পার্ট 3:ড্রোসোফিলা কেনিয়ন কোষ থেকে ম্যাগনেসিয়াম প্রবাহ স্বাভাবিক এবং ডায়েট-বর্ধিত দীর্ঘমেয়াদী স্মৃতির জন্য গুরুত্বপূর্ণ

আরো তথ্যের জন্য:ali.ma@wecistanche.com

অনুগ্রহ করে পার্ট 2-এ এখানে ক্লিক করুন

ক্লিক করুনমেমরির জন্য সিস্টানচে সুবিধা এবং পার্শ্ব প্রতিক্রিয়া

প্রাপ্তবয়স্ক মাছিদের মধ্যে সীমাবদ্ধ ছিল, পরামর্শ দেয় যে নিউরোনাল ফিজিওলজিতে UEX-এর আরও টেকসই ভূমিকা রয়েছে। বিপরীতে, abs বা a{{0}}b0 নিউরনে uex এক্সপ্রেশন ছিটকে দেওয়া LTM কে ক্ষতিগ্রস্ত করেনি। একটি 0 b0 নিউরনের কার্যকলাপ ক্ষুধার্ত এলটিএম (ক্র্যাশ এবং ওয়াডেল, 2008) একত্রিত করার জন্য প্রশিক্ষণের পরে প্রয়োজন, যেখানে abc এবং abs KC আউটপুট, একসাথে এবং আলাদাভাবে, এর অভিব্যক্তির জন্য প্রয়োজনীয় (Krashes and Waddell, 2008; Perisse et al., 2013)। সুতরাং, abs এবং a0b0 নিউরনে uex লস-অফ-ফাংশন সহ মাছিগুলিতে স্বাভাবিক LTM কার্যকারিতা পর্যবেক্ষণ করা uex ম্যানিপুলেট করার সময় ab নিউরোনাল ফাংশনের একটি সাধারণ ঘাটতির বিরুদ্ধে যুক্তি দেয়।

খাদ্যতালিকাগত Mg2 প্লাস মাছিদের ত্রুটিপূর্ণ LTM কর্মক্ষমতা বাড়াতে পারেনি যা গঠনগতভাবে uex মিউট্যান্ট বা KC-সীমাবদ্ধ uex ক্ষতি-অফ-ফাংশনকে আশ্রয় করে। যাইহোক, uex মিউট্যান্ট ফ্লাইসের ab KC-তে uex প্রকাশ করার ফলে কর্মক্ষমতা বাড়ানোর জন্য Mg2 plus-এর ক্ষমতা পুনরুদ্ধার করা হয়েছে। অতএব, ab KCs হল Mg2 প্লাস-বর্ধিত-এর জন্য সেলুলার লোকাসস্মৃতিমাছি

এটি সম্ভবত বিপরীতমুখী বলে মনে হচ্ছে যে UEX-নির্দেশিত ম্যাগনেসিয়াম প্রবাহকে সমর্থন করার জন্য KC-তে প্রয়োজনস্মৃতি- Mg2 প্লাস খাওয়ানোর প্রভাব বৃদ্ধি করে, যখন খাদ্যতালিকায় Mg2 প্লাস KC [Mg2 প্লাস ]i বাড়ায়। এই পর্যায়ে, আমরা কেবল অনুমান করতে পারি কেন এটি এমন। আমরা অনুমান করি যে মস্তিষ্ক এবং ab KCs, বিশেষ করে, খাদ্যতালিকাগত পরিপূরকের ফলে আন্তঃকোষীয় এবং বহির্মুখী Mg2 প্লাসের উচ্চ স্তরের সাথে একটি ভারসাম্যপূর্ণ উপায়ে মানিয়ে নিতে হবে। ওয়াইল্ড-টাইপ এবং uex মিউট্যান্ট মস্তিষ্কে KC [Mg2 plus ]i-এর আমাদের লাইভ-ইমেজিং পরামর্শ দেয় যে UEX-নির্দেশিত প্রবাহ এই উচ্চ স্তরের সক্রিয়, এবং সম্ভবত উদ্দীপনা-উদ্দীপক, হোমিওস্ট্যাটিক রক্ষণাবেক্ষণের একটি অপরিহার্য কারণ হতে পারে।

বেশ কয়েকটি স্তন্যপায়ী কোষ-প্রকার একটি সিএএমপি-নির্ভর পদ্ধতিতে Mg2 প্লাসকে বের করে দেয়, বি-অ্যাড্রেনার্জিক উদ্দীপনার সংস্পর্শে আসার কয়েক মিনিট পরে (রোমানি এবং স্কারপা, 2000; ভারম্যান এবং গুন্থার, 1987; জ্যাকব এট আল।, 1989; রোমানি এবং স্কারপা, 1990b; রোমানি এবং স্কারপা, 1990a; ভোরম্যান এবং গুন্থার, 1987; গুন্থার এট আল।, 1990; হাওয়ার্থ এট আল।, 1994)। একটি CNBH ডোমেনের উপস্থিতি পরামর্শ দেয় যে UEX এবং CNNM সরাসরি CAMP দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হতে পারে। আমরা একটি R622K অ্যামিনো অ্যাসিড প্রতিস্থাপন প্রবর্তন করে CNBH এর গুরুত্ব পরীক্ষা করেছি যা UEX CNBH-এ cAMP বাইন্ডিং ব্লক করবে। এই সূক্ষ্ম মিউটেশনটি uex মিউট্যান্ট ফ্লাইসে LTM কর্মক্ষমতা পুনরুদ্ধার করার uexR622K ট্রান্সজিনের ক্ষমতাকে বিলুপ্ত করেছে। আমরা স্থানীয় uex লোকাসে CNBH পরিবর্তন করতে CRISPR ব্যবহার করেছি। যদিও CNNM4 থেকে CNBH মুছে ফেলার ফলে Mg2 প্লাস ইফ্লাক্স অ্যাক্টিভিটি (চেন এট আল।, 2018) বিলুপ্ত হয়ে যায়, UexT626NRR ক্ষতের জন্য সমজাতীয় মাছিগুলি কার্যকর ছিল, এটি প্রমাণ করে যে তারা পর্যাপ্ত স্তরের UEX ফাংশন ধরে রেখেছে। যাইহোক, এই মাছিগুলি অবিলম্বে এবং দীর্ঘমেয়াদী প্রতিবন্ধী প্রদর্শন করেস্মৃতি. উপরন্তু, uexT626NRR মাছিদের কর্মক্ষমতা Mg2 প্লাস খাওয়ানোর দ্বারা উন্নত করা যায়নি। এই তথ্যগুলি দেখায় যে একটি অক্ষত CNBH এর একটি গুরুত্বপূর্ণ উপাদানস্মৃতি- প্রাসঙ্গিক UEX ফাংশন। CNNM4 CNBH-তে ক্ল্যাথ্রিন অ্যাডাপ্টার প্রোটিনের বাঁধাই বেসোলেটারাল টার্গেটিং (হিরাটা এট আল।, 2014) এর সাথে জড়িত ছিল, পরামর্শ দেয় যে UEXT626NRR কে কেসিগুলিতে অনুপযুক্তভাবে স্থানীয়করণ করা যেতে পারে। অধিকন্তু, CNNM2 E122K মিউট্যান্ট ভেরিয়েন্টের KC এক্সপ্রেশন, যা অবশিষ্ট ফাংশন ধরে রাখে

কিন্তু পাচারের ত্রুটি আছে (Arjona et al., 2014), uex LTM ত্রুটি পুনরুদ্ধার করেনি।

যদিও CNNM2/3 CNBH ডোমেইনগুলি চক্রীয় নিউক্লিওটাইডগুলিকে আবদ্ধ করে কিনা তা নিয়ে প্রশ্ন করা হয়েছে (চেন এট আল।, 2018), আমরা দেখতে পেলাম যে FSK ab KC [Mg2 plus ]i-এর বৃদ্ধির উদ্রেক করেছে যা uex মিউটেশনের জন্য সংবেদনশীল ছিল, এবং সেই UEX: :HA rut2080 adenylate cyclase (Han et al., 1992) এবং dnc1 phosphodiesterase (Dudai et al., 1976) ত্রুটিপূর্ণ মিউট্যান্ট মাছি শেখার ক্ষেত্রে ভুল স্থানান্তরিত হয়েছিল। যেখানে UEX::HA লেবেলটি বন্য ধরণের মাছিগুলিতে g, abc এবং abs KCগুলিতে সমানভাবে বিতরণ করা হয়েছিল, UEX::HA লেবেলটি g এবং abs KCগুলিতে হ্রাস পেয়েছে এবং rut2080 এবং dnc1 মিউট্যান্টগুলিতে abc নিউরনে শক্তিশালী ছিল। মিউট্যান্টদের মধ্যে সিএএমপি-এর দীর্ঘস্থায়ী হেরফেরগুলি তাই সিএএমপি প্রভাবিত করে ইউএক্স স্থানীয়করণের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, সম্ভবত সিএনবিএইচ-এর সাথে যোগাযোগ করে। উপরন্তু, পরিবর্তিত UEX স্থানীয়করণ অবদান রাখতে পারেস্মৃতিrut2080 এবং dnc1 ফ্লাইসের ত্রুটি।

