Cistanche Glyside Rg1 SAMP8 ইঁদুরে NOX4/NLRP3 ইনফ্ল্যামাসোমকে বাধা দিয়ে বার্ধক্যজনিত লিভার ফাইব্রোসিসকে কমিয়ে দেয়
May 29, 2023
বিমূর্ত.বার্ধক্যপ্রায়ই দ্বারা অনুষঙ্গী হয়লিভারের আঘাতএবংফাইব্রোসিস, অবশেষে একটি পতনের নেতৃত্বেযকৃতের কাজ. যাইহোক, এর প্রক্রিয়াবার্ধক্যজনিত লিভারের আঘাতএবংফাইব্রোসিসআমাদের সর্বোত্তম জ্ঞান অনুসারে এখনও সম্পূর্ণরূপে বোঝা যায় নি, এবং বর্তমানে লিভারের বার্ধক্যের জন্য কোনও কার্যকর চিকিত্সার বিকল্প নেই। Cistanche Glycoside Rg1 (Rg1) এর শক্তিশালী অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট এবং প্রদাহ বিরোধী কার্যকলাপের কারণে শক্তিশালী বার্ধক্যজনিত প্রভাব প্রয়োগ করা হয়েছে বলে জানা গেছে। বর্তমান অধ্যয়নের লক্ষ্য ছিল প্রতিরক্ষামূলক প্রভাব এবং Rg1 এর কর্মের অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়া তদন্ত করাবার্ধক্যজনিত লিভারের আঘাতএবংফাইব্রোসিসভিতরেসেন্সেন্স-ত্বরিতমাউস প্রোন 8 (SAMP8) ইঁদুর 9 সপ্তাহ ধরে চিকিত্সা করা হয়েছে।
লিভারের জন্য সিস্টানচে অ্যান্টি-এজিং চিকিত্সা সম্পর্কে আরও তথ্য পেতে এখানে ক্লিক করুন
হিস্টোপ্যাথোলজিকাল ফলাফলগুলি দেখায় যে হেপাটোসাইটের বিন্যাস বিশৃঙ্খল ছিল, বেশিরভাগ কোষে ভ্যাকুয়াল-সদৃশ অবক্ষয় ঘটেছে এবং কোলাজেন IV এবং TGF- 1 এক্সপ্রেশন স্তর, যা ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রির মাধ্যমে সনাক্ত করা হয়েছিল, তাও SAMP8 গ্রুপে উল্লেখযোগ্যভাবে আপ-নিয়ন্ত্রিত হয়েছিল। Rg1 চিকিত্সা উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নতবার্ধক্যজনিত লিভারের আঘাত এবং ফাইব্রোসিস, এবং উল্লেখযোগ্যভাবে কোলাজেন IV এবং TGF-এর অভিব্যক্তি স্তরগুলিকে নিয়ন্ত্রিত করেছে 1. উপরন্তু, ডাইহাইড্রো ইথিলিন স্টেনিং এবং ওয়েস্টার্ন ব্লটিং ফলাফল দেখিয়েছে যে Rg1 চিকিত্সা উল্লেখযোগ্যভাবে প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতি (ROS) এবং IL‑1 এর মাত্রা হ্রাস করেছে , এবং NADPH অক্সিডেস 4 (NOX4), p47phox, p22phox, ফসফরিলেটেড-NF-এর এক্সপ্রেশন স্তরকে নিয়ন্ত্রিত করেছেκবি, ক্যাসপেস-১, অ্যাপোপটোসিস-সম্পর্কিত স্পেক-সদৃশ প্রোটিন যার মধ্যে একটি সি-টার্মিনাল ক্যাসপেস নিয়োগ ডোমেন এবং এনএলআর ফ্যামিলি পাইরিন ডোমেন যার মধ্যে 3 (NLRP3) ইনফ্ল্যামাসোম রয়েছে, যা বয়স্ক SAMP8 মাইয়ের লিভার টিস্যুতে উল্লেখযোগ্যভাবে আপগ্রুলেট করা হয়েছিল। উপসংহারে, বর্তমান গবেষণার ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে Rg1 হ্রাস করতে পারেবার্ধক্যজনিত লিভারের আঘাত এবং ফাইব্রোসিসNOX4-মধ্যস্থিত ROS অক্সিডেটিভ স্ট্রেস হ্রাস করে এবং NLRP3 প্রদাহজনক সক্রিয়করণকে বাধা দিয়ে।
ভূমিকা
লিভার ফাইব্রোসিস হল একটি গতিশীল প্রক্রিয়া যা এক্সট্রা সেলুলার ম্যাট্রিক্সের ক্রমাগত জমা এবং রিসোর্পশনের সাথে যুক্ত, প্রধানত ফাইব্রিলার কোলাজেন (3), যা প্রায়শই স্থাপত্য বিকৃতি এবং কর্মহীনতার প্রথম ধাপ যা লিভারের স্বাভাবিক কাজকে বাধা দেয় (4)। যদি চিকিত্সা না করা হয়, লিভার ফাইব্রোসিস উন্নত লিভার সিরোসিস এবং হেপাটোমা হতে পারে (4)। জমা হওয়া প্রমাণগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে লিভার ফাইব্রোসিস এবং হেপাটাইটিসের সংবেদনশীলতা বয়সের সাথে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পায় (5)। সুতরাং, বার্ধক্যজনিত লিভার ফাইব্রোসিস প্রতিরোধের জন্য অভিনব কৌশল প্রদানের জন্য লিভারের বার্ধক্য এবং সংশ্লিষ্ট অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়াগুলি অধ্যয়ন করা অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ।
