মাইক্রোঅ্যালবুমিনুরিয়া সহ এবং ছাড়াই ক্যানাইন ডায়াবেটিসে মূত্রনালীর প্রোটিওমের পার্থক্য

সরল সারাংশ

ক্যানাইন ডায়াবেটিস একটি গুরুতর রোগ, যা অনেক জটিলতার কারণ হতে পারে। কুকুরের প্রস্রাবের প্রোটিওমিক্সের সীমিত তথ্য রয়েছে এবং প্রস্রাবের প্রোটিওমে ডায়াবেটিস মেলিটাসের প্রভাব নেই। এই গবেষণায়, আমরা সুস্থ প্রাণীদের থেকে সংগৃহীত প্রস্রাবের প্রোটিন গঠন বিশ্লেষণ করার লক্ষ্য নিয়েছিলাম এবং এটি দুটি ডায়াবেটিক গ্রুপের (নরমোআলবুমিনিউরিক এবং মাইক্রোঅ্যালবুমিনিউরিক) সাথে তুলনা করেছি। এই তিনটি গোষ্ঠীর মধ্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য রয়েছে এবং আমরা বিশ্বাস করি যে চিহ্নিত প্রোটিনগুলি একটি সম্ভাব্য ডায়গনিস্টিক টুল হিসাবে প্রতিশ্রুতি রাখে, যা পরে ক্লিনিকাল অনুশীলনে এবং রোগ সম্পর্কে আরও ভাল বোঝার জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে।

বিমূর্ত

এই সমীক্ষায়, আমরা সুস্থ প্রাণীদের থেকে সংগৃহীত প্রস্রাবের প্রোটিন গঠন বিশ্লেষণ এবং দুটি ডায়াবেটিক গ্রুপের সাথে তুলনা করার লক্ষ্য রেখেছিলাম (DM I normoalbuminuric ডায়াবেটিক কুকুর; DM II ডায়াবেটিক কুকুর মাইক্রোঅ্যালবুমিনুরিয়া সহ)। আমরা সম্ভাব্য প্রস্রাবের প্রোটিনগুলি সনাক্ত করার চেষ্টা করেছি যা মাইক্রোঅ্যালবুমিনুরিয়া দেখা দেওয়ার আগেও ডায়াবেটিক রোগীদের মধ্যে উপরে বা হ্রাস পেতে পারে। পদ্ধতি: প্রস্রাব পাওয়ার পরে, আমরা দ্বি-মাত্রিক ইলেক্ট্রোফোরেসিস করেছি, তারপরে Delta2D সফ্টওয়্যার বিশ্লেষণ, যা MALDI-TOF স্পেকট্রোমেট্রি, পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য ভিন্নভাবে প্রকাশিত প্রোটিনের সাথে নির্বাচন এবং সনাক্তকরণের অনুমতি দেয়। আমাদের গবেষণায় ডায়াবেটিক এবং নিয়ন্ত্রণ গ্রুপ থেকে 2D জেলে 286 টি সাধারণ প্রোটিন দাগ প্রকাশ করা হয়েছে। এই প্রোটিনগুলি থেকে, পাঁচটি ইতিবাচকভাবে মালডি-টফ এমএস দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল। পাঁচটি পার্থক্যকারী প্রোটিনকে আরও মূল্যায়ন করার জন্য, প্যান্থার প্রোগ্রামটি তাদের উপযুক্ত জৈবিক প্রক্রিয়াগুলিতে বরাদ্দ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। উপসংহার: চিহ্নিত প্রোটিনের উল্লেখযোগ্য সংখ্যক অন্তঃকোষীয় সংকেত-ভ্যাসিকল গঠন, বন্ধন এবং ঝিল্লির মাধ্যমে পরিবহনে ভূমিকা পালন করে। এটি পরামর্শ দিতে পারে যে কিডনি ডায়াবেটিক সেলুলার বৈকল্যের প্রথম লক্ষণগুলি কোনও ক্লিনিকাল লক্ষণ দেখা দেওয়ার আগে প্রস্রাবের সংমিশ্রণে দেখা যেতে পারে।

কীওয়ার্ড

কিডনি আঘাত; ডায়াবেটিক নেফ্রোপ্যাথি; ক্যানাইন ডায়াবেটিস মেলিটাস; প্রস্রাব চিহ্নিতকারী; প্রোটোমিক

