LRRK2 Kinase ইনহিবিটর নিউরোনাল কোষে অক্সিডেটিভ স্ট্রেস-ইনডিউসড সেলুলার সেন্সেন্সকে পুনরুজ্জীবিত করে পার্ট 1

অনুগ্রহ করে যোগাযোগ করুনoscar.xiao@wecistanche.comআরও তথ্যের জন্য

পটভূমি।লিউসিন-সমৃদ্ধ রিপিট কিনেস 2(LRRK2) পারকিনসন্স ডিজিজের (PD) প্যাথোজেনেসিসে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। পিডির অগ্রগতির জন্য বার্ধক্য সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ ঝুঁকির কারণ। বার্ধক্য এবং সেলুলার সেন্সেন্সের মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্ক প্রতিষ্ঠিত হয়েছে। সেলুলার সেন্সেসেন্স প্রোটিওলাইটিক পাথওয়ে এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতার সাথে সম্পর্কযুক্ত, যা -synuclein ( -syn) পদ্ধতির সমষ্টির সাথেও যুক্ত। মানুষের ডোপামিনার্জিক নিউরন-সদৃশ কোষগুলিকে (ডিফারেন্সিয়েটেড SH-SY5Y কোষ) 48 ঘন্টার জন্য LRRK2 kinase ইনহিবিটর GSK2578215A(GSK-KI) এর উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিতে রোটেনোন দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। p53, p21Wafi/Cip1(p21), -galactosidase(-gal), Rb phosphorylation, Senescence-associated (SA)-gal কার্যকলাপ সহ সেলুলার সেন্সেন্সের চিহ্নিতকারী, এবংলাইসোসোমালকার্যকলাপ, পরীক্ষা করা হয়. 48 ঘন্টার জন্য GSK-KI-এর উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিতে রোটেনোন দিয়ে চিকিত্সার 30 মিনিট আগে ড্যাশ কোষ এবং ইঁদুরের প্রাথমিক কর্টিকাল নিউরনগুলিকে -সিন ফাইব্রিল দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। ইঁদুরকে দুই সপ্তাহের জন্য প্রতি দুই দিনে একবার রোটেনোন এবং MLi-2 (LRRK2 kinase inhibitor) দিয়ে ইন্ট্রাপেরিটোনলি ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। ফলাফল. রোটেনোন p53-p21 সিগন্যালিং অক্ষের সক্রিয়করণের মাধ্যমে LRRK2 ফসফোরিলেশন এবং -গাল স্তরগুলিকে নিয়ন্ত্রণ করে এবং Rb ফসফোরিলেশনকে হ্রাস করে। অতিরিক্তভাবে, রোটেনোন SA-gal কার্যকলাপ, প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতির মাত্রা এবং LRRK2 আপ-রেগুলেটেডফসফোরিলেশনএবং লাইসোসোমের কার্যকলাপকে বাধা দেয়। রোটেনোন-প্ররোচিত LRRK2 আপগ্র্যুলেশন a-syn fibrils এর ক্লিয়ারেন্সকে দুর্বল করে। LRRK2 ইনহিবিটরের সাথে চিকিত্সা রোটেনোন-প্ররোচিত সেলুলার সেন্সেসেন্স এবং -syn সঞ্চয়কে প্রশমিত করে। উপসংহার LRRK2 kinase কার্যকলাপের রোটেনোন-প্ররোচিত আপগ্র্যুলেশন সেলুলার সেন্সেসেন্সকে উন্নীত করে, যা -syn সঞ্চয়কে উন্নত করে। যাইহোক, একটি LRRK2 kinase ইনহিবিটরের প্রশাসন রোটেনোন-প্ররোচিত সেলুলার সেন্সেন্সকে পুনরুজ্জীবিত করেছে।

