পার্ট 1: ইচিনাকোসাইড MPP প্লাস-প্ররোচিত নিউরোনাল অ্যাপোপটোসিসের বিরুদ্ধে সুরক্ষা দেয় ROS/ATF3/CHOP পাথওয়ে রেগুলেশনের মাধ্যমে

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

অনুগ্রহ করে পার্ট 2-এ এখানে ক্লিক করুন

প্রজাতি (ROS) এর বিকাশে অবদান রাখে [3]। PD-এর মতো বৈশিষ্ট্যগুলি বিভিন্ন পরিবেশগত বিষ দ্বারা প্ররোচিত হতে পারে, যার মধ্যে রয়েছে 1-মিথাইল-4-ফিনাইল- 1,2,3,6-টেট্রাহাইড্রোপাইরিডিন (MPTP), সায়ানাইড, কার্বন ডিসালফাইড, এবং টলুইন। MPTP ব্যাপকভাবে PD-এর প্রাণীর মডেলগুলিকে প্ররোচিত করতে ব্যবহৃত হয়, এবং এর সক্রিয় বিপাক, 1-মিথাইল-4- ফেনাইলপাইরিডিনিয়াম আয়ন (MPP?), PD [4, 5] এর সেল মডেলগুলিতে ব্যবহৃত হয়। এমপিপি? নির্বাচনীভাবে ইলেক্ট্রন ট্রান্সপোর্ট চেইনকে বাধা দেয় এবং এর ফলে অত্যধিক ROS উত্পাদন হয়, যার ফলে নিউরোনাল মৃত্যু এবং PD [6] এর মতো একটি সিনড্রোম হয়। সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে এমপিপি? একটি ইন ভিট্রো পিডি মডেলে একাধিক পথ প্ররোচিত করে, যার মধ্যে রয়েছে বর্ধিত GSK3B ফসফোরিলেশন (pY206) এবং a-synuclein সঞ্চয়ন [5], heme oxygenase-1/ni-nicotinamide adenine dinucleotide ফসফেট অক্সিডেস, [/SRO7] 8], সক্রিয় ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর 3 (ATF3) এর এক্সপ্রেশন বৃদ্ধি এবং ডিএনএ ড্যামেজ-ইন্ডুসিবল 153 (GADD153)/C/EBP-হোমোলোগাস প্রোটিন (CHOP) [9] এর মাধ্যমে গ্রোথ অ্যারেস্ট। ক্লিনিকাল চিকিত্সায়, ROS পণ্যগুলির দমন নিউরনগুলির বেঁচে থাকার এবং PD [1] এর চিকিত্সার জন্য সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ কৌশলগুলির মধ্যে একটি।

ইচিনাকোসাইড(ECH, চিত্র 1A), একটি প্রাকৃতিকphenylethanoidঅনেক ঔষধি গাছের মধ্যে পাওয়া যায়, এর একটি প্রধান উপাদানphenylethanoidগ্লাইকোসাইডঐতিহ্যবাহী চীনা ভেষজ থেকে বিচ্ছিন্ন,সিস্তানচেসালসা [১০]। মজার ব্যাপার হল, সাম্প্রতিক গবেষণায় তা প্রমাণিত হয়েছেECHMPTP [10, 11] দ্বারা প্ররোচিত PD এর একটি মাউস মডেলে প্রতিরক্ষামূলক প্রভাব রয়েছে।ECHএছাড়াও টিউমার নেক্রোসিস ফ্যাক্টর-এ বা 6-হাইড্রোক্সিডোপামিন ইন ভিট্রো [12, 13] দ্বারা প্ররোচিত নিউরোব্লাস্টোমা সেল অ্যাপোপটোসিসকে কমিয়ে দেয়। যাইহোক, যা দ্বারা প্রক্রিয়াECHএমপিপিতে নিউরনের বেঁচে থাকার প্রচার করে?-প্ররোচিত পিডি সেল মডেলটি অস্পষ্ট থাকে।