Cistanche সুবিধা পেতে এখানে ক্লিক করুন

ভূমিকা

ডায়াবেটিস মেলিটাস (ডিএম) একটি অপেক্ষাকৃত সাধারণ এন্ডোক্রিনোপ্যাথি যা বেশিরভাগ মধ্যবয়সী এবং বয়স্ক কুকুরের মধ্যে ঘটে [1,2]। এটি ভাস্কুলোপ্যাথি, সিস্টেমিক হাইপারটেনশন এবং নেফ্রোপ্যাথির মতো অসংখ্য জটিলতার কারণ হতে পারে [1]। তাদের সংক্ষিপ্ত জীবনকালের কারণে, এই জটিলতাগুলি ছোট প্রাণীদের মধ্যে খুব কমই ঘটে তবে উল্লেখযোগ্য রোগ সৃষ্টি করতে সক্ষম [3,4]। স্বতঃস্ফূর্ত ডিএম সহ কুকুরগুলিতে প্রস্রাবের অ্যালবুমিন ঘনত্ব সম্পর্কিত তথ্যের ঘাটতিও রয়েছে। পূর্ববর্তী একটি সমীক্ষায়, 20 শতাংশ ডায়াবেটিক কুকুরের প্রোটিনিউরিক প্রস্রাবের প্রোটিন থেকে ক্রিয়েটিনিন অনুপাত (UPC) > 1 এবং 46 শতাংশ হাইপারটেনসিভ ছিল [5]। মাজি এট আল। 55 শতাংশ ডায়াবেটিক কুকুরের মধ্যে উচ্চতর অ্যালবুমিন ঘনত্বের রিপোর্ট করা হয়েছে, তাদের অর্ধেকেরও বেশি মূত্রের প্রোটিন থেকে ক্রিয়েটিনিন অনুপাত (UPC) [6] এ সমসাময়িক উচ্চতা রয়েছে। অন্য একটি গবেষণায় ডায়াবেটিক রোগীদের মধ্যে মাইক্রোঅ্যালবুমিনুরিয়ার প্রাদুর্ভাব একই স্তরে ছিল, উপরন্তু, প্রাথমিক মূল্যায়নে মাইক্রোঅ্যালবুমিনুরিয়া এবং স্বাভাবিক ইউপিসি সহ তিনটি কুকুরের মধ্যে দুটি অনুদৈর্ঘ্য অধ্যয়নের সময় একটি উন্নত ইউপিসি তৈরি করেছিল [4]।

Urinary proteins are a promising target for detecting kidney injury. Only a minimal amount of proteins is present in normal urine, due to the mechanical barrier of the glomerulus, and the reabsorption in the proximal tubules. Urinary total protein (UTP) contains proteins originating from filtered plasma, lower urinary tract, and kidney-derived proteins. High urinary protein concentration can be a result of nephron dysfunction, as a healthy glomerular filtration barrier excludes proteins larger than 69 kDa, the molecular weight of albumin. Also, it is worth noticing that positively charged proteins pass the glomerular barrier easier than negatively charged ones. In conditions of disease, the glomerular barrier gradually collapses, allowing large amounts of proteins of high, or intermediate weight to pass into the ultrafiltrate. Proteins of small molecular weight (>69 kDa) গ্লোমেরুলাসে অবাধে ফিল্টার করা হয় কিন্তু পরে কিডনি প্রক্সিমাল টিউবুলস দ্বারা পুনরায় শোষিত হয়, তাই প্রাথমিক এবং মাধ্যমিক নলাকার উভয় কর্মহীনতার ফলে প্রোটিনুরিয়া হতে পারে [7]।

প্রোটিওমিক এবং বিপাকীয় গবেষণায় অগ্রগতি আমাদের একক বিশ্লেষণে প্রস্রাবের হাজার হাজার প্রোটিন এবং পেপটাইড সনাক্ত করার ক্ষমতা বাড়িয়েছে - যার মধ্যে কিছু নতুন চিহ্নিতকারী হিসাবে কাজ করতে পারে। প্রোটিনের এই বৃহৎ স্কেল অধ্যয়নকে প্রোটিওমিক্স বলা হয়, যেখানে অন্তঃসত্ত্বা প্রোটিজ কার্যকলাপের দ্বারা উত্পন্ন প্রাকৃতিকভাবে ঘটে যাওয়া পেপটাইডগুলির অধ্যয়নকে পেপটিডোমিক্স বলা হয়। প্রোটোমিক বিশ্লেষণ পশুচিকিত্সা গবেষণার একটি গুরুত্বপূর্ণ হাতিয়ার হয়ে উঠেছে [8-12]। স্বাস্থ্যকর কুকুরগুলিতে ক্যানাইন ইউরিনারি প্রোটিওমের বৈশিষ্ট্য ইতিমধ্যে তদন্ত করা হয়েছে [13]। মূত্রনালী প্রোটোমিক্স এবং পেপটিডোমিক্স অন্তর্নিহিত জীববিদ্যার তদন্তে বিভিন্ন মাত্রা যোগ করে [14]। প্রস্রাবে তাদের প্রয়োগের ডায়াবেটিক কিডনি রোগের জন্য গুরুত্বপূর্ণ ক্লিনিকাল প্রভাব রয়েছে, এই কারণে যে প্রস্রাব আপেক্ষিক সহজে অনাক্রম্যভাবে সংগ্রহ করা যেতে পারে এবং সরাসরি কিডনি দ্বারা উত্পাদিত হয়। যেমন, মূত্রনালীর প্রোটিন এবং পেপটাইডের আপেক্ষিক প্রাচুর্যের পরিবর্তনগুলি ডায়াবেটিক কিডনিতে প্রোটিনের প্রকাশ, জমা বা টার্নওভারের পরিবর্তনগুলি প্রতিফলিত করতে পারে [15]। ডায়াবেটিক কুকুরের বিষয়ে উন্নত ভেটেরিনারি মেডিসিন গবেষণা থাকা সত্ত্বেও, প্রস্রাবের আণবিক গবেষণার রিপোর্ট বিক্ষিপ্ত [১১,১৩,১৪,১৬,১৭]।