আরো জানতে এখানে ক্লিক করুন

1। পরিচিতি

পারকিনসন্স ডিজিজ (PD), যা সবচেয়ে সাধারণ নিউরোডিজেনারেটিভ রোগ, এটি প্রতিবন্ধী মোটর নিয়ন্ত্রণ দ্বারা চিহ্নিত করা হয়[1]। বেশ কিছু জেনেটিক এবং পরিবেশগত কারণ PD[2-5] এর প্যাথোজেনেসিসে অবদান রাখে। LRRK2, PD-এর জন্য একটি প্রধান জেনেটিক রিস্ক ফ্যাক্টর, GTPase এবং kinase কার্যকলাপ উভয়ই প্রদর্শন করে [6]। LRRK2 G2019S মিউট্যান্ট, যা বর্ধিত কিনেস কার্যকলাপ প্রদর্শন করে, PD অগ্রগতি প্রচার করে [7]। G2019S মিউট্যান্টকে আশ্রয়কারী রোগীদের মধ্যে PD হওয়ার ঝুঁকি বয়সের সাথে বৃদ্ধি পায় [8] কারণ বার্ধক্য নিউরোডিজেনারেটিভ রোগের অগ্রগতির সাথে সম্পর্কিত [9]। পূর্বে, আমরা রিপোর্ট করেছি যে LRRK2 kinase কার্যকলাপ সেলুলার সেন্সেসেন্সকে উন্নীত করে এবং আলফা-সিনুকলিন (-syn) সমষ্টির অবক্ষয়কে বাধা দেয় [10]। -Syn হল Lewy Bodies (LB) বা Lewy neurites এর একটি প্রধান উপাদান, যা PD এর পোস্টমর্টেম চিহ্নিতকারী। -syn এর প্রতিবন্ধী অধঃপতনের ফলে এর একত্রীকরণ [11]।

সেলুলার সেন্সেসেন্স প্রোটিন ক্ষয়কারী যন্ত্রকে ক্ষতিগ্রস্ত করে[12-14]। কম-ডোজ রোটেনোনের এক্সপোজার, যা পিডিকে প্ররোচিত করে বলে জানা গেছে, মানুষের ট্র্যাবেকুলার মেশওয়ার্ক সেল লাইনে সেলুলার সেন্সেন্সকে প্রচার করে [15]। অতিরিক্তভাবে, রোটেনোন নিউরনগুলিতে LRRK2 kinase কার্যকলাপকে নিয়ন্ত্রণ করে [16]। অতএব, আমরা অনুমান করেছি যে রোটেনোন LRRK2 kinase সক্রিয়করণের মাধ্যমে সেলুলার সেন্সেসেন্সকে প্রচার করে এবং ফলস্বরূপ -syn একত্রীকরণকে উন্নত করে।

Cistanche রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা উন্নত করতে পারে

2. পদ্ধতি এবং উপকরণ

2.1। কোষ সংস্কৃতি এবং চিকিত্সা.

মানুষের নিউরোব্লাস্টোমা সেল লাইন (SH-SY5Y কোষ) একটি বৃদ্ধির মাধ্যম (Dulbecco-এর পরিবর্তিত ঈগলের মাধ্যম (DMEM;10-013-CV; Corning cellgro, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 1{{{{{ 48}} শতাংশ ফিটাল বোভাইন সিরাম (FBS, 35-010-CV, কর্নিং সেলগ্রো), 1 শতাংশ পেনিসিলিন/স্ট্রেপ্টোমাইসিন (P/S, 10378-016, Gibco, Thermo Fisher Scientific), এবং 1 শতাংশ মাইকোপ্লাজমা অপসারণ বিকারক (KOMA)) একটি 5 শতাংশ CO, ইনকিউবেটরে 37 ডিগ্রিতে (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক)। 10μM অল-ট্রান্স রেটিনোইক অ্যাসিড (R2625-100MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) দ্বারা প্রতি দুইবার একবার বৃদ্ধির মাধ্যম তৈরি করে চিকিত্সার পরে পৃথক SH-SY5Y কোষগুলি(dSH কোষ) প্রাপ্ত হয়েছিল সাত দিনের জন্য দিন। রেটিনয়েড অ্যাসিড চিকিত্সার 7 তম দিনে, কোষগুলিকে রোটেনোন (1 ইউএম) এবং জিএসকে 2572815এ (জিএসকে-কেআই) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল; LRRK2 কাইনেজ ইনহিবিটর; 1μM） 48 ঘন্টার জন্য একটি বৃদ্ধির মাধ্যমে প্রি-পেয়ার। ডাইমিথাইল সালফক্সাইড (DMSO) রোটেনোন এবং জিএসকে-কেআই এর বাহন হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। পূর্বে বর্ণিত হিসাবে -সিন ফাইব্রিলগুলি শুদ্ধ করা হয়েছিল [10]। রোটেনোন- এবং জিএসকে-কেআই-চিকিত্সা করা কোষগুলিকে এ-সিন ফাইব্রিলস (70nM) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। ইঁদুরের প্রাথমিক কর্টিকাল নিউরনগুলিকে 48 ঘন্টার জন্য রোটেনোন (1μM), GSK-KI (l μM) এবং a-syn fibril (70nM) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। ইঁদুরের প্রাথমিক কর্টিকাল নিউরনগুলির চিকিত্সার শর্তগুলি ডিএসএইচ-এর জন্য নিযুক্তদের সাথে অভিন্ন। কোষগুলিকে বরফ-ঠাণ্ডা ফসফেট-বাফারযুক্ত স্যালাইন (PBS) দিয়ে দুবার ধুয়ে 1x নমুনা বাফার (50mM Tris-HCl(pH6.8), 2 শতাংশ সোডিয়াম ডোডেসিল সালফেট, 10 শতাংশ গ্লিসারল, 1 শতাংশ -মারকাপটোথেনল এবং 0.02-এ লাইজ করা হয়েছিল। শতাংশ ব্রোমোফেনল নীল)।