স্তন্যপায়ী কোষের সংস্কৃতিতে ম্যাগনেসিয়াম গ্রিন ব্যবহার করে আমাদের শারীরবৃত্তীয় ডেটা এবং ab KCs-তে জেনেটিকালি এনকোড করা ম্যাজিক রিপোর্টার দেখায় যে ফ্লাই UEX Mg2 প্লাস প্রবাহকে সহজতর করে। FSK-এর সাহায্যে ফ্লাই ব্রেইনকে উদ্দীপিত করার ফলে উয়েক্স মিউট্যান্ট ব্রেইনে ab KC [Mg2 plus ]i বৃদ্ধি পেয়েছে বন্য ধরনের নিয়ন্ত্রণের তুলনায় যা প্রথম প্রমাণ দেয় যে UEX ড্রসোফিলা KC-তে [Mg2 প্লাস]i বৃদ্ধিকে সীমিত করে। আমাদের ম্যাজিক রেকর্ডিংগুলি এবি কেসি [Mg2 প্লাস ]i-এর একটি ধীর দোলন (0.015 Hz কেন্দ্রিক, প্রায় মিনিটে একবার) প্রকাশ করেছে যা UEX-এর উপর নির্ভরশীল। আমরা এখনও এই [Mg2 প্লাস ]i ওঠানামার শারীরবৃত্তীয় ফাংশন বুঝতে পারি না যদিও এটি সম্ভবত কোষের হোমিওস্ট্যাটিক সিস্টেম-স্তরের সম্পত্তি প্রতিফলিত করে। জৈব রাসায়নিক দোলনীয় কার্যকলাপ সেলুলার ফিজিওলজির অনেক দিকগুলিতে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে (নোভাক এবং টাইসন, 2008)। সবচেয়ে উল্লেখযোগ্যভাবে, [Mg2 প্লাস ]i এর সার্কাডিয়ান টাইমড ওঠানামা Mg2 প্লাস সংবেদনশীল mTOR (র্যাপামাইসিনের যান্ত্রিক লক্ষ্য) পথের মাধ্যমে গতিশীল সেলুলার শক্তি বিপাককে ঘড়ি-নিয়ন্ত্রিত অনুবাদের সাথে সংযুক্ত করে (ফিনি এট আল।, 2016)। অতএব, এটা সম্ভব যে ধীর Mg2 প্লাস দোলনগুলি CAMP, UEX, শক্তি প্রবাহ (Plac¸ais et al., 2017), এবং MTOR-নির্ভর অনুবাদ অন্তর্নিহিত LTM- প্রাসঙ্গিক সিনাপটিক প্লাস্টিসিটির জন্য ভূমিকা একত্রিত করতে পারে (ক্যাসাডিও এট আল।, 1999 ; Huber et al., 2000; Beaumont et al., 2001; Hou and Klann, 2004; Hoeffer et al., 2008)।

বিকারক এবং সম্পদ ভাগ করার জন্য যোগাযোগ করুন

বিকারকগুলির একটি সম্পূর্ণ তালিকা মূল সম্পদ সারণীতে দেখা যেতে পারে।

সম্পদ এবং রিএজেন্টগুলির জন্য আরও তথ্য এবং অনুরোধ লিড কন্টাক্ট, স্কট ওয়াডেল (scott.waddell@cncb.ox.ac.uk) এর কাছে নির্দেশিত হওয়া উচিত এবং তা পূরণ করা হবে৷

পরীক্ষামূলক মডেল এবং বিষয় বিবরণ

মাছি স্ট্রেন

অন্যথায় বলা না হলে, 60 শতাংশ আর্দ্রতা এবং 25˚C তাপমাত্রায় 12 ঘণ্টার হালকা-অন্ধকার চক্রের অধীনে মানক কর্নমিল খাবারে মাছি জন্মেছিল। GAL80ts পরীক্ষার জন্য পরীক্ষা এবং নিয়ন্ত্রণ মাছিগুলি 18˚C তাপমাত্রায় উত্থাপিত হয়েছিল। পরীক্ষায় 1–7-দিন বয়সী মিশ্র যৌন মাছি ব্যবহার করা হয়েছিল৷

ক্যান্টন-এস ছিল বন্য ধরনের স্ট্রেন। এই গবেষণায় ব্যবহৃত GAL4 ড্রাইভার লাইনগুলি হল c739-GAL4 (McGuire et al., 2001), c305a-GAL4 (Krashes et al., 2007), NP7175-GAL4 (Tanaka et al., 2004), 0770-GAL4 (Gohl et al., 2011), MB247-GAL4 (Zars et al., 2000), nSyb-GAL4 (Bloomington Drosophila Stock Centre, BDSC 51635), elav-GAL4 (BDSC, 8765), এবং uex-GAL4 (Kvon et al., 2014); ভিয়েনা ড্রোসোফিলা রিসোর্স সেন্টার, VDRC, VT23256-GAL4)। স্টক সেন্টার থেকে প্রাপ্ত UAS লাইনগুলি হল UAS-CD8::GFP (BDSC, 5136), UAS-NmdarRNAi (BDSC, 25941), এবং UAS-uexRNAi (BDSC, 36116)। বিভিন্ন মিউট্যান্ট এবং ট্রান্সজেনিক লাইন বর্ণনা করা হয়েছে, uexMI01943 (Venken et al., 2011; BDSC, 32805), uexNC1 (BDSC, 7167), rut2080 (Han et al., 1992), এবং dnc1 (Dudai et al. 97,)। , tubP- GAL80ts (McGuire et al., 2003) এবং PhsILMiT (BDSC, 24613)। uexMI01943.ex1 এবং uexMI01943.ex2 Minos এক্সিশন লাইনগুলি Arc et al., 1997-এ বর্ণিত পদ্ধতি ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছে। বিস্তারিত মিলন স্কিম চিত্র 2-চিত্র সম্পূরক 2A-তে দেখানো হয়েছে। হলুদ শরীরের রঙের ফিনোটাইপ প্রদর্শনকারী পৃথক মাছি থেকে সম্ভাব্য ছেদন লাইন স্থাপন করা হয়েছিল। জিনোমিক ডিএনএ এই ধরনের ছয়টি লাইন থেকে বের করা হয়েছিল এবং ডিএনএকে uexMI01943 MiMIC-এর পাশে পিসিআর দ্বারা প্রশস্ত করা হয়েছিল এবং ক্রম করা হয়েছিল। uexMI01943.ex1 এবং uexMI01943.ex2 লাইনগুলিকে সুনির্দিষ্ট বর্ধনের জন্য চিহ্নিত করা হয়েছিল, বন্য-প্রকার জিনোমিক ক্রম পুনরুদ্ধার করে। পিসিআর এবং সিকোয়েন্সিং প্রাইমার সিকোয়েন্সের জন্য রিসোর্স টেবিল দেখুন। uexMI01943 MiMIC সন্নিবেশের ক্রম বিশদ বিবরণের পরিকল্পিত এবং ছেদন চিত্র 2-চিত্র সম্পূরক 2B-তে দেখানো হয়েছে। ইউএএস-ইউএক্স ট্রান্সজেনিক মাছি নির্মাণের জন্য RT-PCR দ্বারা একটি পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের uex কোডিং সিকোয়েন্স (CDS) ক্লোন করা হয়েছিল। মোট আরএনএ TRIZOL (থার্মো ফিশার, 15596018) ব্যবহার করে বন্য ধরণের মাছি থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং সুপারস্ক্রিপ্ট III ফার্স্ট-স্ট্র্যান্ড সংশ্লেষণ সিস্টেম (ইনভিট্রোজেন, 18080400) ব্যবহার করে সিডিএনএ-তে প্রতিলিপি করা হয়েছিল। এই মোট সিডিএনএ মিশ্রণটি ইউএক্স সিডিএস প্রশস্ত করার জন্য একটি টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। প্রাইমার সিকোয়েন্সের জন্য রিসোর্স টেবিল দেখুন। পিসিআর পণ্যটি SacII এবং XhoI দিয়ে হজম করা হয়েছিল এবং তারপরে pUAST এর পরিপূরক সাইটগুলিতে সংযুক্ত করা হয়েছিল (Brand and Perrimon, 1993)। pUAST ক্লোন করা uex CDS সম্পূর্ণরূপে সিকোয়েন্সড এবং যাচাই করা হয়েছিল বন্য-টাইপ uex cDNA রিডিং ফ্রেমের 2505 bp প্রতিনিধিত্ব করার জন্য (দ্রষ্টব্য, সমস্ত চারটি সম্ভাব্য uex mRNA আইসোফর্ম, ফ্লাইবেস রিলিজ 6, একই 834 অ্যামিনো অ্যাসিড প্রোটিন এনকোড)। UAS-uex ট্রান্সজেনিক মাছি pUAST-uex ভেক্টরের সাথে রূপান্তরের মাধ্যমে বাণিজ্যিকভাবে (বেস্টজিন) তৈরি করা হয়েছিল। আমরা 10টি স্বাধীন ট্রান্সজেনিক লাইনের UAS-uex ক্রোমোজোম সন্নিবেশ ম্যাপ করেছি এবং আচরণগতভাবে তিনটি লাইন পরীক্ষা করেছি, তৃতীয় ক্রোমোজোমে একটি সন্নিবেশ সহ UAS-uex3M, UAS-uex5M এবং UAS-uex8M নির্দেশিত। UAS-uex3M মাছিগুলি পুরো গবেষণায় ব্যবহৃত হয়েছিল এবং পাণ্ডুলিপিতে UAS-uex হিসাবে উল্লেখ করা হয়েছিল।

UAS-uexR622K ট্রান্সজেনিক মাছি UAS-uex মাছির মতোই তৈরি হয়েছিল। CNBH ডোমেনের মধ্যে UEX-এর কোডন 622-এ একটি মিসেন্স মিউটেশন প্রবর্তন করা হয়েছিল, যা পূর্বে প্রোটিন কিনেস এ (বুবিস এট আল।, 1988) এর নিয়ন্ত্রক সাবইউনিটের সিএএমপি-বাইন্ডিং ডোমেনে তৈরি করা হয়েছিল। মিউটেশন CGT কোডন এনকোডিং Arg-কে AAA এনকোডিং Lys-এ পরিবর্তন করে। মিউটেশনটি গিবসন অ্যাসেম্বলি মাস্টার মিক্স (নিউ ইংল্যান্ড বায়োল্যাবস, E2621S) ব্যবহার করে ওয়াইল্ড-টাইপ ইউএক্স সিডিএসে প্রবর্তন করা হয়েছিল যেমন 'গিবসন অ্যাসেম্বলি মাস্টার মিক্স ব্যবহার করে সাইট-নির্দেশিত মিউটেজেনসিসের জন্য উন্নত পদ্ধতি' (এনইবি অ্যাপ্লিকেশন নোট) বর্ণনা করা হয়েছিল। ব্যবহৃত প্রাইমার সেটগুলি রিসোর্স টেবিলে বিস্তারিত আছে। গিবসন সমাবেশের পণ্যটিকে পিসিআর দ্বারা আরও প্রশস্ত করা হয়েছিল এবং ফলস্বরূপ পণ্যটিকে pUAST ভেক্টরে ক্লোন করা হয়েছিল এবং অনুক্রম করা হয়েছিল। ট্রান্সজিন সন্নিবেশগুলি UAS-uex হিসাবে ম্যাপ করা হয়েছিল এবং তৃতীয় ক্রোমোজোমে ম্যাপ করা দুটি সন্নিবেশের একটি আচরণ পরীক্ষায় ব্যবহৃত হয়েছিল।