একটি সি-টার্মিনাল ক্যাসপেস রিক্রুটমেন্ট ডোমেন (ASC) ধারণকারী ক্যাসপেস-1 এবং অ্যাপোপটোসিস-সম্পর্কিত স্পেক-জাতীয় প্রোটিনের স্বীকৃতি রিসেপ্টর। পূর্ববর্তী গবেষণার ফলাফল অনুসারে, NLRP3 ইনফ্ল্যামাসোম, লিভার সহ অসংখ্য টিস্যুতে সর্বব্যাপী প্রকাশ করা এক ধরনের প্রদাহ, লিভার ফাইব্রোসিসের বিবর্তন এবং লিভারের আঘাত এবং বয়স-সম্পর্কিত লিভারের রোগের অগ্রগতির সাথে জড়িত বলে আবিষ্কৃত হয়েছিল। 20-22)। এটিপি এবং কোলেস্টেরল স্ফটিক, সেইসাথে ব্যাকটেরিয়া, ভাইরাল এবং ছত্রাকজনিত রোগজীবাণু (23,24) এর মতো বিভিন্ন বিরক্তিকর দ্বারা সক্রিয় হলে, NLRP3 ইনফ্ল্যামাসোম প্রোইনফ্ল্যামেটরি সাইটোকাইনগুলির একটি সিরিজের পরিপক্কতা প্রচার করে প্রদাহের প্রতিক্রিয়া জানায়, যেমন IL‑1 এবং IL-18 (25)। উপরন্তু, এটি রিপোর্ট করা হয়েছে যে অত্যধিক ROS সঞ্চয় বার্ধক্য প্রক্রিয়ার সময় লিভারে NLRP3 প্রদাহকে সক্রিয় করে, অবশেষে বার্ধক্য-সম্পর্কিত লিভার রোগের দিকে পরিচালিত করে (26)।
উপকরণ এবং পদ্ধতিসমূহ
Animals and treatment. In total, 9 male senescence‑accelerated resistant mouse 1 (SAMR1) and 45 male SAMP8 mice (both age, 6 months; weight, 30‑40 g) were purchased from the Department of Experimental Animal Science, Peking University Medical Science Center (Beijing, China). The mice were maintained in an environmentally controlled room (temperature, 22‑25˚C; relative humidity, 50‑70%) under a 12‑h light/dark cycle with unlimited access to food and water. The SAMP8 mice were randomly divided into five groups (n=9 in each group): i) SAMP8 model group; ii) SAMP8 + apocynin (50 mg/kg) group; iii) SAMP8 + tempol (50 mg/kg) group; iv) SAMP8 + Rg1 (5 mg/kg) group; v) SAMP8 + Rg1 (10mg/kg) group; and vi) SAMR1 mice group, which were used as the control group. The treatments were administered intragastrically (0.1 ml/10 g body weight), and the mice treated with either apocynin (MilliporeSigma), tempol (MilliporeSigma) or Rg1 (content >98 শতাংশ; Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.) দিনে একবার 9 সপ্তাহের জন্য। SAMP8 এবং SAMR1 গ্রুপগুলিকে 9 সপ্তাহের জন্য পাতিত জল দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। 9 সপ্তাহের চিকিত্সার পরে, প্রতিটি গ্রুপের ছয়টি ইঁদুর সার্ভিকাল স্থানচ্যুতির মাধ্যমে বলি দেওয়া হয়েছিল। ওয়েস্টার্ন ব্লটিং এক্সপেরিমেন্টে পরবর্তী ব্যবহারের জন্য লিভারগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং ‑80˚C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল বা রাখা হয়েছিল