2.2. E16 ইঁদুরের ভ্রূণ থেকে প্রাথমিক কর্টিকাল নিউরনের বিচ্ছিন্নতা এবং সংস্কৃতি।

গর্ভবতী ইঁদুরকে CO, গ্যাস দিয়ে euthanized করা হয়েছিল। জরায়ু ছিন্ন করা হয়েছিল, এবং ভ্রূণের থলি থেকে ভ্রূণগুলিকে বরফ-ঠান্ডা HBSS-/-(14175-079, Gibco, Thermo Fisher Scientific) এ স্থাপন করা হয়েছিল। মাথার খুলি ফোরসেপ ব্যবহার করে খোসা ছাড়ানো হয়েছিল এবং কর্টিসগুলি পুরো মস্তিষ্ক থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। মেনিনজেস অপসারণের পর, কর্টিসগুলিকে 0.25 শতাংশ ট্রাইপসিন-ইডিটিএ(25200-056, জিবকো, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) দিয়ে 37 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 20মিনিটের জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল জল স্নান. এরপরে, কর্টিসগুলিকে 40ug/mL DNase I (DN25, Sigma-Aldrich) দিয়ে আবর্তিত করা হয়েছিল, আলতোভাবে ঘূর্ণায়মান করা হয়েছিল, এবং 37 ডিগ্রি জলের স্নানে 5 মিনিটের জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল। স্তন্যপান দ্বারা বেশিরভাগ সুপারনাট্যান্ট অপসারণ করা হয়েছিল, এবং নমুনাগুলি একটি সিরাম ইনহিবিটর-সমৃদ্ধ MEM(11090-08,Gibco, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক), 1.5 শতাংশ DMEM, 5 শতাংশ FBS, 2.5mg/mL বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল (BSA; A7906, Sigma-Aldrich), এবং 2.5 mg/mL ট্রিপসিন ইনহিবিটর (T9253, Sigma-Aldrich)। সিরাম ইনহিবিটার অপসারণ করা হয়েছিল, এবং কোষের পেলেটটি বৃদ্ধির মাধ্যমের সাথে তার আয়তনের 10 গুণে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল। বৃদ্ধির মাধ্যমটির গঠন নিম্নরূপ: নিউরোবাসাল মিডিয়াম(21103-049, কর্নিং সেলগ্রো, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক), 2 শতাংশ বি-27(17504044, কর্নিং সেলগ্রো, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক), এবং 1x গ্লুটাম্যাক্স{ {34}}(35050-061, কর্নিং সেলগ্রো, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক)। বিচ্ছিন্ন ইঁদুরের প্রাথমিক কর্টিকাল নিউরন কোষগুলিকে (3×10 ডিগ্রি/ওয়েল) একটি 12-ওয়েল প্লেটে (SPL30012, SPL লাইফ সায়েন্স, পোচোয়েন, দক্ষিণ কোরিয়া) বীজ করা হয়েছিল এবং 5-এ 37 ডিগ্রিতে বৃদ্ধির মাধ্যমে সংস্কৃত করা হয়েছিল শতাংশ CO, 24 ঘন্টার জন্য ইনকিউবা-টর। সংস্কৃতির মাধ্যমটিকে 0.2mg/mL 5-fluoro-2'-deoxyuridine(F0503, Sigma-Aldrich) এবং 96ug/mL ইউরিডিন (U3750, সিগমা-অলড্রিচ) দিয়ে পরিপূরক বৃদ্ধির মাধ্যম দিয়ে প্রতিস্থাপন করা হয়েছিল। মাইটোসিস বাধা দেয়। 6 তম দিনে, কোষগুলিকে 1uM রোটেনোন, 1uM GSK-KI, এবং 70nM -syn ফাইব্রিল দিয়ে 48 ঘন্টার জন্য চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং lx নমুনা বাফার দিয়ে সংগ্রহ করা হয়েছিল।

2.3। পশ্চিম ফোঁটার.