UAS-CNNM2, UAS-CNNM2E122K, UAS-CNNM2E357K, UAS-CNNM2S269W, এবং UAS-CNNM2T568I ট্রান্সজেনিক ফ্লাই লাইনগুলি pUAST কনস্ট্রাকশনের সাথে রূপান্তর দ্বারা তৈরি হয়েছিল যার মধ্যে cNM2-এর সিএনএমএইচএ বিন্দুর ব্যবহার করা হয়েছে HA), Arjona et al., 2014-এ বর্ণিত। CNNM2 এর ওয়াইল্ড-টাইপ বা পরিবর্তিত সংস্করণগুলি মূল mCNNM2:: pCiNEO_IRES_GFP প্লাজমিডগুলিতে HA ক্লোনগুলি থেকে পরিবর্ধিত হয়েছিল (আরজোনা এট আল।, 2014)। প্রাইমারগুলি রিসোর্স টেবিলে বিস্তারিত আছে। PCR পণ্যগুলি XhoI এবং XbaI দিয়ে হজম করা হয়েছিল এবং pUAST-এর পরিপূরক সাইটগুলিতে সংযুক্ত করা হয়েছিল। তৃতীয় ক্রোমোজোমের প্রতিটি গঠনের সন্নিবেশগুলি উপরে বর্ণিত হিসাবে ম্যাপিং দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল এবং আচরণ পরীক্ষায় ব্যবহৃত হয়েছিল। মনে রাখবেন যে গবেষণায় ব্যবহৃত সমস্ত CNNM2 এনকোডিং নির্মাণগুলি HA-ট্যাগযুক্ত, যদিও সংক্ষিপ্ততার জন্য স্বরলিপি প্রায়শই বাদ দেওয়া হয়।

UAS-MagFRET-1 ট্রান্সজেনিক ফ্লাই লাইনগুলি ম্যাগফ্রেট-1 CDS সমন্বিত pJFRC-MUH কনস্ট্রাক্টের সাথে রূপান্তর দ্বারা তৈরি হয়েছিল, যা লিন্ডেনবার্গ এট আল-এ বর্ণিত pCMVMagFRET-1 প্লাজমিড থেকে সাব-ক্লোন করা হয়েছিল। , 2013. প্রাইমারগুলি রিসোর্স টেবিলে বিস্তারিত আছে। PCR পণ্যগুলি XhoI এবং XbaI দিয়ে হজম করা হয়েছিল এবং pJFRC-MUH-এর পরিপূরক সাইটগুলিতে সংযুক্ত করা হয়েছিল। নির্মাণের সন্নিবেশ সাইট-নির্দিষ্ট ট্রান্সজেনেসিস সিস্টেম দ্বারা মধ্যস্থতা করা হয়েছিল এবং অবতরণ সাইটটি হল attP2 (তৃতীয় ক্রোমোসোমে)।

ইউএএস-ম্যাজিক এবং ইউএএস-মারিও ট্রান্সজেনিক ফ্লাই লাইনগুলি ম্যাজিক/মারিও সিডিএস ধারণকারী pTW নির্মাণের মাধ্যমে রূপান্তরের মাধ্যমে উত্পন্ন হয়েছিল, যা প্লাজমিড MagIC/pcDNA3 এবং MARIO/pcDNA3 থেকে সাব-ক্লোন করা হয়েছিল, দয়া করে টি. নাগাই দ্বারা সরবরাহ করা হয়েছিল: (মায়েশিমা এবং al., 2018 এবং Koldenkova et al., 2015)। ম্যাজিক/মারিও সিডিএস প্রথম পিসিআর যথাক্রমে MARIO/pcDNA3 এবং MagIC/pcDNA3 থেকে প্রশস্ত করা হয়েছিল এবং pENTR/D-TOPO ভেক্টরে ক্লোন করা হয়েছিল। প্রাইমারগুলি রিসোর্স টেবিলে বিস্তারিত আছে। মনে রাখবেন যে MARIO সেন্স প্রাইমারটি MARIO-এর সন্নিবেশ সাইটে pcDNA3 এর ক্রমটির সাথে ওভারল্যাপ করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছিল। MagIC/MARIO CDS আরও ক্লোন করা হয়েছিল গেটওয়ে গন্তব্য ভেক্টর pTW (ড্রোসোফিলা গেটওয়ে ভেক্টর সংগ্রহ)।

CRISPR/Cas9 সম্পাদিত uexD লোকাস বাণিজ্যিকভাবে জেনিটিভিশন দ্বারা তৈরি করা হয়েছিল। সম্পাদনা স্কিমটি চিত্র 2-চিত্র সম্পূরক 2C-এ দেখানো হয়েছে। ইউএক্স লোকাসটি ক্রোমোজোম 2R-এর বিপরীত অভিযোজনে বসে, অবস্থান 3,900,285 এবং 3,949,425 (ফ্লাইবেস, রিলিজ 6) এর মধ্যে একটি 49,141 bp অঞ্চল বিস্তৃত। নিচের বর্ণনাটি uex লোকাসের মধ্যে এই স্থানাঙ্কগুলির সাথে সম্পর্কিত। uexD তৈরি করতে, দুটি gRNA প্লাজমিড এবং একটি ডাবল-স্ট্র্যান্ড ডিএনএ ডোনার (dsDNA) প্লাজমিড তৈরি করা হয়েছিল এবং nos-Cas9 ভ্রূণে (BDSC, 54591) ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। চিত্র 2-এ চিত্রের পরিপূরক 2C এবং রিসোর্স টেবিলে বিশদভাবে নির্দেশিত হিসাবে, আপস্ট্রিম gRNA1 এক্সন 6-এ রয়েছে এবং লক্ষ্য ক্রম 30,930.30,952। সংশ্লিষ্ট ডাউনস্ট্রিম gRNA2 33,988 এবং 34,010 এর মধ্যে Exon 7 এবং Exon 8 এর মধ্যে অবস্থিত। উভয় gRNA পৃথকভাবে pCFD3-dU63gRNA (Addgene, 49410) এ ক্লোন করা হয়েছিল। gRNA1 এর কাট সাইট 30,946 এবং 30,947 এর মধ্যে হওয়া উচিত যেখানে gRNA2 33,993 এবং 33,994 এর মধ্যে কাট হওয়া উচিত। একটি 795 bp আপস্ট্রিম হোমোলজি আর্ম (30,152.30,946) এবং 977 bp ডাউনস্ট্রিম হোমোলজি আর্ম (33,994.34,970) দাতা ডিএনএ প্লাজমিডে ক্লোন করা হয়েছিল। একটি সমাপ্তি কোডন (স্টপ, তিনটি রিডিং ফ্রেমে) দুটি হোমোলজি আর্মের মধ্যে ঢোকানো হয়েছিল এবং একটি 3xP3 প্রবর্তক দ্বারা চালিত একটি GFP ক্যাসেট অনুসরণ করা হয়েছিল। দাতা DNA ব্যাকবোন GenetiVision দ্বারা প্রকৌশলী করা হয়েছিল এবং uexD লাইনের জন্য সম্পূর্ণ দাতা ক্রম অনুরোধের ভিত্তিতে উপলব্ধ। সফল সম্পাদনা মাছির চোখে GFP এর অভিব্যক্তি দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল এবং জিনোমিক পিসিআর এবং সিকোয়েন্সিং দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল। uexD ফ্লাইসে, 30,947 থেকে 33,993 পর্যন্ত একটি 3047 bp ফ্র্যাগমেন্ট ডোনার প্লাজমিডের দুটি হোমোলজি বাহুগুলির মধ্যে ক্রম দ্বারা প্রতিস্থাপিত হয়েছিল, প্রধানত STOP সংকেত এবং GFP ক্যাসেট। uexD অ্যালিল uex ORF কে ছাঁটাই করে। জিনোমিক পিসিআর যাচাইকরণের জন্য ব্যবহৃত প্রাইমারগুলি সম্পদ সারণীতে বিশদভাবে দেওয়া আছে। নোস-ক্যাস9 ট্রান্সজিন (এক্স ক্রোমোজোমের উপর) ক্রসিং দ্বারা সরানো হয়েছিল।

