সিস্টানোসাইড অফ সিস্তানচে হার্বা অ্যামেলিওরেটস হাইপক্সিয়া-প্ররোচিত পুরুষ প্রজনন ক্ষতি যা অক্সিডেটিভ স্ট্রেস দমনের মাধ্যমে-Ⅰ

ভূমিকা

বর্তমানে, বিশ্বব্যাপী প্রজনন বয়সের আনুমানিক 48.5 মিলিয়ন (15%) দম্পতি বন্ধ্যাত্ব দ্বারা প্রভাবিত, যার মধ্যে 40-50% ক্ষেত্রে পুরুষ বন্ধ্যাত্বের জন্য দায়ী, এমন একটি অবস্থা যা পরিবেশগত এবং জীবনধারার কারণগুলির সাথে দৃঢ়ভাবে যুক্ত। প্রমাণ থেকে জানা যায় যে কম অক্সিজেনের চাপে স্তন্যপায়ী অণ্ডকোষের সংবেদনশীলতা পুরুষ বন্ধ্যাত্বের কিছু রূপের একটি কার্যকারক কারণ। পূর্ববর্তী গবেষণায় প্রদর্শিত হিসাবে, হাইপোবারিক হাইপোক্সিয়ার সংস্পর্শে আসার পরে শুক্রাণু সৃষ্টি হয় এবং হ্রাস পায়।

PHGS75% ECH 30% ACT 12%

অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়াটি অন্বেষণ করতে, গবেষণায় দেখা গেছে যে হাইপোবারিক হাইপোক্সিয়ার সংস্পর্শে প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতির (ROS) উত্পাদন বৃদ্ধি করে। পুরুষ প্রজনন ব্যবস্থায় ROS একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। নিম্ন স্তরে, এগুলি শুক্রাণুর ক্যাপাসিটেশন, অ্যাক্রোসোম প্রতিক্রিয়া এবং শুক্রাণু-ওসাইট ফিউশনের জন্য প্রয়োজন হয় [10]। যাইহোক, অত্যধিক ROS শুক্রাণুর পারমাণবিক/মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ ক্ষতি এবং প্লাজমা মেমব্রেন পারঅক্সিডেটিভ ক্ষতি প্ররোচিত করতে পারে, যা ফলস্বরূপ প্রধান ইটিওলজিকাল কারণ।পুরুষ বন্ধ্যাত্বের ঝুঁকি বৃদ্ধি. সুতরাং, হাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত ROS জমে পুরুষ বন্ধ্যাত্বের একটি কারণ হতে পারে।

সিস্টানচেস হার্বা, একটি বহুবর্ষজীবী পরজীবী ঔষধি উদ্ভিদ, শুষ্ক এলাকায় ব্যাপকভাবে বিতরণ করা হয় এবং এর ফার্মাকোলজিক্যাল কার্যকলাপের কারণে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়। সব কার্যকর বিষয়বস্তু মধ্যেসিস্টানচেস হার্বা, PhGs প্রধান সক্রিয় উপাদান হিসাবে গণ্য করা হয়েছে. আজ পর্যন্ত, 34টি PhGs থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছেCistanches গাছপালা. সিস্টানোসাইড(Cis), একটি সক্রিয় PhG থেকে বিচ্ছিন্নCistanches Herba, এর অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট প্রভাবের জন্য মনোযোগ পেয়েছে।

সিআইএস-এর অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট প্রভাব এবং হাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত পুরুষ বন্ধ্যাত্বে ROS-এর ভূমিকা বিবেচনা করে, সিআইএস-এর চিকিত্সার জন্য একটি সম্ভাব্য ওষুধ প্রার্থী হিসাবে বিবেচিত হয়।হাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত পুরুষ বন্ধ্যাত্ব. যাইহোক, কিছু প্রতিবেদনে হাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত পুরুষ বন্ধ্যাত্বের চিকিৎসায় বা এর সাথে জড়িত সংকেত পথের চিকিৎসায় Cistanches Herba থেকে সিআইএস-এর অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট প্রভাবের কথা বলা হয়েছে। এই গবেষণায়, ইন ভিট্রো এবং ইন ভিভো হাইপোক্সিয়া পরীক্ষামূলক মডেলগুলি তৈরি করা হয়েছিল এবং বিভিন্ন সিআইএসের প্রভাব উপাদানগুলি মূল্যায়ন করা হয়েছিল।