এই অধ্যয়নের লক্ষ্য ছিল সুস্থ প্রাণীর প্রস্রাবে প্রোটিন সনাক্ত করা এবং এটি দুটি ডায়াবেটিক গ্রুপের সাথে তুলনা করা (নরমোয়ালবুমিনিউরিক কুকুর এবং মাইক্রোঅ্যালবুমিনুরিয়াযুক্ত কুকুর)। আমরা সম্ভাব্য প্রস্রাবের প্রোটিনগুলি সনাক্ত করার চেষ্টা করেছি যা মাইক্রোঅ্যালবুমিনুরিয়া দেখা দেওয়ার আগেও ডায়াবেটিক রোগীদের মধ্যে উপরে বা হ্রাস পেতে পারে।

Cistanche সম্পূরক এবং Cistanche নির্যাস

উপকরণ এবং পদ্ধতিসমূহ

একটি বহিরাগত জনসংখ্যার সমস্ত কুকুরকে 2018-2020 থেকে দুই বছরের মধ্যে পরপর নথিভুক্ত করা হয়েছিল লুবলিনের ভেটেরিনারি মেডিসিনের প্রাণী রোগবিদ্যা এবং থেরাপি অনুষদের উদ্ভাবনী কেন্দ্রে। সমস্ত নমুনা স্ট্যান্ডার্ড ভেটেরিনারি ডায়গনিস্টিক পদ্ধতির সময় প্রাপ্ত হয়েছিল; এইভাবে, পোলিশ আইন অনুসারে, পশু পরীক্ষায় নৈতিকতার জন্য স্থানীয় কমিশনের অনুমোদনের প্রয়োজন ছিল না যেহেতু চিকিত্সা, আক্রমণাত্মক ডায়াগনস্টিকস, বা অংশগ্রহণকারীদের জন্য মানসিক বা সামাজিক অস্বস্তি সৃষ্টিকারী পদ্ধতি সহ কোনও চিকিত্সা ছিল না। পরীক্ষাগুলি ইউরোপীয় ইউনিয়নের আইন নির্দেশিকা 2010/63/EU এর উপর ভিত্তি করে পরিচালিত হয়েছিল। ARRIVE নির্দেশিকা মেনে গবেষণাটি করা হয়েছিল। কুকুরের মালিকদের গবেষণার পদ্ধতি এবং উদ্দেশ্য সম্পর্কে অবহিত করা হয়েছিল এবং তাদের লিখিত অবহিত সম্মতি দেওয়া হয়েছিল। গবেষণাটি কুকুরের তিনটি গ্রুপের উপর পরিচালিত হয়েছিল: DM I গ্রুপে 7টি নরমালবুমিনিউরিক ডায়াবেটিক কুকুর রয়েছে (4 পুরুষ, 3 জন মহিলা, গড় বয়স: 7); মাইক্রোঅ্যালবুমিনুরিয়া সহ 7টি ডায়াবেটিক কুকুর নিয়ে গঠিত DM II গ্রুপ (3 পুরুষ, 4 মহিলা, গড় বয়স: 8); এইচ গ্রুপে 7টি সুস্থ কুকুর রয়েছে (4টি পুরুষ, 3টি মহিলা, গড় বয়স: 7)।

ক্রমাগত চিহ্নিত হাইপারগ্লাইসেমিয়া (প্লাজমা গ্লুকোজ > 200 mg/dL; 11 mmol/L) এবং রোগের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ ক্লিনিকাল লক্ষণ সহ কুকুরের গ্লুকোসুরিয়া (পলিউরিয়া, পলিডিপসিয়া, ওজন হ্রাস) খুঁজে বের করে ডিএম নির্ণয় করা হয়েছিল।

এছাড়াও, মালিকরা তাদের পোষা প্রাণীদের স্বাভাবিকের তুলনায় জল এবং খাদ্য খরচ, প্রস্রাবের ফ্রিকোয়েন্সি এবং কার্যকলাপের পরিবর্তনগুলি নথিভুক্ত করার জন্য একটি প্রমিত প্রশ্নাবলী সম্পন্ন করেছেন।

