সাইক্লো-অক্সিজেনেস(COX-2) এবং হাইপক্সিয়া প্ররোচিত রোগের মধ্যে সম্পর্ক

আরো তথ্যের জন্য:ali.ma@wecistanche.com

ইন্ট্রাসেলুলার প্রোস্টাগ্ল্যান্ডিন E2 হাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত প্রক্সিমাল টিউবুলার কোষের মৃত্যুতে অবদান রাখে

কোরাল গার্সিয়া-পাস্টরল, সেলমা বেনিটো-মার্টিনেজ, রিকার্ডো জে. বোশ 1, আনা বি ফার্নান্দেজ-মার্টিনেজ, ফ্রান্সিসকো জে লুসিও-কাজানা

প্রক্সিমাল টিউবুলার সেল (পিটিসি) হাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিসের জন্য বিশেষভাবে ঝুঁকিপূর্ণ, এটি একটি প্রাসঙ্গিক কারণকিডনীর রোগ. আমরা এখানে অনুমান করেছি যে হাইপোক্সিয়ার অধীনে PTC মৃত্যু সাইক্লো-অক্সিজেনেস (COX-2)-নির্ভর প্রোস্টাগ্ল্যান্ডিন E,(PGE,) দ্বারা মধ্যস্থতা করে, যা মানুষের প্রক্সিমাল টিউবুলার HK-2কোষে নিশ্চিত করা হয়েছিল কারণ হাইপোক্সিয়া (1 শতাংশ O,)-প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিস (i) একটি COX-2(সাইক্লো) দ্বারা প্রতিরোধ করা হয়েছিল-অক্সিজেনেস) ইনহিবিটর এবং প্রোস্টাগ্ল্যান্ডিন (ইপি) রিসেপ্টরগুলির প্রতিপক্ষ এবং (ii) হাইপোক্সিয়া-ইনডিউসিবল ফ্যাক্টরের কারণে অন্তঃকোষীয় PGE বৃদ্ধির সাথে যুক্ত ছিল }}(সাইক্লো-অক্সিজেন). প্রোস্টাগ্ল্যান্ডিন আপটেক ট্রান্সপোর্টার PGT-এর ইনহিবিটরদের দ্বারাও অ্যাপোপটোসিস প্রতিরোধ করা হয়েছিল, যা ইঙ্গিত করে যে iPGE, হাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিসে অবদান রাখে (বিপরীতভাবে, হাইপোক্সিয়া/রিঅক্সিজেনেশন-প্ররোচিত পিটিসি মৃত্যু একচেটিয়াভাবে বহির্মুখী পিজিই-এর কারণে হয়েছিল)। সুতরাং, আইপিজিই হাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত নলাকার আঘাতের প্যাথোজেনেসিসে একটি নতুন অভিনেতা এবং রেনাল রোগে হাইপোক্সিয়া-নির্ভর ক্ষত প্রতিরোধের জন্য পিজিটি একটি নতুন থেরাপিউটিক লক্ষ্য হতে পারে।

