এমটিটি অ্যাসের সাথে সিস্তানচে টিউবুলোসা থেকে ফেনাইলেথানয়েড গ্লাইকোসাইডের হস্তক্ষেপ

যোগাযোগ: অড্রে হু হোয়াটসঅ্যাপ/এইচপি: 0086 13880143964 ইমেল:audrey.hu@wecistanche.com

ইউ-জি ওয়াং, সি-মিন ঝো, গ্যাং জু এবং ইউ-কিউ গাও

বিমূর্ত:

এমটিটি অ্যাস, একটি স্ক্রীনিং পদ্ধতি হিসাবে, কোষের কার্যকারিতা এবং বিস্তার পরিমাপ করতে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়েছে। যাইহোক, এটি লক্ষ করা উচিত যে MTT অ্যাস এর প্রভাবকে সঠিকভাবে প্রতিফলিত করতে পারে নাCistanche tubulosaEA.hy926 কোষের কার্যকারিতা উপর ethanolic নির্যাস. এমটিটি অ্যাস, ইচিনাকোসাইড এবং অ্যাক্টিওসাইডের পরস্পরবিরোধী পর্যবেক্ষণের জন্য দায়ী উপাদানগুলি তদন্ত ও সনাক্ত করতে, সি. টিউবুলোসা ইথানোলিক নির্যাস থেকে দুটি প্রধান ফিনিলেথানয়েড গ্লাইকোসাইড আলাদা করা হয়েছিল। CCK-8, Hoechst 33342 এবং annexin V-FITC/PI অ্যাসেস থেকে প্রাপ্ত ডেটা থেকে বোঝা যায় যে উভয় বিচ্ছিন্ন যৌগগুলিতে উপস্থিত ক্যাফেওয়েল গ্রুপ এমটিটি পরীক্ষার পরস্পরবিরোধী ফলাফলের জন্য দায়ী ছিল। এই তথ্যগুলি বিভ্রান্তিকর ফলাফল তৈরি এড়াতে কোষের কার্যক্ষমতার উপর ঔষধি এজেন্টের প্রভাব নির্ধারণ করতে বিভিন্ন পদ্ধতি ব্যবহার করার প্রয়োজনীয়তার উপর জোর দেয়।

কীওয়ার্ড: MTT অ্যাস;phenylethanoid glycoside; ক্যাফেইক অ্যাসিড; সেল কার্যকরতা; হস্তক্ষেপ

ভূমিকা

পরজীবী উদ্ভিদCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (Orobanchaceae family) উত্তর আফ্রিকা, আরব এবং এশিয়ান দেশগুলিতে ব্যাপকভাবে বিতরণ করা হয় [1]। থেকে ডালপালাCistanche tubulosaএবংCistanche deserticolaপ্রথাগত চীনা ওষুধে গুরুত্বপূর্ণ, ঔপনিবেশিক জড়তার কারণে পুরুষত্বহীনতা, বন্ধ্যাত্ব, লুম্বাগো এবং কোষ্ঠকাঠিন্যের চিকিৎসার জন্য ব্যবহার করা হয়েছে [২]। এছাড়াও, সিস্টানচে টিউবুলোসার ইথানোলিক নির্যাসটি ইঁদুরের সেরিব্রাল হাইপোক্সিয়ার বিরুদ্ধে একটি উল্লেখযোগ্য প্রতিরক্ষামূলক প্রভাব দেখিয়েছে [3]।

এন্ডোথেলিয়াল কোষগুলি হাইপোক্সিক পালমোনারি হাইপারটেনশনের প্যাথোজেনেসিসে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। EA.hy926 এন্ডোথেলিয়াল সেল লাইনটি প্রাথমিক এন্ডোথেলিয়াল কোষের মতো যথেষ্ট। আমাদের নিজস্ব গবেষণার সময় অ্যান্টি-হাইপক্সিক প্রভাবCistanche tubulosaEA.hy926 এন্ডোথেলিয়াল কোষে ইথানোলিক নির্যাস, আমরা লক্ষ্য করেছি যে 3-(4,5-ডাইমেথাইলথিয়াজল-2-yl)-2,5-ডিফেনিল্টেট্রাজোলিয়াম ব্রোমাইড (MTT) অ্যাস, যা সাধারণত সাইটোটক্সিসিটি এবং সাইটোস্ট্যাটিক ক্রিয়াকলাপের গবেষণায় কোষের কার্যকারিতা মূল্যায়ন করতে ব্যবহৃত হয়, চিকিত্সার পরে EA.hy926 কোষের কার্যকারিতা বৃদ্ধি দেখিয়ে বিরোধপূর্ণ ফলাফল তৈরি করে।