উপকরণ এবং পদ্ধতিসমূহ

কোষ সংস্কৃতি এবং বিকারক

মাউস স্পার্মাটোগোনিয়া সেল লাইন GC-1spg (GC-1) আমেরিকান টাইপ কালচার কালেকশন (ATCC) থেকে ক্রয় করা হয়েছিল এবং DMEM (Invitrogen, USA) তে 10% ভ্রূণ বোভাইন সিরাম, 1% দিয়ে পরিপূরক করা হয়েছিল L-গ্লুটামিন (100 মিমি), পেনিসিলিন (100 U/mL), এবং স্ট্রেপ্টোমাইসিন (100 ug/mL) 5% CO2 সহ একটি আর্দ্র ইনকিউবেটরে 37 ডিগ্রিতে। Cis (Cis-A, B, C, H) Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (China) থেকে কেনা হয়েছিল।

PHGS75% ECH 30% ACT 12%

কোষের কার্যক্ষমতা পরীক্ষা

কোষের কার্যক্ষমতা সেল কাউন্টিং কিট{{0}} অ্যাস (CCK-8) দ্বারা পরীক্ষা করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, GC-1 কোষগুলি প্রতি কূপে 1.5×103 হারে 96-কূপ প্লেটে বীজ করা হয়েছিল, এবং 24 ঘণ্টার জন্য 37 ডিগ্রিতে কালচার করা হয়েছিল। তারপরে, কোষগুলিকে বিভিন্ন ঘনত্ব (20%, 15%, 10%, 5%) অক্সিজেন বা বিভিন্ন ঘনত্ব (2 μM, 0.2 μM, 0.02 μM) Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। C, Cis-H) প্রয়োজনীয় সময়ের জন্য। তারপরে, সুপারনাট্যান্টটি বাতিল করা হয়েছিল, এবং একটি CCK-8 কিট (ডোজিন্দো জাপান) ব্যবহার করে কোষের কার্যকারিতা সনাক্ত করা হয়েছিল। প্রতিটি কূপের শোষণ একটি মাইক্রোপ্লেট রিডার (বায়োরাড ইউএসএ) ব্যবহার করে 450 এনএম এ পরিমাপ করা হয়েছিল। অবশেষে, কোষের কার্যকারিতাগুলি নিম্নলিখিত সূত্র অনুসারে গণনা করা হয়েছিল: কোষের কার্যক্ষমতা=(OD পরীক্ষামূলক গ্রুপ - ODblank গ্রুপ)/ (ODcontrol group - ODblank গ্রুপ) × 100%।

ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ

সংগ্রহ করা কোষ বা টিস্যু প্রোটিন নিষ্কাশনের জন্য RIPA বাফারে একজাত করা হয়েছিল (RIPA Beyotime China; Cocktail Roche Switzerland)। সুপারন্যাট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল, এবং প্রোটিনের ঘনত্ব বিসিএ পদ্ধতি (বিয়োটাইম) দ্বারা পরীক্ষা করা হয়েছিল। প্রতিটি নমুনা থেকে প্রায় 40 ug বের করা প্রোটিন SDS-PAGE দ্বারা আলাদা করা হয়েছিল এবং একটি নাইট্রোসেলুলোজ (NC) ফিল্টার মেমব্রেনে (Beyotime China) ইলেক্ট্রোট্রান্সফার করা হয়েছিল। NC ফিল্টার মেমব্রেনগুলি 1.5 ঘন্টার জন্য 5% ননফ্যাট দুধ দিয়ে ব্লক করা হয়েছিল এবং নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি (অ্যান্টি-পিএআরপি 1:1000, অ্যান্টি-ক্যাস্পেস-3 1:1000, অ্যান্টি-বিসিএল-2 1:1000, অ্যান্টি-ব্যাক্স 1 :1000, অ্যান্টি-GAPDH 1:1000; সমস্ত অ্যান্টিবডি সেল সিগন্যালিং টেকনোলজি, ইউএসএ থেকে 4 ডিগ্রিতে রাতারাতি কেনা হয়েছিল। তারপরে, সমস্ত এনসি ঝিল্লি ঘরের তাপমাত্রায় 1.5 ঘন্টার জন্য সংশ্লিষ্ট হর্সরাডিশ পারক্সিডেস-কনজুগেটেড সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল এবং একটি ইমেজিং সিস্টেম (ট্যানন, চীন) দিয়ে চিত্রিত হয়েছিল।