এটি সুপ্রতিষ্ঠিত যে টিউবুলার হাইপোক্সিয়া তীব্র এবং দীর্ঘস্থায়ী উভয় ক্ষেত্রেই একটি প্রাসঙ্গিক কারণ।কিডনীর রোগ'2 প্রক্সিমাল টিউবুলার কোষ (PTC) অক্সিজেন খরচের ক্ষেত্রে অত্যন্ত সক্রিয় কারণ তাদের পুনর্শোষণের শক্তি-চাহিদামূলক ক্রিয়াকলাপ এবং ফলস্বরূপ, তারা হাইপোক্সিয়ার জন্য ঝুঁকিপূর্ণ। এটি দেখানো হয়েছে যে অ্যাপোপটোসিস হাইপোক্সিয়া-তে সংস্কৃত PTC-এর সংস্পর্শে একটি প্রাসঙ্গিক ভূমিকা পালন করে, তবে অ্যাপোপটোটিক যন্ত্রপাতি সক্রিয় করার জন্য দায়ী সংকেত পথগুলি তদন্ত করা হয়নি। আমরা এবং অন্যরা খুঁজে পেয়েছি যে প্রোস্টাগ্ল্যান্ডিন E, (PGE,), অনেক শারীরবৃত্তীয় এবং রোগগত প্রক্রিয়াগুলির একটি গুরুত্বপূর্ণ লিপিড মধ্যস্থতাকারী।কিডনি, সিসপ্ল্যাটিন 7, অ্যালবুমিন8 বা লেপটিন এবং জেন্টামাইসিনের সাথে চিকিত্সার পরে পিটিসি অ্যাপোপটোসিসের দিকে পরিচালিত সংকেতগুলিতে একটি প্রাসঙ্গিক ভূমিকা পালন করে। সমস্ত ক্ষেত্রে, PGE বৃদ্ধি সাইক্লো-অক্সিজেনেসের বর্ধিত অভিব্যক্তির উপর নির্ভরশীল বলে দেখা গেছে-2(COX-2)(সাইক্লো-অক্সিজেনেস), একটি ইন্ডুসিবল এনজাইম যা COX-1l ​​সহ, প্রোস্টাগ্ল্যান্ডিনের সংশ্লেষণের হার-সীমিত পদক্ষেপ। মানুষের মধ্যেকিডনি, বেসাল কক্স-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)অভিব্যক্তিটি COX-1 এর চেয়ে কম তীব্র। কক্স-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)শারীরবৃত্তীয় অবস্থার অধীনে পডোসাইট এবং হেনলের লুপের অংশ এবং রেনাল ভাস্কুলেচারে সনাক্ত করা হয়েছে10। প্যাথলজিকাল অবস্থায়, তবে, COX-2 ইমিউনোরঅ্যাক্টিভিটি আরও অনেক কোষের মধ্যে পাওয়া যেতে পারেকিডনিPTC সহ, এবং সম্ভবত রেনাল ইনজুরিতে অবদান রাখে। মজার বিষয় হল, হাইপোক্সিয়া COX এর অভিব্যক্তি বাড়ায়-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)এবং/অথবা PGE এর উৎপাদন,12-i7 অনেক ধরনের কোষে। প্রকৃতপক্ষে, আমরা আগে দেখেছি যে হাইপোক্সিয়া PGE-তে অন্তঃকোষীয় বিষয়বস্তু বাড়ায়, সেইসাথে এটি বহির্মুখী মাধ্যম 8-এ মুক্তি দেয়। অতএব, এটি তাত্ত্বিকভাবে সম্ভব যে পিজিই পিটিসিতে হাইপোক্সিয়ার অ্যাপোপটোটিক প্রভাবের মধ্যস্থতা করে।

PGE-নির্ভর অ্যাপোপটোসিসের উপর বেশিরভাগ গবেষণায় মূলত অতিরিক্ত-সেলুলার PGE জড়িত প্রক্রিয়াগুলির উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করা হয়েছে কারণ এটি ব্যাপকভাবে স্বীকৃত যে PGE, প্লাজমা মেমব্রেন-স্প্যানিং জি-প্রোটিন যুগল PGE, রিসেপ্টর (ই সিরিজ প্রোস্টাগ্ল্যান্ডিন রিসেপ্টর) সক্রিয় করার মাধ্যমে তার জৈবিক প্রভাব প্রয়োগ করে। EP1-4)1. তবুও, কিছু মডেলে, অন্তঃকোষীয় PGE,(iPGE,) অ্যাপোপটোটিক কোষের মৃত্যুতে প্রাসঙ্গিক720-22। এটি বোঝায় যে অ্যাপোপটোসিস প্ররোচিত করার জন্য, পিজিইকে আবার অন্তঃকোষীয় মাধ্যমে পৌঁছাতে হবে এবং ইপি রিসেপ্টরগুলির একটি উপসেট সক্রিয় করতে হবে, যা কোষের (আইইপি রিসেপ্টর) ভিতরে অবস্থিত। কারণ PGE ক্যাপচার করার কাজটি প্রধানত প্রোস্টাগ্ল্যান্ডিন আপটেক ট্রান্সপোর্টার (PGT)23-26 দ্বারা করা হয়, PGT বাধার ফলে iPGE প্রতিরোধ হয়,-মধ্যস্থিত অ্যাপোপটোটিক কোষের মৃত্যু7।

এই পটভূমিকে বিবেচনায় রেখে, বর্তমান কাজে, আমরা একটি কক্স-2 কিনা তা অধ্যয়ন করেছি(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)-আইপিজিই-তে নির্ভরশীল বৃদ্ধি, স্তরগুলি পিটিসি-তে হাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিসের মধ্যস্থতা করে।