আমরা সেটা দেখিয়েছিECHMPP দ্বারা প্ররোচিত ROS পণ্যগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে? SH-SY5Y কোষে।ECHএছাড়াও ATF3, CHOP, এবং a-synuclein-এর MPP?-প্ররোচিত অভিব্যক্তিকে বাধা দেয়, সেইসাথে প্রো-অ্যাপোপ্টোসিস প্রোটিন ক্যাসপেস-3 এবং পলি (ADP-রাইবোজ) পলিমারেজ (PARP) এর সক্রিয়করণকে দমন করে।

সিস্তানচেechinacosideআছেনিউরোপ্রোটেক্টিভপ্রভাব

উপকরণ এবং পদ্ধতিসমূহ

বিকারক

Dulbecco-এর ন্যূনতম প্রয়োজনীয় মাধ্যম (DMEM), ভ্রূণের বোভাইন সিরাম, 0.25 শতাংশ ট্রিপসিন, 1 শতাংশ পেনিসিলিন/স্ট্রেপ্টোমাইসিন, এবং TRIzol রিএজেন্ট ছিল Life Technologies (Grand Island, NY) থেকে। ক্রোমাটিন ডাই বিসবেনজিমাইড (Hoechst 33342), পলি-এল-লাইসিন, MPP? আয়োডাইড এবং MPTP সিগমা (সেন্ট লুইস, এমও) থেকে এসেছে। লিপিড পারক্সিডেশন ম্যালোন্ডিয়ালডিহাইড (এমডিএ) অ্যাস কিট এবং ডিক্লোরোফ্লুরেসসিন ডায়াসেটেট (ডিসিএফএইচ-ডিএ) বিয়োটাইম বায়োটেক (হাইমেন, চীন) থেকে ছিল। C98 শতাংশ বিশুদ্ধতার ECH পুশ বায়োটেকনোলজি (চেংদু, চীন) থেকে এসেছে।

প্রাণী এবং চিকিত্সা

প্রাণী রক্ষণাবেক্ষণ এবং চিকিত্সা পূর্বে বর্ণিত হিসাবে ছিল [14]। আমরা 10 সপ্তাহ বয়সে 24-26 গ্রাম ওজনের পুরুষ C57BL/6 ইঁদুর (Shanghai Laboratory Animal Co., Shanghai, China) ব্যবহার করেছি। প্রাণীগুলিকে মানক অবস্থার অধীনে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল (12:12 ঘন্টা আলো: অন্ধকার চক্র, 21 ± 2C, এবং আপেক্ষিক আর্দ্রতা 40 শতাংশ) এবং খাবার এবং জলের অ্যাড লিবিটাম অ্যাক্সেসের অনুমতি দেওয়া হয়েছিল। সমস্ত পদ্ধতি ফুদান ইউনিভার্সিটির ঝংশান হাসপাতালের অ্যানিমেল এথিক্স কমিটি দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল এবং যত্ন ও ব্যবহারের জন্য ন্যাশনাল ইনস্টিটিউট অফ হেলথ গাইড অনুসারে পরিচালিত হয়েছিল

