোপ্রেসিন (AVP) এবং এনজিওটেনসিন II (ANGII) এর মতো হরমোনগুলি ক্রমবর্ধমান সিএএমপি উত্পাদন এবং প্রোটিন কিনেস এ (পিকেএ) সক্রিয়করণের মাধ্যমে NKCC2 কে উদ্দীপিত করে। 5 PKA সরাসরি Ser126-এ NKCC2 ফসফরিলেট করে বলে মনে করা হয়, যা vesicles ধারণকারী NKCC2 এর এক্সোসাইটোসিস বাড়ায় এবং তাই অ্যাপিক্যাল প্লাজমা মেমব্রেনে ট্রান্সপোর্টারের প্রাচুর্য। 6 একইভাবে, অন্তঃকোষীয় ক্লোরাইড ঘনত্বের পরিবর্তন NKCC2 ফসফোরিলেশন নিয়ন্ত্রণ করে। ট্র্যাসেলুলার Cl − এর ঘনত্ব কম হলে উইথ-নোলাইসিন(K) কাইনেস WNK1 এবং WNK4 কে ফসফরিলেট করতে উদ্দীপিত করে এবং ডাউনস্ট্রিম কাইনেস স্টে20- সম্পর্কিত প্রোলিন অ্যালানাইন রিচ কিনেস (SPAK) বা অক্সিডেটিভ স্ট্রেস রেসপন্সিভ কাইনেস (OXSR1111) ) 7- 9 NKCC2-এ একটি "RFxV" মোটিফের সাথে আবদ্ধ হওয়ার পরে, এই কাইনেসগুলি NKCC2কে দুটি থ্রোনাইন অবশিষ্টাংশে (T96 এবং T101) ফসফরিলেট করে। 2 এই অবশিষ্টাংশগুলির ডিফোসফোরিলেশন ফসফেটেস ক্যালসিনুরিন দ্বারা মধ্যস্থতা করে, জোর দিয়ে যে NKCC2 হল বেশ কয়েকটি সংকেত পথের লক্ষ্য। 10
NKCC2 ফাংশন অধ্যয়ন করার জন্য, আমাদের সহ বেশ কয়েকটি গ্রুপ Thr96 এবং/অথবা Thr101 এর বিরুদ্ধে ফসফফর্ম-নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি তৈরি করেছে। 11- 17 অ্যান্টিবডিগুলি হেটেরোলজাস এক্সপ্রেশন সিস্টেম 7,11,17,18,19,20 এবং ইঁদুর 10,21,22,23,24,25 এবং ইঁদুর সহ প্রাণী মডেলগুলিতে NKCC2 ফসফোরিলেশন মূল্যায়ন করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। 14,15,16,17,19,26,27 যাইহোক, আমাদের pT96/101 NKCC2 অ্যান্টিবডি ব্যবহার করার সময়, আমরা আমাদের বিভিন্ন মাউস মডেলগুলিতে অসামঞ্জস্যপূর্ণ ফলাফল পেয়েছি। যদিও আমরা 129Sv জেনেটিক ব্যাকগ্রাউন্ডে ইঁদুর থেকে কিডনিতে শক্তিশালী pNKCC2 সংকেত সনাক্ত করেছি, আমরা C57BL/6 ইঁদুর থেকে কিডনিতে নির্ভরযোগ্য pNKCC2 সংকেত পাইনি কিন্তু pNCC এর সাথে pNKCC2 অ্যান্টিবডিগুলির ক্রস-রিঅ্যাক্টিভিটি পর্যবেক্ষণ করেছি। জেএ ম্যাককরমিক এবং এএ ম্যাকডোনফ (ব্যক্তিগত যোগাযোগ) সহ অন্যান্য পরীক্ষাগারগুলি একই রকম পর্যবেক্ষণ করেছে। 18,28,29 তদ্ব্যতীত, ইঁদুরের মধ্যে আকর্ষণীয় স্ট্রেন পার্থক্য বর্ণনা করা হয়েছেরেনাল129Sv ইঁদুরের তুলনায় C57BL/6-এ উল্লেখযোগ্যভাবে কম মূত্রের Ca 2 প্লাস নির্গমন সহ ফাংশন 30। 31 অতএব, আমরা অনুমান করেছি যে C57BL/6 ইঁদুর NKCC2 এর একটি জেনেটিক বৈকল্পিক প্রকাশ করে যা NKCC2 ফসফোরিলেশনকে প্রভাবিত করে এবং সম্ভবতকিডনি ফাংশনযা পর্যবেক্ষণ করা স্ট্রেন পার্থক্য ব্যাখ্যা করে। নিম্নলিখিত অধ্যয়নটি এই অনুমানটি পদ্ধতিগতভাবে পরীক্ষা করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছিল।
কীওয়ার্ড:আয়ন হোমিওস্ট্যাসিস, কিডনি, NKCC2, ফসফোরিলেশন, স্ট্রেন পার্থক্য
ফলাফল
2.1|C57BL/6 ইঁদুরের NKCC2-তে পাঁচটি অ্যামিনো অ্যাসিড অপসারণ রয়েছে যা ফসফরিলেটেড NKCC2 সনাক্তকরণে হস্তক্ষেপ করেপ্রথমত, আমরা NKCC2 এবং NCC (চিত্র 1A,B, যথাক্রমে)-এর প্রকাশিত N-টার্মিনাল অ্যামিনো অ্যাসিড সিকোয়েন্স (টেবিল S1-এ ট্রান্সক্রিপশন আইডি) বেশ কয়েকটি প্রজাতির জন্য সারিবদ্ধ করেছি যা পিএনসিসি এবং অ্যান্টি-পিএনকেসিসি অ্যান্টিবডি দ্বারা স্বীকৃত এপিটোপের সাথে মিলে যায়। (চিত্র 1C)। প্রান্তিককরণটি NKCC2 এবং NCC 7 এর ফসফোরিলেশন সাইটগুলির উচ্চ ডিগ্রী সংরক্ষণের বিষয়টি নিশ্চিত করেছে যা সম্ভবত আমাদের এবং অন্যদের দ্বারা পর্যবেক্ষণ করা pNKCC2 এবং pNCC অ্যান্টিবডিগুলির ক্রস-রিঅ্যাকটিভিটি ব্যাখ্যা করে। 18,28,29 আকর্ষণীয়ভাবে এবং আমাদের অনুমানের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, প্রান্তিককরণটি C57BL/6 ইঁদুর (ΔF97- T101) থেকে NKCC2 এর ক্রমানুসারে এখনও পর্যন্ত প্রশংসা করা হয়নি এমন পাঁচটি অ্যামিনো অ্যাসিড অপসারণকে পুনরায় প্রকাশ করেছে (চিত্র 1A) . মার্কিন যুক্তরাষ্ট্রের জ্যাকসন ল্যাবরেটরি বা ফ্রান্সের জানভিয়ার ল্যাবসে রাখা দুটি ভিন্ন C57BL/6 মাউস কলোনি থেকে ডিএনএর সিকোয়েন্সিং C57BL/6 NKCC2-এর এক্সন 2-এ নিউক্লিওটাইড অপসারণ নিশ্চিত করেছে যা উপরে উল্লিখিত অ্যামিনো অ্যাসিড অপসারণের সাথে মিলে যায় (চিত্র S1) ,টেবিল S2)।
মোট এবং ফসফরিলেটেড NKCC2 এর ইমিউনোডটেকশনের উপর পাঁচটি অ্যামিনো অ্যাসিড ডি-লেশনের প্রভাবকে চিহ্নিত করার জন্য, আমরা ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি এবং ইমিউনোব্লটিং দ্বারা C57BL/6 এবং 129Sv ইঁদুরের কিডনিগুলি নিয়মিতভাবে অধ্যয়ন করেছি। মোট NKCC2 এর বিরুদ্ধে একটি অ্যান্টিবডি সহ ইমিউনোফ্লুরোসেন্স 129Sv এবং C57BL/6 ইঁদুরের TALs-এর এপিকাল প্লাজমা ঝিল্লিতে একটি শক্তিশালী ফ্লুরোসেন্ট সংকেত দেখিয়েছে। যাইহোক, আমাদের পূর্বে বিকশিত pT96/T101 NKCC2 অ্যান্টিবডি শুধুমাত্র 129Sv ইঁদুরে TALs-এর একটি শক্তিশালী apical লেবেলিং দেখিয়েছিল, যখন C57BL/6 ইঁদুরের TAL-এর খুব দুর্বল ইমিউনোস্টেইনিং ছিল (চিত্র 1D)। এর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ ইঁদুরের উভয় স্ট্রেইনে মোট NKCC2 এর জন্য একটি শক্তিশালী ব্যান্ড প্রকাশ করেছে, যখন pT96/T101 NKCC2 অ্যান্টিবডি শুধুমাত্র 129Sv ইঁদুরে (চিত্র 1E) প্রত্যাশিত আকারে (170 kDa) একটি শক্তিশালী ব্যান্ড সনাক্ত করেছে। পরিবর্তে, C57BL/6 ইঁদুরের কিডনি 130 kDa তে একটি ব্যান্ড প্রকাশ করেছে যা NCC (চিত্র 1E) এর প্রত্যাশিত আকারের সাথে মিলে যায়। পূর্বে NKCC2 ফসফোরিলেশন (চিত্র S2) অধ্যয়নের জন্য ব্যবহৃত অন্যান্য অ্যান্টিবডিগুলির সাথে অনুরূপ ফলাফল প্রাপ্ত হয়েছিল। pT212/T217 NKCC1 R5 অ্যান্টিবডি 11 pNCC সংকেত ছাড়াও pNKCC2 (চিত্র S2) এর জন্য প্রত্যাশিত আকারে একটি ক্ষীণ সংকেত দেখিয়েছে। pNKCC2 এর জন্য ইমিউনোরঅ্যাক্টিভ ব্যান্ড যখন তাজা হয় তখন আরও তীব্র হয়ে ওঠেকিডনিlysates ব্যবহার করা হয়েছিল। ডিটারজেন্ট (RIPA বাফার) সহ একটি লাইসিস বাফারের ব্যবহার উন্নত হয়নি তবে সংকেতের তীব্রতা হ্রাস করেছে (চিত্র S3)।