tome (Leica CM3050; Leica Microsystems GmbH) ‑20˚C তাপমাত্রায়। বিভাগগুলিকে পিবিএস দিয়ে ধুয়ে 5 মিলিগ্রাম/লি হোয়েচস্ট 33258 দ্রবণ (সিগমা-অলড্রিচ; মার্ক কেজিএ) দিয়ে 5 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউব করা হয়েছিল। তারপরে, বিভাগগুলিকে একটি অ্যান্টি-ফ্লুরোসেন্স শেনিং এজেন্ট (বেয়োটাইম ইনস্টিটিউট অফ বায়োটেকনোলজি) দিয়ে সিল করা হয়েছিল এবং একটি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ (অলিম্পাস IX72; অলিম্পাস কর্পোরেশন; ম্যাগনিফিকেশন, x400) ব্যবহার করে ভিজ্যুয়ালাইজ করা হয়েছিল। ইমেজ প্রো প্লাস 6.0 সফ্টওয়্যার (মিডিয়া সাইবারনেটিক্স, ইনক.) ROS উত্পাদন নির্দেশ করতে প্রতিটি বিভাগে এলোমেলোভাবে নির্বাচিত তিনটি ক্ষেত্র থেকে রেড ফ্লুরোসেন্সের গড় ঘনত্ব সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।
লিভার টিস্যুর প্যাথলজিকাল পরীক্ষা।
লিভারের আকারগত পরিবর্তনগুলি H&E, পর্যায়ক্রমিক অ্যাসিড-শিফ (PAS) এবং ম্যাসনের ট্রাইক্রোম স্টেনিং কৌশল ব্যবহার করে পরীক্ষা করা হয়েছিল। টিস্যুতে রোগগত পরিবর্তনগুলি পর্যবেক্ষণ করার জন্য H&E স্টেনিং হল সবচেয়ে সাধারণ পদ্ধতি (38)। সংক্ষেপে, লিভারের নমুনাগুলি 24-48 ঘন্টার জন্য 4 শতাংশ প্যারাফর্মালডিহাইডে স্থির করা হয়েছিল, ডিহাইড্রেটেড এবং প্যারাফিন-এম্বেডেড, তারপর 5‑µm পুরু অংশে কাটা হয়েছিল। যকৃতের অংশগুলি (n=4) জাইলিনের মধ্যে ডিপ্যারাফিনাইজ করা হয়েছিল এবং গ্রেডেড অ্যালকোহল সিরিজে (অনহাইড্রাস ইথানল, 85 শতাংশ ইথানল, 75 শতাংশ ইথানল), তারপর 3 মিনিটের জন্য হেমাটোক্সিলিন এবং 30 সেকেন্ডের জন্য ইওসিন দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল। এই সমস্ত পদক্ষেপ ঘরের তাপমাত্রায় বাহিত হয়েছিল। বিভাগগুলি নিরপেক্ষ রজন দিয়ে সিল করা হয়েছিল এবং একটি হালকা মাইক্রোস্কোপ (অলিম্পাস IX72; অলিম্পাস কর্পোরেশন; ম্যাগনিফিকেশন, x200) ব্যবহার করে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।
ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি স্টেনিং।
H&E স্টেনিংয়ের জন্য বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে প্যারাফিন-এম্বেড করা বিভাগগুলি (n=4) ডিপ্যারাফিনাইজড এবং রিহাইড্রেট করা হয়েছিল। তারপরে, অ্যান্টিজেন পুনরুদ্ধারের জন্য একটি মাইক্রোওয়েভ ওভেনে 7 মিনিটের জন্য ফুটন্ত সোডিয়াম সাইট্রেট বাফারে নিমজ্জিত হওয়ার আগে অন্তঃসত্ত্বা পারক্সিডেস ক্রিয়াকলাপকে ব্লক করার জন্য 37°C তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য 3 শতাংশ H2O2 দিয়ে অংশগুলিকে ইনকিউব করা হয়েছিল। বিভাগগুলি পরবর্তীতে 10 শতাংশ ছাগলের সিরাম (বিড়াল নং C0265; বেয়োটাইম ইনস্টিটিউট অফ বায়োটেকনোলজি) দিয়ে 37˚C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য অ-নির্দিষ্ট বাঁধাই ব্লক করা হয়েছিল। তারপরে বিভাগগুলিকে রাতারাতি 4˚C তাপমাত্রায় নিম্নলিখিত প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলি দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল: খরগোশ পলিক্লোনাল অ্যান্টি-কোলাজেন IV (1:100; বায়োওয়ার্ল্ড বায়োটেকনোলজি, Inc.; বিড়াল নং. BS1072), খরগোশ পলিক্লোনাল অ্যান্টি-NLRP3 (1:100; Bioworld Biotechnology, Inc.; cat. no. BS90949) এবং খরগোশ পলিক্লোনাল অ্যান্টি-TGF-1 (1:100; Abcam; cat. no. ab92486)৷
পশ্চিমা শোষক.