একটি ঔষধি এজেন্টের সম্ভাব্য সাইটোটক্সিক বা সাইটোপ্রোটেকটিভ প্রভাব সনাক্ত করার জন্য কোষের কার্যক্ষমতার সঠিক মূল্যায়ন অপরিহার্য। তাই, আমরা তদন্ত করেছি যে সি. টিউবুলোসা ইথানলিক নির্যাসে উপস্থিত কোন উপাদানগুলি এমটিটি পরীক্ষার সাথে পরিলক্ষিত বিরোধপূর্ণ ফলাফলের জন্য দায়ী হতে পারে। আমরা C. tubulosa ethanolic extract থেকে দুটি প্রধান phenylethanoid glycosides (PhGs) বিচ্ছিন্ন করেছি, echinacoside (এরপরে যৌগ 1) এবং acteoside (এর পরে যৌগ 2), এবং বিভিন্ন পদ্ধতি ব্যবহার করে EA.hy926 কোষের কার্যক্ষমতার উপর তাদের প্রভাব নির্ধারণ করেছি। উপরন্তু, 1 এবং 2 যৌগগুলির কোন বিকল্পটি পরস্পরবিরোধী ফলাফলের জন্য দায়ী হতে পারে তা আরও স্পষ্ট করার জন্য, আমরা তাদের অ্যাগ্লাইকোন, ক্যাফেইক অ্যাসিড (এর পরে যৌগ 3) এবং 3,4-ডাইহাইড্রোক্সিলফেনিলেথানল (এর পরে যৌগ 4) পরীক্ষা করেছি। একই পদ্ধতি ব্যবহার করে EA.hy926 কোষের কার্যক্ষমতার উপর।

ফলাফল এবং আলোচনা

যৌগ সনাক্তকরণ

সি. টিউবুলোসা ইথানোলিক নির্যাস থেকে বিচ্ছিন্ন দুটি যৌগের গঠন পারমাণবিক চৌম্বকীয় অনুরণন (এনএমআর) এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি (এমএস) বিশ্লেষণ দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছে এবং চিত্র 1-এ দেখানো হয়েছে। পূর্বে রিপোর্ট করা এনএমআর (টেবিল) এর সাথে তুলনা করে যৌগ 1কে ইচিনাকোসাইড হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছিল। 1) এবং MS (m/z 785 [M−H]− ) ডেটা [4]। যৌগ 2 NMR স্পেকট্রা একটি -D-গ্লুকোপাইরানোসিল গ্রুপের (টেবিল 1) অনুপস্থিতি ব্যতীত যৌগ 1 এর সাথে অত্যন্ত মিল ছিল। যৌগ 2 (m/z 623 [M−H]− ) কে অ্যাক্টিওসাইড [5] হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছিল। গুরুত্বপূর্ণভাবে, উভয় যৌগের একই অ্যাগ্লাইকোন রয়েছে, যার মধ্যে রয়েছে ক্যাফেইক অ্যাসিড (যৌগ 3) এবং 3,4-ডাইহাইড্রোক্সিলফেনিলেথানল (যৌগ 4)।

সেল কার্যকারিতা পরীক্ষা

MTT এবং CCK{{0}} অ্যাসে ব্যবহার করা হয়েছিল EA.hy926 কোষের কার্যক্ষমতার উপর যৌগ 1-4 এর প্রভাব বিশ্লেষণ করতে। এমটিটি পরীক্ষায় দেখা গেছে যে 25 এবং 50 μM যৌগ 1, 2, বা 3 (যৌগ 1 এর জন্য 166.3 শতাংশ এবং 174.1 শতাংশ, 205.8 শতাংশ এবং যৌগের জন্য 224.3 শতাংশ) দিয়ে চিকিত্সার পরে EA.hy926 কোষগুলির কার্যকারিতা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে। 2, এবং যৌগ 3 এর জন্য যথাক্রমে 164.8 শতাংশ এবং 189.6 শতাংশ; p <0.05), যখন="" নিয়ন্ত্রণ="" কোষের="" সাথে="" তুলনা="" করা="" হয়="" (চিত্র="" 2a)।="" তদ্ব্যতীত,="" কোষগুলির="" একটি="" রূপতাত্ত্বিক="" পরিদর্শন="" নির্ধারণ="" করে="" যে="" 50="" μm="" যৌগ="" 1,="" 2,="" বা="" 3="" দিয়ে="" চিকিত্সা="" বেগুনি="" ফর্মাজান="" স্ফটিকগুলির="" গঠন="" বৃদ্ধি="" করেছে,="" যা="" জীবিত="" কোষগুলির="" অনুপাতের="" একটি="" প্রত্যক্ষ="" ইঙ্গিত="" হিসাবে="" বিবেচিত="" হয়="" (চিত্র="" 3)।="" বিপরীতভাবে,="" cck-8="" পরীক্ষায়="" পরামর্শ="" দেওয়া="" হয়েছে="" যে="" 12.5,="" 25,="" এবং="" 50="" μm="" যৌগ="" 1,="" 2,="" বা="" 3="" (75.5="" শতাংশ,="" 45.1="" শতাংশ,="" এবং="" যৌগ="" 1,="" 85.5="" শতাংশের="" জন্য="" 43.7="" শতাংশ)="" দিয়ে="" চিকিত্সার="" পরে="" কোষের="" কার্যক্ষমতা="" উল্লেখযোগ্যভাবে="" হ্রাস="" পেয়েছে।="" যৌগ="" 2="" এর="" জন্য="" 51.8="" শতাংশ,="" এবং="" 34.3="" শতাংশ,="" এবং="" যৌগ="" 3="" এর="" জন্য="" যথাক্রমে="" 64.5="" শতাংশ,="" 48.2="" শতাংশ="" এবং="" 36.4="" শতাংশ;="" p=""><0.05), নিয়ন্ত্রণ="" কোষের="" তুলনায়="" (চিত্র="" 2b)।="" যৌগ="" 4="" mtt="" বা="" cck-8="" পরীক্ষায়="" কোষের="" কার্যক্ষমতাকে="" প্রভাবিত="" করেনি।="" দুটি="" অ্যাসেসের="" সাথে="" প্রাপ্ত="" ফলাফলের="" মধ্যে="" পার্থক্য="" থেকে="" বোঝা="" যায়="" যে="" দুটি="" অ্যাসেগুলির="" একটি="" সঠিকভাবে="" ea.hy926="" কোষের="" কার্যকারিতার="" উপর="" যৌগ="" 1="" এবং="" 2="" এর="" প্রভাবগুলিকে="" সঠিকভাবে="" প্রতিফলিত="" করতে="" পারে="">