একটি অধ্যয়ন গোষ্ঠী হিসাবে, মালিকের দ্বারা উপস্থাপিত মোট 30টি ডায়াবেটিক মিশ্র-প্রজাতির কুকুরের মধ্যে 14টি অন্তর্ভুক্তির জন্য যোগ্য ছিল৷ অন্তর্ভুক্তির প্রয়োজনীয়তাগুলি ছিল: (1) ডায়াবেটিস মেলিটাসের পূর্বের নির্ণয়; (2) কমপক্ষে তিন মাস ইনসুলিন চিকিত্সা দেওয়া হয়; (3) ক্লিনিক্যালি স্থিতিশীল ডায়াবেটিস। বর্জনের মানদণ্ডগুলি ছিল: প্রোটিনুরিয়া (প্রস্রাবের প্রোটিন থেকে ক্রিয়েটিনিনের অনুপাত > 0.5), সক্রিয় মূত্রের পলল, প্যানক্রিয়াটাইটিস, অ্যাড্রিনাল গ্রন্থির হাইপারঅ্যাক্টিভিটি, জরায়ুর পুষ্প প্রদাহ, এবং কিডনি বা মূত্রথলির ব্যাকটেরিয়াজনিত প্রদাহ। একটি নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠী হিসাবে, বিভিন্ন প্রজাতির 7 টি সুস্থ কুকুর অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল। শারীরিক পরীক্ষা, সম্পূর্ণ রক্তকণিকা গণনা, প্লাজমা বায়োকেমিস্ট্রি প্রোফাইল এবং ইউরিনালাইসিসের ভিত্তিতে তাদের সুস্থ বলে বিবেচিত হয়েছিল। কন্ট্রোল গ্রুপটি অধ্যয়ন গোষ্ঠীর সাথে বয়সের সাথে মিলে যাওয়ার জন্য বেছে নেওয়া হয়েছিল।

রক্তচাপ পরিমাপের সাথে ক্লিনিকাল পরীক্ষা, রুটিন জৈব রাসায়নিক এবং হেমাটোলজিকাল রক্ত ​​​​পরীক্ষা এবং প্রতিটি কুকুরের জন্য ইউরিনালাইসিস করা হয়েছিল। প্রতিটি রক্তের নমুনা একটি বন্ধ ভ্যাকুয়াম সিস্টেম ব্যবহার করে ইডিটিএ ধারণকারী একটি টেস্ট টিউবে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং একটি এক্সিগো ভেট বিশ্লেষক (বুলে, স্প্যাঙ্গা, সুইডেন) এ হেমাটোলজিকাল বিশ্লেষণের শিকার হয়েছিল। 4 ◦C তে 15 মিনিটের জন্য 3000 rpm-এ সেন্ট্রিফিউগেশনের পরে প্রাপ্ত প্লাজমা একটি BS-130 স্বয়ংক্রিয় জৈব রাসায়নিক বিশ্লেষক (Mindray, Shenzhen, China) এ বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। রসায়ন প্যানেলে অ্যালানাইন ট্রান্সফারেজ, অ্যাসপার্টেট অ্যামিনোট্রান্সফেরেজ, মোট বিলিরুবিন, ইউরিয়া, ক্রিয়েটিনিন, ক্ষারীয় ফসফেটেস, গ্লুকোজ, অ্যালবুমিন, মোট প্রোটিন, অ্যামাইলেজ, -গ্লুটামিলট্রান্সফেরেজ অন্তর্ভুক্ত ছিল। এনজাইম-এম্প্লিফাইড কেমিলুমিনেসেন্ট অ্যাস (ইমিউলাইট 1000 বিশ্লেষক) ব্যবহার করে সিরাম কর্টিসলের ঘনত্বও নির্ধারণ করা হয়েছিল। ডায়াবেটিক কুকুরের জন্য, সিরাম ফ্রুক্টোসামিন ঘনত্ব ব্যবহার করে গ্লাইসেমিক নিয়ন্ত্রণ অনুমান করা হয়েছিল। অকার্যকর মধ্যধারার প্রস্রাবের নমুনাগুলি সকালে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং প্রতিটি নমুনা সংগ্রহের দিনে 500 × গ্রাম 4 ◦C তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। সুপারনাট্যান্টগুলি সরানো হয়েছিল এবং প্রোটিজ ইনহিবিটরগুলি যুক্ত করা হয়েছিল (প্রোটেজ ইনহিবিটর ককটেল, সিগমা, P8340, স্প্রুস স্ট্রিট, সেন্ট লুইস, MO, USA।) একটি স্বয়ংক্রিয় রসায়ন বিশ্লেষক (Mindray BS{1 }})। UPC নিম্নলিখিত সূত্র ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল: UPC=ইউরিন প্রোটিন (mg/dL)/প্রস্রাব ক্রিয়েটিনিন (mg/dL)। মাইক্রোস্কোপিক পলল বিশ্লেষণ সহ মৌলিক প্রস্রাব বিশ্লেষণ তাজা প্রস্রাবের নমুনাগুলিতে সঞ্চালিত হয়েছিল। প্রস্রাব-নির্দিষ্ট মাধ্যাকর্ষণ (USG) একটি রিফ্র্যাক্টোমিটার ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল। মাইক্রোঅ্যালবুমিনুরিয়া একটি বাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ ELISA পরীক্ষার কিট ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল (ক্যানাইন মাইক্রোঅ্যালবুমিনুরিয়া এলিসা কিট, মাই বায়োসোর্স, সান দিয়েগো, CA, USA)। মাইক্রোঅ্যালবুমিনুরিয়া পরীক্ষা প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে সঞ্চালিত হয়েছিল। অ্যালবুমিনুরিয়া একটি তাজা স্পট প্রস্রাবের নমুনায় ইউরিনারি অ্যালবুমিন-টু-ক্রিয়েটিনিন অনুপাত (UACR) দ্বারা মূল্যায়ন করা হয়েছিল। আরও বিশ্লেষণের জন্য অবশিষ্ট প্রস্রাব −80 ◦C তাপমাত্রায় হিমায়িত করা হয়েছিল।