কোষ চক্র সনাক্তকরণ

কোষ চক্র বিশ্লেষণ করতে একটি ফ্লো সাইটোমেট্রিক অ্যাস (এফসিএম) করা হয়েছিল। কোষগুলিকে 72 ঘন্টার জন্য বিভিন্ন পরিস্থিতিতে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং ফসল কাটা হয়েছিল। তারপর কোষগুলিকে পিবিএস দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়, 75% ইথানলে স্থির করা হয় এবং প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড (পিআই) দিয়ে দাগ দেওয়া হয়। প্রতিটি নমুনার জন্য, ফ্লো সাইটোমেট্রি (FACS Calibur, BD Biosciences) দ্বারা 1×104 কোষ সংগ্রহ এবং বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। তারপর, G1/S/G2 ফেজ কোষের অনুপাত এবং বিস্তার সূচক [ফেজ(S+G2)/ফেজ(G1+S+G2) × 100%] গণনা করা হয়েছিল।

কি-67 দাগ

কোষগুলিকে একটি কনফোকাল ডিশে সংষ্কৃত করা হয়েছিল এবং 72 ঘন্টার জন্য হাইপোক্সিয়া বা সিআইএসের বিভিন্ন উপপ্রকার দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। 4% প্যারাফর্মালডিহাইড সহ সমস্ত কোষ ঠিক করার পরে, তাদের একটি অ্যান্টি-কি-67 অ্যান্টিবডি (1:200, সেল সিগন্যালিং প্রযুক্তি) দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। তারপরে, সমস্ত কোষ একটি সংশ্লিষ্ট CY-3-সংযোজিত অ্যান্টি-র্যাবিট আইজিজি অ্যান্টিবডি (1:200, বোস্টার, চায়না) এবং DAPI সলিউশন (1.0 ug/mL, Beyotime) দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। ফ্লুরোসেন্স একটি ফ্লুভিউ এফভি1000 কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ (অলিম্পাস, জাপান) দিয়ে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।

টেসটোস্টেরন PHGS75% ECH 30% ACT 12% বৃদ্ধির জন্য শীর্ষ-স্তরের সিস্টানচে টিউবুলোসা নির্যাস

ROS সনাক্তকরণ

DCFH-DA ব্যবহার করে আন্তঃকোষীয় ROS স্তর পরিমাপ করার জন্য FCM চালু করা হয়েছিল। স্থগিত কোষগুলিকে 6-কূপ প্লেটে বীজ দেওয়া হয়েছিল এবং বিভিন্ন চিকিত্সার শিকার হয়েছিল৷ 72 ঘন্টা চিকিত্সার পরে, কোষগুলি 10 μM DCFH-DA (Beyotime) সহ সিরাম-মুক্ত DMEM-এ স্থগিত করা হয়েছিল। ROS বিষয়বস্তু তখন বেকম্যান কাল্টার ফ্লো সাইটোমেট্রি সিস্টেমে ফ্লুরোসেন্স-অ্যাক্টিভেটেড সেল বাছাই দ্বারা 488 এনএম এবং 525 এনএম এর নির্গমন তরঙ্গদৈর্ঘ্য সহ নির্ণয় করা হয়েছিল [18]।

লিপিড পারক্সিডেশন নির্ধারণ (LPO)

এলপিও সনাক্ত করতে থায়োবারবিটুরিক অ্যাসিড প্রতিক্রিয়াশীল পদার্থ (টিবিএআরএস) পরীক্ষা করা হয়েছিল। সমস্ত অপারেটিং পদক্ষেপ নির্দেশাবলী (সিগমা ইউএসএ) অনুযায়ী সঞ্চালিত হয়েছিল। 1.56×105/(M·cm) এর মোলার বিলুপ্তি সহগ ব্যবহার করে ঘনত্ব গণনা করা হয়েছিল, যা একটি মান হিসাবে ম্যালোন্ডিয়ালডিহাইড ব্যবহার করে প্রাপ্ত হয়েছিল। ফলাফল MDA সমতুল্য/mg প্রোটিনের nmol হিসাবে প্রকাশ করা হয়।