হোচেস্ট স্টেনিং দ্বারা অ্যাপোপটোসিস মূল্যায়ন

Hoechst 33342 হল একটি কোষ-ভেদযোগ্য DNA দাগ যা অতিবেগুনী আলো দ্বারা উত্তেজিত হয় এবং 460 থেকে 490 nm এ নীল প্রতিপ্রভ নির্গত করে। অ্যাপোপটোটিক কোষের ঘনীভূত ক্রোমাটিন সাধারণ কোষের ক্রোমাটিনের চেয়ে বেশি উজ্জ্বলভাবে দাগ দেয় [6]। যেখানে কন্ট্রোল কোষগুলি সমানভাবে বিচ্ছুরিত ক্রোমাটিন, স্বাভাবিক অর্গানেল এবং অক্ষত কোষের ঝিল্লি প্রদর্শন করে, সেখানে 48 ঘন্টার জন্য 50 μM যৌগ 1, 2, বা 3 দিয়ে ইনকিউব করা কোষগুলি অ্যাপোপটোটিক কোষগুলির সাধারণ দাগ দেখায় (চিত্র 4A)। বিপরীতভাবে, যৌগ 4 এর 50 μM কোষের এক্সপোজার নিয়ন্ত্রণ চিকিত্সার তুলনায় অ্যাপোপটোটিক নিউক্লিয়াসের সংখ্যা বাড়ায়নি।

অ্যাপোপটোটিক কোষের ফ্লো সাইটোমেট্রিক বিশ্লেষণ

অ্যানেক্সিন ভি-এফআইটিসি/পিআই ডাবল-স্টেইনিং অ্যাস অ্যানেক্সিন ভি-এফআইটিসি-র ফসফ্যাটিডিলসারিনের উচ্চ-সম্পর্কের দ্বারা অ্যাপোপটোটিক কোষগুলিকে সনাক্ত করে, যা অ্যাপোপটোসিস [7] এর মধ্য দিয়ে যাওয়া কোষগুলিতে বহিরাগত হয়। এই পরীক্ষায়, কার্যকর কোষগুলি অ্যানেক্সিন V বা পিআই-এর সাথে আবদ্ধ হয় না এবং তাই দাগযুক্ত হয় না (নিম্ন বাম চতুর্ভুজ), প্রাথমিক অ্যাপোপটোটিক কোষগুলি অ্যানেক্সিন ভি-এফআইটিসি (নিম্ন ডান চতুর্ভুজ) এবং দেরীতে অ্যাপোপটোটিক কোষের বাঁধাই দ্বারা সবুজ হয়ে যায়। অ্যানেক্সিন V-FITC-এর সাথে ফসফ্যাটিডিলসারিন এবং পিআই-এর সাথে নেক্রোটিক কোষের সাথে যথাক্রমে (উপরের ডান চতুর্ভুজ) বাঁধার ফলে সবুজ এবং লাল হয়ে যায়। চিত্র 4B-তে দেখানো হয়েছে, 48 ঘন্টার জন্য 50 μM যৌগ 1, 2, বা 3 দিয়ে ইনকিউব করা কোষ, অ্যাপোপটোটিক কোষের শতাংশ 3.74 শতাংশ (নিয়ন্ত্রণ কোষ) থেকে যথাক্রমে 10.32 শতাংশ, 12.95 শতাংশ এবং 11.30 শতাংশে বৃদ্ধি পেয়েছে। নিয়ন্ত্রণ কোষের তুলনায়, যৌগ 4 অ্যাপোপটোটিক EA.hy926 কোষের শতাংশ বৃদ্ধি করেনি।

CCK-8 অ্যাস এবং Hoechst 33342 স্টেনিং দ্বারা প্রাপ্ত ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, ফ্লো সাইটোমেট্রি অ্যাস দেখায় যে EA.hy926 কোষে যৌগ 1, 2, এবং 3 প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিস। সামগ্রিকভাবে, এই পর্যবেক্ষণগুলি পরামর্শ দেয় যে EA.hy926 কোষের কার্যকারিতা বৃদ্ধি MTT অ্যাস এর সাথে 1-3 যৌগগুলির সাথে চিকিত্সার পরে একটি মিথ্যা-ইতিবাচক ফলাফলের প্রতিনিধিত্ব করে।