চিত্র 1 pT96/T101 NKCC2 অ্যান্টিবডি C57BL/6 ইঁদুরে একটি দৃশ্যমান pNKCC2 সংকেত সনাক্ত করে না। A, NKCC2 অ্যামিনো অ্যাসিড বিভিন্ন প্রজাতির সিকোয়েন্স অ্যালাইনমেন্ট এবং দুটি মাউস স্ট্রেন 129Sv এবং C57BL/6। বিভিন্ন প্রজাতির জন্য NKCC2 সিকোয়েন্স আইডিগুলি সারণি S1 এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। মুরিন Thr96 থেকে মুরিন Thr101-এর সাথে সম্পর্কিত অত্যন্ত সংরক্ষিত অঞ্চলটি ধূসর রঙে চিহ্নিত করা হয়েছে। বি, বিভিন্ন প্রজাতির মধ্যে এনসিসির অ্যামিনো অ্যাসিড ক্রম সারিবদ্ধকরণ। বিভিন্ন প্রজাতির জন্য NCC সিকোয়েন্স আইডিগুলি সারণি S1 এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। C, pT53 বা pT58NCC সনাক্তকারী সাধারণত ব্যবহৃত এবং প্রকাশিত অ্যান্টিবডিগুলির এপিটোপের তালিকা, সেইসাথে Thr96 থেকে Thr101 এর কাছাকাছি সংরক্ষিত অবস্থানে pNKCC2। D, 129Sv এবং C57BL/6 ব্যাকগ্রাউন্ড সহ ইঁদুরের ক্রায়ো-বিভাগে মোট এবং pT96/T101 NKCC2 এর ইমিউনোস্টেইনিং। স্কেল বার=50 µm। ই, মোট ইমিউনোব্লট এবং 129Sv এবং C57BL/6 ব্যাকগ্রাউন্ড সহ ইঁদুরের pT96/T101 NKCC2। মানগুলি হল ± SEM, n=5 মাউস প্রতি গ্রুপ, সবুজ তীরগুলি নির্দিষ্ট ব্যান্ডগুলির দিকে নির্দেশ করে যখন লাল তীর-শিরোনাগুলি অ-নির্দিষ্ট ব্যান্ডগুলির দিকে নির্দেশ করে৷ আণবিক ওজন চিহ্নিতকারী অন্তর্ভুক্ত করা হয়. মোট এবং pT96/T101 NKCC2 ব্যান্ড 170 kDa তে প্রত্যাশিত৷ F, ইমিউনোব্লট মোট এবং pT96/T101 NKCC2, মোট এবং pT53 এবং pT58 NCC NCC WT এবং NCC নকআউট (KO) বিভিন্ন ব্যাকগ্রাউন্ডের ইঁদুর। সবুজ তীরগুলি নির্দিষ্ট ব্যান্ডগুলির দিকে নির্দেশ করে যখন লাল তীরগুলি অ-নির্দিষ্ট ব্যান্ডগুলির দিকে নির্দেশ করে৷ আণবিক ওজন চিহ্নিতকারী অন্তর্ভুক্ত করা হয়. মোট এবং pT58 এবং pT53 NCC ব্যান্ড 130 kDa তে প্রত্যাশিত, মোট এবং pT96/T101 NKCC2 ব্যান্ড 170 kDa তে প্রত্যাশিত
আমাদের pT96/T101 NKCC2 অ্যান্টিবডি প্রকৃতপক্ষে C57BL/6 ইঁদুরে ফসফরিলেটেড এনসিসির সাথে ক্রস-প্রতিক্রিয়া করে কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য, আমরা পরীক্ষা করেছিলামকিডনিমোট NKCC2, pT96/T101 NKCC2, মোট NCC, এবং ফসফরিলেটেড NCC (pT53 এবং pT58 NCC) (চিত্র1F) বিরুদ্ধে অ্যান্টিবডি সহ 129Sv এবং C57BL/6 ওয়াইল্ড-টাইপ ইঁদুর এবং C57BL/6 NCC নকআউট ইঁদুর থেকে lysates। pT96/T101 NKCC2 অ্যান্টিবডি এবং মোট NCC এবং pNCC-এর বিরুদ্ধে অ্যান্টিবডি C57BL/6 NCC নকআউট মাউস (চিত্র 1F) এ 130- 170 kDa-তে ব্যান্ড সনাক্ত করেনি। মজার বিষয় হল, ইমিউনোব্লটের পাশাপাশি অতিরিক্ত ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি পরীক্ষাগুলি (চিত্র S4) নির্দেশ করে যে শুধুমাত্র pNKCC2 অ্যান্টিবডিগুলি C57BL/6 ইঁদুরের NCC-এর সাথে ক্রস-প্রতিক্রিয়া করে না কিন্তু আমাদের pNCC অ্যান্টিবডিগুলি (pT53 NCC এবং pT58 NCC) NKCC29 এর সাথে ক্রস-প্রতিক্রিয়া করে। ব্যবহৃত ঘনত্বে ইঁদুর।
প্রস্রাবের ক্যালসিয়াম এবং ম্যাগনেসিয়াম নিঃসরণ 129Sv এবং C57BL/6 ইঁদুরের মধ্যে পার্থক্য
NKCC2-এ মুছে ফেলা (F97- T101) 129Sv এবং C57BL/6 ইঁদুরের মধ্যে শারীরবৃত্তীয় পার্থক্যের সাথে যুক্ত হতে পারে কিনা তা নির্ধারণ করতে, আমরা দুটি মাউসের স্ট্রেনের মধ্যে জল গ্রহণ, প্লাজমা আয়ন স্তর এবং প্রস্রাবের তরল এবং আয়ন নির্গমনের তুলনা করেছি। সারণী 1 এ সংক্ষিপ্ত হিসাবে, মূল্যায়ন করা বেশিরভাগ পরামিতি স্ট্রেইনের মধ্যে আলাদা ছিল না। যাইহোক, C57BL/6 ইঁদুর 129Sv ইঁদুরের তুলনায় কম প্রস্রাব Ca 2 প্লাস এবং উচ্চতর প্রস্রাব Mg 2 প্লাস নির্গমন দেখিয়েছে। প্লাজমা Ca 2 প্লাস এবং Mg 2 প্লাস স্তর উভয় গ্রুপের জন্য একই ছিল, ইঁদুরগুলি একটি স্থির অবস্থায় ছিল যেখানে অন্ত্রের পুনর্শোষণ, টিস্যু সংহতকরণ (যেমন হাড় থেকে) এর হোমিওস্ট্যাটিক ভারসাম্য ছিল।রেনালCa 2 প্লাস এবং Mg 2 প্লাস আয়নগুলির নির্গমন পৌঁছেছিল। এই আয়নগুলির অন্ত্রের গ্রহণের পার্থক্যের কারণে বিভিন্ন প্রস্রাবের Ca 2 প্লাস এবং Mg 2 প্লাস নির্গমনের হারগুলি পরীক্ষা করার জন্য, আমরা প্রতিদিনের খাদ্য গ্রহণ, মল আউটপুট এবং মল Ca 2 plus এবং Mg 2 প্লাস নির্গমনের তুলনা করেছি। মাউস স্ট্রেন চিত্র S5 তে দেখানো হয়েছে, খাদ্য গ্রহণ এবং মল Ca 2 প্লাস আউট পুট একই ছিল, কিন্তু 129Sv ইঁদুরের তুলনায় C57BL/6 ইঁদুরে দৈনিক মল Mg 2 প্লাস নিঃসরণ কম ছিল যা নির্দেশ করে যে C57BL/6 ইঁদুরের অন্ত্রের Mg 2 প্লাস পুনঃশোষণ বেশি। 129Sv ইঁদুরের চেয়ে। এই অনুমানের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, C57BL/6 ইঁদুরের ম্যাগনেসিয়াম চ্যানেল TRPM6 (চিত্র S6) এর শক্তিশালী ঔপনিবেশিক অভিব্যক্তি ছিল, সেইসাথে 129Sv ইঁদুরের তুলনায় উচ্চতর প্লাজমা Mg 2 প্লাস স্তরের প্রবণতা ছিল, যদিও পার্থক্যগুলি পরিসংখ্যানগত তাত্পর্য পর্যন্ত পৌঁছায়নি। হাড়ের সম্ভাব্য অবদান মূল্যায়ন করতে, আমরা উভয় স্ট্রেইনে হাড়ের খনিজ ঘনত্ব মাইক্রো-সিটি দ্বারা বিশ্লেষণ করেছি। পূর্ববর্তী রিপোর্টের মতই, 32 C57BL/6 ইঁদুরের হাড়ের খনিজ ঘনত্ব কম ছিল (চিত্র S7), যা ব্যাখ্যা করতে পারে কেন এই ইঁদুরগুলি Ca 2 প্লাস আয়নগুলিকে হ্রাস করার মাধ্যমে সংরক্ষণ করে।রেনালCa 2 প্লাস রেচন। একটি বর্ধিত টিউবুলার Ca 2 প্লাস পুনর্শোষণ হারের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, C57BL/6 ইঁদুরের কিডনি