CRISPR/Cas9-সম্পাদিত uex::HA মাছি কেট ও'কনর-গাইলসের ল্যাব দ্বারা তৈরি স্কারলেসডিএসরেড সিস্টেম ব্যবহার করে ওয়েলজেনেটিক্স দ্বারা তৈরি করা হয়েছিল (অপ্রকাশিত, মূল প্লাজমিড অ্যাডজিনে দান করা হয়েছে, #80822)। একটি 6XHA ট্যাগ UEX-এর কার্বক্সি-টার্মিনাসে ফ্রেমে মিশ্রিত করা হয়েছিল 6XHA-কোডিং সিকোয়েন্সটি ইউএক্স লোকাসে নেটিভ স্টপ কোডনের আগে (চিত্র 3—চিত্র সম্পূরক 1A) সন্নিবেশিত করে। প্রক্রিয়া দুটি প্রধান পদক্ষেপ জড়িত. ধাপ 1-এ, একটি 6XHA ট্যাগ একত্রে একটি pBAC ট্রান্সপোসনের সাথে একটি DsRed ক্যাসেট সম্বলিত ফ্রেমে CRISPR/Cas{11}এর মাধ্যমে 1 gRNA ব্যবহার করে হোমোলজি-ডাইরেক্টেড রিপেয়ার (HDR) দ্বারা মধ্যস্থিত জিনোম এডিটিং ব্যবহার করে uex-এর STOP কোডন দিয়ে ঢোকানো হয়েছিল। একজন ডিএসডিএনএ প্লাজমিড দাতা। gRNA uex STOP কোডন থেকে 50 bp অবস্থিত এবং 48,587 এবং 48,588 এর মধ্যে একটি কাট নির্দেশ করা উচিত। gRNA একটি pCFD3-dU63gRNA প্লাজমিডে ক্লোন করা হয়েছিল। একটি 1,200 bp আপস্ট্রিম আর্ম (47,438.48,637) এবং 1,033 bp ডাউনস্ট্রিম আর্ম (48,641.49,673) পিইউসি57-কান (2579 bp) ব্যাকবোনের সাথে দাতা ডিএনএ প্লাজমিডে ক্লোন করা হয়েছিল। জিআরএনএ এবং প্রাইমার সিকোয়েন্সের জন্য রিসোর্স টেবিল দেখুন। এইচডিআর প্রচারের জন্য দাতার মধ্যে একটি প্রোটোস্পেসার অ্যাডজাসেন্ট মোটিফ (পিএএম) মিউটেশন (টিসিসি থেকে টিসিজি, 48,581.48,583) চালু করা হয়েছিল। একটি 6XHA ট্যাগ, তারপরে একটি pBAC ট্রান্সপোসন যার মধ্যে একটি 3XP3 প্রমোটার-চালিত DsRed ক্যাসেট রয়েছে, দুটি হোমোলজি বাহুগুলির মধ্যে ঢোকানো হয়েছিল। একটি pBAC স্বীকৃতি মোটিফ TTAA 6XHA এর STOP কোডনে এম্বেড করা আছে। সম্পূর্ণ দাতা ক্রম অনুরোধের ভিত্তিতে উপলব্ধ. দাতা এবং জিআরএনএ প্লাজমিডগুলি নোস-ক্যাস 9 ভ্রূণে (এনআইজি-ফ্লাই, সিএএস0002) ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। সফল সম্পাদনাটি মাছির চোখে DsRed এর অভিব্যক্তি দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল এবং জিনোমিক পিসিআর এবং সিকোয়েন্সিং দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল। ছয়টি স্বাধীন ইতিবাচক লাইন চিহ্নিত করা হয়েছে এবং চারটি পিসিআর বৈধতা পাস করেছে। এই চারটি লাইনের মধ্যে, একটি আরও সিকোয়েন্সিং বৈধতা পাস করেছে এবং এটি চিত্র 3-চিত্র সম্পূরক 1A-তে উপস্থাপন করা মধ্যবর্তী লাইন। এই লাইন থেকে চারটি আইসোজেনাইজড এবং সুষম স্টক প্রতিষ্ঠিত হয়েছিল। ধাপ 2-এ, DsRed নির্বাচন চিহ্নিতকারীকে পিগিব্যাক (PBac) ট্রান্সপোজিশন দ্বারা হেল্পার লাইন Tub-PBac (BDSC, 8285) দিয়ে এক্সাইজ করা হয়েছিল। জিনোমিক পিসিআর এবং সিকোয়েন্সিং দ্বারা সফল ছেদন সহ পাঁচটি সমজাতীয় কার্যকর লাইন বৈধ করা হয়েছিল। একটি মনোনীত uex::HA পাণ্ডুলিপিতে পরীক্ষায় ব্যবহৃত হয়েছিল।

CRISPR/Cas{{0}}সম্পাদিত uexT626NRR ফ্লাইস তৈরি করতে, আমরা একটি gRNA ডিজাইন ও ক্লোন করেছি এবং ডিজাইন ও অর্ডার করেছি (সিগমা) একটি সিঙ্গেল-স্ট্র্যান্ডেড অলিগো-ডিঅক্সিনিউক্লিওটাইড (ssODN)। gRNA এবং ssODN ক্রমগুলি রিসোর্স টেবিলে বিশদভাবে দেওয়া আছে। যেহেতু আমরা UEX CNBH ডোমেনে একটি একক অ্যামিনো অ্যাসিড প্রতিস্থাপন R622K করার পরিকল্পনা করেছি, 120 bp ssODN দাতা কোডন R622-এর উপর কেন্দ্রীভূত ছিল এবং কোডন পরিবর্তন CGT-কে AAA (31,179.31,181-এ) R622K-এর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ করে। gRNA এর প্রত্যাশিত কাট সাইট (31,192 এবং 31,193 এর মধ্যে) প্রত্যাশিত মিউটেশন পয়েন্ট থেকে মাত্র 11 bp দূরে। HDR-এর সম্ভাবনা বাড়ানোর জন্য, যা দাতা হিসাবে ssODN ব্যবহার করে কম বলে, আমরা বাণিজ্যিকভাবে (জেনেটিভিশন) 250 lig4 KO vasa-Cas ভ্রূণ (Zimmer et al., 2016) এ সম্পাদনা উপাদান ইনজেকশন দিয়েছি। আমরা ইনজেকশন করা ভ্রূণ থেকে 37টি কার্যকর G0 মাছি পেয়েছি। মোট 224 G1 মাছি একক ফ্লাই জিনোমিক পিসিআর এবং প্রত্যাশিত মিউটেশনের জন্য স্ক্রীনের সিকোয়েন্সিংয়ের শিকার হয়েছিল। প্রাইমারগুলি রিসোর্স টেবিলে বিস্তারিত। আমরা প্রথম রাউন্ডের স্ক্রীনিং থেকে 59টি পুটেটিভ সম্পাদিত লাইন সনাক্ত করেছি এবং এর মধ্যে 12টি নিশ্চিত হয়েছে। lig4 KO vasa-Cas9 ব্যবহার করা সত্ত্বেও, আমরা HDR-মিডিয়াটেড পয়েন্ট মিউটেশনের পরিবর্তে শুধুমাত্র নন-হোমোলোগাস এন্ড জয়েনিং (NHEJ) ইভেন্টগুলি সনাক্ত করেছি। 12টি সম্পাদিত লাইনের মধ্যে ছয়টি ছিল সমজাতীয় প্রাণঘাতী এবং বাকি ছয়টি ছিল কার্যকর। চারটি সমজাতীয় কার্যকর লাইনে, আমরা 31,192 এবং 31,193 এর মধ্যে ATCTTC-এর একটি 6 bp ইন-ফ্রেম সন্নিবেশ সহ 31,192 অবস্থানে T-এর সাথে G-এর প্রতিস্থাপন পেয়েছি। এই NHEJ সম্পাদনা T626 এর সাথে মিলে যায়! UEX এর প্রোটিন অনুক্রমে NRR পরিবর্তন (চিত্র 5A)। X ক্রোমোজোম vasa-Cas9 ক্রসিং করে এই লাইনগুলি থেকে সরানো হয়েছিল এবং একটি লাইন যা uexT626NRR হিসাবে উল্লেখ করা হয়েছিল পান্ডুলিপিতে আচরণ পরীক্ষায় ব্যবহার করা হয়েছিল।

পদ্ধতির বিবরণ

আচরণগত পরীক্ষা-নিরীক্ষা

আচরণগত T-maze পরীক্ষার জন্য, 1–7-দিনের মিশ্র যৌন মাছি ব্যবহার করা হয়েছিল। গন্ধগুলি ছিল 4-মিথাইলসি-সাইক্লোহেক্সানল (MCH) এবং 3-অক্টানল (OCT), মিশ্রিত ~1:103 (বিশেষত, 8 মিলি খনিজ তেলে 9 মিলি এমসিএইচ বা 7 মিলি ওসিটি)। সমস্ত পরীক্ষা 23˚C এবং 55-65 শতাংশ আপেক্ষিক আর্দ্রতায় সঞ্চালিত হয়েছিল।

ক্ষুধার্ত অবিলম্বে এবং পরেস্মৃতিপরীক্ষাগুলি মূলত বর্ণিত হিসাবে সঞ্চালিত হয়েছিল (Krashes এবং Waddell, 2008; Perisse et al., 2013)। ~2 মিলি 1 শতাংশ আগর (পানির উৎস হিসাবে) এবং একটি 2 সেমি 4 সেমি ফিল্টার পেপার সম্বলিত 35 মিলি স্টার স্টারভেশন শিশিতে প্রশিক্ষণের আগে 100-120টি মাছির ব্যাচ 21-23 ঘণ্টার জন্য ক্ষুধার্ত ছিল। প্রশিক্ষণের জন্য চিনির কাগজগুলি (5 সেমি 7.5 সেমি) 4 মিলি 2 এম সুক্রোজ দিয়ে ভিজিয়ে এবং রাতারাতি শুকানোর মাধ্যমে প্রস্তুত করা হয়েছিল। একই আকারের ওয়াটার পেপারগুলো পানিতে ভিজিয়ে সারারাত রেখে দেওয়া হয়। ক্ষুধার্ত প্রশিক্ষণের জন্য, মাছিগুলিকে একটি ক্ষুধার্ত টিউব থেকে একটি শুকনো 'জল' কাগজ সহ একটি প্রশিক্ষণ টিউবে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল, এবং অবিলম্বে টি-মেইজের প্রশিক্ষণ বাহুতে সংযুক্ত করা হয়েছিল এবং 2 মিনিটের জন্য সিএস গন্ধের সংস্পর্শে এসেছে, তারপরে 30 সেকেন্ড পরিষ্কার বাতাস. তারপরে মাছিগুলিকে শুকনো চিনির কাগজ সহ অন্য প্রশিক্ষণ টিউবে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল, টি-ধাঁধাঁর সাথে সংযুক্ত এবং 2 মিনিটের জন্য সিএস প্লাস গন্ধের সংস্পর্শে আনা হয়েছিল। তাৎক্ষণিকস্মৃতিটি-চয়েস পয়েন্টে মাছি পরিবহন করে এবং দুটি গন্ধ প্রবাহের মধ্যে 2 মিনিট বেছে নেওয়ার অনুমতি দিয়ে পরীক্ষা করা হয়েছিল। 24 ঘন্টা পরীক্ষা করতেস্মৃতি, মাছিগুলিকে ট্রেনিং টিউব থেকে সরানো হয়েছিল এবং 1 ঘন্টার জন্য স্ট্যান্ডার্ড কর্নমিল খাবারের শিশিতে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল, তারপরে পরীক্ষা না হওয়া পর্যন্ত 23 ঘন্টার জন্য ক্ষুধার্ত শিশিতে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল। পারফরম্যান্স ইনডেক্স গণনা করা হয়েছিল CS প্লাস আর্ম-এ মাছির সংখ্যা বিয়োগ CS আর্ম-এর সংখ্যা, মোট মাছি সংখ্যা দ্বারা ভাগ করা হয়েছে। MCH এবং OCT পর্যায়ক্রমে CS প্লাস বা CS হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল এবং একটি একক নমুনা, বা n, দুটি পারস্পরিকভাবে প্রশিক্ষিত গোষ্ঠীর গড় পারফরম্যান্স সূচকের প্রতিনিধিত্ব করে।