আলোচনা

1983 সালে, মোসম্যান কোষের বিস্তার এবং সাইটোটক্সিসিটি পরিমাপের জন্য একটি রঙিনমিট্রিক এমটিটি মাইক্রোপ্লেট অ্যাস তৈরি করেছিলেন [8]। এই সহজ পরীক্ষা, এবং এর পরিবর্তনগুলি এখন সারা বিশ্বের কোষ জীববিজ্ঞান গবেষণাগারগুলিতে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়। স্তন্যপায়ী কোষে ভগ্নাংশ অধ্যয়ন ইঙ্গিত দেয় যে হ্রাসকৃত পাইরিডিন নিউক্লিওটাইড কোফ্যাক্টর, NADH, বেশিরভাগ MTT হ্রাসের জন্য দায়ী। এটি সম্পূর্ণ কোষ ব্যবহার করে গবেষণা দ্বারা সমর্থিত ছিল [9]। এমটিটি হ্রাস তাই বিপাকীয়ভাবে সক্রিয় কোষগুলির সাথে যুক্ত এবং এটি শুধুমাত্র মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বাস-প্রশ্বাসের সাথেই নয়, সাইটোপ্লাজম এবং অ-মাইটোকন্ড্রিয়াল ঝিল্লি সহ এন্ডোসোম/লাইসোসোম কম্পার্টমেন্ট এবং প্লাজমা মেমব্রেন [10] এর সাথেও যুক্ত। এমটিটি অণুর নিট পজিটিভ চার্জ হল প্লাজমা মেমব্রেন পটেনশিয়াল এর মাধ্যমে সেলুলার গ্রহণের জন্য প্রাথমিক ফ্যাক্টর।

উল্লেখযোগ্যভাবে, এমটিটি পরীক্ষা মাঝে মাঝে সঠিকভাবে নির্দিষ্ট কোষে একটি পরীক্ষিত যৌগের প্রকৃত প্রভাব প্রতিফলিত করতে পারে না। যাইহোক, রাসায়নিক কাঠামো বা গোষ্ঠীগুলি যা MTT পরীক্ষায় বিরোধপূর্ণ ফলাফলের কারণ হতে পারে তা চিহ্নিত করা হয়নি। সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে MTT অ্যাস (−)-এপিগালোকাটেচিন-3-গ্যালেটের অ্যান্টি-প্রলিফারেটিভ প্রভাবকে অবমূল্যায়ন করতে পারে, যেটি গ্রিন টিতে সবচেয়ে বেশি পরিমাণে পলিফেনল রয়েছে [১১]। টিউমার কেমোসেনসিটিভিটি সনাক্ত করতে এমটিটি অ্যাস ব্যবহার করে গবেষণায়, ক্যান্সার-বিরোধী কেমোথেরাপিউটিক এজেন্ট, যেমন এপিরুবিসিন, প্যাক্লিট্যাক্সেল, ডোসেট্যাক্সেল এবং ইমেটিনিব মেসিলেট (গ্লিভেক) কোষের কার্যক্ষমতা বৃদ্ধি করেছে [12,13]। তদুপরি, বেশ কয়েকটি গবেষণায় জানা গেছে যে নির্দিষ্ট উদ্ভিদের নির্যাস এবং রেডক্স-অ্যাকটিভ পলিফেনলগুলি এমটিটি অ্যাসেতে হস্তক্ষেপ করতে পারে কারণ তারা কোষের অনুপস্থিতিতে এমটিটি টেট্রাজোলিয়াম লবণকে সরাসরি হ্রাস করে [14]।

একটি মাইক্রোপ্লেট রিডারে স্পেকট্রোফোটোমেট্রিক বিশ্লেষণের আগে এমটিটি ফরমাজান স্ফটিকগুলিকে দ্রবণীয় করার প্রয়োজন এবং প্রতিক্রিয়ার অন্তর্নিহিত শেষ বিন্দুর প্রকৃতি এমটিটি অ্যাস ব্যবহারকে নির্দিষ্ট অ্যাপ্লিকেশনগুলিতে সীমাবদ্ধ করে। এটি টেট্রাজোলিয়াম অ্যানালগগুলির বিকাশের দিকে পরিচালিত করে যেখানে ফিনাইল মোয়েটিগুলি নেতিবাচক চার্জযুক্ত সালফোনেট গ্রুপগুলি দিয়ে সজ্জিত ছিল, যেমন 2,3-বিস-(2-মিথক্সি-4-নাইট্রো- 5- সালফোফেনাইল){{6}H-টেট্রাজোলিয়াম-5-কারবক্সামাইড (এক্সটিটি), একটি নেতিবাচক চার্জযুক্ত অভ্যন্তরীণ লবণ [15] এবং 3-(4,5-ডাইমেথাইলথিয়াজল-2-ইএল) -5-(3-কারবক্সিমেথোক্সিফেনাইল)-2-(4-সালফোফেনাইল)-2এইচ-টেট্রাজোলিয়াম (এমটিএস), একটি দুর্বল অম্লীয় অভ্যন্তরীণ লবণ MTT এর সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত [16] . এই পরিবর্তনগুলির ফলে সংস্কৃতির মাঝারি-দ্রবণীয় ফর্মাজান পণ্যগুলির উত্পাদন হয়েছে যা পরিমাণ নির্ধারণের আগে একটি দ্রবণীয় পদক্ষেপের প্রয়োজনীয়তা দূর করে। তদনুসারে, যেহেতু এই অণুগুলির উপর বর্ধিত ঋণাত্মক চার্জ কোষের ঝিল্লি [17] জুড়ে তাদের চলাফেরার ক্ষমতা হ্রাস করে, মধ্যবর্তী ইলেকট্রন গ্রহণকারী (IEA), যেমন 1-মিথক্সি-5-মিথাইল ফেনাজিনিয়াম মিথাইল সালফেট ({{25}) }}মিথক্সি পিএমএস) টেট্রাজল ডাই কমানোর জন্য বা হ্রাসের হার বাড়ানোর জন্য প্রয়োজন ছিল।