পূর্বে বর্ণিত হিসাবে ওয়েস্টার্ন ব্লটিং সম্পাদিত হয়েছিল [17]। ওয়েস্টার্ন ব্লটিং-এর জন্য নিম্নলিখিত অ্যান্টিবডিগুলি ব্যবহার করা হয়েছিল: খরগোশ অ্যান্টি-LRRK2 ফসফো-S935 মনোক্লোনাল(ab133450,Abcam, Cambridge,UK), র‌্যাব-বিট অ্যান্টি-LRRK2 ফসফো-S1292 মনোক্লোনাল (ab203181, AbcamRnomous), অ্যান্টি-এলআরআরকে 2 N241A/34, Neu-roMab,UC Davis, CA, USA), মাউস অ্যান্টি-p53 মনোক্লোনাল (মানুষের জন্য p53:sc-126; মাউস p53:sc-393031 জন্য;সান্তা ক্রুজ বায়োটেকনোলজি, ডালাস, TX, USA), মাউস অ্যান্টি-p21wafi/-Ccip1(p21) মনোক্লোনাল (CM5131, ECM বায়োসায়েন্স, Ver-sailles, KY, USA), মাউস অ্যান্টি-Rb মনোক্লোনাল (#9309S, সেল সিগন্যালিং টেকনোলজি(CST), Danvers,MA , USA), anti-phosphoRb(Ser807/811)(#9308S, CST),মাউস অ্যান্টি- -গ্যালাকটোসিডেস মনোক্লোনাল (sc-377257,সান্তা ক্রুজ বায়োটেক-নোলজি),মাউস অ্যান্টি-p62 মনোক্লোনাল(ab56416 ,Abcam), মাউস অ্যান্টি- -অ্যাক্টিন মনোক্লোনাল(sc-47778; সান্তা ক্রুজ বায়ো-টেকনোলজি), খরগোশ অ্যান্টি-LC3B পলিক্লোনাল (#2775S; CST), মাউস অ্যান্টি- -সিন (ক্লোন) 42)মনোক্লোনাল (610786; BD বায়ো-সায়েন্স, সান জোসে, CA, USA),অ্যান্টি-ফসফো-থ্রোনিন-আর্গি-নাইন(#2351S, CST), অ্যান্টি-p53(SC-99, সান্তা ক্রুজ বায়োটেকনোলজি), অ্যান্টি-লামিনবি(SC-6216,সান্তা ক্রুজ বায়োটেক-নোলজি), ছাগলের পারক্সিডেস-কনজুগেটেড অ্যাফিনিপিউর অ্যান্টি-মাউস আইজিজি(এইচ প্লাস এল)(#115-035-003;জ্যাকসন ইমিউনোরসার্চ ল্যাবো-রেটরিজ ইনক।, ওয়েস্ট গ্রোভ, পিএ, ইউএসএ), এবং ছাগলperoxidase-সংযুক্তঅ্যাফিনিপিউর অ্যান্টি-র্যাবিট আইজিজি(এইচ প্লাস এল)(#1l1-035-144; জ্যাকসন ইমিউনোরসার্চ ল্যাবরেটরিজ ইনক।) অ্যান্টিবডি। নাইট্রোসেলুলোজ ঝিল্লিতে ইমিউনোরঅ্যাক্টিভ সংকেতগুলি লুমিনাটা ক্রেসসেন্ডো ওয়েস্টার্ন এইচআরপি (#WBLUR0500, Merck & Co. Inc., Kenilworth, NJ, USA) দিয়ে তৈরি করা হয়েছিল এবং ছবিগুলি একটি মাইক্রোকেমি 4.2 ক্যামেরা (শিমাদজু, কিয়োটো, জাপান) দিয়ে ধারণ করা হয়েছিল।