Mg2 প্লাস খাওয়ানোর পরে আচরণ পরীক্ষার জন্য, উপরে বর্ণিত হিসাবে ক্ষুধার্ত প্রশিক্ষণ এবং পরীক্ষার জন্য 1-5 দিন আগে 1-2-দিন বয়সী মাছিকে Mg2 প্লাস সম্পূরক খাবারের শিশিতে রাখা হয়েছিল। 80 mM [Mg2 plus] খাদ্য তৈরি করতে, 40 মিলি 1 M MgCl2 দ্রবণ 460 মিলি সাধারণ তরল মাছি খাবারে যোগ করা হয়েছিল; 1 mM [Mg2 plus] খাবার তৈরি করা হয়েছিল 0.5 ml 1 M MgCl2 39.5 মিলি মিলিকিউ জলে মিশিয়ে এবং 460 মিলি তরল খাবারে যোগ করে। খাদ্য অলিকোট করা হয়েছিল এবং শক্ত করার জন্য ঠান্ডা করা হয়েছিল। MgSO4 এবং CaCl2 সম্পূরক খাবার একইভাবে প্রস্তুত করা হয়েছিল।

বিরূপ অবিলম্বে এবং 24 ঘন্টাস্মৃতিপূর্বে বর্ণিত হিসাবে পরীক্ষাগুলি পরিচালিত হয়েছিল (হিরানো এট আল।, 2013; পেরিস এট আল।, 2016; টুলি এবং কুইন, 1985)। 100-120 টি মাছির দলগুলিকে একটি বিরূপ প্রশিক্ষণের একটি চক্র, অথবা 15 মিনিটের আন্তঃ-পরীক্ষার ব্যবধানে (স্পেসযুক্ত প্রশিক্ষণ) দ্বারা পাঁচটি চক্রের মাধ্যমে প্রশিক্ষিত করা হয়েছিল। বিরূপ অবিলম্বে জন্যস্মৃতি, এক-চক্র প্রশিক্ষণের পরে মাছি পরীক্ষা করা হয়েছিল। এভারসিভ 24 ঘন্টাস্মৃতিদুটি ভিন্ন প্রোটোকল ব্যবহার করে পরীক্ষা করা হয়েছিল। উপবাস-সুবিধাযুক্ত প্রোটোকলে, এক-চক্র প্রশিক্ষণের আগে মাছিগুলি 16 ঘন্টার জন্য অভুক্ত ছিল (হিরানো এট আল।, 2013)। ফাঁকা প্রশিক্ষণের জন্য, প্রশিক্ষণের আগে মাছি ক্ষুধার্ত ছিল না। পরীক্ষা করার আগে উপবাস-সুবিধাযুক্ত এবং ব্যবধানে প্রশিক্ষণের পরে মাছিকে 24 ঘন্টার জন্য সাধারণ মাছির খাবার খাওয়ানো হয়েছিলস্মৃতিকর্মক্ষমতা. প্রতিটি বিরূপ প্রশিক্ষণ চক্রের সময়, মাছি 5 সেকেন্ডের ব্যবধানে বারোটি 90 V বৈদ্যুতিক শকের সাথে যুক্ত প্রথম গন্ধ (CS প্লাস) 1 মিনিটের জন্য উন্মুক্ত হয়েছিল। 45 সেকেন্ড পরিষ্কার বাতাসের পরে, ধাক্কা ছাড়াই 1 মিনিটের জন্য একটি দ্বিতীয় গন্ধ (CS ) উপস্থাপন করা হয়েছিল। পারফরম্যান্স ইনডেক্স গণনা করা হয়েছিল CS আর্মে মাছির সংখ্যা বিয়োগ CS প্লাসের সংখ্যা হিসাবে

বাহু, মোট মাছি সংখ্যা দ্বারা ভাগ। MCH এবং OCT পর্যায়ক্রমে CS প্লাস বা CS হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল এবং একটি একক নমুনা, বা n, দুটি পারস্পরিকভাবে প্রশিক্ষিত গোষ্ঠীর গড় পারফরম্যান্স সূচকের প্রতিনিধিত্ব করে।

সংবেদনশীল তীক্ষ্ণতা পরীক্ষা (চিত্র 2—উৎস ডেটা 1) বর্ণনা করা হয়েছে (Keene et al., 2004; Keene et al., 2006; Schwaerzel et al., 2003) পরিবর্তন সহ। ঘ্রাণশক্তির তীক্ষ্ণতা পরীক্ষা করার জন্য, অপ্রশিক্ষিত মাছিগুলিকে টি গোলকধাঁধায় খনিজ তেলের মাধ্যমে কন্ডিশনারে ব্যবহৃত মিশ্রিত গন্ধ এবং বাতাসের মধ্যে বাছাই করার জন্য 2 মিনিট সময় দেওয়া হয়েছিল। একটি পরিহার সূচক গণনা করা হয়েছিল বায়ুর বাহুতে মাছির সংখ্যা বিয়োগ করে গন্ধ বাহুতে থাকা সংখ্যা, মোট মাছি সংখ্যা দ্বারা ভাগ করা হয়। বৈদ্যুতিক শক পরিহার করা হয়েছিল এবং একইভাবে গণনা করা হয়েছিল। অপ্রশিক্ষিত মাছিরা বৈদ্যুতিক গ্রিড ধারণকারী দুটি টিউবের মধ্যে 1 মিনিটের জন্য বেছে নেয়, কিন্তু শুধুমাত্র একটি শক্তির উৎসের সাথে সংযুক্ত ছিল। একটি পরিহার সূচক গণনা করা হয়েছিল অ-বিদ্যুতায়িত বাহুতে মাছির সংখ্যা বিয়োগ করে বিদ্যুতায়িত বাহুতে থাকা সংখ্যা, মাছির মোট সংখ্যা দ্বারা ভাগ করা হয়। চিনির তীক্ষ্ণতা মূল্যায়ন করার জন্য, ক্ষুধার্ত মাছিদের একটি শুকনো চিনির কাগজ এবং অন্যটিতে শুকনো 'জল' ফিল্টার পেপার সম্বলিত টি-ধাঁধাঁর একটি হাতের মধ্যে বেছে নিতে 2 মিনিট সময় দেওয়া হয়েছিল। দুটি কাগজই ক্ষুধার্ত হিসাবে প্রস্তুত করা হয়েছিলস্মৃতিassays একটি পছন্দ সূচক গণনা করা হয়েছিল চিনির বাহুতে মাছির সংখ্যা হিসাবে বিয়োগ যা অন্য বাহুতে, মাছির মোট সংখ্যা দ্বারা ভাগ করা হয়। আমরা দেখেছি যে আচরণগত কক্ষে আলো জ্বালিয়ে রাখা এবং টেস্টিং টিউবের মধ্য দিয়ে বায়ুপ্রবাহ চলার ফলে বন্য ধরণের মাছিদের পছন্দের সূচক অনেক বেড়ে যায় এবং তাই সমস্ত চিনি পছন্দ পরীক্ষার জন্য এই শর্তগুলি প্রয়োগ করা হয়।

এন্টি-UEX অ্যান্টিবডি এবং ওয়েস্টার্ন ব্লট

একটি পলিক্লোনাল UEX অ্যান্টিবডি বাণিজ্যিকভাবে ইউরোজেনটেক দ্বারা তৈরি করা হয়েছিল। দুটি পেপটাইড অ্যান্টিজেন হিসাবে সংশ্লেষিত হয়েছিল: পেপটাইড 1 H-CLPKLDDKFESKQSKP-OH (16aa) এবং পেপটাইড 2 H-CVDNRTK TRRNRYKKA-NH2 (16aa) এবং খরগোশের মধ্যে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। শুধুমাত্র পেপটাইড 2 একটি শক্তিশালী ইমিউন প্রতিক্রিয়া প্ররোচিত করে এবং আরও প্রক্রিয়া করা হয়েছিল। চূড়ান্ত সিরাম পেপটাইড 2 এর বিরুদ্ধে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল এবং 1:2000 তরল হিসাবে ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল।