অতি সম্প্রতি, পানিতে দ্রবণীয় টেট্রাজোলিয়াম লবণের একটি নতুন প্রজন্ম তৈরি করা হয়েছে যার WST-1 হল প্রোটোটাইপ [১৮]। ডাব্লুএসটি-1, একটি নেতিবাচক চার্জযুক্ত ডিসলফনেটেড অভ্যন্তরীণ লবণ যাতে একটি আয়োডিনের অবশিষ্টাংশ থাকে, এটির বাধ্যতামূলক আইইএ 1-মেথক্সি পিএমএস-এর উপস্থিতিতে XTT এবং MTS-এর চেয়ে বেশি স্থিতিশীল। এর ফলে WST-1/1-মিথক্সি পিএমএস একটি সুবিধাজনক একক বিকারক কোষ প্রসারণ কিট হিসেবে বিপণন করা হয়েছে। WST সিরিজের আরও বেশ কিছু টেট্রাজোলিয়াম লবণ তৈরি করা হয়েছে, যার মধ্যে সবচেয়ে দরকারী সম্ভবত WST-8 [19]। WST-8-এ WST-1-এর সাথে অত্যন্ত অনুরূপ সেলুলার রিডাকশন বৈশিষ্ট্য রয়েছে বলে মনে হচ্ছে এবং CCK-8 অ্যাস হিসাবে স্বাধীনভাবে বাজারজাত করা হচ্ছে৷ ডাব্লুএসটি-8 কোষের অভেদ্য এবং তাই মেথক্সি পিএমএস দ্বারা মধ্যস্থতাকারী প্লাজমা মেমব্রেন জুড়ে আন্তঃকোষীয় NADH থেকে WST-8 পর্যন্ত ইলেকট্রন পরিবহনের মাধ্যমে বহির্কোষীয়ভাবে হ্রাস পায়। যদিও MTT এবং WST-8/1-মেথক্সি পিএমএস হ্রাস উভয়ই আন্তঃকোষীয় NADH দ্বারা চালিত হয়, NADH এর উত্স এই দুটি পদ্ধতির মধ্যে আলাদা বলে মনে হয়। ডাব্লুএসটি-8/1-মেথক্সি পিএমএস হ্রাস ম্যালেট/অ্যাসপার্টেট শাটলের উপর বেশি নির্ভরশীল যা মাইটোকন্ড্রিয়াল ট্রাইকারবক্সিলিক অ্যাসিড চক্র-এনএডিএইচকে এক্সট্রামিটোকন্ড্রিয়াল স্পেস [20] এর সাথে সংযুক্ত করে।

প্রাথমিক পরীক্ষায়, আমরা নিশ্চিত করেছি যে যৌগ 1, 2, 3, এবং 4 সরাসরি MTT টেট্রাজোলিয়াম লবণ কমাতে পারে না (দেখানো হয়নি)। বর্তমান গবেষণায়, প্রস্তুতকারকের প্রোটোকলগুলিতে নির্দেশিত হিসাবে এমটিটি বা সিসিকে-8 দ্রবণ যোগ করার আগে ফসফেট-বাফার স্যালাইন (পিবিএস) দিয়ে মাইক্রোপ্লেটগুলিকে সাবধানে ধোয়ার মাধ্যমে বিকারকের সাথে যৌগগুলির সরাসরি প্রভাব দূর করা হয়েছিল। তবুও, দুটি পদ্ধতি ব্যবহার করে প্রাপ্ত ফলাফলগুলি এখনও পরস্পর বিরোধী ছিল (চিত্র 2)। প্রত্যাশিত হিসাবে, যৌগ 1, 2, এবং 3 সহ কোষের ইনকিউবেশন নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর (চিত্র 3) তুলনায় টেট্রাজোলিয়াম লবণের হ্রাসকে বেগুনি ফর্মাজানে বৃদ্ধি করেছে, যা একটি নির্দিষ্ট যৌগের উপস্থিতিতে টেট্রাজোলিয়াম লবণের নিছক হ্রাসের পরামর্শ দেয়। এমটিটি পরীক্ষায় হস্তক্ষেপ করার যৌগের ক্ষমতা বিচার করার জন্য যথেষ্ট নয়।