2.4.প্রক্সিমিটি লিগেশন অ্যাসে (PLA)এবং ইমিউনোফ্লোরেসেন্স (IF)।

পিএলএ Duolink⑨ In Situ Detection Reagents Green (DUO{{0}}RXN, Sigma-Aldrich), DuolinkeIn Situ PLA4Probe অ্যান্টি-মাউস MINUS অ্যান্টিবডি (DUO92002-100RXN, সিগমা-অলড্রিচ) ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল , এবং অ্যান্টি-র্যাবিট প্লাস অ্যান্টিবডি (DUO92004-100RXN, Sigma-Aldrich), প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসরণ করে। SH-SY5Y কোষগুলিকে 96-ওয়েল ব্ল্যাক প্লেটে (655077, Greiner Bio-One, Krems-münster, Austria) বিভক্ত করা হয়েছিল, এবং পার্থক্য করা কোষগুলিকে রোটেনোন এবং GSK-KI দিয়ে 7 তম দিনে চিকিত্সা করা হয়েছিল৷ কোষগুলি বরফ-ঠান্ডা Dulbecco-এর PBS(DPBS) দিয়ে দুবার ধুয়ে, ঘরের তাপমাত্রায় (RT) 30 মিনিটের জন্য 4 শতাংশ প্যারাফর্মালডিহাইড দিয়ে স্থির করা হয় এবং বরফ-ঠাণ্ডা DPBS দিয়ে তিনবার ধুয়ে ফেলা হয়। এর পরে, DPBS-এ প্রস্তুত 0.1 শতাংশ ট্রাইটন এক্স-100 ব্যবহার করে কোষগুলিকে ব্যাপ্ত করা হয়েছিল। ঠান্ডা ডিপিবিএস দিয়ে তিনবার ধোয়ার পর, কোষগুলিকে 1 ঘন্টার জন্য 37C তাপমাত্রায় ব্লকিং সলিউশনের ড্রপ দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। ব্লকিং দ্রবণটি সরানো হয়েছিল, এবং কোষগুলি 3 ঘন্টার জন্য 37 ডিগ্রিতে অ্যান্টিবডি (50μL) দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। অ্যান্টি-বডি মিশ্রণটি কিট থেকে একটি অ্যান্টিবডি ডাইলুয়েন্টের সমন্বয়ে গঠিত ছিল (পিএলএর জন্য ব্যবহৃত অ্যান্টিবডি: মাউস অ্যান্টি-এলআরআরকে2 মনো-ক্লোনাল(1:20) অ্যান্টিবডি এবং খরগোশ অ্যান্টি-এলআরআরকে2 ফসফো-এস1292 মনোক্লোনাল (1:20) অ্যান্টিবডি; অ্যান্টিবডি IF অ্যাস-এর জন্য ব্যবহৃত হয়: চিকেন অ্যান্টি- -গাল পলিক্লোনাল অ্যান্টিবডি(1:400, ab9361, Abcam))। IF অ্যাসে, পিএলএ অ্যাপ্লিকেশান ধাপ পর্যন্ত পুরো প্রক্রিয়া জুড়ে অ্যান্টিবডি যোগ করা হয়েছিল। তারপর নমুনাগুলিকে 5 মিনিটের জন্য 1x ওয়াশ বাফার A দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। প্রোবের সমাধান প্রস্তুত করতে, ডুওলিঙ্ক⑧ইন সিটু পিএলএ· প্রোব অ্যান্টি-মাউস মাইনাস এবং অ্যান্টি-র্যাবিট প্লাস অ্যান্টিবডি ডাইলুয়েন্ট (1:5) এর সাথে মিশ্রিত করা হয়েছিল। IF পরীক্ষার জন্য, অ্যান্টি{51}}গ্যাল অ্যান্টিবডিও যোগ করা হয়েছিল (1:400) মিশ্রণে। কোষগুলি 1 ঘন্টার জন্য 37C এ প্রোব দ্রবণের 50μL দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। এর পরে, কোষগুলি 5 মিনিটের জন্য এলএক্স ওয়াশ বাফার এ দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। IF অ্যাস-এর জন্য, লিগেজ (40:1) এবং অ্যান্টি- -গাল অ্যান্টিবডি (400:1) লাইগেশন বাফারে মিশ্রিত হয়েছিল। কোষগুলি 30 মিনিটের জন্য 37 ডিগ্রিতে লাইগেশন দ্রবণ（50μL） দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল এবং 5 মিনিটের জন্য lx ওয়াশ বাফার A দিয়ে দুবার ধোয়া হয়েছিল। IF পরীক্ষার জন্য,পলিমারেজ(1:40) 37C তাপমাত্রায় 100 মিনিটের জন্য ছাগল-বিরোধী চিকেন IgY H প্লাস L(Alexa Fluor② 594; ab150172) সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (1:500) দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। কোষগুলি 10 মিনিটের জন্য 1x ওয়াশ বাফার বি দিয়ে দুবার ধোয়া হয়েছিল, তারপরে 1 মিনিটের জন্য 0.01x ওয়াশ বাফার বি দিয়ে ধোয়া হয়েছিল। নিউক্লিয়াসকে দাগ দেওয়ার জন্য, কোষগুলি 10 মিনিটের জন্য RT-তে DPBS-এ প্রস্তুত Hoechst 33342 (1:1000; 62249, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। একটি কনফোকাল লেজার স্ক্যানিং মাইক্রোস্কোপ (LSM 700, Carl Zeiss Jena, Germany) ব্যবহার করে 96-কূপ কালো প্লেটের কোষগুলির ছবিগুলি ধারণ করা হয়েছিল৷