129Sv ইঁদুরের কিডনির তুলনায় প্রোটিন স্তরে TRPV5 Ca 2 প্লাস চ্যানেল বেশি প্রকাশ করেছে (চিত্র 2)। C57BL/6 ইঁদুরের 129Sv ইঁদুরের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি NCC mRNA এবং প্রোটিন এক্সপ্রেশন ছিল (চিত্র 2A)। একইভাবে, 129Sv ইঁদুরের (চিত্র 2B,C) তুলনায় C57BL/6-এ মোট NKCC2, মোট এবং ফসফরিলেটেড NCC এবং মোট - ENaC-এর প্রোটিনের প্রাচুর্য ছিল। প্রোটিওলিটিক্যালি ক্লিভডের প্রাচুর্য এবং তাই - এবং - ENaC-এর সক্রিয় রূপগুলি ভিন্ন ছিল না যা নির্দেশ করে যেরেনালENaC কার্যকলাপ উভয় স্ট্রেইনের জন্য একই ছিল (চিত্র 2B, C)।
129Sv ইঁদুরের তুলনায় C57BL/6 ইঁদুরে পরিবর্তিত পুরু আরোহী অঙ্গ ফাংশনের কোনো প্রমাণ নেই
C57BL/6 ইঁদুরের কিডনিতে মোট NKCC2, মোট NCC এবং ফসফরিলেটেড NCC-এর উচ্চতর প্রাচুর্য NKCC2 ফসফোরিলেশন হ্রাসের জন্য ক্ষতিপূরণমূলক প্রতিক্রিয়া হতে পারে। NKCC2 এবং NCC-এর কার্যকলাপ মাউসের স্ট্রেনের মধ্যে আলাদা কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য, আমরা যথাক্রমে একটি বুমেটানাইড- এবং থিয়াজাইড- পরীক্ষা করেছি। বুমেটানাইড বা হাইড্রোক্লোরোথিয়াজাইডের একটি একক ইনজেকশন একটি শক্তিশালী নেট্রিউরিসিসকে উস্কে দেয় যা হাইড্রোক্লোরোথিয়াজাইডের চেয়ে বুমেটানাইডের জন্য বেশি স্পষ্ট ছিল। যাইহোক, উভয় স্ট্রেইনে মূত্রবর্ধক প্রতিক্রিয়া সম্পূর্ণরূপে একই রকম ছিল যা পরামর্শ দেয় যে NKCC2 এবং NCC এর কার্যকরী ক্রিয়াকলাপ C57BL/6 এবং 129Sv ইঁদুরের মধ্যে আলাদা ছিল না (চিত্র 3A-D)। স্পষ্টতই, প্রোটিনের প্রাচুর্য এবং ফসফোরিলেশনের মাত্রা অগত্যা এর কার্যকরী কার্যকলাপের সাথে মেলে নারেনালআয়ন পরিবহন প্রোটিন যেমন সম্প্রতি হান্টার এবং সহকর্মীরা উল্লেখ করেছেন। 33 টিএএল ফাংশন আরও মূল্যায়ন করার জন্য, আমরা একটি জল নিষেধাজ্ঞা পরীক্ষা করেছি যেখানে ইঁদুর 24 ঘন্টা ভিজে যাওয়া খাবারের অ্যাক্সেস পেয়েছিল, কিন্তু জলের কলের জন্য নয়। এই অবস্থার অধীনে, উভয় মাউস স্ট্রেন একই মানগুলিতে প্রস্রাবের অসমোলারিটি বাড়িয়েছে (সারণী 1)। অধিকন্তু, C57BL/6 ইঁদুর এবং 129Sv ইঁদুর একই রকম ইউরোমোডুলিন (Tamm-Horsfall প্রোটিন) (টেবিল 1) এর প্রস্রাবের নির্গমন দেখিয়েছে, যা TAL কোষের কার্যকরী কার্যকলাপের উপর নির্ভর করে প্রস্রাবে উৎপন্ন ও নির্গত হয়। 3
129Sv এবং C57BL/6 ইঁদুরের ক্রসব্রিডিং পরামর্শ দেয় যে NKCC2-তে পাঁচটি অ্যামিনো অ্যাসিড অপসারণ একটি নির্দিষ্ট ফিনোটাইপকে আলাদা করে না
উপস্থাপিত তথ্য প্রস্তাব করে যে প্রস্রাবের আয়ন নিঃসরণে স্ট্রেনের পার্থক্য এবংরেনালপ্রোটিনের প্রাচুর্যগুলি C57BL/6 NKCC2-তে পাঁচটি অ্যামিনো অ্যাসিড অপসারণের সাথে সম্পর্কিত নয়, তবে দুটি মাউস স্ট্রেনের মধ্যে অন্যান্য জেনেটিক পার্থক্যের সাথে সম্পর্কিত। এটি আরও পরীক্ষা করার জন্য, আমরা 129Sv এবং C57BL/6 ইঁদুরকে F2 প্রজন্মের সাথে ক্রসব্রেড করেছি যেখানে জেনেটিক স্ট্রেনের পার্থক্য (NKCC2 সহ) এলোমেলোভাবে হওয়া উচিত
ইঁদুরে বিতরণ করা হয়। তারপরে আমরা F2 ইঁদুরের তুলনা করেছি যেগুলি হয় পূর্ণ দৈর্ঘ্যের NKCC2 (f/f) এর জন্য সমজাতীয়, NKCC2 মুছে ফেলার জন্য হোমোজাইগাস (Δ/Δ), অথবা NKCC2 মুছে ফেলার জন্য হেটেরোজাইগাস (f/Δ)। NKCC2 এবং NCC-এর বিরুদ্ধে ফসফোফর্ম-নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডিগুলির প্রত্যাশিত বিভিন্ন বাঁধাই প্যাটার্ন বাদ দিয়ে (এবং mRNA-তে ROMK অভিব্যক্তির একটি অস্পষ্ট পার্থক্য, কিন্তু প্রোটিন স্তরে নয়), দুটি স্ট্রেনের মধ্যে পূর্বে চিহ্নিত পার্থক্যগুলির মধ্যে কোনওটিই স্পষ্ট ছিল না। F2 প্রজন্মের f/f, Δ/Δ, বা f/Δ ইঁদুর (চিত্র 4 এবং টেবিল 2)। বিশেষ করে, প্রস্রাবের Ca 2 plus বা Mg 2 প্লাস নিঃসরণে কোন পার্থক্য ছিল না, সেইসাথে প্লাজমা Ca 2 plus বা Mg 2 প্লাস মাত্রার মধ্যে কোন পার্থক্য ছিল না, পরামর্শ দেয় যে 129Sv এবং C57BL/6 ইঁদুরের মধ্যে স্ট্রেনের পার্থক্যগুলি স্বাধীন NKCC2 এ পাঁচটি অ্যামিনো অ্যাসিড অপসারণ।
একটি উপন্যাস pT96 NKCC2 অ্যান্টিবডি উভয় স্ট্রেইনে pNKCC2 সনাক্ত করে
যেহেতু NKCC2-তে পাঁচটি অ্যামিনো অ্যাসিড মুছে ফেলার ফলে উপলব্ধ অ্যান্টিবডিগুলি ব্যবহার করার সময় C57BL/6 ইঁদুরে NKCC2 ফসফোরিলেশনের একটি নির্ভরযোগ্য সনাক্তকরণকে বাধা দেয়, তাই আমরা C57BL/6 ইঁদুরে T96 ফসফোসাইটের বিরুদ্ধে নির্দেশিত একটি নতুন অ্যান্টিবডি তৈরি করেছি। খরগোশকে একটি ফসফোপেপটাইড দিয়ে টিকা দেওয়া হয়েছিল যা T96 (YYLQ(p)TMDA) এর আশেপাশে C57BL/6 NKCC2 এর অ্যামিনো অ্যাসিড ক্রম অনুসারে। অ্যান্টিসেরা সম্বন্ধযুক্ত ছিল- শুদ্ধ এবং ইমিউনোব্লটিং এবং ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি দ্বারা চিহ্নিত (চিত্র 5)। অ্যান্টিবডি 129Sv, C57BL/6 ওয়াইল্ড-টাইপ এবং C57BL/6 NCC নক-আউটের কিডনিতে 170 kDa এর প্রত্যাশিত আকারে একটি একক ব্যান্ড সনাক্ত করেছে।