প্রমিত Cistanche

প্রস্রাবের প্রোটোমিক বিশ্লেষণ

প্রোটোমিক বিশ্লেষণের জন্য, গ্রুপ I (DM I) থেকে 7 টি স্বতন্ত্র প্রস্রাবের নমুনা, গ্রুপ II (DM II) থেকে 7 টি স্বতন্ত্র প্রস্রাবের নমুনা এবং স্বাস্থ্যকর গ্রুপ (এইচ) থেকে 7 টি পৃথক প্রস্রাবের নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল।

প্রতিটি প্রস্রাবের নমুনা অ্যামিকন আল্ট্রা-0 দ্বারা বিশুদ্ধ, ডিসল্ট করা এবং ঘনীভূত করা হয়েছিল। প্রোটিনের ঘনত্ব একটি মাইক্রো-ভলিউম স্পেকট্রোফোটোমিটার (মায়েস্ট্রোনানো, মায়েস্ট্রোজেন, জিনঝু, তাইওয়ান) দিয়ে পরিমাপ করা হয়েছিল এবং প্রস্রাবের নমুনাগুলি প্রস্তুত করা হয়েছিল এবং 2D ইলেক্ট্রোফোরসিসের শিকার হয়েছিল। গ্রাফিকাল এবং পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণের পর মালডি-টফ এমএস (ম্যাট্রিক্স-অ্যাসিস্টেড লেজার ডিসোর্পশন আয়োনাইজেশন-টাইম অফ ফ্লাইট মাস স্পেকট্রোমেট্রি) কৌশলের সাহায্যে ভর স্পেকট্রোমেট্রি দ্বারা আরও শনাক্ত করার জন্য জেল থেকে আগ্রহের প্রোটিনগুলি কেটে নেওয়া হয়েছিল।