2.5.ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন।

রোটেনোন (1 μM）) এবং GSK-KI （1 uM） দিয়ে চিকিত্সা করা dSHcellগুলির সম্পূর্ণ-কোষের লাইসেটগুলি লাইসিস দ্রবণ (PBS, 1 শতাংশ ট্রাইটন X-100, 1x প্রোটেজ ইনহিবিটর ককটেল, এবং lx ফসফেটেস) ব্যবহার করে প্রি-প্যার করা হয়েছিল। ইনহিবিটার ককটেল)। লাইসেটগুলিকে 5 মিনিটের জন্য 4,000g এবং 4 ডিগ্রি ডিগ্রীতে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল, এবং সুপারনাট্যান্টকে অ্যান্টি-p53 অ্যান্টিবডি (554293, বিডি বায়োসায়েন্সেস) এবং পিয়ার্সপ্রোটিন জি আগা-রোজ (20398, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। 12 ঘন্টার জন্য লাইসিস সমাধানে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়। পুঁতিগুলি লাইসিস দ্রবণ দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং পুঁতি-প্রোটিন কমপ্লেক্সটি এলএক্স নমুনা বাফার দিয়ে বিকৃত করা হয়েছিল।

2.6। পারমাণবিক ভগ্নাংশ।

পারমাণবিক ভগ্নাংশটি নির্মাতার নির্দেশ অনুসরণ করে NE-PERr নিউক্লিয়ার এবং সাইটোপ্লাজমিক এক্সট্রাকশন রিএজেন্টস (78833, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল।

2.7। mRNA প্রস্তুতি এবং পরিমাণগত রিয়েল-টাইম পলিমারেজ চেইন প্রতিক্রিয়া (qRT-PCR)।

mRNA কে RNeasy Plus Mini kit (74134, QIAGEN, Hilden, Germany) ব্যবহার করে রোটেনোন/GSK-KI-চিকিত্সা করা dSH কোষ থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। এরপর, mRNA কে TOPscript cDNA সংশ্লেষণ কিট (EZ005S, Enzynomics, Daejeon, Republic of Korea) ব্যবহার করে পরিপূরক DNA (cDNA) তে বিপরীতভাবে প্রতিলিপি করা হয়েছিল। TOPreal"qPCR 2x প্রি-মিক্স (SYBR সবুজ) ব্যবহার করে cDNA qRT-PCR-এর শিকার হয়েছিল। ROX, UDG plus)(RT500M, Enzynomics)। নিম্নলিখিত প্রাইমারগুলি qRT-PCR-এর জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল: মানব p21,5'-ATG AAA TTC ACC CCC TTT CC-3'(ফরোয়ার্ড)) এবং 5'-CCC ট্যাগ GCT GTG CTC ACT TC-3'(বিপরীত); মানব p16INK4(p16),5'-CCC AAC GCA CCG AAT AGT TAC-3'(ফরোয়ার্ড) এবং 5'-CAC GGG TCG GGT GAG AGT -3'(বিপরীত).qRT-PCR Mic qPCR সাইক্লারে (MIC-4,বায়োমলিকুলার সিস্টেম, আপার কুমেরা, অস্ট্রেলিয়া) সঞ্চালিত হয়েছিল৷

2.8। সেনেসেন্স-অ্যাসোসিয়েটেড (SA)Galactosidase (-Gal) কার্যকলাপ, প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতি (ROS), এবং লাইসোসোম কার্যকলাপের পরিমাপ।