ইঁদুর (চিত্র 5A)। ব্যান্ডটি 130 kDa-তে NCC-এর জন্য সনাক্ত করা ব্যান্ড থেকে স্পষ্টতই আলাদা ছিল। 129Sv এর ডিফোসফোরিলেশনকিডনিবাছুরের অন্ত্রের ক্ষারীয় ফসফেটেস (CIAP) সহ নমুনাগুলি নতুন pT96 NKCC2 অ্যান্টিবডির সাথে প্রাপ্ত সংকেতকে সম্পূর্ণরূপে নির্মূল করেছে, যখন নন-ফসফোফর্ম-নির্দিষ্ট NKCC2 অ্যান্টিবডি সহ সংকেত নিয়ন্ত্রণ এবং ডিফসফোরাইলেড নমুনাগুলিতে দৃশ্যমান ছিল (চিত্র 5B)। মজার বিষয় হল, এনকেসিসি 2 ফসফোরিলেশনও মূলত যখন নির্মূল হয়েছিলকিডনিলাইসেটগুলি CIAP ছাড়াই 1 ঘন্টার জন্য 37 ডিগ্রীতে ইনকিউবেট করা হয়েছিল (সম্ভবত প্রক্সিমাল টিউবুল থেকে অন্তঃসত্ত্বা ক্ষারীয় ফসফেটেসের কার্যকলাপের কারণে)। C57BL/6 ইঁদুরের ক্রমাগত প্যারাফিন-কিডনি বিভাগে ল্যাম্বডা ফসফেটেস ব্যবহার করে ডিফসফোরিলেশন পরীক্ষাগুলি আরও নিশ্চিত করেছে যে নতুন অ্যান্টিবডি শুধুমাত্র ফসফরিলেটেড NKCC2 (চিত্র 5C) স্বীকৃতি দেয়। অধিকন্তু, পরপর ক্রায়োসেকশনে ইমিউনো ফ্লুরোসেন্স প্রমাণ করে যে নতুন অ্যান্টিবডি শুধুমাত্র NKCC2- পজিটিভ TAL-এর অ্যাপিক্যাল প্লাজমা মেমব্রেনে দাগ দেয় কিন্তু 129Sv এবং C57BL/6 ইঁদুরের (চিত্র 5D) মধ্যে NCC- পজিটিভ ডিসিটি নয়, পরামর্শ দেয় যে নতুন pNKCC2 অ্যান্টিবডি pNCC এর সাথে ক্রস-প্রতিক্রিয়া করে না। মানব NKCC2 (hNKCC2) এবং মানব NCC (hNCC) প্রকাশ করে MDCKI কোষ থেকে সেল লাইসেট ব্যবহার করে এই উপসংহারটিও নিশ্চিত করা হয়েছিল। ইমিউনোব্লটস অফ ইমিউনোপ্রিসিপিটেশনস (আইপি) এবং পুরো সেল লাইসেটগুলি প্রমাণ করেছে যে উপন্যাস pT96 NKCC2 অ্যান্টিবডি মানব NKCC2 কে স্বীকৃতি দেয় কিন্তু মানব NCC (চিত্র S8A) নয়। মজার বিষয় হল, যদিও C57BL/6 ইঁদুরের pNKCC2 এর বিরুদ্ধে নতুন অ্যান্টিবডি উত্থাপিত হয়েছিল, নতুন অ্যান্টিবডিটি ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি (চিত্র 6A) এবং ইমিউনোব্লটিং (চিত্র 6B) উভয়ের দ্বারা উভয় মাউস স্ট্রেনের কিডনিতে সমানভাবে NKCC2 ফসফোরিলেশন সনাক্ত করেছে।
উপন্যাস pT96 NKCC2 অ্যান্টিবডি নিয়ন্ত্রিত NKCC2 ফসফোরিলেশন বিশ্লেষণের অনুমতি দেয়
ফসফোরিলেশন এবং তাই NKCC2 এবং NCC এর কার্যকলাপ বহির্কোষী আয়ন ঘনত্ব দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়। একটি নিম্ন [Cl − ] ex WNK/SPAK/OSR1 পথ সক্রিয় করার মাধ্যমে Thr96 এবং Thr101-এ NKCC2 এবং Thr53 এবং Thr58-এ NCC-এর ফসফোরিলেশন বাড়ায়। 7,8,18,29,35 একইভাবে, একটি উচ্চ [K প্লাস] দ্রুত এনসিসির ফসফোরিলেশন হ্রাস করে, তবে NKCC2 ফসফোরিলেশনের উপর সামান্য বা কোন প্রভাব নেই বলে মনে করা হয়। 12,36,37,38 নতুন উন্নত pT96 NKCC2 অ্যান্টিবডি NKCC2 ফসফোরিলেশনের এই ধরনের ডিফারেনশিয়াল রেগুলেশন সনাক্ত করতে সক্ষম কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য,কিডনিC57BL/6 ইঁদুরের স্লাইসগুলি যথাক্রমে 110 বা 5 mM [Cl − ] ex এবং 3 বা 10 mM [K প্লাস] ex-এ এক্স-ভিভো-তে প্রকাশ করা হয়েছিল। প্রত্যাশিত হিসাবে, নিম্ন [Cl − ] ex- দৃঢ়ভাবে NCC এবং NKCC2 ফসফোরিলেশন বৃদ্ধি করেছে (চিত্র 7A,B), যখন উচ্চ [K প্লাস] ex শুধুমাত্র NCC ফসফোরিলেশন হ্রাস করেছে কিন্তু NKCC2 ফসফোরিলেশন (চিত্র 7C,D) পরিবর্তন করেনি। একইভাবে, নতুন অ্যান্টিবডি সনাক্ত করা হয়েছে সমানভাবে পরিবর্তিত
চিত্র 4 mRNA এবং মেজরের প্রোটিন এক্সপ্রেশনে কোন উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন নেইরেনালক্রসব্রেড F2 প্রজন্মের আয়ন পরিবহনকারী এবং চ্যানেল। এ, ইঁদুরের তিনটি গ্রুপে আপেক্ষিক mRNA এক্সপ্রেশন স্তরের বার প্লট। সমস্ত মান f/f ইঁদুরে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। মান মানে ± SEM। বি, মাউসে প্রোটিনের প্রাচুর্যকিডনিF2 প্রজন্মের প্রাণী থেকে lysates। তিনটি গোষ্ঠী পূর্ণ-দৈর্ঘ্য NKCC2 (f/f), NKCC2 মোছার জন্য সমজাতীয় (Δ/Δ) বা NKCC2 হেটেরোজাইগাস (f/Δ/) এর সাথে মিলে যায়। আণবিক ওজন চিহ্নিতকারী অন্তর্ভুক্ত করা হয়. NKCC2 এবং pNKCC2 170 kDa, NCC এবং pNCC 130 kDa, TRPM6 260 kDa, - 95 kDa তে ENaC এবং 34 kDa (ক্লিভড), - 100 kDa এ ENaC, - ENaC 100 kDa, - ENaC এবং kDa (10085) , ROMK 55 kDa (পরিপক্ক গ্লাইকোসিলেটেড), 43 kDa (কোর গ্লাইকোসিলেটেড) এবং 34 kDa (আংলাইকোসিলেটেড)। সবুজ তীরগুলি নির্দিষ্ট ব্যান্ডগুলির দিকে নির্দেশ করে যখন লাল তীরগুলি অ-নির্দিষ্ট ব্যান্ডগুলির দিকে নির্দেশ করে৷ সি, এফ/এফ এবং Δ/Δ ইঁদুরের তুলনা করে প্রোটিনের প্রাচুর্যের ঘনত্বের বিশ্লেষণ। Δ/Δ ইঁদুর থেকে ব্যান্ডের তীব্রতা f/f থেকে স্বাভাবিক করা হয়। (মানগুলির মানে হল ± SEM; n=5 ইঁদুর/গোষ্ঠী; *P < .05,="" †="" p="">< .01,="" ‡="" p=""><>
NKCC2 ফসফোরিলেশন যা MDCKI কোষে মানব NKCC2 (hNKCC2) বা মাউস NKCC2 (mNKCC2(C57BL/6)) কে হাইপোটোনিক লো এক্সট্রা সেলুলার ক্লোরাইড অবস্থা (চিত্র S8B) দ্বারা প্রকাশ করে। ভিতরেকিডনি5 mM [Cl − ] ex-এ স্লাইস করা হয়েছে, এছাড়াও পূর্বে বর্ণিত অ্যান্টি-মাউস pT96/ T101 NKCC2 39 এবং অ্যান্টি-হিউম্যান pT212/T217 NKCC1 R5 11 অ্যান্টিবডিগুলি NKCC2 এবং NCC-এর জন্য দুর্বল সংকেত সনাক্ত করে, যা আরও স্পষ্ট হয় যখন আরও প্রোটিন লোড করা হয় এবং ইমিউনোব্লটগুলিকে উন্নত সেটিংসে চিত্রিত করা হয় (চিত্র S9)।
আলোচনা
জৈব চিকিৎসা গবেষণার জন্য C57BL/6 এবং 129Sv ইঁদুর দুটি সর্বাধিক ব্যবহৃত মাউস স্ট্রেন। C57BL/6 ইঁদুরের জিনোম ছিল প্রথম যা মাউস 40-এর জন্য ক্রমানুসারে তৈরি করা হয়েছিল এবং মাউসের স্ট্রেনের মধ্যে জেনেটিক এবং ফেনোটাইপিক বৈচিত্র বিশ্লেষণের জন্য রেফারেন্স জিনোম হিসাবে কাজ করেছে। 41- 44 জন্যকিডনিগবেষণা, C57BL/6 এবং 129Sv ইঁদুরের মধ্যে একটি অপরিহার্য পার্থক্য রেনিন জিনের অভিব্যক্তিকে উদ্বিগ্ন করে। মানুষের মত, C57BL/6 ইঁদুর শুধুমাত্র একটি রেনিন জিনকে আশ্রয় করে, যখন 129Sv ইঁদুরের দুটি কপি থাকে, যা উচ্চ রক্তচাপ 45,46 এবং হাইপারটেনসিভ ইনজুরির জন্য এই মাউস স্ট্রেনের উচ্চতর সংবেদনশীলতা ব্যাখ্যা করতে পারে। 47 বর্তমান অধ্যয়নের সাথে, আমরা আরেকটি গুরুত্বপূর্ণ জেনেটিক পার্থক্য যোগ করি যা বিবেচনা করা প্রয়োজন। আমরা এখন পর্যন্ত NKCC2 (ΔF97- T101) তে পাঁচটি অ্যামিনো অ্যাসিড অপসারণের বর্ণনা করি, C57BL/6 তে উপস্থিত কিন্তু 129Sv ইঁদুরে নয়, যা পূর্বে উপলব্ধ অ্যান্টিবডিগুলির সাথে NKCC2 ফসফোরিলেশন সনাক্তকরণে হস্তক্ষেপ করে, কিন্তু উল্লেখযোগ্যভাবে নয় প্রভাবকিডনি ফাংশন।