1. 2D ইলেক্ট্রোফোরেসিস

দ্বি-মাত্রিক ইলেক্ট্রোফোরেসিস ছিল গবেষণার প্রথম পর্যায় যা প্রস্রাবের প্রোটিন বিচ্ছেদ ঘটায়। সংক্ষেপে, প্রতি 17 সেমি স্ট্রিপে 200 µg প্রোটিন একটি বৃষ্টিপাত কিট (রেডি-প্রিপ™ 2-ডি ক্লিনআপ কিট, বায়ো-র্যাড, হারকিউলিস, CA, USA) মাধ্যমে প্রাপ্ত হয়েছিল . প্রোটিন পেলেটগুলি রিহাইড্রেশন বাফারে দ্রবীভূত করা হয়েছিল (রেডিপ্রেপ 2-ডি রিহাইড্রেশন/নমুনা বাফার 1, বায়োরাড, হারকিউলিস, সিএ, ইউএসএ), এবং ফলস্বরূপ সমাধানগুলি একটি রিহাইড্রেশন প্লেটে প্রয়োগ করা হয়েছিল, 17 সেমি অচলিত পিএইচ গ্রেডিয়েন্ট (IPG) দিয়ে আচ্ছাদিত ) আইসোইলেক্ট্রিক ফোকাসিংয়ের জন্য রৈখিক স্ট্রিপ (রেডিস্ট্রিপ আইপিজি স্ট্রিপস, পিএইচ 3–10, বায়ো-র্যাড, হারকিউলিস, CA, USA) এবং খনিজ তেল (বায়ো-র্যাড, হারকিউলিস, CA, USA)। রিহাইড্রেশনের 12 ঘন্টা পরে, ভেজানো প্রোটিন সহ স্ট্রিপগুলিকে প্রথম মাত্রায় ইলেক্ট্রোফোরেসিস পরিচালনা করার জন্য IEF-100 Hoefer যন্ত্রপাতিতে (Hoefer IEF100, Hoefer, Inc., Holliston, MA, USA) স্থানান্তরিত করা হয়েছিল (প্রক্রিয়ার অবস্থা: 250 V) /30 মিনিট; 10,000 V/3 h; 60 kV/hr., বর্তমান সীমা 50 µA/স্ট্রিপ সহ)। এরপরে, স্ট্রিপগুলিকে 1,4-ডিথিওথ্রিটল এবং আইডোঅ্যাসেটামাইড ইউরিয়া/TRIS/SDS সলিউশনে ক্রমানুসারে ভারসাম্যপূর্ণ করা হয়েছিল। প্রতিটি ভারসাম্য পদক্ষেপ 15 মিনিট স্থায়ী হয়েছিল। ভারসাম্যপূর্ণ স্ট্রিপগুলি তখন ইলেক্ট্রোফোরেসিসের দ্বিতীয় মাত্রার অধীনে তাদের আণবিক ভর দ্বারা 12.5 শতাংশ পলিঅ্যাক্রাইলামাইড জেলে প্রোটিনগুলিকে পৃথক করার জন্য নিম্নলিখিত বর্তমান পরামিতিগুলির সাথে জড়িত ছিল: একটি ইলেক্ট্রোফোরেটিক চেম্বারে 600 V/30 mA/100 W (PROTEAN® II xi, Bio-Rad , হারকিউলিস, CA, USA)। প্রাপ্ত জেলগুলি ফর্মালডিহাইডের উপস্থিতিতে সিলভার নাইট্রেট সহ একটি স্ট্যান্ডার্ড সিলভার-দাগযুক্ত পদ্ধতির শিকার হয়েছিল। দাগ দেওয়ার পরে, জেলগুলি চিত্র স্ক্যানার III (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) ব্যবহার করে স্ক্যান করা হয়েছিল এবং Delta2D সফ্টওয়্যার (সংস্করণ 4.7, DECODON, Greifswald, Germany) দ্বারা প্রক্রিয়া করা হয়েছিল। ম্যানুয়ালি মিথ্যা-ইতিবাচক এবং মিথ্যা-নেতিবাচক দাগগুলি বাদ দেওয়ার পরে পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। Delta2D সফ্টওয়্যারে স্মার্টভেক্টর প্রযুক্তির দ্বারা স্ক্যান করা ছবিগুলিকে বিকৃত করা হয়েছে যার অর্থ প্রকল্পের সমস্ত জেল জুড়ে একই প্রোটিনের দাগের অবস্থান একই ছিল। জেল ইমেজ ওয়ার্পিং ব্যবহার করে জেল ইমেজগুলির মধ্যে পার্থক্যগুলিকে সারিবদ্ধ করতে সক্ষম করে। এরপরে, বিকৃত চিত্রগুলি ফিউজড চিত্র তৈরি করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। একটি ফিউজড ইমেজ পুরো পরীক্ষায় প্রাপ্ত প্রতিটি প্রোটিন স্পট ধারণকারী প্রোটিওম ম্যাপে সাড়া দেয়। অভিব্যক্তি অনুপাত তৈরি করা হয়েছিল, এবং পরিসংখ্যানগুলি একমুখী ANOVA (p-মান 0.05 এর চেয়ে কম বা সমান) এবং একটি পোস্ট-হক Tukey তুলনা পরীক্ষা দ্বারা স্বাভাবিক ভলিউমগুলির উপর তৈরি করা হয়েছিল। ডিথিওথ্রিটল এবং আইডোঅ্যাসেটামাইড দ্রবণ ব্যবহার করে জেল থেকে মনোনীত প্রোটিন দাগ কেটে ফেলা হয়েছিল, আটকানো হয়েছিল, হ্রাস করা হয়েছিল এবং অ্যালকাইলেট করা হয়েছিল। প্রোটিন ধারণকারী জেল টুকরা পেপটাইড টুকরা প্রাপ্ত করার জন্য ট্রাইপটিক হজমের শিকার হয়েছিল। ট্রাইপসিন হজম 50 মিমি অ্যামোনিয়াম বাইকার্বোনেট বাফারে 12 ঘন্টার জন্য 37 ◦C তাপমাত্রায় ঘটেছে (প্রোমেগা, ট্রিপসিন গোল্ড, ম্যাস স্পেকট্রোমেট্রি গ্রেড, টেকনিক্যাল বুলেটিন)। পেপটাইডগুলি পরবর্তীকালে জেলের টুকরোগুলি থেকে জল/অ্যাসিটোনিট্রিল/টিএফএ দ্রবণ (v:v 45:50:5) দিয়ে ট্রিপল নিষ্কাশনের মাধ্যমে নির্গত করা হয়েছিল এবং প্রাপ্ত নির্যাসগুলি ভ্যাকুয়াম অবস্থায় কেন্দ্রীভূত হয়েছিল (ল্যাবকনকো, কানসাস সিটি, এমও, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র)। প্রাপ্ত পেপটাইড পেলেটগুলি 0.1 শতাংশ ট্রাইফ্লুরোঅ্যাসেটিক অ্যাসিডে দ্রবীভূত করা হয়েছিল এবং প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে C18 জিপ-টিআইপি পিপেট টিপস দ্বারা পরিষ্কার করা হয়েছিল (মার্ক কেমিক্যালস, বিলেরিকা, এমএ, ইউএসএ, পিআর 02358, টেকনিক্যাল নোট) এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি অ্যানালাইসিসের জন্য প্রস্তুত করা হয়েছিল।