30 মিনিটের পরের চিকিত্সায়, লাইভ dSH কোষগুলি 2μM GlycoGREEN-Gal (GC611, Goryo Chemical Inc., Hokkaido, Japan), 5uM 2',7'-ডিক্লোরোফ্লুরেসসিন ডায়াসেটেট (DCFDA; 287810, ক্যালবিও-সিএ, ক্যালবিও-সিএ, ক্যালবিও-সিএ) দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল। USA）,2μM LysoSensorm Blue DND-167 (L7533, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), এবং 1 μM Hoechst 33342 যথাক্রমে SA-gal কার্যকলাপ, ROS, সক্রিয় লাইসোসোম এবং নিউক্লিয়াস পরীক্ষা করার জন্য। ProLongDiamond Antifade Mountant (P36965, Invitrogen) দিয়ে মাউন্ট করা হয়েছে এবং একটি কনফোকাল লেজার স্ক্যানিং মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে চিত্রিত করা হয়েছে। একটি কনফোকাল লেজার স্ক্যানিং মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে ডিফারেনশিয়াল ইন্টারফারেন্স কনট্রাস্ট ইমেজ প্রাপ্ত করা হয়েছে। 2.9.SA -Gal Activity Assay। SA -gal কার্যকলাপ ব্যবহার করে একটি পরীক্ষা করা হয়েছিল {21}}ওয়েল সেলুলার সেন্সেসেন্স অ্যাসে কিট(CBA-213, Cell Biolabs Inc., San Diego, CA, USA), প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসরণ করে৷

2.10.মাউস হ্যান্ডলিং এবং ড্রাগ অ্যাডমিনিস্ট্রেশন।

ডানকুক অ্যানিমাল এথিক্স কমিটির (ডানকুক আইএসিইউসি,18-026) নির্দেশিকা অনুসারে ইঁদুরগুলি পূর্বে বর্ণিত হিসাবে পরিচালনা করা হয়েছিল [18]। C57BL/6] 16 সপ্তাহ বয়সী পুরুষ ইঁদুরকে ইন্ট্রাপেরিটোনলি রোটেনোন দিয়ে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল (0) .75 mg/kg শরীরের ওজন) এবং MLi-2 (একটি LRRK2 kinase নিরোধক; 1mg/kg শরীরের ওজন) দুই সপ্তাহের জন্য প্রতি দুই দিনে একবার।

2.11.রোটারড পরীক্ষা এবং মস্তিষ্কের টিস্যু প্রস্তুতি।

14 তম দিনে চিকিত্সার পরে, ইঁদুরগুলিকে একটি ঘূর্ণনযোগ্য সিলিন্ডার-আকৃতির রডের উপর স্থাপন করা হয়েছিল। মেঝেতে পড়ার প্রয়োজনীয় সময় রেকর্ড করা হয়েছিল। রোটারড পরীক্ষার বিশদ বিবরণ অন্যত্র বর্ণনা করা হয়েছে [18]। এর পরে, ইঁদুরগুলিকে euthanized করা হয়েছিল এবং Ca2 এবং Mg ধারণকারী বরফ-ঠান্ডা HBSS দিয়ে ট্রান্সকার্ডিয়ালভাবে পারফিউজ করা হয়েছিল। মাইক্রো কাঁচি এবং টুইজার দিয়ে মিডব্রেন ছিন্ন করা হয়েছিল। টিস্যুগুলি পিবিএস-এ 1 শতাংশ ট্রাইটন X-100,1xXpert প্রোটিজ ইনহিবিটর ককটেল সলিউশন (P3100, GenDEPOT, Katy, TX, USA), এবং lx Xpert ফসফেটেস ইনহিবিটর ককটেল সলিউশন (P3200,GenDEPOT) ধারণ করা হয়েছিল। প্যালেট পেস্টল কর্ডলেস মোটর (সিগমা-অলড্রিচ) ব্যবহার করে নমুনাগুলি একজাত করা হয়েছিল। সুপারনাট্যান্ট ওয়েস্টার্ন ব্লটিং, এসএ-গাল অ্যাকটিভিটি অ্যাস এবং এনজাইম-লিঙ্কড ইমিউনোসর্বেন্ট অ্যাস (ELISA) এর শিকার হয়েছিল।

Oligomeric -Syn-এর জন্য 2.12.ELISA।

পূর্বে, আমরা একটি অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে ফাইব্রিলার -সিন অলিগোমারগুলির বিশ্লেষণের জন্য একটি স্যান্ডউইচ এলিসা প্রতিষ্ঠা করেছি যা -সিন সমষ্টির ফিলামেন্টাস গঠনকে স্বীকৃতি দেয় [17]। অপরিশোধিত মিডব্রেন লাইসেটগুলি ELISA এর অধীন ছিল এবং -syn সমষ্টিগুলি -syn ফাইব্রিল মান ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল।

2.13। ছবি এবং তথ্য বিশ্লেষণ.