ল্যাবরেটরি প্রাণী।

ইঁদুরগুলিকে এলোমেলোভাবে চারটি দলে বিভক্ত করা হয়েছিল (10টি ইঁদুর/গোষ্ঠী): গ্রুপ A, যানবাহন নিয়ন্ত্রণ গ্রুপ, সাধারণ স্যালাইনের সমান পরিমাণ (500 lL) দেওয়া হয়েছে (NS); গ্রুপ B, ECH কন্ট্রোল গ্রুপ, দেওয়া হয়েছে 20 mg/kg ECH; গ্রুপ সি, এমপিটিপি মডেল গ্রুপ, এনএস এর সমান ভলিউমের সাথে প্রি-ট্রিটেড; এবং গ্রুপ ডি, ইসিএইচ-চিকিত্সা করা গ্রুপ, 20 মিগ্রা/কেজি দিয়ে পূর্ব-চিকিত্সা করা হয়ECH. ECHNS-তে দ্রবীভূত করা হয়েছিল এবং প্রতি 24 ঘন্টা পরপর 15 দিনের জন্য ইন্ট্রা-গ্যাস্ট্রিক প্রশাসনের মাধ্যমে বিতরণ করা হয়েছিল। 11 দিন থেকে 15 দিন পর্যন্ত প্রতি 24 ঘন্টা পরপর 30 mg/kg MPTP 30 mg/kg MPTP-এর পাঁচটি ইন্ট্রাপেরিটোনিয়াল ইনজেকশনের মাধ্যমে মাউস PD মডেল তৈরি করা হয়েছিল। সার্ভিকাল ডিসলোকেশন বা পারফিউশন 10 শতাংশ ক্লোরালহাইড্রেট (. kg) চূড়ান্ত চিকিত্সার 24 ঘন্টা পরে ইন্ট্রাপেরিটোনলি।

পারফিউশন এবং টিস্যু প্রক্রিয়াকরণ পূর্বে বর্ণিত হিসাবে ছিল [14]। ইন্ট্রাকার্ডিয়াক পারফিউশনের পরে, মস্তিষ্কের নমুনাগুলি 4C তে 24 ঘন্টার জন্য 4 শতাংশ প্যারাফর্মালডিহাইডে স্থির করা হয়েছিল, প্যারাফিনে এম্বেড করা হয়েছিল এবং পুরো SNc (স্টেরিওট্যাক্সিক কোঅর্ডিনেটস অ্যান্টিরোপোস্টেরিয়র -3.64 থেকে -2 জুড়ে প্যারাফিনে এমবেড করা হয়েছিল ব্রেগমার সাপেক্ষে মিমি) 5 এলএম এ কাটা হয়েছিল।

প্রতিটি গ্রুপের আরও 5টি প্রাণী জরায়ুর স্থানচ্যুতিতে মারা গিয়েছিল এবং বরফের উপর 1 শতাংশ এসডিএস লাইসিস বাফারে ভেন্ট্রাল মিডব্রেন দ্রুত লস করা হয়েছিল। লাইসেটে CHOP এবং ATF3 প্রোটিনের মাত্রা ওয়েস্টার্ন ব্লটিং দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

kidney injury and disease

সিস্তানচেechinacosideউদ্দীপিত প্রভাব আছেকিডনি

ইঁদুরের ভেন্ট্রাল মিডব্রেইনের সংস্কৃতি (ভিএম)

ডোপামিনার্জিক নিউরন

গর্ভবতী উইস্টার ইঁদুরগুলি সাংহাই ল্যাবরেটরি অ্যানিমাল কোং, (সাংহাই, চীন) থেকে কেনা হয়েছিল। ভিএম-এর ডিএ নিউরনগুলি ভ্রূণের দিনে 14-এ বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। পূর্বে বর্ণিত [15, 16] হিসাবে প্রাথমিক ভিএম ডিএ নিউরন সংস্কৃতি প্রতিষ্ঠার জন্য ভিএমকে বিচ্ছিন্ন এবং প্রক্রিয়া করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, টিস্যুর টুকরা বরফ-ঠান্ডা হ্যাঙ্কসের সুষম লবণের দ্রবণে (HBSS) সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং 5 মিনিটের জন্য 1000 rpm 4C-তে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। টিস্যু পেলেটটি 5 শতাংশ CO2 সহ 37C তাপমাত্রায় 15 মিনিটের জন্য 0.1 শতাংশ ট্রিপসিন-HBSS-এর 750 lL তে ইনকিউব করা হয়েছিল। ভ্রূণ বাছুরের সিরাম (FCS; 750 lL) ট্রিপসিনকে নিষ্ক্রিয় করতে ব্যবহার করা হয়েছিল এবং টিস্যুগুলি মৃদু ট্রিচুরেশন দ্বারা বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল

একটি জীবাণুমুক্ত পাস্তুর পাইপেট ব্যবহার করে। সেল সাসপেনশনগুলিকে 1000 rpm-এ 4 মিনিটের জন্য 4C তে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং ডিফারেনসিয়েশন মিডিয়ামে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল (ডুলবেকোর পরিবর্তিত ঈগলের মাঝারি/F12, 33 mmol/L D-গ্লুকোজ, 1 শতাংশ L-গ্লুটামিন, এবং 1 শতাংশ ফ্যামিলিটেড, এবং 1 শতাংশ B27)। কোষগুলিকে পলি-ডি-লাইসিন (সিগমা)-কোটেড 24-ওয়েল টিস্যু কালচার প্লেটে 5 9 104 কোষে/কূপে 500 lL ডিফারেনসিয়েশন মিডিয়ামে 37C তাপমাত্রায় 5 শতাংশ CO2 দিয়ে 10 দিনের জন্য বীজ দেওয়া হয়েছিল

পরিপক্ক ডিএ নিউরন। ভিএম ডিএ নিউরনগুলি অ্যান্টি-বি-টিউবুলিন আইসোটাইপ III অ্যান্টিবডি এবং টাইরোসিন হাইড্রোক্সিলেস (TH) অ্যান্টিবডি (চিত্র S1) সহ ইমিউনোফ্লুরেসেন্স দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল। কোষগুলিকে 1 mmol/L MPP?, 40 LG/mL ECH, MPP-এর সংমিশ্রণ দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল? এবং ECH, বা PBS একা নিয়ন্ত্রণ হিসাবে। 96 ঘন্টা চিকিত্সার পরে CCK-8 বিকারক দিয়ে কোষের কার্যকারিতা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

এবং গড় হিসাবে উপস্থাপিত হয় ± SD (n {{0}}; **P \0৷{5}}1 বনাম নিয়ন্ত্রণ, #P \ 0.05, ##P \0.01 বনাম MPP চিকিৎসা)। C MPP দ্বারা প্ররোচিত রূপগত পরিবর্তনের হালকা মাইক্রোস্কোপিক চিত্র? বা এমপিপি? এবং ECH. একটি, পিবিএস নিয়ন্ত্রণ; b, 40 lg/mL ECH; c, 1 mmol/L MPP?; d, 1 mmol/L MPP? এবং 10 lg/mL ECH; e, 1 mmol/L MPP? এবং 20 lg/mL ECH; f, 1 mmol/L MPP? এবং 40 lg/mL ECH (স্কেল বার, 200 lm)।