Cistanche বড়ি

2. ভর স্পেকট্রোমেট্রি

একটি অ্যাঙ্কর চিপ MALDI প্লেটে (Bruker, Bremen, Germany) এক µL প্রস্তুত পেপটাইড দ্রবণ দেখা গেছে। যখন প্রোটিন নমুনাগুলি শুকানো হয়, তখন তাদের পৃষ্ঠগুলি -সায়ানো-4-হাইড্রোক্সিসিনামিক অ্যাসিড ম্যাট্রিক্স (HCCA, ব্রুকার, ব্রেমেন, জার্মানি) এর 1 μL দ্বারা আবৃত ছিল। পেপটাইড স্ট্যান্ডার্ড দ্রবণ (পেপটাইড ক্যালিব্রেশন স্ট্যান্ডার্ড II, ব্রুকার, ব্রেমেন, জার্মানি) ক্রমাঙ্কন দাগের উপর ম্যাট্রিক্স দ্বারাও দাগ এবং আচ্ছাদিত ছিল। ভর স্পেকট্রা 700–4000 m/z রেঞ্জের মধ্যে একটি Ultraflextreme MALDI TOF/TOF (Bruker, Bremen, Germany) স্পেকট্রোমিটার ব্যবহার করে সক্রিয় ইতিবাচক প্রতিফলক মোডে রেকর্ড করা হয়েছিল এবং flexControl 3.3 (Bruker, Bremen, Germany) সফটওয়্যার। সংগৃহীত বর্ণালী মসৃণ করা হয়েছে এবং বেসলাইন সংশোধন করা হয়েছে। flexAnalysis 3.0 সফ্টওয়্যার (Bruker, Bremen, Germany) এ তৈরি করা হয়েছে, > 3-এর সিগন্যাল-টু-আওয়াজ অনুপাতের শীর্ষ তালিকাটি BioTools 3.2 (Bruker, Bremen, Germany) এ স্থানান্তরিত হয়েছে এবং Mascot 2.2 সফ্টওয়্যার (ম্যাট্রিক্স বিজ্ঞান, Boston, MA, USA) সুইস-প্রোট ডাটাবেস ব্যবহার করে "স্তন্যপায়ী" শ্রেণীবিন্যাসে সীমাবদ্ধ সর্বোচ্চ ত্রুটি 0.3 Da এবং বাধ্যতামূলক পরিবর্তন হিসাবে সিস্টাইনের কার্বামিডোমেথিলেশন। 61 এর উপরে একটি মাসকট স্কোর সহ ফলাফলগুলি পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল (p 0.05 এর চেয়ে কম বা সমান); অন্যথায়, নির্বাচিত পেপটাইডের খণ্ড আয়ন স্পেকট্রা LIFT মোড ব্যবহার করে প্রাপ্ত করা হয়েছিল এবং MALDI TOF/TOF সনাক্তকরণের লক্ষ্যের সাথে মিলিত হয়েছিল।

তথ্যসূত্র

1. Hoenig, M. কুকুর এবং বিড়ালের ডায়াবেটিস মেলিটাসের তুলনামূলক দিক। মোল। সেল। এন্ডোক্রিনোল। 2002, 197, 221-229।

2. ডেভিসন, এলজে; Herrtage, ME; ক্যাচপোল, বি. ডায়াবেটিস মেলিটাস যুক্ত যুক্তরাজ্যের 253 টি কুকুরের অধ্যয়ন। পশুচিকিত্সক Rec. 2005, 156, 467-471।

3. হেরিং, আইপি; প্যানসিয়েরা, ডিএল; ভেরে, স্বতঃস্ফূর্ত ডায়াবেটিস মেলিটাস সহ কুকুরের উচ্চ রক্তচাপ, প্রোটিনুরিয়া এবং রেটিনোপ্যাথির এসআর অনুদৈর্ঘ্য প্রবণতা। জে. ভেট ইন্টার্ন মেড. 2014, 28, 488–495।

4. মুনানা, কেআর ডায়াবেটিস মেলিটাসের দীর্ঘমেয়াদী জটিলতা, পার্ট I: রেটিনোপ্যাথি, নেফ্রোপ্যাথি, নিউরোপ্যাথি। পশুচিকিত্সক ক্লিন। N. Am ছোট আনিম। অনুশীলন করুন। 1995, 25, 715-730।

5. স্ট্রাবল, এএল; ফেল্ডম্যান, ইসি; নেলসন, RW; Kass, PH সিস্টেমিক হাইপারটেনশন এবং ডায়াবেটিস মেলিটাস কুকুরের মধ্যে প্রোটিনুরিয়া। জে. এ.এম. পশুচিকিত্সক মেড. এসোসি. 1998, 213, 822-825।

6. মাজি, এ.; ফ্র্যাকাসি, এফ.; ডন্ডি, এফ.; জেন্টিলিনি, এফ.; ফ্যামিগলি বার্গ্যামিনি, পি. ডায়াবেটিস মেলিটাস এবং হাইপারঅ্যাড্রেনোকোর্টিসিজম সহ কুকুরে মূত্রের প্রোটিন থেকে ক্রিয়েটিনিন এবং অ্যালবুমিন থেকে ক্রিয়েটিনিনের অনুপাত। পশুচিকিত্সক Res. কমুন 2008, 32 (সরবরাহ S1), S299–S301।

7. ডি'অ্যামিকো, জি.; বাজ্জি, সি. প্রোটিনুরিয়ার প্যাথোফিজিওলজি। কিডনি Int. 2003, 63, 809-825।

8. বানাচ, টি.; Adaszek, Ł.; ওয়াইলুপেক, ডি.; উইনিয়ারজিক, এম.; Winiarczyk, S. ভর স্পেকট্রোমেট্রি MALDI-TOF ব্যবহার করে প্রস্রাবের প্রোটোমিক বিশ্লেষণে 2D জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস এবং লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফির প্রয়োগযোগ্যতা। পোল জে. ভেট বিজ্ঞান 2013, 16, 587-592।