PLA এবং লাইভ-সেল স্টেনিংয়ের তীব্রতা Zen 2012 (Carl Zeiss) ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল। লক্ষ্য প্রোটিনগুলির ঘনত্ব ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল

চিত্র 1: রোটেনোন-প্ররোচিত LRRK2 কাইনেজ অ্যাক্টিভেশন মানুষের বিভেদযুক্ত নিউরোব্লাস্টোমা সেল লাইনে সেলুলার সেন্সেন্সকে উৎসাহিত করে। 1 uM রোটেনোন বা 1 uM GSK2578215A(GSK-K), একটি LRRK2 kinase ইনহিবিটর, লক্ষ্য প্রোটিন(a) এর বিরুদ্ধে অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে 48 ঘন্টার জন্য dSH কোষের পশ্চিমী ব্লটিং বিশ্লেষণ। প্রোটিনের ঘনত্ব -অ্যাক্টিন (bg.n =3.(h) dSH কোষগুলিকে 48 ঘন্টার জন্য 1 uM রোটেনোন বা 1uM GSK-KI দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল যা প্রক্সিমিটি লাইগেশন অ্যাস (PLA) এর শিকার হয়েছিল। phospho-S1292 LRRK2 এবং টোটাল IRRK2(PIA-pS1292) এবং ইমিউনোফ্লোরোসেন্স (TF) বিশ্লেষণ -গ্যালাক্টোসিডেস, নিউক্লিয়াস Hoechst 33342 দিয়ে দাগযুক্ত ছিল। PLA এবং IF স্টেনিং-এ ব্যবহৃত নিয়ন্ত্রণগুলি ফলাফল দুটির বৈধতা প্রকাশ করে। PLA-pS1292(i) এবং -galactosidase (j) এর তীব্রতা 4',6-diamidino-2-phenylindole.n= 4 এর মধ্যে স্বাভাবিক করা হয়েছিল; কক্ষের সংখ্যা= 12-17।

মাল্টি গেজ (ফুজিলম, টোকিও, জাপান)। প্রিজম 8 (গ্রাফপ্যাড সফ্টওয়্যার, সান দিয়েগো, CA, USA) ব্যবহার করে সমস্ত ডেটাসেট বিশ্লেষণ এবং গ্রাফ করা হয়েছিল। dSH কোষ এবং ইঁদুরের প্রাথমিক কর্টিকাল নিউরনগুলি ব্যবহার করে সঞ্চালিত পরীক্ষার ডেটা দ্বিমুখী বিশ্লেষণ ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ভেরিয়েন্সের (ANOVA), তারপরে Bonferroni's post hoc test(n=3)। এদিকে,the data obtained from mouse experiments, live-cell stain-ing,and PLA in the dSH cells were analyzed using two-way ANOVA, followed by Tukey's post hoc test (n>3)। সমস্ত ডেটা গড় ± মান ত্রুটি হিসাবে উপস্থাপিত হয়. *পি<><><><0.0001,and n.s.="not">

চিত্র 2: LRRK kinase ইনহিবিটর ডিফারেনিয়েটেড মানব নিউরোব্লাস্টোমা সেল লাইনে p53 সক্রিয়করণকে বাধা দেয়। (a) সম্পূর্ণ কোষের লাইসেট (20 শতাংশ), যা ইমিউনোপ্রেসিপিটেশন (আইপি) এর ইনপুট হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল এবং পারমাণবিক ভগ্নাংশ সংগ্রহ করা হয়েছিল। বিশ্লেষণে প্রকাশ করা হয়েছে যে 20 শতাংশ ইনপুট চিত্র 1-এ পরিলক্ষিত ফলাফলের অনুরূপ। p53-তে TXR সাইট ফসফোরিলেশন স্তরগুলি মোট p53 স্তরে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। n=3.(ডি)নিউসিয়াসের মোট p53 স্তরগুলি পশ্চিমা ব্লটিং ব্যবহার করে পরীক্ষা করা হয়েছিল। LaminB পারমাণবিক p53 স্তরের স্বাভাবিককরণের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল। n=3.(f) চিকিত্সা গোষ্ঠীতে p21 এবং pl6-এর mRNA স্তরগুলি গাড়ি-(ডাইমিথাইল সালফক্সাইড-) চিকিত্সা করা গ্রুপে থাকা ব্যক্তিদের কাছে স্বাভাবিক করা হয়েছিল, n =3৷

এই নিবন্ধটি হিন্দাউই অক্সিডেটিভ মেডিসিন এবং সেলুলার লংএভিটি ভলিউম 2021, আর্টিকেল আইডি 9969842, 16 পৃষ্ঠাগুলি থেকে নেওয়া হয়েছে https://doi.org/10.1155/2021/9969842