11-

সিস্টানচে ইচিনাকোসাইডের অ্যাপোপটোসিস প্রতিরোধের প্রভাব রয়েছে

SH-SY5Y কোষ সংস্কৃতি

SH-SY5Y কোষগুলি সাংহাই ইনস্টিটিউট অফ সেল বায়োলজির সেল ব্যাঙ্কের (চাইনিজ একাডেমি অফ সায়েন্সেস, সাংহাই, চায়না) এবং 10 শতাংশ ভ্রূণের বোভাইন সিরাম, 100 U/mL পেনিসিলিন এবং 100 U/mL স্ট্রেপ্টোমাইসিনের সাথে সম্পূরক DMEM-তে সংস্কৃত করা হয়েছিল। 5 শতাংশ CO2 দিয়ে সরবরাহ করা একটি আর্দ্রতাযুক্ত 37C ইনকিউবেটরে কোষগুলি বজায় রাখা হয়েছিল। এমপিপি? জীবাণুমুক্ত জলে দ্রবীভূত করা হয়েছিল এবং অবিলম্বে ব্যবহার করা হয়েছিল। ইসিএইচ পিবিএসে দ্রবীভূত হয়েছিল। ROS-সম্পর্কিত জিনের অভিব্যক্তি এবং প্রোটিন স্তরগুলি অন্বেষণ করতে, কোষগুলিকে 6-কূপ প্লেটে বীজ দেওয়া হয়েছিল এবং 24 ঘন্টার জন্য সংষ্কৃত করা হয়েছিল৷ তারপর কোষগুলিকে MPP?, ECH, MPP-এর সংমিশ্রণযুক্ত তাজা মাধ্যম দিয়ে খাওয়ানো হয়েছিল? এবং ECH, বা PBS একা নিয়ন্ত্রণ হিসাবে। 24 ঘন্টা চিকিত্সার পরে, ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণের জন্য কোষগুলিকে 1 শতাংশ SDS লাইসিস বাফার (1 শতাংশ SDS, 25 mmol/L EDTA, 45 mmol/L Tris–HCl, pH 6.5) দিয়ে লাইজ করা হয়েছিল এবং মোট আরএনএ সরাসরি বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল TRIzol বিকারক।

চিকিত্সার পরে ATF3 এবং CHOP বিতরণ বিশ্লেষণ করতে, নিউক্লিয়ার এবং সাইটোপ্লাজমিক নিষ্কাশন বিকারক কিটগুলি (থার্মো ফিশার, ওয়ালথাম, এমএ) ড্রাগ-চিকিত্সা এবং নিয়ন্ত্রণ কোষগুলি থেকে সাইটোপ্লাজমিক এবং পারমাণবিক ভগ্নাংশগুলি বের করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।

কোষের কার্যকারিতা পরীক্ষা

SH-SY5Y কোষগুলিকে 96-কূপ প্লেটে বীজ দেওয়া হয়েছিল এবং রাতারাতি ইনকিউব করা হয়েছিল৷ কোষগুলিকে প্রতি 24 ঘন্টার মধ্যে একটি নতুন সম্পূর্ণ মাধ্যম দিয়ে খাওয়ানো হয়েছিল এবং 3 দিনের জন্য রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল। তারপরে CCK8 সেল কাউন্টার কিট (ডোজিন্দো, জাপান) ব্যবহার করে কার্যকারিতা মূল্যায়ন করা হয়েছিল। পিবিএস নিয়ন্ত্রণের ফলাফলে ডেটা স্বাভাবিক করা হয়েছিল এবং গড় ± SD হিসাবে উপস্থাপিত হয়। ATF3-নকডাউন SH-SY5Y (ATF3 shRNA) এবং কন্ট্রোল (GFP shRNA) কোষে কার্যক্ষমতা বিশ্লেষণ করার জন্য, কোষগুলিকে 96-ওয়েল প্লেটে যোগ করা হয়েছিল এবং 14-16 ঘণ্টার জন্য সংষ্কৃত করা হয়েছিল৷ ATF3 shRNA বা GFP shRNA প্লাজমিডগুলি Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) ব্যবহার করে SH-SY5Y কোষে স্থানান্তরিত হয়েছিল। কোষ 1 mmol/L MPP দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল? বা ট্রান্সফেকশনের 24 ঘন্টা পরে PBS এর সমান পরিমাণ এবং তারপর 3 দিনের জন্য ইনকিউব করা হয়। সেল নম্বর প্রতিদিন গণনা করা হয়। ডেটা গড় ± SD হিসাবে উপস্থাপিত হয়।

shRNA কনস্ট্রাক্টস এবং অলিগো প্রাইমার

pGV298-ATF3 shRNA (ATF3shRNA) এবং GFP কন্ট্রোল shRNA নির্মাণগুলি GeneChem Co. (সাংহাই, চীন) থেকে ছিল। ATF3 টার্গেট সিকোয়েন্স ছিল 50-GCAAAGT G!CCGAAAACAAGA-30 পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতিগুলি থেকে [১৭, ১৮]। MPP দ্বারা প্ররোচিত জিনের অভিব্যক্তি সনাক্ত করতে?, ROS স্ট্রেস-সম্পর্কিত এবং PD-সম্পর্কিত জিনগুলি qRT-PCR-এর জন্য নির্বাচন করা হয়েছিল এবং GAPDH নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। সমস্ত প্রাইমারগুলি সাঙ্গন বায়োটেক কোং (সাংহাই, চীন) দ্বারা সংশ্লেষিত হয়েছিল এবং প্রাইমারের ক্রমগুলি সারণি 1 এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে।