মাউস NKCC2 N- টার্মিনাল ফসফোরিলেশন সাইট T96 এবং T101 প্রজাতি জুড়ে এবং NKCC2, NKCC1 এবং NCC (চিত্র 1) এর মধ্যে অত্যন্ত সংরক্ষিত। 48 অতএব, এটি আশ্চর্যজনক নয় যে এই ফসফোরিলেশন সাইটগুলির বিরুদ্ধে নির্দেশিত অ্যান্টিবডিগুলি অন্যান্য কোট্রান্সপোর্টারদের সাথে ক্রস-প্রতিক্রিয়া করে। পূর্ববর্তী গবেষণায় রিপোর্ট করা হয়েছে যে ফসফরিলেটেড NCC-এর বিরুদ্ধে অ্যান্টিবডিগুলি ফসফরিলেটেড NKCC2 7,18,28,29 সনাক্ত করে এবং একটি pNKCC1 অ্যান্টিবডি NKCC1 এবং NKCC2 উভয়ের ফসফোরিলেশন স্তরের বিশ্লেষণের অনুমতি দেয়। 11 এর সাথে সামঞ্জস্য রেখে, আমরা আমাদের pNCC (pT53 এবং pT58) অ্যান্টিবডিগুলির ফসফরিলেটেড NKCC2 এবং আমাদের pT96/pT101 NKCC2 অ্যান্টিবডি ফসফরিলেটেড NCC সহ ক্রস-রিঅ্যাক্টিভিটি পর্যবেক্ষণ করেছি। যাইহোক, NKCC2 এর সাথে pNCC অ্যান্টিবডিগুলির ক্রস-রিঅ্যাকটিভিটি শুধুমাত্র 129Sv ইঁদুরের কিডনিতে দেখা গেছে, কিন্তু C57BL/6 ইঁদুরের কিডনিতে নয়। বিপরীতভাবে, NKCC2 pT96/pT101-এ আমাদের পূর্বে তৈরি অ্যান্টিবডি C57BL/6 ইঁদুরের কিডনিতে pNKCC2-এর জন্য খুব দুর্বল সংকেত দেখায়নি এবং এই স্ট্রেনে প্রধানত ফসফরিলেটেড NCC সনাক্ত করেছে। এখন, আমরা এই বিভ্রান্তিকর পর্যবেক্ষণগুলিকে C57BL6 ইঁদুর (ΔF97- T101) এর NKCC2-এ পাঁচটি অ্যামিনো অ্যাসিড অপসারণের সাথে লিঙ্ক করি৷ NKCC2 ফসফোরিলেশনের নিয়ন্ত্রণ অধ্যয়ন করা হয়েছে-
বিভিন্ন পরীক্ষামূলক সেটিংসে এবং ভ্যাসোপ্রেসিন, 14,21,24,25,49 ইউরোমোডুলিন 19,20,50 এবং ক্যালসিনুরিন ইনহিবিটর সহ বিভিন্ন উদ্দীপনার জন্য। 10,26 যদিও বেশিরভাগ অধ্যয়ন হেটেরোলজাস এক্সপ্রেশন সিস্টেম 10,19,20,25,50 বা ইঁদুর 10,24 এবং ইঁদুর 19,26 পূর্ণ দৈর্ঘ্য NKCC2 প্রকাশ করে, কিছু গবেষণা করা হয়েছিল C57BL/6 ইঁদুরেও। 7,18,27,28,29,51 যেমন আমরা এখানে রিপোর্ট করি, C57BL/6 ইঁদুর পাঁচটি অ্যামিনো অ্যাসিড মুছে ফেলার সাথে একটি NKCC2 রূপ প্রকাশ করে যা NKCC2 ফসফোরিলেশনের সঠিক সনাক্তকরণে হস্তক্ষেপ করে এবং এটি স্ট্যান্ডার্ড pT96/T101 NKCC2 এর ঝুঁকি বহন করে। অ্যান্টিবডি এবং R5 অ্যান্টি ফসফো-NKCC1 অ্যান্টিবডি ফসফরিলেটেড এনসিসির সাথে ক্রস-প্রতিক্রিয়া করে অন্তত আমাদের কাজে ব্যবহৃত শর্তে। পূর্ববর্তী পরীক্ষামূলক সিদ্ধান্তে এই ক্রস-প্রতিক্রিয়ার প্রভাবের বিচার করা সম্ভব নয়, তবে আমাদের পর্যবেক্ষণ অনুসারে, C57BL/6 ইঁদুরের ডেটা পুনরায় পর্যালোচনা করা উচিত এবং সতর্কতার সাথে ব্যাখ্যা করা উচিত। সত্য সত্ত্বেও, যে পাঁচটি অ্যামিনো অ্যাসিড মুছে ফেলার NKCC2 ফসফোরিলেশন সনাক্তকরণের উপর একটি শক্তিশালী প্রভাব ছিল, আমাদের কাছে কোনও প্রমাণ নেই যে মুছে ফেলাটি কোট্রান্সপোর্টারের কার্যকরী কার্যকলাপকে উল্লেখযোগ্যভাবে প্রভাবিত করে। C57BL/6 ইঁদুরের 129Sv ইঁদুরের তুলনায় উচ্চতর মূত্রনালী Mg 2 প্লাস নির্গমন এবং নিম্ন মূত্রনালী Ca 2 প্লাস নির্গমন 31 ছিল, কিন্তু আমরা দেখেছি যে এই পার্থক্যগুলি সম্ভবত TAL বরাবর এই ক্যাটেশনগুলির পরিবর্তিত প্যারাসেলুলার পরিবহনের সাথে সম্পর্কিত নয়, কিন্তু অন্ত্রে একটি বর্ধিত TRPM6- নির্ভরশীল Mg 2 প্লাস গ্রহণ এবং DCT2 এবং CNT-তে একটি বর্ধিত TRPV5- নির্ভরশীল Ca 2 প্লাস পুনর্শোষণের ফলাফল। পরবর্তীটি একটি ইতিবাচক Ca 2 প্লাস ভারসাম্য সৃষ্টি করে যা C57BL/6 ইঁদুরের কম হাড়ের খনিজ ঘনত্ব বাড়াতে সাহায্য করতে পারে। অনুসন্ধান যে C57BL/6 এবং 129Sv ইঁদুর একই দেখায়রেনাললুপ- এবং থিয়াজাইড মূত্রবর্ধক এবং জলের সীমাবদ্ধতার প্রতিক্রিয়া আরও পরামর্শ দেয় যে NKCC2-তে পাঁচটি অ্যামিনো অ্যাসিড মুছে ফেলা TAL ফাংশনকে উল্লেখযোগ্যভাবে ক্ষতিগ্রস্ত করে না। সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ, ক্রস-ব্রিড C57BL/6 এবং 129Sv ইঁদুরের F2 প্রজন্মের ইঁদুর একই রকমরেনালফিনোটাইপ ইঁদুর পূর্ণ দৈর্ঘ্য (f/f) NKCC2 বা NKCC2 প্রকাশ করে কিনা তার থেকে স্বাধীন
মোছার জন্য homozygous (Δ/Δ)। ইঁদুরের এই পর্যবেক্ষণগুলি হেটেরোলজাস এক্সপ্রেশন সিস্টেমের পূর্ববর্তী কার্যকরী ডেটার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। NKCC1 (মানুষে T217, মাউসে T211) বা NCC (মানুষে T60, মাউসে T58) একক অবশিষ্টাংশের মিউটেশন এই কোট্রান্স পোর্টারের কার্যকলাপকে বাতিল করে, NKCC2 (মানুষে T105, মাউসে T101) এর সংশ্লিষ্ট অবশিষ্টাংশের মিউটেশন ) বেসলাইন এবং উদ্দীপিত NKCC2 কার্যকলাপের উপর সামান্য বা এমনকি কোন প্রভাব নেই। 35,52,53 এমনকি যখন NKCC2-এর উভয় থ্রোনাইন অবশিষ্টাংশই অ্যালানাইনে রূপান্তরিত হয়, তখনও NKCC2-এর কার্যকরী কার্যকলাপ সর্বাধিক ক্রিয়াকলাপের ~70 শতাংশে পৌঁছায়, 35 প্রস্তাব করে যে এই সাইটগুলির ফসফোরিলেশন নির্দেশক কিন্তু NKCC2 কার্যকলাপের জন্য অপরিহার্য নয়।
ফসফোরিলেশন সাইটগুলি প্রায়ই প্রোটিনের মধ্যে সমজাতীয় হয়। তাই, ফসফোফর্ম-নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডিগুলির ক্রস-রিঅ্যাকটিভিটির সমস্যাটি ফসফরিলেটেড NCC, NKCC2 এবং NKCC1 এর বিরুদ্ধে নির্দেশিত অ্যান্টিবডিগুলির জন্য অনন্য নয়, তবে অন্যান্য প্রোটিনের জন্যও রিপোর্ট করা হয়েছিল যেমন সাইক্লিন নির্ভর কাইনেস 1 এবং 2 54 এবং এক্সট্রা সেলুলার সংকেত-নিয়ন্ত্রিত কাইনেস 1 এবং 2। 55 ধারাবাহিকভাবে, যখনই ফসফোরিলেশন স্টেট-নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি ব্যবহার করা হয়, তখন সনাক্ত করা সংকেতগুলির নির্দিষ্টতা নিশ্চিত করার জন্য কঠোর পরীক্ষামূলক নিয়ন্ত্রণের প্রয়োজন হয়। এর মধ্যে অন্তর্ভুক্ত থাকতে পারে (ক) নিশ্চিতকরণ যে নিযুক্ত অ্যান্টিবডি প্রত্যাশিত আণবিক ওজন (ইমিউনোব্লটিং) এবং/অথবা প্রত্যাশিত সেলুলার এবং সাবসেলুলার স্থানীয়করণে (ইমিউনোফ্লোরেসেন্স) প্রোটিন সনাক্ত করে, (খ) যাচাইকরণ যে অ্যান্টিবডি বিশেষভাবে ফসফরিলেটেড এপিটোপের সাথে যোগাযোগ করে ফসফরিলেটেড এবং নন-ফসফরিলেটেড পেপটাইডের সাথে প্রতিযোগিতার পরীক্ষা ব্যবহার করে এবং (গ) প্রদর্শন যে