যৌগ 1, 2, 3, এবং 4 EA.hy926 কোষে অ্যাপোপটোসিস প্ররোচিত করতে পারে কিনা তা নির্ধারণ করতে, সেলুলার আকারগত পরিবর্তন এবং ফসফ্যাটিডিলসারিন বাহ্যিককরণ মূল্যায়ন করা হয়েছিল। ধারাবাহিকভাবে CCK-8 অ্যাস এর সাথে পরিলক্ষিত সেলুলার কার্যক্ষমতা হ্রাসের সাথে, অ্যানেক্সিন V-FITC/PI ব্যবহার করে Hoechst স্টেনিং এবং ফ্লো সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণের ফলাফলগুলি প্রস্তাব করেছে যে যৌগ 1, 2, এবং 3 চিকিত্সার পরে পরিলক্ষিত বৃদ্ধি বাধা ছিল EA.hy926 সেল অ্যাপোপটোসিসের কারণে, অন্তত আংশিকভাবে। আমাদের ফলাফলগুলি এই ধারণাটিকেও সমর্থন করে যে 1 এবং 2 উভয় যৌগে উপস্থিত ক্যাফেওয়েল গ্রুপটি এমটিটি অ্যাস এর সাথে প্রাপ্ত পরস্পরবিরোধী ফলাফলের জন্য দায়ী।

আমাদের অনুসন্ধানের অনুরূপ, রটলরিন, একটি শক্তিশালী বৃহৎ পরিবাহী পটাসিয়াম চ্যানেল ওপেনার, ভিট্রোতে এমটিটি-এর প্রতি প্রতিক্রিয়া প্রদর্শন করেনি। যাইহোক, এটি কোষের অভ্যন্তরে ফরমাজান স্ফটিকের গঠনকে দৃঢ়ভাবে উন্নত করেছে, যার ফলে NF-κB-এর রটলারিন বাধা এবং কোষের বিস্তারের সাথে স্পষ্ট দ্বন্দ্ব ছিল [3 H]-থাইমিডিন ডিএনএ [21]-এর বিশ্লেষণের দ্বারা পর্যবেক্ষণ করা হয়েছে। যে পদ্ধতির দ্বারা রটলরিন MTT হ্রাসকে বাড়িয়েছিল তার মাইটোকন্ড্রিয়াল আনকপলিং প্রভাব [22] এর জন্য দায়ী করা হয়েছিল। Rottlerin একটি cinnamoyl অ্যাসিড বিকল্প গ্রুপ আছে. সিনামোয়েল অ্যাসিডের সাথে তুলনা করে, যৌগ 3-এ দুটি অতিরিক্ত হাইড্রক্সিল অবশিষ্টাংশ রয়েছে, যা C-3 এবং C-4 এ অবস্থিত। অতএব, আমরা অনুমান করি যে যে পদ্ধতির দ্বারা যৌগ 1 এবং 2 এমটিটি পরীক্ষায় বিরোধপূর্ণ ফলাফল সৃষ্টি করে তা তাদের মাইটোকন্ড্রিয়াল আনকপলিং প্রভাবগুলির সাথেও যুক্ত হতে পারে। এই অনুমান পরীক্ষা করার জন্য, যৌগ 1, 2 এবং একটি রাসায়নিক আনকপ্লার, যেমন ট্রাইফ্লুরোকার্বনিলসায়ানাইড ফেনাইলহাইড্রাজোন (FCCP) এর মধ্যে তুলনামূলক গবেষণা প্রয়োজন।

পরীক্ষামূলক অংশ

বিকারক এবং রাসায়নিক

যৌগ 3 (ক্যাফিক অ্যাসিড-পাউডার, বিশুদ্ধতা=98.6 শতাংশ) চেংডু পুশ বায়ো-টেকনোলজি কোং লিমিটেড (চেংদু, চীন) থেকে কেনা হয়েছিল। যৌগ 4 (3,4-ডাইহাইড্রোক্সিলফেনিলেথানল–তেল, বিশুদ্ধতা=98.5 শতাংশ) চেংডু মাস্ট বায়ো-টেকনোলজি কোং লিমিটেড (চেংদু, চীন) থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। এমটিটি এবং ডাইমিথাইল সালফক্সাইড (ডিএমএসও) সিগমা-অলড্রিচ (সেন্ট লুইস, এমও, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। CCK{11}} পরীক্ষাটি Dojin Laboratories (Kumamoto, Japan) থেকে কেনা হয়েছে। Hoechst 33342 এবং annexin V-FITC/PI অ্যাপোপটোসিস সনাক্তকরণ কিটগুলি বেয়োটাইম ইনস্টিটিউট অফ বায়োটেকনোলজি (হাইমেন, চীন) থেকে কেনা হয়েছিল

উদ্ভিদ উপাদান

সি. টিউবুলোসা ডালপালা ইউটিয়ান প্রিফেকচার, জিনজিয়াং উইগুর স্বায়ত্তশাসিত অঞ্চল, চীন থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল। ভাউচারের নমুনাগুলি হাই অল্টিটিউড মেডিসিনের কী ল্যাবরেটরি, থার্ড মিলিটারি মেডিকেল ইউনিভার্সিটি (চংকিং, চীন) এ জমা করা হয়েছিল এবং চেংডু ইউনিভার্সিটি অফ ট্র্যাডিশনাল চাইনিজ মেডিসিন (চেংডু, চীন) থেকে ই ঝাং দ্বারা প্রমাণিত হয়েছিল।