RIPA লাইসিস বাফার (cat. no. P0013B; Beyotime Institute of Biotechnology) এবং একটি স্বয়ংক্রিয় নমুনা দ্রুত গ্রাইন্ডিং মেশিন (Jinxing Industrial Development Co.,Ltd .) 4˚C তাপমাত্রায় 60 সেকেন্ডের জন্য 65 Hz এ। একটি BCA প্রোটিন অ্যাস কিট ব্যবহার করে মোট প্রোটিনের পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল এবং প্রোটিনগুলি (20 µg) 8-15 শতাংশ SDS/PAGE এর মাধ্যমে আলাদা করা হয়েছিল। আলাদা করা প্রোটিনগুলি পরবর্তীতে PVDF মেমব্রেনে (মিলিপোরসিগমা) স্থানান্তরিত হয় এবং ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য TBS-0.05 শতাংশ Tween-20 (TBST) বাফারে 5 শতাংশ স্কিমড মিল্ক দিয়ে ব্লক করা হয়। তারপরে ঝিল্লিগুলিকে 4˚C তাপমাত্রায় রাতারাতি নিম্নলিখিত প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলির সাথে ইনকিউব করা হয়েছিল: Anti‑NLRP3 (1:1,000; Bioworld Biotechnology, Inc.; cat. no. BS90949), anti‑ASC (1:1) ,000; BIOSS; বিড়াল নং. bs‑67412‑R), অ্যান্টি-ক্যাস্পেস‑1(1:1,000; Abcam; cat. no. ab1872), অ্যান্টি-IL‑1 (1:500; Abcam;cat. no. ab9722), anti-NOX4 (1:1,000; Bioworld Biotechnology, Inc.; cat. no. BS60435), anti-p47phox (1:1,{ {40}}; বায়োওয়ার্ল্ড বায়োটেকনোলজি, ইনক.; বিড়াল নং. BS4852), অ্যান্টি-পি22ফক্স (1:1,000;বায়োওয়ার্ল্ড বায়োটেকনোলজি, Inc.; বিড়াল নং. BS60290), অ্যান্টি-NF‑κB p65 (1:1,000; Wuhan Service Technology Co., Ltd.;
প্রাথমিক অ্যান্টিবডি ইনকিউবেশনের পরে, ঝিল্লিগুলি টিবিএসটি দিয়ে তিনবার ধুয়ে (প্রতিবার 10 মিনিট) এবং এইচআরপি-সংযোজিত ছাগল-বিরোধী-খরগোশ আইজিজি (1:10,000; অ্যাফিনিটি বায়োসায়েন্সেস; বিড়াল নং এস) দিয়ে ইনকিউট করা হয়েছিল। 0001) এবং ছাগল অ্যান্টি-মাউস IgG (1:10,000 অ্যাফিনিটি বায়োসায়েন্স; বিড়াল নং S0002) ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি। প্রোটিন ব্যান্ডগুলি একটি ECL কিট (Bio-Rad Laboratories, Inc.) এবং একটি বায়োশাইন কেমি ইমেজিং সিস্টেম (Q4600 মিনি; সাংহাই বায়োশাইন প্রযুক্তি) ব্যবহার করে কল্পনা করা হয়েছিল। ImageJ 1.53a সফ্টওয়্যার (ন্যাশনাল ইনস্টিটিউট অফ হেলথ) ব্যবহার করে প্রতিটি ব্যান্ডের অপটিক্যাল ঘনত্ব আধা-পরিমাণ করা হয়েছিল এবং GAPDH এক্সপ্রেশনে স্বাভাবিক করা হয়েছিল।
পরিসংখ্যান সংক্রান্ত বিশ্লেষণ.