ওয়েস্টার্ন ব্লটের প্রতিটি নমুনার জন্য, 120 মিলি প্রোটিন নমুনা বাফারে পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে একত্রিত করে 20টি মাছির মাথা থেকে প্রোটিন বের করা হয়েছিল যাতে 30 মিলি 2-মেরকাপটোথেনল (বায়ো-র্যাড), 270 মিলি 4 মিশ্রিত ছিল Laemmli নমুনা বাফার (BioRad), এবং 900 মিলি নিউক্লিজ ফ্রি ওয়াটার (ইনভিট্রোজেন)। তারপরে নমুনাগুলি 100˚C তাপ ব্লকে 3 মিনিটের জন্য সিদ্ধ করা হয়েছিল এবং লোড করার আগে 10 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। প্রতিটি SDS-PAGE জেল লেনের মধ্যে চারটি মাথার সমতুল্য একটি নমুনা ভলিউম লোড করা হয়েছিল। প্রোটিনগুলিকে PVDF মেমব্রেনে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল এবং 35 rpm আন্দোলনের সাথে 25˚C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য 5 শতাংশ স্কিম মিল্কে ব্লক করা হয়েছিল। তারপরে ঝিল্লিটিকে 35 আরপিএম অ্যাজিটেশন সহ 4˚C তাপমাত্রায় রাতারাতি অ্যান্টি-UEX দ্রবণে (1:2000 খরগোশ অ্যান্টি-UEX 5 শতাংশ স্কিম মিল্ক) দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। ঝিল্লিটি দ্রুত তিনবার ধোয়া হয় এবং তারপরে টিবিএসটি দ্রবণে 3 10 মিনিট ধোয়া হয় (100 মিলি টিবিএস 10 দ্রবণ, বায়োরাড, 900 মিলি মিলিকিউ জলে মিশ্রিত করা হয়, 0.1 শতাংশ টুইন 20 সহ) এবং তারপরে এইচআরপি-কঞ্জুগেটেড দিয়ে ইনকিউব করা হয়। সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দ্রবণ (5 শতাংশ স্কিম দুধে 1:5000 ছাগল-বিরোধী খরগোশ) 35 rpm অ্যাজিটেশন সহ 25˚C তাপমাত্রায় 1-2 ঘণ্টার জন্য। ঝিল্লিটি আবার তিনবার দ্রুত ধোয়া হয় এবং তারপরে TBST-তে 3 10 মিনিট ধোয়া হয়৷ প্রোটিন ব্যান্ডগুলি পিয়ার্স ইসিএল ওয়েস্টার্ন ব্লটিং সাবস্ট্রেট (লাইফ টেকনোলজিস, 32134) ব্যবহার করে কল্পনা করা হয়েছিল। তারপর মিলিপুর রিব্লট প্লাস মাইল্ড সলিউশন (Merck, 2502) ব্যবহার করে ঝিল্লিটি ছিনতাই করা হয়, 5 শতাংশ স্কিম দুধে আবার ব্লক করা হয় এবং মাউস অ্যান্টি-টিউবুলিন প্রাথমিক অ্যান্টিবডি (1:2000, সিগমা, T6199) এবং সংশ্লিষ্ট এইচআরপি কনজুগেটেড গোট অ্যান্টিবডি দিয়ে পরীক্ষা করা হয়। মাউস সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (1:5000) উপরে বর্ণিত প্রোটোকল অনুসরণ করে।

ইমিউনোস্টেইনিং

বর্ণনা অনুযায়ী ইমিউনোস্টেইনিং করা হয়েছিল (উ এবং লুও, 2006)। 1- থেকে 5- দিন বয়সী প্রাপ্তবয়স্ক মাছিগুলিকে পিবিএস-এ বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং ঘরের তাপমাত্রায় 4 শতাংশ প্যারাফর্মালডিহাইড সহ পিবিএস-এ 20 মিনিটের জন্য স্থির করা হয়েছিল। তারপরে তারা দুবার সংক্ষিপ্তভাবে 0.5 শতাংশ পিবিটি (2.5 মিলি ট্রাইটন-এক্স10497.5 মিলি পিবিএস-এ 0) এবং তিনটি 20 মিনিট ধোয়া হয়েছিল৷ তারপরে 5 শতাংশ স্বাভাবিক ছাগলের সিরাম ধারণ করে PBT-তে কক্ষ তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য মস্তিষ্ককে অবরুদ্ধ করা হয়েছিল এবং তারপর 1 বা 2 দিনের জন্য 4˚C তাপমাত্রায় হালকা ঘূর্ণন (35 rpm) সহ প্রাথমিক এবং মাধ্যমিক অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলি ছিল খরগোশ-বিরোধী GFP (1:250; Invitrogen A11122) এবং খরগোশ-বিরোধী HA (1:250, NEB 3724T)। আলেক্সা 488-সংযুক্ত ছাগল বিরোধী খরগোশ (1:250; ইনভিট্রোজেন, A11034) ছিল সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি। সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি ইনকিউবেশনের আগে এবং পরে, মস্তিষ্ক দুটি দ্রুত ধোয়ার শিকার হয়েছিল এবং তারপরে 0.5 শতাংশ পিবিটিতে তিনটি 20 মিনিট ধোয়া হয়েছিল। দাগযুক্ত মস্তিষ্কগুলি Vectashield (Vector Labs H1000) এর কাচের স্লাইডে মাউন্ট করা হয়েছিল এবং 40 ম্যাগনিফিকেশনে একটি Leica TCS SP5 কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে চিত্রিত করা হয়েছিল (HCX PL APO 40 , 1.3 CS তেল নিমজ্জন উদ্দেশ্য, Leica)। চিত্রের স্ট্যাকগুলি 1 মিমি ধাপ সহ 1024 1024 রেজোলিউশনে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং ফিজি ব্যবহার করে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল (Schindelin et al., 2012)৷ চিত্র 3G এবং H-এ পরিমাপের জন্য, পৃথিবীর জন্য আনুমানিক 40 25 মিমি আয়তক্ষেত্রাকার ROI, বা ab, a'b' এবং EB-এর জন্য 15 মিমি ব্যাস সহ বৃত্তাকার ROIগুলি একটি একক বিভাগে ম্যানুয়ালি আঁকা হয়েছিল মাছি মস্তিষ্কের একটি z-স্ট্যাক স্ক্যান. পটভূমি নিয়ন্ত্রণ অঞ্চল হিসাবে সুপিরিয়র মিডিয়াল প্রোটোসেরব্রাম (এসএমপি) তে সংশ্লিষ্ট ROIগুলিও আঁকা হয়েছিল এবং ইমেজজে ব্যবহার করে গড় ফ্লুরোসেন্স গণনা করা হয়েছিল। এমবি লোব এবং ইবি এর ROI তীব্রতা সংশ্লিষ্ট SMP তীব্রতার সাথে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। একটি একক ডেটা পয়েন্টের জন্য বাম এবং ডান মস্তিষ্কের মধ্যে গড় ব্যবহার করা হয়েছিল। চিত্র 7C এবং D-এ পরিমাণ নির্ধারণের জন্য, ROIগুলি পরিসংখ্যানে নির্দেশিত হয়েছে এবং ROI তীব্রতা চিত্র 3H-এর ফলাফলের অনুরূপভাবে গণনা করা হয়েছিল। চিত্র 7C-এ, একটি লোবের অগ্রভাগের প্রশস্ত অংশ দিয়ে একটি রেখা আঁকা হয়েছে। এই লাইনের তীব্রতা প্রোফাইল ImageJ এর মাধ্যমে প্রাপ্ত হয়েছিল। প্রতিটি লাইন প্রোফাইলের জন্য প্রায় 15 মিমি লাইন বিস্তৃত এই জাতীয় প্রোফাইলের মাঝখানে ত্রিশটি ডেটা পয়েন্ট বের করা হয়েছিল। প্রোফাইলটিকে আরও স্বাভাবিক করা হয়েছিল প্রথম পাঁচটি ডেটা পয়েন্টের গড় মান (F0) এবং (F F0)/F0 হিসাবে গণনা করা হয়েছিল। বিভিন্ন মস্তিষ্কের এই স্বাভাবিক প্রোফাইলগুলির গড় মানগুলি প্লট করা হয়েছিল (চিত্র 7C, মধ্যম প্যানেল)। মস্তিষ্কের বাম এবং ডান প্রোফাইলগুলি গণনা করা হয়েছিল এবং আলাদাভাবে প্রদর্শিত হয়। চিত্র 7D-এ, বিভিন্ন অঞ্চলের প্রতিনিধিত্বকারী বিভিন্ন ROI থেকে আপেক্ষিক তীব্রতা MB-এর জন্য মোট তীব্রতা পরিমাপ তৈরি করতে একত্রে যুক্ত করা হয়।

কোষ সংস্কৃতিতে Mg2 প্লাস ফ্লাক্স তদন্ত করতে ব্যবহৃত মানব CNNM4 cDNA এক্সপ্রেশন গঠনটি পূর্বে বর্ণিত হয়েছে (ইয়ামাজাকি এট আল।, 2013)। ড্রোসোফিলা ইউএক্স প্রকাশকারী একটি নির্মাণ Uex CDS-এর STOP কোডনের সামনে একটি FLAG ট্যাগ ঢোকানোর মাধ্যমে তৈরি করা হয়েছিল। FLAG-ট্যাগযুক্ত CNNM4 এবং uex cDNAs পরবর্তীতে HEK293 কোষে প্রকাশের জন্য pCMV ট্যাগ-4A (Agilent) ঢোকানো হয়েছিল। HEK293 কোষগুলি Dulbecco-এর পরিবর্তিত ঈগল মিডিয়ামে (Nissui) 10 শতাংশ ফেটাল বোভাইন সিরাম (FBS) এবং অ্যান্টিবায়োটিক দিয়ে পরিপূরক করা হয়েছিল৷ এক্সপ্রেশন প্লাজমিডগুলি Lipofectamine 2000 (Invitrogen) দিয়ে স্থানান্তরিত হয়েছিল।

ইমিউনোস্টেইনিংয়ের জন্য, কোষগুলিকে পিবিএস-এ 3.7 শতাংশ ফর্মালডিহাইড দিয়ে 20 মিনিটের জন্য স্থির করা হয়েছিল এবং তারপর 0.2 শতাংশ ট্রাইটন এক্স-100 দিয়ে পিবিএস-এ 5 মিনিটের জন্য, উভয় কক্ষ তাপমাত্রায় প্রবেশ করানো হয়েছিল। তারা পরবর্তীতে ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য 3 শতাংশ FBS এবং 10 শতাংশ বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন (ব্লকিং বাফার) ধারণকারী পিবিএস দিয়ে ব্লক করা হয়েছিল। তারপরে কোষগুলিকে খরগোশের অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ অ্যান্টিবডি (F7425, সিগমা-অলড্রিচ) ব্লকিং বাফারে মিশ্রিত করে 4˚C তাপমাত্রায় রাতারাতি ইনকিউব করা হয়, পিবিএস দিয়ে 3টি ধুয়ে ফেলা হয় এবং অ্যালেক্সা 488- কনজুগেটেড অ্যান্টি-এর সাহায্যে ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘণ্টার জন্য ইনকিউব করা হয়। খরগোশ IgG (Invitrogen) এবং rhodamine-phalloidin (F-actin visualization, Invitrogen) ব্লকিং বাফারে মিশ্রিত। পিবিএস দিয়ে তিনটি ধোয়ার পরে, কভারস্লিপগুলি স্লাইডে মাউন্ট করা হয়েছিল এবং একটি কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ (ফ্লুওভিউ এফভি1000; অলিম্পাস) দিয়ে চিত্রিত করা হয়েছিল।