উদ্ভিদ উপাদান নিষ্কাশন এবং বিচ্ছিন্নতা

বাতাসে শুকনো সি. টিউবুলোসা (0.6 কেজি) ডালপালা গুঁড়ো করে 50 শতাংশ ইথানল দিয়ে 2 ঘন্টার জন্য 70 ডিগ্রিতে বের করা হয়েছিল। কম চাপে দ্রাবক অপসারণের পরে, ইথানোলিক নির্যাস (212.5 গ্রাম) দ্রবীভূত করা হয়েছিল এবং জলে (2 L) ঝুলিয়ে দেওয়া হয়েছিল এবং n-butanol (2 L × 3) দিয়ে বের করা হয়েছিল। এন-বুটানোলিক নির্যাস (110 গ্রাম) একটি পলিমাইড কলামে ক্রোমাটোগ্রাফ করা হয়েছিল এবং ইথানল/জল (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) দিয়ে নির্গত হয়েছিল পাঁচটি ভগ্নাংশ (A-E) . ভগ্নাংশ B (65 গ্রাম) একটি ODS কলামে ভগ্নাংশ করা হয়েছিল; ইথানল সহ ইলুশন: জল (1:9) পৃথক যৌগ 1 (3 গ্রাম)। ভগ্নাংশ D (10.5 গ্রাম) একটি ODS কলামে ভগ্নাংশ করা হয়েছিল; ইথানল/জল (1:4) পৃথক যৌগ 2 (1 গ্রাম) সহ ইলুশন।

অভ্যন্তরীণ মান হিসাবে টেট্রামেথিসিলেন (টিএমএস) সহ CD3OD-তে ব্রুকার অ্যাভান্স 600 স্পেকট্রোমিটারে NMR স্পেকট্রা রেকর্ড করা হয়েছিল। ভর স্পেকট্রা বায়োটফ-কিউ ভর স্পেকট্রোমিটারে চালানো হয়েছিল।

সেল সংস্কৃতি

EA.hy926 সেল লাইনগুলি আমেরিকান টাইপ কালচার কালেকশন (মানাসাস, ভিএ, ইউএসএ) থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। কোষগুলিকে RPMI 1640 মিডিয়ামে সংষ্কৃত করা হয়েছিল, 10 শতাংশ (v/v) ভ্রূণের বোভাইন সিরাম এবং 1 শতাংশ (v/v) পেনিসিলিন-স্ট্রেপ্টোমাইসিন একটি আর্দ্র পরিবেশে 37 ডিগ্রিতে 5 শতাংশ CO2 দিয়ে পরিপূরক।

সেল কার্যকরতা

MTT এবং CCK{{0}} অ্যাসেস ব্যবহার করে কোষের কার্যকারিতা মূল্যায়ন করা হয়েছিল। যৌগ 1 এবং 2, এবং তাদের এগ্লাইকোন, ক্যাফেইক অ্যাসিড (3) এবং 3,4-ডাইহাইড্রোক্সিলফেনিলেথানল (4) DMSO-তে দ্রবীভূত হয়েছিল চূড়ান্ত DMSO ঘনত্ব <0.1 শতাংশ="" (v/v)="" সংস্কৃতি="">

EA.hy926 কোষগুলিকে 96-ওয়েল প্লেটে 4 × 103 কোষ/কূপে বীজ দেওয়া হয়েছিল৷ 24 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেশনের পরে, কোষগুলিকে 24 ঘন্টার জন্য 6.25-50 μM যৌগ 1, 2, 3, বা 4 দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। সংস্কৃতির মাধ্যমটি সরানো হয়েছিল এবং কোষগুলিকে ফসফেট-বাফারযুক্ত স্যালাইন (পিবিএস) দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। স্টক MTT দ্রবণ (5 mg·mL−1 ) এর অ্যালিকোটস (10 μL) প্রতিটি কূপে 100 μL মাঝারি ধারণ করে যুক্ত করা হয়েছিল এবং 4 ঘন্টার জন্য কোষের সাথে ইনকিউব করা হয়েছিল। ইনকিউবেশনের পরে, মাধ্যমটি সরানো হয়েছিল এবং ফর্মাজান স্ফটিকগুলিকে দ্রবীভূত করতে প্রতিটি কূপে DMSO-এর 150 μL অ্যালিকোট যুক্ত করা হয়েছিল। একটি মাইক্রোপ্লেট রিডার (বায়ো-টেক সিনার্জি এইচটি, উইনোস্কি, ভিটি, ইউএসএ) ব্যবহার করে শোষণ 490 এনএম পরিমাপ করা হয়েছিল। কোষের কার্যক্ষমতা MTT হ্রাসের শতাংশ হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছিল, নিয়ন্ত্রণ কোষগুলির শোষণের 100 শতাংশ মান নির্ধারণ করে। সমস্ত পরীক্ষাগুলি তিনবার সম্পাদিত হয়েছিল এবং গড় ± স্ট্যান্ডার্ড বিচ্যুতি (এসডি) হিসাবে উপস্থাপিত হয়েছিল।