সমস্ত ডেটা 3টি স্বাধীন পরীক্ষা-নিরীক্ষার চেয়ে বড় বা সমান গড় ± SD হিসাবে উপস্থাপিত হয়। গ্রাফপ্যাড প্রিজম 8৷{2}} সফ্টওয়্যার (গ্রাফপ্যাড সফ্টওয়্যার, ইনক.) পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল৷ গোষ্ঠীর মধ্যে পার্থক্য তুলনা করার জন্য Tukey-এর পোস্ট-হক পরীক্ষা দ্বারা অনুসরণ করা ওয়ান-ওয়ে ANOVA। পৃ< 0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.
ফলাফল
Rg1 বার্ধক্যজনিত লিভার ফাইব্রোসিস উপশম করে কিনা তা অন্বেষণ করুন, ম্যাসনের স্টেনিং ব্যবহার করে লিভারের টিস্যুতে কোলাজেন জমা পরিমাপ করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি দেখায় যে SAMR1 গ্রুপের (চিত্র 2A এবং B) তুলনায় SAMP8 গ্রুপের লিভার টিস্যুতে নীল ইতিবাচক অঞ্চলগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে। যাইহোক, SAMP8 মডেল গ্রুপের সাথে তুলনা করে, টেম্পোল, অ্যাপোসিনিন এবং Rg1 (5 এবং 10 mg/kg) চিকিত্সা গ্রুপে (চিত্র 2A এবং B) কোলাজেন জমার মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে। এছাড়াও, কোলাজেন IV এবং TGF-1 এর অভিব্যক্তি স্তরগুলি ইমিউনোহিস্টোকেমিক্যাল স্টেনিং ব্যবহার করে লিভারের টিস্যুতে পরিমাপ করা হয়েছিল।
কোলাজেন IV দাগের ফলাফল প্রকাশ করে যে কোলাজেন IV SAMR1 গ্রুপে (চিত্র 3A এবং C) যকৃতের টিস্যুতে নিম্ন স্তরে প্রকাশ করা হয়েছিল। যাইহোক, SAMR1 গ্রুপের সাথে তুলনা করে,
Rg1 চিকিত্সা SAMP8 ইঁদুরের লিভারে ROS উত্পাদন এবং NOX4 এক্সপ্রেশন হ্রাস করে। হেপাটিক ফাইব্রোসিস (41) এর বিকাশে ROS একটি গুরুত্বপূর্ণ ফ্যাক্টর। বর্তমান গবেষণায়, একটি ROS প্রোব, DHE, যকৃতের টিস্যুতে ROS উত্পাদনের স্তর সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। ফলাফলগুলি দেখায় যে SAMR1 গ্রুপের লিভার টিস্যুতে ROS উত্পাদনের নিম্ন স্তর ছিল। যাইহোক, SAMR1 গ্রুপের সাথে তুলনা করে, SAMP8 গ্রুপে ROS উৎপাদনের মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 4A এবং B), যখন SAMP8 গ্রুপ, টেম্পোল, অ্যাপোসিনিন এবং Rg1 (5 এবং 10 mg/kg) চিকিত্সার সাথে তুলনা করা হয়েছে। যকৃতের টিস্যুতে ROS উৎপাদনের মাত্রা হ্রাস করে (চিত্র 4A এবং B)। বার্ধক্যের সময় ROS জমে NOX4 এর প্রভাব নিশ্চিত করতে, NOX4- সম্পর্কিত প্রোটিনের অভিব্যক্তি স্তরগুলি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি প্রমাণ করেছে যে, SAMR1 গ্রুপের সাথে তুলনা করে, যকৃতের টিস্যুতে NOX4, p22phox এবং p47phox-এর প্রকাশের মাত্রাগুলি SAMP8 গ্রুপে (চিত্র 5A‑D) উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নীত হয়েছে।
যাইহোক, SAMP8 গ্রুপের সাথে তুলনা করে, টেমপোল, অ্যাপোসিনিন এবং Rg1 (5 এবং 10 mg/kg) চিকিত্সা বার্ধক্যের সময় যকৃতের টিস্যুতে NOX4, p22phox এবং p47phox-এর প্রকাশের মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করে (চিত্র 5A‑D)। এই তথ্যগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে Rg1 চিকিত্সা ইঁদুরের বার্ধক্যের সময় NOX4 বাধা দিয়ে যকৃতের টিস্যুতে ROS-প্ররোচিত অক্সিডেটিভ স্ট্রেসের আঘাতকে কমিয়ে দিতে পারে।