ম্যাগনেসিয়াম গ্রীনের সাথে Mg2 প্লাস-ইমেজিং বর্ণনা করা হয়েছে (ইয়ামাজাকি এট আল।, 2013), সামান্য পরিবর্তন সহ। অভিব্যক্ত প্রোটিনের সাথে সম্ভাব্যভাবে [Mg2 প্লাস ]i হ্রাস এড়াতে, ট্রান্সফেক্টেড HEK293 কোষগুলি ইমেজিং পর্যন্ত 40 mM MgCl2 এর সাথে সম্পূরক গ্রোথ মিডিয়াতে সংস্কৃতি করা হয়েছিল। কোষগুলিকে তখন Mg2 প্লাস-লোডিং বাফার (78.1 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 40 mM MgCl2, 5.5 mM গ্লুকোজ, এবং 5.5 mM HEPES-KOH [pH 7.2M Magnes সহ 7.2M]), দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। (ইনভিট্রোজেন), 37˚C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য। তারপরে লোডিং বাফার দিয়ে কোষগুলি একবার ধুয়ে ফেলা হয় এবং একটি ORCA-ফ্ল্যাশ 4.0 CMOS ক্যামেরা (হামামাতসু) এবং একটি SHI-1300L পারদ বাতি (অলিম্পাস) দিয়ে সজ্জিত একটি Olympus IX81 মাইক্রোস্কোপ দিয়ে দেখা হয়। মেটামর্ফ সফ্টওয়্যার (আণবিক ডিভাইস) এর নিয়ন্ত্রণে প্রতি 20 সেকেন্ডে (470-490 এনএমে উত্তেজনা এবং 505-545 এনএমে নির্গমন) ফ্লুরোসেন্স পরিমাপ করা হয়েছিল। বাফারটি তখন Mg2 প্লাস ফ্রি বাফারে পরিবর্তিত হয়েছিল (লোডিং বাফারে MgCl2 60 mM NaCl দিয়ে প্রতিস্থাপিত হয়েছিল)। ডেটা লাইন প্লট হিসাবে উপস্থাপিত হয় (10 টি কোষের গড়)। ইমেজিংয়ের পরে, কোষগুলিকে 3.7 শতাংশ ফর্মালডিহাইডযুক্ত পিবিএস দিয়ে স্থির করা হয়েছিল এবং প্রোটিনের অভিব্যক্তি নিশ্চিত করতে ইমিউনোফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির শিকার হয়েছিল।

ফিক্সড ফ্লাই মস্তিষ্কে FRET-ভিত্তিক Mg2 প্লাস ঘনত্ব পরিমাপ

জিনোটাইপ c739 সহ এক থেকে দুই দিন বয়সী মাছি; UAS-MagFRET-1 সংগ্রহ করার আগে 4 দিনের জন্য 1 mM বা 80 mM [Mg2 plus] খাবারের সাথে শিশিতে রাখা হয়েছিল। পিবিএস-এ ফ্লাই মস্তিস্ক ছিন্ন করা হয়েছিল এবং ঘরের তাপমাত্রায় 4 শতাংশ প্যারাফর্মালডিহাইড সহ পিবিএস-এ 20 মিনিটের জন্য স্থির করা হয়েছিল। তারপরে তারা 0.5 শতাংশ পিবিটি (497.5 মিলি পিবিএস-এ 2.5 মিলি ট্রাইটন-এক্স100) এবং তিনটি 10 ​​মিনিট ধোয়াতে সংক্ষিপ্তভাবে দুবার ধোয়া হয়েছিল। এরপর ব্রেনগুলিকে Vectashield (Vector Labs H1000)-এ কাচের স্লাইডগুলিতে মাউন্ট করা হয়েছিল এবং একটি 40, 0.8 NA জল-নিমজ্জন উদ্দেশ্য এবং Andor Solis সফ্টওয়্যার (v4.27) সহ একটি Andor Zyla sCMOS ক্যামেরা সহ একটি প্রশস্ত-ক্ষেত্র সায়েন্টিফিকা স্লাইসস্কোপ ব্যবহার করে চিত্রিত করা হয়েছিল। অ্যাব নিউরনের Mg2 প্লাস ঘনত্ব নির্দেশ করে এমন FRET অনুপাত পাওয়ার জন্য, 3 Hz-এ 512 512 পিক্সেল এবং 16 বিট সহ সেরুলিয়ান চ্যানেল এবং সিট্রিন চ্যানেলের মধ্যে বিকল্পভাবে টাইম সিরিজ অধিগ্রহণ করা হয়েছিল। উভয় চ্যানেলের জন্য উত্তেজনা তরঙ্গদৈর্ঘ্য 436 এনএম, যখন সেরুলিয়ানের নির্গমন ফিল্টার 460-500 এনএম এবং সিট্রিনের জন্য 520-550 এনএম। সিরিজ অধিগ্রহণ সেরুলিয়ান চ্যানেল থেকে শুরু হয় এবং 5 সেকেন্ড স্থায়ী হয়, তারপরে সিট্রিন চ্যানেলে স্যুইচ করে এবং আরও 5 সেকেন্ড পর্যন্ত স্থায়ী হয় এবং এই চক্রটি আরও দুইবার পুনরাবৃত্তি হয়। তাই প্রতিটি মস্তিষ্কের জন্য মোট 30 সেকেন্ড (90 ফ্রেম) ইমেজ স্ট্যাক অর্জিত হয়েছিল। ইমেজ স্ট্যাকগুলি পরবর্তীতে ইমেজজে এবং কাস্টম-লিখিত ম্যাটল্যাব স্ক্রিপ্টগুলি ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, আয়তক্ষেত্র ROIs (চিত্র 1E, বাম প্যানেল) অ্যাব লোবগুলিতে ম্যানুয়ালি আঁকা হয়েছিল (প্রতিটি গোলার্ধের জন্য একটি লোবে এবং একটি বি লোবে প্রতিটি গোলার্ধের জন্য), এবং পটভূমি নিয়ন্ত্রণ হিসাবে অ্যাব লোবের বাইরে (প্রতিটি গোলার্ধের জন্য একটি)। সেরুলিয়ান চ্যানেল থেকে ফ্লুরোসেন্সের তীব্রতা প্রতিটি উল্লম্ব বা অনুভূমিক লোব ROI কে পটভূমি ROI দ্বারা ভাগ করে গণনা করা হয়েছিল, এবং প্রতিটি লোবের জন্য দুটি গোলার্ধের মধ্যে গড় করা হয়েছিল এবং প্রতিটি চক্রের জন্য 15টি ফ্রেমের গড়। সিট্রিন চ্যানেল থেকে একইভাবে প্রাপ্ত হয়েছিল। উপরের তীব্রতা থেকে একটি FRET অনুপাত প্রাপ্ত হয়েছিল, অধিগ্রহণের তিনটি চক্রের মধ্যে আরও গড়, চিত্র 1E (ডান প্যানেল) এ একটি ডেটা পয়েন্ট হিসাবে চিত্রিত হয়েছে।

এক্সপ্ল্যান্ট ফ্লাই ব্রেইনে কনফোকাল এমজি২ প্লাস ইমেজিং

সি739-GAL4 চালিত UAS-MagIC প্রকাশকারী এক্সপ্লান্ট মস্তিষ্ক একটি 35 মিমি গ্লাস-বটম মাইক্রোওয়েল ডিশের নীচে (পার্ট নং P35G-1.5–14 সি, ম্যাটটেক কর্পোরেশন), এক্সট্রা সেলুলার নীচে স্থাপন করা হয়েছিল স্যালাইন বাফার দ্রবণ (103 mM NaCl, 3 mM KCl, 5 mM N-Tris, 10 mM trehalose, 10 mM গ্লুকোজ, 7 mM সুক্রোজ, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4, 1.5 mM CaCl2, 4 mCmos, 4 mCmos, 4 mM pH 7.3]) ক্যালসিয়াম-মুক্ত বাফারে ব্যবচ্ছেদ অনুসরণ করে (Barnstedt et al., 2016)। UAS-MagIC-এর Mg2 প্লাস সংবেদনশীলতা এবং সেইসাথে EDTA, EGTA, এবং CaCl2 (চিত্র 8B) এর মতো অন্যান্য রাসায়নিকগুলিতে UAS-MagIC-এর প্রতিক্রিয়া নির্ধারণ করতে, 20 মিলিগ্রাম/মিলি ডিজিটোনিন দিয়ে স্যালাইন বাফার দ্রবণে মস্তিস্ককে ইনকিউব করা হয়েছিল। ইমেজ করার 6 মিনিট আগে (কোল্ডেনকোভা এট আল।, 2015)। Forskolin (FSK) প্রয়োগের (চিত্র 8C-I) প্রতিক্রিয়া হিসাবে Mg2 প্লাস ওঠানামা তদন্ত করতে, মস্তিষ্কগুলিকে ডিজিটোনিন বা ইনকিউবেশন ছাড়াই স্যালাইন বাফার দ্রবণে রাখা হয়েছিল। উভয় পরিস্থিতিতে, স্যালাইন বাফারকে বোঝায় (ডিজিটোনিন সহ বা ছাড়াই) যেখানে মস্তিষ্ক নিমজ্জিত হয়।