কিডনি রোগের জন্য জৈব Cistanche ক্লিক করুন

পদ্ধতি

বিকারক।

AG1478, Bromocresolgreen (BG), PGE, AH6809, GW627368X, ক্রিস্টাল ভায়োলেট, ট্রাইপ্যান ব্লু সলিউশন, ব্রোমোসালফোফথালিন (BRS), 3-(5'-হাইড্রোক্সিমিথাইল2'-ফুরিল)-1-বেনজিল ইনডাজোল, এবং অ্যাক্টিনোমাইসিন ডি সিগমা (সেন্ট লুইস, এমও, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) থেকে কেনা হয়েছিল। Z-VAD-FMK এবং celecoxib ছিল যথাক্রমে Calbiochem (Darmstadt, Germany) এবং Cayman Chemical (An Arbor, MI, USA) থেকে। TriReagent Vitro (মাদ্রিদ, স্পেন) থেকে কেনা হয়েছিল এবং PVDF মেমব্রেন এবং ওয়েস্টার্ন ব্লটিং লুমিনোল রিএজেন্ট সান্তা ক্রুজ বায়োটেকনোলজি (সান্তা ক্রুজ, CA. USA) থেকে অর্জিত হয়েছিল। 4,6-ডায়ামিডিনো{{14} সহ প্রোলং গোল্ড অ্যান্টিফেড রিএজেন্ট }}ফিনাইল ইনডোল (ডিএপিআই), অ্যানেক্সিন-ভি-এফআইটিসি (ফ্লুরেসিন আইসোথিওসায়ানেট)/প্রপিডিয়াম আয়োডাইড (পিআই) অ্যাপোপটোসিস সনাক্তকরণ কিট এবং 2',7'-ডাইক্লোরোফ্লুরেসসিন ডায়াসেটেট (ডিসিএফএইচ-ডিএ) প্রোব ইনভিট্রোজেন (কার্লসবাড) থেকে কেনা হয়েছিল ইউএসএ), এবং আণবিক প্রোবস (ওরেগন, ইউএসএ), যথাক্রমে। অ্যান্টিবডিগুলি নিম্নলিখিত উত্স থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল: অ্যান্টি-পিজিই এবং অ্যান্টি-কক্স-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)অ্যান্টিবডিগুলি আবক্যাম (কেমব্রিজ, ইউকে) থেকে এসেছে; অ্যান্টি-বাক্স এবং অ্যান্টি-বিসিএল-2 সান্তা ক্রুজ টেকনোলজিস (সান্তা ক্রুজ, CA.USA); অ্যান্টি-এইচআইএফ-লা অ্যান্টিবডি এবং -র্যাবিট-আলেক্সা-ফ্লুর 488 যথাক্রমে বিডি বায়োসায়েন্সেস (পালো অল্টো, সিএ, ইউএসএ) এবং ইনভিট্রোজেন (কার্লসব্যাড, সিএ, ইউএসএ) থেকে এসেছে; অ্যান্টি- -অ্যাক্টিন এবং খরগোশ অ্যান্টি-মাউস আইজিজি পারক্সিডেস কনজুগেট সিগমা (সেন্ট লুইস, এমও, ইউএসএ) থেকে কেনা হয়েছিল।

কোষ সংস্কৃতি এবং পরীক্ষামূলক অবস্থা।

হিউম্যান প্রক্সিমাল টিউবুলার HK-2 কোষগুলি আমেরিকান টাইপ কালচার কালেকশন (ATCC)(রকভিল, MD, USA) থেকে কেনা হয়েছিল৷ কোষগুলি 5 শতাংশ CO-তে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল, 37 ডিগ্রি Cin DMEM/F12 তে 10 শতাংশ ভ্রূণের বোভাইন দিয়ে পরিপূরক৷ সিরাম(এফবিএস), 1 শতাংশ পেনিসিলিন/স্ট্রেপ্টোমাইসিন/অ্যামফোটেরিসিন বি এবং 1 শতাংশ গ্লুটামিন (ইনভিট্রোজেন। কার্লসব্যাড, সিএ, ইউএসএ) এবং 1 শতাংশ ইনসুলিন-ট্রান্সফারিন-সেলেনিয়াম (থার্মোফিশার। গ্র্যান্ড আইল্যান্ড, এনওয়াই, ইউএসএ)। সমস্ত পরীক্ষায় কোষ 70-90 শতাংশ সঙ্গমে প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল, এবং সম্পূর্ণরূপে সংযুক্ত হলে, তারা হাইপোক্সিক (1 শতাংশ অক্সিজেন) বা নরমোক্সিক অবস্থার (21 শতাংশ অক্সিজেন) অধীনে সংষ্কৃত হয়েছিল।হাইপোক্সিয়াপরীক্ষাগুলি একটি In vivo200 এ সঞ্চালিত হয়েছিলহাইপোক্সিয়াওয়ার্কস্টেশন (রাস্কিন টেকনোলজি, ওয়েস্ট ইয়র্কশায়ার, যুক্তরাজ্য)। জন্যহাইপোক্সিয়া/রিঅক্সিজেনেশন পরীক্ষা, কোষের অধীন ছিলহাইপোক্সিয়া24 ঘন্টার জন্য, এবং তারপরে, কোষগুলি 3 ঘন্টা পর্যন্ত (রিঅক্সিজেনেশন পিরিয়ড) পর্যন্ত নরমোক্সিক অবস্থায় ক্ষয়প্রাপ্ত হয়েছিল।

iPGE-এর ইমিউনোফ্লোরোসেন্স বিশ্লেষণ এবং COX-2 এর ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)এবং HIF-1।