এনজাইম ক্রিয়াকলাপ নির্ধারণ

গ্লুটাথিয়ন রিডাক্টেস (জিআর), গ্লুটাথিয়ন পারক্সিডেস (জিপিএক্স), এবং সুপারঅক্সাইড ডিসম্যুটেজ (এসওডি) সহ অ্যাস কিট ব্যবহার করে এনজাইমের ক্রিয়াকলাপগুলি পরীক্ষা করা হয়েছিল। সমস্ত অপারেটিং পদক্ষেপ সরবরাহ করা নির্দেশাবলী অনুসারে সম্পাদিত হয়েছিল (ন্যান জিং জিয়ান চেং বায়োইঞ্জিনিয়ারিং ইনস্টিটিউট চীন)।

প্রাণী এবং পরীক্ষামূলক প্রোটোকল

প্রাপ্তবয়স্ক পুরুষ উইস্টার ইঁদুর (180-220 গ্রাম, 8 ওয়াট পুরানো) চতুর্থ মিলিটারি মেডিকেল ইউনিভার্সিটি, জিয়ান, চীনের পশু কেন্দ্র থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। প্রাণীদের ব্যবহারের জন্য অনুমতি বিশ্ববিদ্যালয়ের নীতিশাস্ত্র কমিটি থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল (রেফারেন্স নম্বর: 20190506)। পরীক্ষাগার প্রাণীদের যত্ন এবং ব্যবহারের জন্য বিশ্ববিদ্যালয়ের নির্দেশিকা অনুসারে প্রাণী পরীক্ষা করা হয়েছিল।

পরীক্ষা শুরু হওয়ার প্রায় 1 সপ্তাহ আগে সমস্ত ইঁদুরকে মানিয়ে নেওয়ার অনুমতি দেওয়া হয়েছিল। অভিযোজনের পরে, ইঁদুরগুলিকে এলোমেলোভাবে প্রতিটি গ্রুপে 5 টি প্রাণী সহ 6 টি গ্রুপে বিতরণ করা হয়েছিল। কন্ট্রোল গ্রুপের ইঁদুরগুলি স্বাভাবিক চাপে উত্থাপিত হয়েছিল (PO2: 20%; বায়ুচাপ: 101.3 kPa), যখন মডেল এবং Cis-চিকিত্সা করা গ্রুপের ইঁদুরগুলি একটি কম চাপের অক্সিজেন চেম্বারে (61.6 kPa এর অভ্যন্তরীণ চাপ) উত্থাপিত হয়েছিল , সমুদ্রপৃষ্ঠ থেকে 4000 মিটার উচ্চতার সমতুল্য PO2: 14.55%) একটি উচ্চ-উচ্চতা হাইপোক্সিক পরিবেশ অনুকরণ করতে। একটি স্বয়ংক্রিয় 12-ঘন্টা আলো/অন্ধকার চক্রের সাথে 22 ± 2 ডিগ্রী এবং আর্দ্রতার অবস্থাতে প্লাস্টিকের খাঁচায় সমস্ত ইঁদুরের খাবার এবং জল বিনামূল্যে অ্যাক্সেস ছিল। মডেল এবং সিআইএস-চিকিত্সা করা গোষ্ঠীর ইঁদুরগুলি হাইপোবারিক অবস্থার অধীনে ছিল তবে প্রতি 96 ঘন্টা অন্তর নরমোবারিক অবস্থায় স্থানান্তরিত হয়েছিল, সেই সময়ে তাদের খাবার এবং জল সরবরাহ করা হয়েছিল এবং খাঁচাগুলি পরিষ্কার করা হয়েছিল। হাইপোবারিক থেকে হাইপোবারিকে রূপান্তরের সময়কাল ছিল প্রায় 2 ঘন্টা। সমস্ত চিকিত্সা গোষ্ঠীগুলিকে 8 সপ্তাহের জন্য মৌখিক গ্যাভেজের মাধ্যমে সংশ্লিষ্ট সিআইএস (8 মিলিগ্রাম/কেজি/ডি) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল, যেখানে নিয়ন্ত্রণ এবং মডেল ইঁদুরগুলিকে সমান পরিমাণে জল দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল।