9. ডি ফ্রেইটাস ক্যাম্পোস, সি.; কোল, এন.; ডাইক, ডিভি; ওয়ালশ, বিজে; Diakos, P.; আলমেইডা, ডি.; Torrecilhas, A.; লাউস, জেএল; উইলকক্স, এমডিপি প্রোটিওমিক অ্যানালাইসিস অফ ডগ টিয়ার্স ফর পটেনশিয়াল ক্যান্সার মার্কার। Res. পশুচিকিত্সক বিজ্ঞান 2008, 85, 349-352।

10. উইনিয়ারজিক, ডি.; উইনিয়ারজিক, এম.; উইনিয়ারজিক, এস.; মিচালক, কে.; Adaszek, Ł. ডায়াবেটিক কুকুর থেকে প্রাপ্ত টিয়ার ফিল্মের প্রোটোমিক বিশ্লেষণ। প্রাণী 2020, 10, 2416।

11. উইনিয়ারজিক, ডি.; মিচালক, কে.; Adaszek, L.; উইনিয়ারজিক, এম.; Winiarczyk, S. Babesiosis সময় কিডনি আঘাত সহ কুকুরের মূত্রনালীর প্রোটিওম। BMC পশুচিকিত্সক Res. 2019, 15, 439।

12. ফ্রাঙ্কো-মার্টিনেজ, এল.; গেলমানভিক, এ.; হরভাটিক, এ.; Contreras-Aguilar, MD; Mrljak, V.; সেরন, জেজে; মার্টিনেজ-সুবিয়েলা, এস.; Tvarijonaviciute, A. ডায়াবেটিস মেলিটাস সহ কুকুরের সিরাম এবং লালা প্রোটিওম। আনিম। Open Access J. MDPI 2020, 10, 2261।

13. ব্র্যান্ডট, এলই; Ehrhart, EJ; শেরম্যান, এইচ.; ওলভার, সিএস; বোহন, এএ; প্রেনি, জেই ক্যানাইন ইউরিনারি প্রোটিওমের বৈশিষ্ট্য। পশুচিকিত্সক ক্লিন। পথোল। 2014, 43, 193-205। [ক্রসরেফ] [পাবমেড]

14. ফেরলিজা, ই.; ইসানি, জি.; ডন্ডি, এফ.; আন্দ্রেয়ানি, জি.; Vasylyeva, K.; বেলেই, ই.; আলমেইডা, এএম; Matzapetakis, M. ইউরিনারি প্রোটিওম এবং কুকুরের মেটাবোলোম (ক্যানিস লুপাস ফ্যামিলিয়ারিস): দীর্ঘস্থায়ী কিডনি রোগের প্রভাব। জে. প্রোটিওম। 2020, 222, 103795।

15. ভ্যান, জেএডি; স্কোলি, জেডব্লিউ; কনভালিঙ্কা, এ. ইউরিনারি প্রোটোমিক্স এবং বায়োইনফরমেটিক্স ব্যবহার করে ডায়াবেটিক কিডনি রোগের অন্তর্দৃষ্টি। জে. এ.এম. সমাজ নেফ্রোল। 2017, 28, 1050-1061।

16. Nabity, MB; লিস, জিই; ড্যাঙ্গট, এলজে; সিয়ানসিওলো, আর.; সুচোডোলস্কি, জেএস; স্টেইনার, প্রগতিশীল গ্লোমেরুলার ডিজিজের ক্যানাইন মডেলে টিউবুলোইন্টারস্টিশিয়াল ইনজুরির প্রাথমিক পর্যায়ে পুরুষ কুকুর থেকে প্রস্রাবের জেএম প্রোটোমিক বিশ্লেষণ। পশুচিকিত্সক ক্লিন। পথোল। 2011, 40, 222-236।

17. পেল্যান্ডার, এল.; Brunchault, V.; বাফিন-মেয়ার, বি.; ক্লেইন, জে.; ব্রুইল, বি.; Zürbig, P.; Magalhães, P.; মুলেন, ডব্লিউ.; এলিয়ট, জে.; সাইম, এইচ.; ইত্যাদি কুকুরের দীর্ঘস্থায়ী কিডনি রোগ নির্ণয়ের জন্য মূত্রনালী পেপটিডোম বিশ্লেষণ। পশুচিকিত্সক জে. 2019, 249, 73-79।

ডাগমারা উইনিয়ারকজিক 1, মাতেউস উইনিয়ারকজিক 2, কাতারজিনা মিচালক 3, স্ট্যানিসলাও উইনিয়ারজিক 3 এবং লুকাসজ অ্যাডাসজেক 3

1 ছোট প্রাণীর অভ্যন্তরীণ রোগ বিভাগ, ইউনিভার্সিটি অফ লাইফ সায়েন্সেস অফ লুবলিন, 20-400 লুবলিন, পোল্যান্ড

2 Department of Vitreoretinal Surgery, Medical University of Lublin, 20-059 Lublin, Poland; winiarm86@gmail.com

3 এপিজুটিওলজি বিভাগ, ইউনিভার্সিটি অফ লাইফ সায়েন্সেস অফ লুবলিন, 20-400 লুবলিন, পোল্যান্ড; artica@wp.pl (কেএম); genp53@interia.pl (SW); ukaszek0@wp.pl (Ł.A.)