ZEN 2011 সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে একটি 20 বায়ু উদ্দেশ্য সহ একটি LSM780 কনফোকাল মাইক্রোস্কোপে (Zeiss) ইমেজিং করা হয়েছিল। ম্যাজিকের শুক্র অংশটি 488 এনএম লেজারের সাথে উত্তেজিত হয়েছিল এবং এর নির্গমন 520-560 এনএম পরিসরে সংগ্রহ করা হয়েছিল। mCherry একটি 561 এনএম লেজারের সাথে উত্তেজিত ছিল এবং এর নির্গমন 600-640 এনএম পরিসরে সংগ্রহ করা হয়েছিল। টাইম সিরিজ 512 512 পিক্সেল এবং 16 বিট সহ 0.5 Hz এ অর্জিত হয়েছিল৷ বেসলাইন ভেনাস/mCherry পরিমাপের 60 সেকেন্ডের পরে, 2-20 মিলি স্যালাইন বা অন্যান্য প্রাসঙ্গিক রাসায়নিক দ্রবণ একটি মাইক্রোপিপেটের মাধ্যমে ধ্রুবক ইমেজ ক্যাপচার সহ ডিশে যোগ করা হয়েছিল। ভেনাস/mCherry নির্গমনের উপর প্রয়োগকৃত এজেন্টের প্রভাব তারপর 15-20 মিনিটের জন্য রেকর্ড করা হয়েছিল।

ইমেজ স্ট্যাকগুলি পরবর্তীতে ইমেজজে এবং কাস্টম-লিখিত পাইথন স্ক্রিপ্টগুলি ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, আয়তক্ষেত্র ROI গুলি ম্যানুয়ালি অ্যাব নিউরনগুলিতে আঁকা হয়েছিল (প্রতিটি গোলার্ধের জন্য একটি, চিত্র 8A), এবং একই আকারের আরেকটি ROI মাঝখানে আঁকা হয়েছিল কিন্তু ব্যাকগ্রাউন্ড নিয়ন্ত্রণ হিসাবে MBs এর বাইরে। শুক্র (বা mCherry) চ্যানেল থেকে ফ্লুরোসেন্সের তীব্রতা যথাক্রমে ক্যালিক্স ROIs থেকে ব্যাকগ্রাউন্ড ROI বিয়োগ করে এবং দুটি গোলার্ধের মধ্যে গড় করে গণনা করা হয়েছিল। এটি 'Rel' হিসাবে উল্লেখ করা হয়। চিত্র 8D এবং E-তে তীব্রতা (au)। শুক্র এবং mCherry তীব্রতার মধ্যে অনুপাত চিত্র 8B এবং C এবং চিত্র 8F এবং G-এ 'ম্যাজিক অনুপাত' হিসাবে গণনা করা হয়েছিল। চিত্র 8H-এর জন্য, দুটি চ্যানেলের তীব্রতা আলাদাভাবে গণনা করা হয়েছিল। এই ক্ষেত্রে, 'রিল. তীব্রতা (DF/F0)' (FF0)/F{{9} হিসাবে গণনা করা বেসলাইন পিরিয়ড F0 থেকে গড় তীব্রতায় স্বাভাবিক করা আপেক্ষিক ফ্লুরোসেন্স তীব্রতাকে বোঝায় } শুক্রের আপেক্ষিক তীব্রতা DF/F0 পাইথন ফাংশন psd (matplotlib.pyplot এর অধীনে) এর মাধ্যমে PSD (চিত্র 8I) গণনা করতে ব্যবহৃত হয়েছিল, যা ওয়েলচের গড় পিরিয়ডোগ্রাম পদ্ধতি গ্রহণ করেছিল (বেন্ডাত এট আল।, 2000)।

বিপরীত প্রতিলিপি এবং পরিমাণগত রিয়েল-টাইম পিসিআর

প্রতিটি নমুনার জন্য, 120টি মাছি তরল নাইট্রোজেনে হিমায়িত ছিল এবং তাদের মাথাগুলি সম্পূর্ণরূপে TRIzol রিএজেন্ট (ইনভিট্রোজেন) এ একজাত করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসরণ করে একটি Direct-zol RNA MiniPrep (R2050) কিট ব্যবহার করে মোট RNA বের করা হয়েছিল। সিডিএনএ সুপারস্ক্রিপ্ট III ফার্স্ট-স্ট্র্যান্ড সংশ্লেষণ সিস্টেম (ইনভিট্রোজেন) ব্যবহার করে সংশ্লেষিত হয়েছিল। প্রতিটি পৃথক চিকিত্সা বা জিনোটাইপের জন্য পাঁচটি স্বাধীন নমুনা প্রস্তুত করা হয়েছিল। SYBR Green I Master Mix (Roche) ব্যবহার করে একটি LightCycler 480 Instrument (Roche) এ প্রতিটি cDNA নমুনার জন্য পরিমাণগত পিসিআর ট্রিপ্লিকেট করা হয়েছিল। প্রশস্তকরণের পরে গলিত বক্ররেখাগুলি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং প্রাইমারের নির্দিষ্টতা নিশ্চিত করতে অ্যাগ্রোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরসিস দ্বারা অ্যামপ্লিকনগুলিকে কল্পনা করা হয়েছিল। আপেক্ষিক প্রতিলিপি স্তরগুলি 2-DDCt পদ্ধতি (Livak এবং Schmittgen, 2001) দ্বারা গণনা করা হয়েছিল এবং তিনটি রেফারেন্স জিনের Ct মানের জ্যামিতিক গড় (Gapdh, Tbp, এবং Ef1a 100E) স্বাভাবিককরণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। প্রাইমারগুলি রিসোর্স টেবিলে বিস্তারিত আছে।

বিপরীত পিসিআর

UexMI01943 ফ্লাইসে MiMIC সন্নিবেশের অবস্থান ম্যাপ করতে ইনভার্স পিসিআর ব্যবহার করা হয়েছিল। জিনোমিক ডিএনএ 15টি প্রাপ্তবয়স্ক মাছি থেকে প্রস্তুত করা হয়েছিল। দুটি মাছির সমতুল্য ডিএনএ তারপর Mbo I এর সাথে 25 মিলি সীমাবদ্ধতা বিক্রিয়ায় হজম করা হয়েছিল এবং 10 মিলি পণ্যটি রাতারাতি 4˚C তাপমাত্রায় রাতারাতি আটকে রাখা হয়েছিল টুকরোগুলোকে বৃত্তাকার করার জন্য; লিগেশন পণ্যের 5 মিলি বিপরীত পিসিআর-এর জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল। পিসিআর পণ্যটি সিকোয়েন্স করার আগে এক্সো/এসএপি প্রতিক্রিয়া (থার্মো ফিশার, 78201) ব্যবহার করে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। ক্রমটি ব্লাস্ট দ্বারা ডি. মেলানোগাস্টার জিনোমের (ফ্লাইবেস, রিলিজ 6) সাথে তুলনা করা হয়েছিল এবং 2R-তে 3,882,886.3,882,641 অঞ্চলের সাথে সমানভাবে মিলেছে, FlyBase-এ রিপোর্ট করা uexMI01943 সন্নিবেশের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। প্রাইমারগুলি রিসোর্স টেবিলে বিস্তারিত আছে।

প্রোটিন ডোমেনের পূর্বাভাস এবং প্রান্তিককরণ

জিনিয়াস R10.2.2 ব্যবহার করে প্রোটিন সিকোয়েন্স অ্যালাইনমেন্ট করা হয়েছিল। প্রোটিন ডোমেনের পূর্বাভাস ইন্টারপ্রো (ফিন এট আল।, 2017; জোন্স এট আল।, 2014) এবং Phyre2 (কেলি এট আল।, 2015) এর সাথে সম্পাদিত হয়েছিল। প্রোটিন ডোমেন এবং স্ট্রাকচার অ্যালাইনমেন্ট টিএম-সারিবদ্ধ (ঝাং এবং স্কলনিক, 2005) ব্যবহার করে সম্পাদিত হয়েছিল। প্রোটিন স্ট্রাকচার ভিজ্যুয়ালাইজেশন কাইমেরা 1.11.2 (পেটারসেন এট আল।, 2004) এ রেন্ডার করা হয়েছিল।

পরিমাপ এবং পরিসংখ্যান বিশ্লেষণ

এক্সেল এবং প্রিজম 6 ব্যবহার করে আচরণের ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ইমেজজে এবং কাস্টম-লিখিত MATLAB বা পাইথন স্ক্রিপ্ট ব্যবহার করে ইমেজিং ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। দুটি গোষ্ঠীর তুলনা করার জন্য জোড়াবিহীন দুই-টেইলড টি-পরীক্ষা ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং একাধিক গ্রুপের তুলনা করার জন্য একমুখী ANOVA এর পরে Tukey-এর পোস্ট-হক পরীক্ষা ব্যবহার করা হয়েছিল। পরিসংখ্যানগত তাত্পর্যের থ্রেশহোল্ড p এ সেট করা হয়েছিল<>

স্বীকৃতি

আমরা FJ Arjona এবং JGJ Hoenderop কে মুরিন CNNM2 ক্লোন এবং পান্ডুলিপিতে মন্তব্যের জন্য ধন্যবাদ জানাই। আমরা MagIC এবং MARIO এর ক্লোনগুলির জন্য T Nagai এর কাছে এবং ফ্লাইসের জন্য ব্লুমিংটন স্টক সেন্টার এবং VDRC-এর কাছে কৃতজ্ঞ। আমরা প্রযুক্তিগত সহায়তার জন্য P Cognigni, Y Huang, R Brain, R Szoke-Kovacs এবং M Goodwin এবং Waddell গ্রুপের অন্যান্য সদস্যদের আলোচনার জন্য ধন্যবাদ জানাই। আমরা N Halidi, C Monico, এবং Micron Advanced Bioimaging Unit (Well- come Strategic Awards 091911/B/10/Z এবং 107457/Z/15/Z দ্বারা সমর্থিত) এই কাজে তাদের সমর্থন এবং সহায়তার জন্য স্বীকার করি। EM একটি EMBO দীর্ঘমেয়াদী ফেলোশিপ (ALTF 184-2109) ​​দ্বারা অর্থায়ন করা হয়েছিল৷ KDJ রোডস ট্রাস্ট থেকে সমর্থন স্বীকার করে। SW একটি ওয়েলকাম প্রিন্সিপাল রিসার্চ ফেলোশিপ (200846/ Z/16/Z) এবং একটি ERC অ্যাডভান্সড গ্রান্ট (789274) দ্বারা অর্থায়ন করা হয়েছিল।