8 সপ্তাহ পরে, ইঁদুরকে অ্যানেস্থেশিয়ার অধীনে বলি দেওয়া হয়েছিল। টেস্টিস, এপিডিডাইমিস এবং সেমিনাল ভেসিকেলগুলিকে আলাদা করা হয়েছিল এবং ওজন করা হয়েছিল এবং অঙ্গ সূচকটি নিম্নলিখিত সূত্র অনুসারে গণনা করা হয়েছিল: (অঙ্গ/প্রাণীর ওজনের ওজন) × 100%। পরবর্তীকালে, এপিডিডাইমিসে শুক্রাণু সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং তাদের গতিশীলতা এবং অ্যাক্রোসোম এনজাইম কার্যকলাপ পরীক্ষা করা হয়েছিল। একইভাবে, টেস্টিকুলার টিস্যু হিস্টোপ্যাথলজিক স্টাডিজ এবং ROS, LPO এবং অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট এনজাইম কার্যকলাপ সনাক্তকরণের জন্য সংগ্রহ করা হয়েছিল।

CISTANCHE TUBULOSA নির্যাস CISTANCHE হার্ব যৌন শক্তি বৃদ্ধি PHGS75% ECH 30% আইন 12%

লাইভ শুক্রাণুর হারের মূল্যায়ন

এপিডিডাইমিসকে অস্ত্রোপচারের কাঁচি দিয়ে কেটে ফেলা হয়েছিল এবং শুক্রাণু সাসপেনশনটি সাধারণ স্যালাইনে প্রস্তুত করা হয়েছিল। লাইভ শুক্রাণুর হার মূল্যায়ন করতে, শুক্রাণু সাসপেনশনের 5 μL সাবধানে ইওসিন-ওয়াই দাগের সমান পরিমাণে মিশ্রিত করা হয়েছিল। শুক্রাণু তারপর একটি হালকা মাইক্রোস্কোপ অধীনে গণনা করা হয়. জীবন্ত শুক্রাণুর হারগুলি দাগযুক্ত (মৃত শুক্রাণু) এবং দাগহীন শুক্রাণু (জীবন্ত শুক্রাণু) উভয় গণনা করে মূল্যায়ন করা হয়েছিল।

শুক্রাণু অ্যাক্রোসোম এনজাইম কার্যকলাপ নির্ধারণ

শুক্রাণু অ্যাক্রোসোম এনজাইম ক্রিয়াকলাপ পরীক্ষাটি শুক্রাণু অ্যাক্রোসোম এনজাইমগুলি মূল্যায়নের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল [19]। প্রতিটি গ্রুপের ফলাফলগুলি নিম্নলিখিত সূত্র ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল: অ্যাক্রোসোম এনজাইম কার্যকলাপ (μIU)=(ODExperiment group - ODBlank group)/(247.5×10) × 106৷

ফলাফল

জিসি-1 কোষে হাইপক্সিয়ার প্রভাব

জীবাণু কোষে হাইপোক্সিয়ার প্রভাব নির্ধারণের জন্য, আমরা প্রথমে 1, 3, 5 এর জন্য বিভিন্ন অক্সিজেন ঘনত্ব (20%, 15%, 10% এবং 5%) সহ হাইপোক্সিয়া চিকিত্সার পরে কোষের কার্যক্ষমতার পরিবর্তনগুলি পরীক্ষা করেছিলাম। , এবং যথাক্রমে 7 দিন। CCK-8 পরীক্ষার ফলাফলগুলি দেখায় যে নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর (20% অক্সিজেন ঘনত্ব) তুলনায়, হাইপোক্সিয়ার সংস্পর্শে আসা কোষগুলি কার্যক্ষমতাতে উল্লেখযোগ্য হ্রাস প্রদর্শন করেছে (P <0.01; চিত্র 1A)। তদুপরি, তাদের বেঁচে থাকার হার অক্সিজেনের ঘনত্বের বিপরীতভাবে সমানুপাতিক ছিল এবং আনয়ন সময়ের সাথে আরও হ্রাস পেয়েছে। একটি অত্যধিক সাইটোটক্সিক প্রভাব এড়াতে, একটি 10% অক্সিজেন ঘনত্ব এবং 3-দিনের আনয়ন সময়কে পরবর্তীতে ভিট্রো পরীক্ষার জন্য হাইপোক্সিক মডেলের মানদণ্ড হিসাবে নির্বাচিত করা হয়েছিল।