CCK-8 অ্যাস সামান্য পরিবর্তনের সাথে সাহিত্য অনুসরণ করে সঞ্চালিত হয়েছিল [23]। বিশেষত, কোষগুলিকে 24 ঘন্টার জন্য 6.25-50 μM যৌগ 1, 2, 3, বা 4 দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং 10 μL CCK-8 দ্রবণ এবং 100 μL কালচার মিডিয়া যোগ করার আগে PBS দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। মাইক্রোপ্লেটটি 2 ঘন্টার জন্য 37 ডিগ্রিতে ইনকিউব করার পরে, একটি মাইক্রোপ্লেট রিডার ব্যবহার করে শোষণ 450 এনএম পরিমাপ করা হয়েছিল। কোষের কার্যক্ষমতা নিয়ন্ত্রণ কোষের তুলনায় কার্যকর কোষের শতাংশ হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছিল (100 শতাংশ)। সমস্ত পরীক্ষা তিনবার করা হয়েছিল এবং গড় ± SD হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছিল।

Hoechst 33342 স্টেনিং দ্বারা অ্যাপোপটোসিস মূল্যায়ন

Apoptotic morphological পরিবর্তন Hoechst 33342 staining দ্বারা পরিলক্ষিত হয়েছিল। সংক্ষেপে, EA.hy926 কোষগুলিকে 48-ওয়েল প্লেটে (2 × 104 কোষ/কূপ) বীজ দেওয়া হয়েছিল এবং 50 μM যৌগ 1, 2, 3, বা 4 দিয়ে 48 ঘন্টার জন্য 37 ডিগ্রিতে চিকিত্সা করা হয়েছিল, পিবিএস দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল, এবং কক্ষ তাপমাত্রায় 15 মিনিটের জন্য 4 শতাংশ (v/v) প্যারাফর্মালডিহাইড দিয়ে স্থির করা হয়। PBS দিয়ে দুবার ধোয়ার পর, ঘরের তাপমাত্রায় 5 মিনিটের জন্য Hoechst 33342 (10 ug·mL−1 ) দিয়ে কোষগুলিকে দাগ দেওয়া হয় এবং PBS দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়। ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ (অলিম্পাস, টোকিও, জাপান) ব্যবহার করে হোচেস্ট-দাগযুক্ত নিউক্লিয়াসকে কল্পনা করা হয়েছিল।

ফ্লো সাইটোমেট্রি দ্বারা অ্যাপোপটোসিস বিশ্লেষণ

অ্যানেক্সিন ভি-এফআইটিসি/পিআই ডাবল-স্টেইনিং এবং ফ্লো সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণ দ্বারা অ্যাপোপটোটিক কোষগুলি সনাক্ত করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, 50 μM যৌগ 1, 2, 3, বা 4 দিয়ে 48 ঘন্টার জন্য চিকিত্সার পরে, কোষগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং 1 × 105 কোষ·mL−1 এ পিবিএস-এ পুনরায় স্থগিত করা হয়েছিল। 25 ডিগ্রীতে 5 মিনিটের জন্য 500 × g সেন্ট্রিফিউগেশনের পরে, অ্যানেক্সিন V-FITC বাইন্ডিং বাফারের 195 μL এবং অ্যানেক্সিন V-FITC এর 5 μL যোগ করা হয়েছিল। মৃদু ঘূর্ণি-মিশ্রণের পরে, মিশ্রণটি অন্ধকারে ঘরের তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য সিদ্ধ করা হয়েছিল। 25 ডিগ্রীতে 5 মিনিটের জন্য 500 × g সেন্ট্রিফিউগেশনের পরে, FITC-সংযোজিত অ্যানেক্সিন V বাইন্ডিং বাফারের 190 μL এবং 10 μL PI যোগ করা হয়েছিল। মৃদু ঘূর্ণি-মিশ্রণের পরে, 30 মিনিটের মধ্যে একটি FACSCalibur ফ্লো সাইটোমিটার (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) ব্যবহার করে নমুনাগুলি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

পরিসংখ্যান সংক্রান্ত বিশ্লেষণ

সমস্ত পরীক্ষামূলক ডেটা গড় ± SD হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছিল। পরীক্ষামূলক নমুনা এবং সংশ্লিষ্ট নিয়ন্ত্রণের মধ্যে পার্থক্যের তাত্পর্য SPSS সফ্টওয়্যার (সংস্করণ 11.5) ব্যবহার করে ভিন্নতা (ANOVA) এর একমুখী বিশ্লেষণ দ্বারা মূল্যায়ন করা হয়েছিল। পরিসংখ্যানগত তাত্পর্য p < 0.05="" এ="" সেট="" করা="">

উপসংহার

আমাদের ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে এমটিটি অ্যাসে পরিলক্ষিত কার্যকর কোষের সংখ্যার অত্যধিক মূল্যায়ন নির্দিষ্ট যৌগের সাইটোটক্সিসিটি মাস্ক করতে পারে। তাই, ওষুধের স্ক্রীনিং প্রক্রিয়া চলাকালীন, আমরা বিভ্রান্তিকর ফলাফল তৈরি এড়াতে কোষের কার্যক্ষমতায় নির্দিষ্ট যৌগের প্রভাব (যেমন CCK-8 এবং 3 H-TdR অ্যাসেস) নির্ধারণ করতে বিভিন্ন পদ্ধতি ব্যবহার করার পরামর্শ দিই।