ইমিউনোফ্লোরোসেন্স বিশ্লেষণ এবং ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণের জন্য কোষগুলি যথাক্রমে কাচের কভারস্লিপগুলিতে (4×104 কোষ/গ্লাস কভারস্লিপ) বা ছয়-ওয়েল প্লেটে (15×104 কোষ/কূপ) বিভক্ত করা হয়েছিল এবং "ফলাফল" এ বর্ণিত হিসাবে ইনকিউব করা হয়েছিল। তারপরে, ইমিউনোফ্লোরোসেন্স এবং ইমিউনোব্লটিং বিশ্লেষণগুলি মূলত পূর্বে বর্ণিত হিসাবে সঞ্চালিত হয়েছিল৷ অ্যান্টি-বডি ওয়ার্কিং ডিলিউশনগুলি ছিল: PGE এর জন্য 1/50, COX এর জন্য 1/1000-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 এবং 1/5000 -অ্যাক্টিনের জন্য। বায়োইঞ্জিনিয়ারিং, বায়োমেটেরিয়ালস, এবং ন্যানোমেডিসিন (BNCIBER-এ) বায়োমেডিকাল রিসার্চ নেটওয়ার্কিং সেন্টারের কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি সার্ভিস (ICTS 'NANBIOSIS'U17) এর মাধ্যমে একটি Leica SP5 কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) ব্যবহার করে ইমিউনোফ্লুরোসেন্স সনাক্তকরণ করা হয়েছিল। আলকাল বিশ্ববিদ্যালয়, মাদ্রিদ, স্পেন)

ক্ষণস্থায়ী স্থানান্তর।

siRNA PGT (সান্তা ক্রুজ বায়োটেকনোলজি, সান্তা ক্রুজ, CA), স্তন্যপায়ী এক্সপ্রেশন ভেক্টর pcDNA3 এর সাথে ক্ষণস্থায়ী স্থানান্তর যা বন্য ধরণের মানুষের cDNA ধারণ করে 15-হাইড্রক্সি-প্রোস্টাগ্ল্যান্ডিন ডিহাইড্রোজেনেস (p15-PGDH) মানুষের কক্সের জন্য লুসিফেরেস রিপোর্টার প্লাজমিড গঠন করে-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)phPES2-লুক, মানবহাইপোক্সিয়ারেসপন্স এলিমেন্ট (HRE)p9HIF1-Luc এবং R. reniformis pRL-CMV(Promega, Madison, WI) এবং luciferase কার্যকলাপের সংকল্প অন্যত্র বর্ণিত হিসাবে সঞ্চালিত হয়েছিল 27,28৷

কোষ গণনা এবং কোষ/নিউক্লিয়াস রূপবিদ্যা.

অনুগত কোষের সংখ্যা একটি পরিবর্তিত ক্রিস্টাল ভায়োলেট স্টেনিং পদ্ধতি 2 দিয়ে স্পেকট্রোফটোমেট্রিকভাবে নির্ধারণ করা হয়েছিল। অ্যাপোপটোসিসের প্রমাণ সনাক্ত করার জন্য, ফেজ-কনট্রাস্ট মাইক্রোস্কোপি ব্যবহার করে কোষের আকারবিদ্যা পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। পূর্বে বর্ণিত হিসাবে DAPI এর সাথে DNA স্টেনিংয়ের পরে কোষের নিউক্লিয়াস কল্পনা করা হয়েছিল0, সাধারণ অ্যাপোপটোটিক আকারবিদ্যা যা পরীক্ষা করা হয়েছিল তার মধ্যে রয়েছে সেলুলার সংকোচন, পারমাণবিক ঘনীভবন এবং খণ্ডিতকরণ, এবং অ্যাপোপটোটিক দেহের গঠন। পরিমাপের জন্য, অ্যাপোপটোসিসের মতো চেহারা সহ নিউক্লিয়াসের শতাংশ অনুমান করার জন্য প্রতিটি পরীক্ষামূলক অবস্থায় ছয়টি ক্ষেত্র অন্ধ পদ্ধতিতে পরীক্ষা করা হয়েছিল।

ট্রিপ্যান ব্লু ডাই এক্সক্লুশন টেস্টের মাধ্যমে ফ্লো সাইটোমেট্রি অ্যাপোপটোসিস অ্যাস এবং কোষের কার্যকারিতা পরীক্ষা।