অ্যান্টিবডিটি ফসফোরিলেটেড এবং ডিফসফরিলেটেড টিস্যু নমুনার তুলনা করে ফসফফর্ম নির্দিষ্ট। এই নিয়ন্ত্রণগুলি জেনেটিক নিয়ন্ত্রণগুলির দ্বারা পরিপূরক হতে পারে যার মধ্যে নকআউট প্রাণী এবং/অথবা কোষ থেকে টিস্যুগুলির পরীক্ষা অন্তর্ভুক্ত রয়েছে ভিন্নভাবে আগ্রহের প্রোটিন প্রকাশ করে। বর্তমান গবেষণায়, আমরা একটি নতুন pT96 NKCC2 অ্যান্টিবডিকে পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে চিহ্নিত করার জন্য উপরে উল্লিখিত পদ্ধতিগুলি ব্যবহার করেছি যা ফসফরিলেটেড NKCC2 সনাক্ত করে।কিডনিC57BL/6 এবং 129Sv ইঁদুরের নমুনাগুলি সমানভাবে ভাল। অ্যান্টিবডিটি ফসফোফর্ম-নির্দিষ্ট এবং পরীক্ষিত যেকোনো পরিস্থিতিতে ফসফরিলেটেড এনসিসির সাথে কোনও আপাত ক্রস-প্রতিক্রিয়া দেখায় না। এই অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে আমরা নিশ্চিত করেছি যে কম এক্সট্রা সেলুলার ক্লোরাইড ঘনত্ব এই সাইটে NKCC2 এর ফসফোরিলেশন বাড়ায়, 7,8 যখন পরিবর্তিত এক্সট্রা সেলুলার পটাসিয়াম ঘনত্বের কোনও উল্লেখযোগ্য নিয়ন্ত্রক ভূমিকা নেই। 24 উপসংহারে, আমাদের কাজ মাউস NKCC2-এর অ্যামিনো অ্যাসিডের অনুক্রমের একটি সমালোচনামূলক স্ট্রেন পার্থক্য প্রকাশ করে যা সনাক্তকরণকে প্রভাবিত করে এবং সেইজন্য NKCC2 ফসফোরিলেশন এবং নিয়ন্ত্রণের বিশ্লেষণকে প্রভাবিত করে। একটি নতুন উন্নত pT96 NKCC2 অ্যান্টিবডি এই প্রযুক্তিগত সতর্কতাকে বাধা দেয় এবং মাউস মডেলের জেনেটিক পটভূমি থেকে স্বাধীন পরিবর্তিত NKCC2 ফসফোরিলেশনের একটি নির্ভরযোগ্য সনাক্তকরণের অনুমতি দেয়। তদুপরি, আমাদের গবেষণায় আবার জোর দেওয়া হয়েছে যে মাউস মডেলগুলি বিশ্লেষণ করার সময় জেনেটিক পটভূমির পার্থক্যগুলি বিবেচনা করতে হবে।
উপকরণ এবং পদ্ধতিসমূহ
প্রাণী,পুরুষ বয়সের সাথে মিলিত (6- 8 সপ্তাহ) ইঁদুরগুলি হয় জন্মগত স্ট্রেন 129S6/SvEvTac, C57BL/6J, এইভাবে 129Sv এবং C57BL/6 হিসাবে উল্লেখ করা হয়েছে, অথবা F2 প্রজন্মে একটি মিশ্র হাইব্রিড স্ট্রেন 129S/B6 হিসাবে উল্লেখ করা হয়েছে। সমস্ত প্রাণী পরীক্ষা সুইস প্রাণী কল্যাণ আইন অনুসারে পরিচালিত হয়েছিল এবং জুরিখের ক্যান্টন, সুইজারল্যান্ডের ভেটেরিনারি প্রশাসন দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল (লাইসেন্স: 141/2014, 185/2017 এবং 135/2018)। সারণি S3 এ প্রদত্ত প্রাইমার সহ স্ট্যান্ডার্ড পিসিআর ব্যবহার করে 15টি ঘাঁটি মুছে ফেলার জন্য ইঁদুরগুলিকে জিনোটাইপ করা হয়েছিল। পূর্ণ-দৈর্ঘ্য (f/f) NKCC2 এর একটি প্রত্যাশিত PCR পণ্য 87 bp আছে যখন মুছে ফেলা NKCC2 ক্রম (Δ/Δ) 70 bp-এ প্রত্যাশিত।
টিস্যু প্রক্রিয়াকরণআইসোফ্লুরেন (2 শতাংশ - 4 শতাংশ, 0.5 লি/মিন; প্রোভেট; সিএইচ) এবং টেমজেসিক (বুপ্রেনরফিন; 0।{5}} এর সংমিশ্রণে ইঁদুরকে অ্যানেস্থেশিয়া করা হয়েছিল। 4 মিলিগ্রাম/কেজি শরীরের ওজন; ইন্ডিভোর; সিএইচ)। জৈব রাসায়নিক বিশ্লেষণের জন্য, ফসফেট বাফারযুক্ত স্যালাইন (পিবিএস) দিয়ে ইঁদুরকে অ্যানেস্থেটাইজ করা হয়েছিল এবং হার্টের বাম ভেন্ট্রিকলের মাধ্যমে পারফিউজ করা হয়েছিল। কিডনি এবং দূরবর্তী কোলন সংগ্রহ করা হয়, তরল নাইট্রোজেনে হিমায়িত করা হয় এবং পরবর্তী প্রক্রিয়া না হওয়া পর্যন্ত −80 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়। ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রির জন্য, প্যারাফর্মালডিহাইড (PFA) 3 শতাংশ 0.1 M ফসফেট বাফার (pH 7.4, 300 mOsm) ব্যবহার করে কিডনিগুলিকে গভীরভাবে চেতনানাশক মাউসের রেট্রোগ্রেড পারফিউশন দ্বারা স্থির করা হয়েছিল। 0.1 এম ফস ফেট বাফার (0.2 M NaH 2 PO 4 x H 2 O, 0.2 M NaH 2 PO 4 x 2H 2 O, 0.1 M CaCl 2 ) দিয়ে একটি ছোট ধমনী দিয়ে তারপরে পেটের মহাধমনী। পরবর্তীকালে, কিডনি অপসারণ করা হয়, টুকরো টুকরো করে কেটে তরল প্রোপেনে হিমায়িত করা হয় এবং −80 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়।
বিপাকীয় খাঁচা অধ্যয়নবিপাকীয় খাঁচায় (টেকনিপ্লাস্ট) অভিযোজনের পর, বিপাকীয় খাঁচায় ইঁদুরগুলিকে টানা চার দিন ট্যাপ ওয়াটার এবং স্ট্যান্ডার্ড ল্যাব চাউ (Ssniff, Spezialdiäten GmbH) বিনামূল্যে অ্যাক্সেসের সাথে রাখা হয়েছিল। শরীরের ওজন, খাদ্য এবং জল গ্রহণ প্রতিদিন রেকর্ড করা হয়েছিল এবং 24 ঘন্টা প্রস্রাব এবং মল সংগ্রহ করা হয়েছিল।
জল সীমাবদ্ধতা প্রোটোকলবিপাকীয় খাঁচায় (টেকনিপ্লাস্ট) ইঁদুরগুলিকে 24 ঘন্টার জন্য কলের জলের অ্যাক্সেস ছাড়াই রাখা হয়েছিল। স্ট্যান্ডার্ড ল্যাব চাউ পাউডার (Ssniff, Spezialdiäten GmbH) 1:1 জলে মেশানো হয়েছিল, 24 ঘন্টা প্রস্রাব এবং মল সংগ্রহ এবং বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। 24 ঘন্টা পরে, ইঁদুরগুলিকে আবার স্বাভাবিক খাঁচায় (T 2L (IVC), LASC, UZH) রাখা হয়েছিল।