রিয়েল-টাইম পিসিআর

প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে মোট আরএনএ TRIzol বিকারক দিয়ে বের করা হয়েছিল। বিপরীত-প্রতিলিপি এবং পরিমাণগত রিয়েল-টাইম পিসিআর (কিউআরটি-পিসিআর) পূর্বে বর্ণিত হিসাবে সম্পাদিত হয়েছিল। বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন প্রতিক্রিয়া প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে রিভার্টএইড ফার্স্ট স্ট্র্যান্ড সিডিএনএ সিন্থেসিস কিট (থার্মো সায়েন্টিফিক, ওয়াল্টহাম, এমএ) ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল। SYB Premix Ex Taq II কিট (TaKaRa, Dalian, China) qRT-PCR: 20-lL প্রতিক্রিয়া সিস্টেমগুলি ABI (লাইফ টেকনোলজিস, কার্লসব্যাড, CA) এর সাথে ব্যবহার করা হয়েছিল। পিসিআর পরামিতিগুলি নিম্নলিখিত পদক্ষেপগুলি নিয়ে গঠিত: 3 মিনিটের জন্য 95C, 1 চক্র; 5 s এর জন্য 95C এবং 40 s, 40 চক্রের জন্য 60C। চূড়ান্ত তথ্য ছিল না-

GAPDH তে নৈতিকতা এবং নিয়ন্ত্রণের অনুপাত হিসাবে উপস্থাপন করা হয়। প্রশস্তকরণের জন্য ব্যবহৃত প্রাইমারগুলি সারণি 1 এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে।

পশ্চিমা শোষক

পূর্বে বর্ণিত হিসাবে ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ সম্পাদিত হয়েছিল [19]। প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলি ছিল অ্যান্টি-ক্লিভড ক্যাসপেস 3 এবং p53 (সেল সিগন্যালিং টেকনোলজি, ড্যানভার্স, এমএ), অ্যান্টি-জিএপিডিএইচ (প্রোটিনটেক গ্রুপ, শিকাগো, আইএল), অ্যান্টি-জিএডিডি153/চপ (ওয়ানলেই বায়ো, শেনিয়াং, চীন), এবং অ্যান্টি- ATF3, অ্যান্টি-PARP, অ্যান্টি-PUMA, এবং অ্যান্টি-হিস্টোন 3 (সান্তা ক্রুজ বায়োটেকনোলজি, সান্তা ক্রুজ, CA)। Horseradish peroxidase-লেবেলযুক্ত সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলি জ্যাকসন ইমিউন রিসার্চ ল্যাবরেটরিজ (ওয়েস্টার্ন গ্রোভ, PA) থেকে ছিল। পিভিডিএফ মেমব্রেনগুলি ছিল ইএমডি মিলিপুর (বিলেরিকা, এমএ) এবং ইসিএল সাবস্ট্রেটটি ছিল সিডব্লিউবিও (সুঝো, চীন) থেকে। ইমেজ থেকে ধূসর স্তরের উপর ভিত্তি করে আপেক্ষিক প্রোটিন স্তরগুলি Tanon GIS সফ্টওয়্যার (Tanon Biotech, Shanghai, China) দিয়ে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং ডেটা GAPDH-এর লক্ষ্য প্রোটিনের অনুপাত হিসাবে উপস্থাপিত হয়েছে।