প্লেটের অনুগত কোষগুলিকে ট্রিপসিনাইজেশন দ্বারা বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং সংস্কৃতির মাধ্যম থেকে পূর্বে পুনরুদ্ধার করা বিচ্ছিন্ন কোষগুলির সাথে একসাথে পরীক্ষা করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।

অ্যানেক্সিন-ভি-এফআইটিসি/পিআই অ্যাপোপটোসিস সনাক্তকরণ কিট অ্যাপোপটোটিক এবং নেক্রোটিক এইচকে-2 কোষগুলির প্রবাহ সাইটোমেট্রি সনাক্তকরণের জন্য অনুমোদিত, যেমনটি পূর্বে বর্ণিত হয়েছে7. প্রাথমিক এবং দেরীতে অ্যাপোপটোটিক কোষগুলি যথাক্রমে অ্যানেক্সিন ভি স্টেনিং এবং অ্যানেক্সিন ভি স্টেনিংয়ের জন্য ইতিবাচক ছিল। দাগ নেক্রোটিক কোষগুলি শুধুমাত্র PI তে ইতিবাচক ছিল এবং লাইভ HK-2 কোষগুলি কোনও দাগ দেখায়নি৷

ট্রাইপ্যান ব্লু ডাই বর্জন পরীক্ষাটি কোষের কার্যকারিতা মূল্যায়ন করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। কার্যকর কোষ (সাদা) এবং মৃত কোষ (নীল) একটি হালকা মাইক্রোস্কোপ এবং একটি হেমোসাইটোমিটার ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল।

পরিসংখ্যান সংক্রান্ত বিশ্লেষণ.

প্রতিটি পরীক্ষা অন্তত তিনবার পুনরাবৃত্তি ছিল। ফলাফলগুলি গড় ± SEM হিসাবে প্রকাশ করা হয়। তারা ভিন্নতা (ANOVA) এর একমুখী বিশ্লেষণের শিকার হয়েছিল এবং একাধিক তুলনার জন্য বনফেরোনির পরীক্ষা দ্বারা অনুসরণ করা হয়েছিল। তাত্পর্যের স্তরটি P এর থেকে কম বা 0.05 এর সমান সেট করা হয়েছিল৷

ফলাফল

হাইপোক্সিয়া প্রক্সিমাল টিউবুলার HK-2 কোষের মৃত্যু ঘটায়।

হাইপোক্সিয়াHK-2 কোষের সংখ্যা কমিয়েছে, যেমনটি ক্রিস্টাল ভায়োলেট অ্যাস (Fig. la) দ্বারা মূল্যায়ন করা হয়েছে, এবং এছাড়াও প্ররোচিত কোষ গোলাকার এবং প্লেট থেকে বিচ্ছিন্নকরণ (চিত্র lb, উপরের প্যানেল)। প্রত্যাশিত,হাইপোক্সিয়াঅ্যাপোপটোসিসের স্পষ্ট মরফোলজিক্যাল বৈশিষ্ট্য সহ কোষের মৃত্যুর একটি মডেল ট্রিগার করে (চিত্র lb, নিম্ন প্যানেলে, বামে DAPI সহ নিউক্লিয়ার স্টেনিং দেখুন) যেমন উল্লেখযোগ্য পারমাণবিক ঘনীভবনের সাথে কোষের সংকোচন, খণ্ডিতকরণ এবং অ্যাপোপটোটিক-সদৃশ দেহের গঠন।হাইপোক্সিয়া-প্রবাহ সাইটোমেট্রি দ্বারা মূল্যায়ন করা অ্যানেক্সিন ভি-এফআইটিসিস্টেইনিংয়ের বৃদ্ধি এবং প্যান-ক্যাসপেস ইনহিবিটর জেড-ভিএডি-এফএমকে (চিত্র এলসি) দিয়ে এর প্রতিরোধের দ্বারা প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিস আরও নিশ্চিত করা হয়েছিল।হাইপোক্সিয়াএছাড়াও কার্যকর কোষের সংখ্যা হ্রাস নির্ধারণ করেছে কিন্তু নেক্রোটিক কোষের সংখ্যায় পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন আনেনি (চিত্র। lc, ইনসেট)।