জৈব রাসায়নিক পরিমাপNa plus , K plus , Ca 2 plus এর প্রস্রাবের ঘনত্ব শিখা ফটোমেট্রি (EFOX 5053, Eppendorf) দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। জুরিখ সেন্টার ফর ইন্টিগ্রেটিভ রডেন্ট ফিজিওলজিতে একটি SYNCHRON LX ® সিস্টেম(গুলি), UniCel ® DxC 800 Synchron ® ক্লিনিকাল সিস্টেম এবং Synchron ® সিস্টেম মাল্টি ক্যালিব্রেটরের সাহায্যে Mg 2 প্লাসের মূত্র এবং প্লাজমা ঘনত্ব পরিমাপ করা হয়েছিল। জাফ পদ্ধতি অনুসরণ করে প্রস্রাবের ক্রিয়েটিনিন পরিমাপ করা হয়েছিল। ভেনা কাভা থেকে রক্ত সংগ্রহের পরপরই ABL825Flex ব্লাড গ্যাস অ্যানালাইজার (রেডিওমিটার) ব্যবহার করে হেপারিনাইজড পুরো রক্তে রক্তের গ্যাস এবং আয়নের ঘনত্ব পরিমাপ করা হয়েছিল। প্লাজমা অ্যালডোস্টেরনের মাত্রা এবং ইউরোমোডুলিন (ইউএমওডি) এর প্রস্রাবের ঘনত্ব বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ ELISA কিটগুলির সাথে পরিমাপ করা হয়েছিল (কেম্যানের অ্যালডোস্টেরন ELISA কিট; #501090 এবং Abcam দ্বারা মাউস Uromodulin ELISA কিট; ab245726)।
রিয়েল টাইম পরিমাণগত পলিমারেজ চেইন প্রতিক্রিয়া (RT- qPCR)
এসভি মোট আরএনএ আইসোলেশন কিট (প্রোমেগা) ব্যবহার করে কিডনি এবং দূরবর্তী কোলন থেকে আরএনএ বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। বিচ্ছিন্ন RNA-এর সমান ঘনত্ব (250 ng in 129Sv vs C57BL/6 বা f/f, Δ/Δ এবং f/Δ তে 500 ng) GoScript™ রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেস কিট (প্রোমেগা) দিয়ে সিডিএনএ-তে বিপরীত প্রতিলিপি করা হয়েছিল। উত্পন্ন সিডিএনএগুলি আরও ডিএনএজ/আরএনএ-মুক্ত জল (1:5) দিয়ে মিশ্রিত করা হয়েছিল। প্রাইমারগুলি মোট Slc12a1, Slc12a3, Trpm6, Trpv5, Scnn1a, Scnn1b, Scnn1g এবং Kcnj1 (টেবিল S3) এর পরিমাণ নির্ধারণের জন্য ডিজাইন করা হয়েছিল। পরিমাণগত PCR বিশ্লেষণ LightCycler ® 480 (Roche) ব্যবহার করে আগ্রহের জিনের অভিব্যক্তি মাত্রা পরিমাপ করা হয়েছিল। রেফারেন্স জিন হিসাবে -actin ব্যবহার করে ডেল্টা Ct পদ্ধতি ব্যবহার করে আপেক্ষিক জিনের অভিব্যক্তি গণনা করা হয়েছিল।
ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণডিটারজেন্ট-মুক্ত লাইসিস বাফারে (DFLB) কিডনি একজাত করা হয়েছিল যাতে ম্যানিটল 200 মিমি, HEPES [4- (2- হাইড্রো জাইলেথাইল)- 1পাইপেরাজিনেথানেসালফোনিক থাকে অ্যাসিড] 80 মিমি, পটাস সিয়াম হাইড্রোক্সাইড 41 মিমি, প্রোটেজ ইনহিবিটরস (কমপ্লিট আল্ট্রা, রোচে) এবং ফসফেটেস ইনহিবিটরস (ফসস্টপ, রোচে) একটি প্রিসেলিস 24 টিস্যু হোমোজেনাইজারে 32টি ম্যাগনা লাইসার গ্রিন বিডস (রোচে) ব্যবহার করে। Bretonneux)। জপমালা সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা 10 মিনিট (1987 rcf) পললযুক্ত ছিল এবং সুপারনাট্যান্ট ধারণকারী প্রোটিন −80 ডিগ্রিতে একক-ব্যবহার-অ্যালিকোটগুলিতে সংরক্ষণ করা হয়েছিল। ওয়েস্টার্ন ব্লটের জন্য, 8 শতাংশ - 12 শতাংশ জেল ব্যবহার করে এসডিএস-পেজ দ্বারা আলাদা করা লায়েমলি বাফারে 50 µg প্রোটিন বিকৃত করা হয়েছিল এবং পরবর্তীকালে নাইট্রোসেলুলোজ ঝিল্লিতে স্থানান্তরিত হয়েছিল। 12 ঘন্টার জন্য 4 ডিগ্রিতে 0.2x ওডিসি ব্লকিং সলিউশনে মিশ্রিত প্রাথমিক অ্যান্টিবডি (টেবিল এস 4) দিয়ে ঝিল্লির ইনকিউবেশন করার আগে 1x ওডিসি ব্লকিং সলিউশন (Li-COR বায়োসায়েন্সেস) ব্যবহার করে অ-নির্দিষ্ট বাঁধাই সাইটগুলি ব্লক করা হয়েছিল। পিবিএস- 0.1 শতাংশ টুইনে ধোয়ার পরে, ঝিল্লিগুলি সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (ছাগল-বিরোধী খরগোশ আইআরডিই 800 বা ছাগল-মাউস-বিরোধী আইআর ডাই 680, 1:10'000, LI - COR বায়োসায়েন্স) 0.1x কেসিন ব্লকিং বাফার (সিগমা) এ মিশ্রিত। সনাক্ত করা ব্যান্ডগুলি ওডিসি ইনফ্রারেড ইমেজিং সিস্টেম (Li-COR Biosciences) দিয়ে কল্পনা করা হয়েছিল। সমান প্রোটিন লোডিং নিশ্চিত করার জন্য, অ্যান্টিবডি সনাক্তকরণের আগে মেমব্রেনগুলিকে অ্যাক্টিনের বিরুদ্ধে অ্যান্টিবডি দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল বা টোটাল প্রোটিনকে REVERT Total Protein Stain (Li-COR Biosciences) ব্যবহার করে দাগ দেওয়া হয়েছিল। ফিজিতে (ImageJ) ইমিউনোরঅ্যাক্টিভ ব্যান্ডের পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল এবং যথাক্রমে অ্যাক্টিন সিগন্যাল বা রিভার্ট মোট প্রোটিন দাগের বিরুদ্ধে স্বাভাবিক করা হয়েছিল।
ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রিক্রায়োস্ট্যাট বিভাগগুলি (বেধ 4 µm) 10 শতাংশ সাধারণ ছাগলের সিরামের সাথে অ-নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি বাঁধার জন্য ব্লক করা হয়েছিল এবং পরবর্তীতে প্রাথমিক অ্যান্টিবডি (টেবিল S4) দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল।
রাতারাতি ৪ ডিগ্রি তাপমাত্রায় 1X PBS দিয়ে ধোয়ার পর, স্লাইডগুলিকে সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (Cy3 – কনজুগেটেড গোট- অ্যান্টি-র্যাবিট IgG, প্রোডাক্ট নম্বর 111- 165- 144, 1:1000 এবং FITC- কনজুগেটেড গোট- অ্যান্টি-মাউস IgG) দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল , পণ্য নম্বর 115- 095- 068, যথাক্রমে 1:100, উভয় জ্যাকসন ইমিউনো রিসার্চ ল্যাবরেটরিজ থেকে) ঘরের তাপমাত্রায় 2 ঘন্টা। সমস্ত অ্যান্টিবডি 1 শতাংশ BSA/1xPBS এ পাতলা করা হয়েছিল। কোষের নিউক্লিয়াস 0.1 μg/mL ঘনত্বে DAPI (4′,6- Diamidino- 2- Fentyl-indole, Sigma-Aldrich, Co.) দিয়ে দাগযুক্ত ছিল। একটি Leica DM6000 B ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ (Leica Microsystems, 35578) একটি Leica DFC350 FX ফ্লুরোসেন্স একরঙা ডিজিটাল ক্যামেরা (Leica Microsystems, 35578) ব্যবহার করে ইমেজিং করা হয়েছিল। ছবিগুলি ফিজিতে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল (ImageJ)।