পরবর্তীকালে, হাইপোক্সিয়া চিকিত্সার অধীনে GC{{0}} কোষগুলির বিস্তার পরিবর্তনের আরও মূল্যায়ন করার জন্য এফসিএম এবং ইমিউনোফ্লোরেসেন্স স্টেনিং করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি দেখায় যে হাইপোক্সিয়া G1 পর্বে GC-1 কোষের গ্রেপ্তারকে প্ররোচিত করতে পারে, যার ফলে S পর্বে কোষের প্রবেশ হ্রাস পায় এবং ডিএনএ প্রতিলিপিকে বাধা দেয়। এইভাবে, হাইপোক্সিয়া উল্লেখযোগ্যভাবে GC-1 কোষের বিস্তার সূচক হ্রাস করেছে (P <0.01; চিত্র 1B)। পজিটিভ কি-67 স্টেনিং হল প্রসারিত কোষের আরেকটি নির্দিষ্ট বায়োমার্কার। তাই, আমরা হাইপোক্সিয়া চিকিত্সা সহ বা ছাড়াই কি-67-পজিটিভ কোষের অনুপাত পরীক্ষা করেছি। কন্ট্রোল গ্রুপের সাথে তুলনা করে, হাইপোক্সিয়া চিকিত্সা উল্লেখযোগ্যভাবে কি-67-পজিটিভ কোষকে হ্রাস করেছে, যেমন চিত্র 1C-তে দেখানো হয়েছে।

এর পরে, আমরা হাইপোক্সিয়া দ্বারা প্ররোচিত GC{{0}} কোষের কার্যকারিতা বাধার মোড তদন্ত করার লক্ষ্য রেখেছিলাম। সাহিত্যে যেমন রিপোর্ট করা হয়েছে, ইঁদুরগুলি হাইপোবারিক হাইপোক্সিক পরিবেশের সংস্পর্শে আসার সাথে সাথে ROS-এর স্তর বৃদ্ধি পেয়েছে [8, 20]। তাই, GC-1 কোষে অন্তঃসত্ত্বা ROS স্তরগুলি FCM অ্যাস ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি স্বাভাবিক অক্সিজেন গ্রুপের (পি <0.01; চিত্র 1D) তুলনায় হাইপোক্সিয়ার অধীনে উচ্চতর ROS মাত্রা দেখিয়েছে। জমে থাকা ROS চিহ্নিত ডিএনএ বৈকল্যের কারণ হয়, যার ফলে সেল অ্যাপোপটোসিস পাথওয়ে অ্যাক্টিভেশন হয় এবং পুরুষ বন্ধ্যাত্বের ক্রমবর্ধমান ঝুঁকির জন্য প্রধান ইটিওলজিক্যাল ফ্যাক্টর হতে পারে [২১, ২২]। এরপরে, আমরা TUNEL স্টেনিং দ্বারা GC-1 কোষগুলিতে হাইপোক্সিয়ার অ্যাপোপটোটিক অ্যাক্টিভেশন প্রভাব সনাক্ত করেছি। চিত্র 1E-তে দেখানো হয়েছে, হাইপোক্সিয়ার চিকিত্সার ফলে নিয়ন্ত্রণ গ্রুপের তুলনায় TUNEL ফ্লুরোসেন্স বৃদ্ধি পেয়েছে, যা মডেল গ্রুপে অ্যাপোপটোসিস বৃদ্ধির ইঙ্গিত দেয়।

যেহেতু ROS-প্ররোচিত কোষের ক্ষতি সাধারণত OS দ্বারা সৃষ্ট হয়, তাই আমরা GC-1 কোষের OS পরীক্ষা করেছি। চিত্র 1F-তে উপস্থাপিত হিসাবে, মডেল গ্রুপে GC-1 কোষের LPO স্তরগুলি নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর GC-1 কোষগুলির LPO স্তরের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে৷ এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে হাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত GC-1 কোষের আঘাত OS এর সাথে সম্পর্কিত হতে পারে, যা ROS সঞ্চয় দ্বারা প্ররোচিত হয়।