চিত্র 1. হাইপোক্সিয়া প্রক্সিমাল টিউবুলার HK-2 কোষের মৃত্যু ঘটায়।(ক) কমে যাওয়া কোষের সংখ্যা (ক্রিস্টাল ভায়োলেট অ্যাস)। (b) অ্যাপোপটোসিসের রূপগত বৈশিষ্ট্য। রিপ্রেজেন্টেটিভ ফেজ-কনট্রাস্ট ফটোমাইক্রোগ্রাফ (উপরের প্যানেল, আসল ম্যাগনিফিকেশন, 10×) DAPI স্টেনিং ফটোমাইক্রোগ্রাফ (লোয়ার প্যানেল, আসল ম্যাগনিফিকেশন, 40×)। (c) অ্যাপোপটোসিস বৃদ্ধি (ফ্লো সাইটোমেট্রি স্টাডিজ)। অ্যানেক্সিন ভি প্লাস কোষগুলি অ্যানেক্সিন ভি প্লাস /প্রপিডিয়াম আয়োডাইড-কোষ (অর্থাৎ সংরক্ষিত প্লাজমা মেমব্রেন অখণ্ডতা সহ প্রারম্ভিক অ্যাপোপটোটিক কোষ) এবং অ্যানেক্সিন ভি প্লাস /প্রপিডিয়াম আয়োডাইড প্লাস কোষ (অর্থাৎ দেরী অ্যাপোপটোটিক কোষ) নিয়ে গঠিত। ইনসেট: কোষের জনসংখ্যার ধরন (অ্যানেক্সিন ভি-/ প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড প্লাস কোষ হল নেক্রোটিক কোষ এবং অ্যানেক্সিন ভি-/ প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড- কোষ জীবিত)। ফলাফলগুলি ইভেন্টের মোট সংখ্যার সাপেক্ষে শতাংশ হিসাবে প্রকাশ করা হয়। সাধারণ তথ্য:(1) নরমোক্সিক (21 শতাংশ O2) বা হাইপোক্সিক （1 শতাংশ O,） শর্তে কোষগুলি 24 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল, যেমনটি "পদ্ধতি? এক্সপোজার শুরু করার আগে 1 ঘন্টা যোগ করা হয়েছেহাইপোক্সিয়া. (2) মাইক্রোফটোগ্রাফ তিনটি স্বাধীন পরীক্ষার প্রতিনিধি উদাহরণ। গ্রাফে বার এবং ত্রুটি বার: প্রতিটি বার 3টি ভিন্ন পরীক্ষার গড় ±SEM প্রতিনিধিত্ব করে *P<0.01 vs.=""><0.01 vs="">হাইপোক্সিয়া;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">হাইপোক্সিয়াপ্লাস ZVAD।

কক্স-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)/iPGE,/EP রিসেপ্টর পাথওয়ে হাইপোক্সিয়া দ্বারা প্রবর্তিত প্রক্সিমাল টিউবুলার HK-2 কোষের মৃত্যুর মধ্যস্থতা করে।

কক্সের ভূমিকা মূল্যায়ন করার জন্য-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)/iPGE2/EP রিসেপ্টর পাথওয়ে ইনহাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত HK-2 কোষের মৃত্যু, আমরা প্রথমে সেলকোক্সিব, একটি COX-2 দিয়ে কোষকে প্রাক-ইনকিউবেট করি(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)বাধা 1; AH6809, EP1, EP2 এবং EP3 রিসেপ্টর বা GW627368X, EP4 রিসেপ্টর33-এর বিরোধী; অথবা ব্রোমোক্রেসল গ্রিন বা ব্রোমোসুল-ফোফথাল উভয়েই PGT435 এর ইনহিবিটর। পিজিটিও siRNA-র মাধ্যমে ট্রান্সফেকশনের মাধ্যমে ছিটকে পড়ে।