অ্যাফিনিটি পিউরিফাইড খরগোশ- অ্যান্টি-মাউস pT96 NKCC2 অ্যান্টিবডি তৈরিঅ্যান্টিবডি উত্পাদন পিনেদা অ্যান্টিবডি পরিষেবা (বার্লিন, জার্মানি) দ্বারা সঞ্চালিত হয়েছিল। C57BL/6 মাউস NKCC2 ক্রম (NH2- YYLQ(p) TMDAV-COOH) এর অ্যামিনো অ্যাসিড 105- 114 সমন্বিত ফসফো-পেপটাইড দিয়ে খরগোশকে টিকা দেওয়া হয়েছিল। মনোস্পেসিফিক আইজিজি ভগ্নাংশটি ফসফো-পেপটাইডের বিরুদ্ধে অ্যাফিনিটি শুদ্ধ করা হয়েছিল এবং পরবর্তীতে ডিফসফোপেপটাইডের সাথে প্রাক-শোষিত হয়েছিল যার ফলে একটি ফসফোফর্ম-নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি ভগ্নাংশ তৈরি হয়েছিল। এই ভগ্নাংশের অ্যান্টিবডি নির্দিষ্টতা ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি এবং ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ (চিত্র 5 এবং চিত্র S4) দ্বারা পরীক্ষা করা হয়েছিল।
ফসফেটেস চিকিত্সাপ্রোটিন লাইসেটগুলিকে বাছুরের অন্ত্রের ক্ষারীয় ফসফেটেস (CIAP) (1 U/1 µg প্রোটিন) দিয়ে 37 ডিগ্রিতে 1 ঘন্টা ধরে ফোস-ফোরলেটেড প্রোটিনের 5′-ফসফেট গ্রুপের হাইড্রোলাইসিস প্ররোচিত করা হয়েছিল, যা pT 96 এর নির্দিষ্ট বাঁধনকে বাধা দেয়। নাইট্রোসেলুলোজ ওয়েস্টার্ন ব্লট মেমব্রেনে প্রোটিনের জন্য NKCC2 অ্যান্টিবডি (চিত্র 5B)। C57BL6 ইঁদুর থেকে আর্কাইভ করা প্যারাফিনবেডেড কিডনি ব্যবহার করা হয়েছিল। বাছুরের অন্ত্রের ক্ষারীয় ফসফেটেস (সিগমা অ্যালড্রিচ) ব্যবহার করে বিভাগগুলির চিকিত্সা ছোটখাটো পরিবর্তনের সাথে পূর্বে বর্ণিত হিসাবে সঞ্চালিত হয়েছিল। 56 বিনামূল্যে অ্যালডিহাইড গোষ্ঠীগুলিকে ব্লক করার পরে, বিভাগগুলি ক্ষারীয় ফসফেটেস বাফারে পাঁচবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল (100 মিমি ট্রিস, 50 µm CaCl 2 , 0.1 mm MgCl 2 , 8.4 µm লিউপেপ্টিন, 4 মিমি লিউপেপ্টিন, 4 pH 9.0)। পরে, বিভাগগুলিকে 35 ডিগ্রিতে 2 ঘন্টার জন্য একটি ইনকিউবেটরে বাছুরের অন্ত্রের ক্ষারীয় ফসফেটেস (~ 130 ইউনিট/mL) সহ বা ছাড়া ক্ষারীয় ফসফেটেস বাফারে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি এবং হালকা মাইক্রোস্কোপি পরবর্তীতে বিশদ হিসাবে সঞ্চালিত হয়েছিল। 57
অ্যামিনো অ্যাসিড ক্রম প্রান্তিককরণবিভিন্ন প্রজাতি এবং মাউস স্ট্রেনের জন্য অ্যামিনো অ্যাসিডের ক্রমগুলি খোলা ডেটা বেস "এনসেম্বল জিনোম ব্রাউজার" (www.ensem bl.org, Sanger Institute) থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। 42 ট্রান্সক্রিপ্ট আইডিগুলির উত্সগুলি সারণি S1 এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে৷ কিয়াজেন © CLC মেইন ওয়ার্কবেঞ্চ 20 ব্যবহার করে সিকোয়েন্সগুলি সারিবদ্ধ করা হয়েছিল।
কিডনির টুকরোকিডনিC57BL/6 ইঁদুরের স্লাইসগুলি পূর্বে বর্ণিত হিসাবে প্রাক্তন ভিভো পরীক্ষার জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল। 12 সংক্ষেপে, NKCC2 এবং NCC-এর ফসফোরিলেশন স্তরে খাদ্যতালিকায় আয়ন গ্রহণের যে কোনও সম্ভাব্য প্রভাব এড়াতে ইঁদুরগুলিকে জলের বিনামূল্যে অ্যাক্সেস সহ রাতারাতি উপবাস করা হয়েছিল। চেতনানাশক প্রাণীদের থেকে কিডনি অপসারণ করা হয়েছিল, একটি স্পন্দিত মাইক্রোস্লাইসার (ভাইব্রেটোম, মাইক্রোম; থার্মো সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে 280 µm পুরু টুকরো টুকরো করে কেটে একটি রিঙ্গারের দ্রবণে (মিমিতে) স্থাপন করা হয়েছিল: 98.5 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 Na1 KCl, HPO 4 , 2.5 CaCl 2 , 1.8 MgCl 2 এবং 25 গ্লুকোজ 30 মিনিটের জন্য 30.5 ডিগ্রিতে 95 শতাংশ O 2 এবং 5 শতাংশ CO 2 সহ ধ্রুবক বুদবুদ। পরবর্তীকালে, রিঙ্গার দ্রবণটি অনুরূপ সমাধান দ্বারা প্রতিস্থাপিত হয়েছিল কিন্তু ভিন্ন Cl − (নিম্ন Cl − এর জন্য 5 mM, স্বাভাবিক Cl − এর জন্য 110 mM) এবং K প্লাস ঘনত্ব (স্বাভাবিক K প্লাসের জন্য 3 মিমি, উচ্চ K প্লাসের জন্য 10 মিমি)। অতিরিক্ত 30 মিনিট। অবশেষে, স্লাইসগুলি তরল নাইট্রোজেনে হিমায়িত করা হয়েছিল।
পরিসংখ্যানঅসম বৈচিত্র্যের ক্ষেত্রে অসংযোজিত ছাত্রের টি পরীক্ষা এবং ওয়েলচের পরীক্ষা দুটি গ্রুপের তুলনা করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল (গ্রাফপ্যাড প্রিজম, সংস্করণ 8৷{1}}.2)৷ একাধিক তুলনার জন্য, এক-তরফা বা দ্বি-মুখী ANOVA এর পরে Tukey-এর একাধিক তুলনা পোস্ট-পরীক্ষা করা হয়েছিল (গ্রাফপ্যাড প্রিজম, সংস্করণ 8৷{7}}.2)৷ ডেটা মানে ± SEM (সারণী এবং চিত্রে) হিসাবে প্রদর্শিত হয়। পার্থক্যগুলিকে তাৎপর্যপূর্ণ বলে মনে করা হত যখন P <>
স্বীকৃতি লেখকরা এনসিসি-কেও ইঁদুর প্রদানের জন্য ডঃ গ্যারি শুল (ইউনিভার্সিটি অফ সিনসিনাটি, সিনসিনাইট, ওএইচ), ডঃ বিফ ফরবুশ (ইয়েল স্কুল অফ মেডিসিন, নিউ হ্যাভেন, সিটি) কে তার "R5" pNKCC1 অ্যান্টিবডির জন্য এবং ডঃ হেনরিক ডিমকে ( ইউনিভার্সিটি অফ সাউদার্ন ডেনমার্ক, ওডেন্স, ডেনমার্ক) তার মাউসের মনোক্লোনাল মোট এনসিসি অ্যান্টিবডির জন্য। লেখকরা প্রযুক্তিগত সহায়তার জন্য মনিক ক্যারেল এবং ইঞ্জার মেরেতে পলসেন এবং প্রদানের জন্য ডঃ এজটার ব্যাঙ্কিকে স্বীকার করেছেনকিডনিনমুনা হাড়ের খনিজ ঘনত্ব পরিমাপ এবং প্রস্রাবের অংশ এবং রক্তরস বিশ্লেষণ যথাক্রমে ডঃ পেট্রা সিবেক এবং নাদিন নাগেল (জুরিখ ইন্টিগ্রেটিভ রডেন্ট ফিজিওলজি, ইউনিভার্সিটি অফ জুরিখ) দ্বারা করা হয়েছিল। ডাঃ অ্যালিসিয়া ম্যাকডোনাফ (ইউনিভার্সিটি অফ সাউদার্ন ক্যালিফোর্নিয়া) এবং ডঃ অলিভিয়ার ডিউইস্ট (জুরিখ বিশ্ববিদ্যালয়) এর খুব সহায়ক ইনপুট অত্যন্ত প্রশংসা করেছিলেন।
স্বার্থের সংঘাত JL-এর গোষ্ঠী যথাক্রমে মিলিপুর এবং অ্যাবক্যাম থেকে NCC এবং ফসফরিলেটেড নেড4- 2 এর বিরুদ্ধে লাইসেন্সকৃত অ্যান্টিবডির জন্য রয়্যালটি পায়। উভয় অ্যান্টিবডি বর্তমান গবেষণায় ব্যবহার করা হয়নি। অধিকন্তু, JL 2019 VIFOR এর কাছ থেকে VIFOR আয়োজিত একটি সিম্পোজিয়ামে মৌখিক উপস্থাপনার জন্য সম্মানী পেয়েছে।