চিত্র 2. কক্স-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)/iPGE,/EP রিসেপ্টর পাথওয়ে হাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত প্রক্সিমাল টিউবুলার HK-2 কোষের মৃত্যুর মধ্যস্থতা করে।(ক) পথের বাধা দ্বারা কোষের মৃত্যু প্রতিরোধ। উপরের প্যানেল; বারগুলি মোট কোষের মৃত্যুর শতাংশ (বাম) বা অ্যাপোপটোটিক অ্যানেক্সিন ভি প্লাস কোষের শতাংশ (ডানে) দেখায়। উন্মুক্ত হওয়ার আগেহাইপোক্সিয়া, কোষগুলি 3 μM celecoxib（COX-2 সহ 1 ঘন্টার জন্য প্রাক-ইনকিউবেটেড ছিল(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)ইনহিবিটর）;10 μuM AH6809, （EP1-3 রিসেপ্টর বিরোধী）, 10 μM GW627368X（EP4 রিসেপ্টর বিরোধী）; অথবা 50 μM ব্রোমোক্রেসল গ্রিন (BG) বা 25 μM ব্রোমোসালফোফথালিন (BrS), দুটি PGT ইনহিবিটর সহ। নিম্ন প্যানেল: বাম: siRNA (ট্রাইপ্যান ব্লু ডাইভ এক্সক্লুশন টেস্ট) দিয়ে ট্রান্সফেকশনের মাধ্যমে পিজিটি ছিটকে দিয়ে কোষের মৃত্যু প্রতিরোধ। ইনসেট: PGT এর নকডাউনের কার্যকারিতা (ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ) ডান: ব্রোমোক্রেসল গ্রিন (বিজি) এর প্রতিরোধমূলক প্রভাবের ঘনত্ব নির্ভরতা। (b) প্রোস্টাগ্ল্যান্ডিন নিষ্ক্রিয়কারী এনজাইম 15-হাইড্রোক্সি-প্রোস্টাগ্ল্যান্ডিন ডিহাইড্রোজেনেস(15-PGDH) cDNA(ট্রাইপ্যান ব্লু ডাই এক্সক্লুশন টেস্ট) ধারণকারী স্তন্যপায়ী এক্সপ্রেশন ভেক্টর দিয়ে স্থানান্তর করে কোষের মৃত্যুর প্রতিরোধ। 11} PGDH (ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ) স্থানান্তরিত কোষে। (গ)হাইপোক্সিয়াiPGE-তে একটি PGT-সংবেদনশীল বৃদ্ধি প্ররোচিত করে, বাম: PGE,-নির্ভর ইমিউনোফ্লোরেসেন্স একা বা DAPI-এর সাথে পারমাণবিক স্টেনিংয়ের সাথে একত্রিত দেখানো হয়েছে (আসল বিবর্ধন, 40×) ডান: ইমেজ জে সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে বাম প্যানেলে উপস্থাপিত চিত্রগুলির পরিমাণগত পদ্ধতি। (d) EGFR অ্যাক্টিভেশন AG1478 এর ইনহিবিটর HK-2 কোষের মৃত্যু EGFR প্রতিরোধ করে না। 1 ঘন্টার জন্য l μM AG1478 এর সাথে আক্রান্ত হওয়ার আগে কোষগুলিকে প্রাক-ইনকিউবেট করা হয়েছিলহাইপোক্সিয়া. (e）) PGT ইনহিবিটর BG HK-2 কোষে Bax এবং Bcl-2 এর অভিব্যক্তি পরিবর্তন করে নাহাইপোক্সিয়া(ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ)। (f) প্রতিরোধহাইপোক্সিয়া/পাথওয়ের ইনহিবিটরদের দ্বারা পুনঃঅক্সিজেনেশন-প্ররোচিত কোষের মৃত্যু (ট্রাইপ্যান ব্লু ডাই এক্সক্লুশন টেস্ট)। কোষগুলি পাথওয়ের ইনহিবিটারগুলির সাথে প্রাক-ইনকিউবেটেড ছিল এবং এর শিকার হয়েছিলহাইপোক্সিয়াযেমন (ক)। তারপরে, কোষগুলি 3 ঘন্টার জন্য নরমোক্সিয়ার সংস্পর্শে এসেছিল। সাধারণ তথ্য: (1) কোষগুলি 24 ঘন্টার জন্য নরমোক্সিক (21 শতাংশ O,) বা হাইপোক্সিক (1 শতাংশ O,) অবস্থার জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল, যেমনটি "পদ্ধতি" এ নির্দেশিত হয়েছে। (2) মাইক্রোফটোগ্রাফ তিনটি স্বাধীন পরীক্ষার প্রতিনিধি উদাহরণ। (3) ইনহিবিটরগুলির দ্রাবক (luL/mL মাধ্যম) এর প্রভাব পরিবর্তন করেনিহাইপোক্সিয়াকোষের মৃত্যুতে (ফলাফল দেখানো হয় না)। (4) ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ: অ্যান্টি- -অ্যাক্টিন বা অ্যান্টি-GAPDH অ্যান্টিবডি দিয়ে পরীক্ষা করে সমান প্রোটিন নিশ্চিত করা হয়েছিল। (5) গ্রাফে বার এবং ত্রুটি বার: প্রতিটি বার 3টি ভিন্ন পরীক্ষার গড় ±SEM প্রতিনিধিত্ব করে।*P<0.01><0.01>হাইপোক্সিয়াবাহাইপোক্সিয়া/রিঅক্সিজেনেশন।

চিত্র 2a এ দেখানো হয়েছে,হাইপোক্সিয়া-প্রেরিত প্রক্সিমাল টিউবুলার কোষের মৃত্যু সমস্ত ক্ষেত্রে প্রতিরোধ করা হয়েছিল। celecoxib দ্বারা অ্যাপোপটোসিস প্রতিরোধ নির্দেশ করে যে COX-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)একটি প্রাসঙ্গিক ভূমিকা পালন করেহাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত অ্যাপোপটোটিক কোষের মৃত্যু (চিত্র 2a, উপরের প্যানেল, ডানদিকে)। আরও নির্দিষ্টভাবে, ইপি রিসেপ্টরগুলির বৈরিতার দ্বারা অ্যাপোপটোসিস প্রতিরোধ করা হয়েছিল তা বলে যে অ্যাপোপটোসিসটি COX দ্বারা মধ্যস্থতা করা হয়-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)-পিজিই-এর উপর নির্ভরশীল উত্পাদন।অন্যদিকে, এটি সম্ভবত আইপিজিইতে অবদান রাখেহাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত HK-2 কোষের মৃত্যু কারণ এটি প্রতিরোধ করা হয়েছিল;(i) PGT(Fig.2a) বা (i) 15-PGDH(Fig. 2b) এর অত্যধিক এক্সপ্রেশন, যা iPGE2 এর মাধ্যমে নিষ্ক্রিয় করে অক্সিডেশন25হাইপোক্সিয়া: অ-পরিবর্তিত কোষে 15-20 শতাংশের তুলনায় নিয়ন্ত্রণ অবস্থায় স্থানান্তরের জন্য কোষের মৃত্যু ছিল 45-55 শতাংশ)। iPGE এর অবদানের জন্য আরও সমর্থন,হাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত HK-2 কোষের মৃত্যু, আমাদের পূর্ববর্তী অনুসন্ধান যাহাইপোক্সিয়াiPGE,1-এর সেল সামগ্রীর বৃদ্ধি নির্ধারণ করে এবং এই বৃদ্ধি পিজিটি ইনহিবিটরস দ্বারা প্রতিরোধ করা হয়েছিল (চিত্র 2c)।

MAPK সিগন্যালিং পথগুলি অ্যাপোপটোসিসকে প্ররোচিত করতে পারে, কারণ iEP রিসেপ্টরগুলি এপিডার্মাল গ্রোথ ফ্যাক্টর রিসেপ্টর (EGFR)36 ট্রান্সঅ্যাক্টিভেট করে, যা HK-2 কোষে MAP কিনাসেস ERK1/2 এবং p38 সক্রিয় করার দিকে পরিচালিত করে0, আমরা জিজ্ঞাসা করেছি যে আগে -ইজিএফআর অ্যাক্টিভেশন AG1478 এর ইনহিবিটর দিয়ে HK-2 কোষের ইনকিউবেশন প্রতিরোধ করা হয়েছেহাইপোক্সিয়া- প্ররোচিত কোষের মৃত্যু। আমরা নেতিবাচক ফলাফল পেয়েছি (Fig.2d) এবং তাই, এটি অসম্ভাব্য যে EGFR এর ট্রানস্যাক্টিভেশন HK-2 কোষের মৃত্যুর মধ্যস্থতা করেহাইপোক্সিয়া.

বেশ কয়েকটি পরীক্ষামূলক মডেলে, মাইটোকন্ড্রিয়াল-উত্পন্ন ATP এর সময় হ্রাসহাইপোক্সিয়াপ্রো-অ্যাপোপ্টোটিক প্রোটিন ব্যাক্স থেকে অ্যান্টি-অ্যাপোপ্টোটিক প্রোটিন Bcl-2 এক্সপ্রেশন রেশিওতে বৃদ্ধি ঘটায়, যা সাইটোসোলে সাইটোক্রোম সি রিলিজ, ক্যাসপেস 9 সক্রিয়করণ এবং পরবর্তী ক্লিভেজ এবং ডাউন-স্ট্রীম, ইফেক্টর সক্রিয়করণের দিকে পরিচালিত করে। caspases37,38. যাইহোক, HK-2 কোষের অধীনে PGT ইনহিবিটর BG এর সাথে প্রাক-ইনকিউবেশনহাইপোক্সিয়াBc-2 এবং Bax(Fig.2e) এর অভিব্যক্তির মধ্যে ভারসাম্যের মধ্যে একটি অ্যান্টি-অ্যাপোপ্টোটিক শিফটের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ পরিবর্তনগুলি ঘটেনি, যা HK-2 কোষে এই প্রোটিনের ভূমিকা সমর্থন করে না অধীনে মৃত্যুহাইপোক্সিয়া.

হাইপোক্সিক এক্সপোজারের পরে, রিঅক্সিজেনেশনের পর্বগুলি (ইসকেমিয়া/রিপারফিউশন ইনজুরি) অতিরিক্ত কোষের ক্ষতি করতে পারে। রিঅক্সিজেনেশন ইনজুরির "প্যারাডক্স" বোঝা যায় যে কোষগুলি এনজাইমের ক্রিয়াকলাপ, মাইটোকন্ড্রিয়াল ফাংশন, সাইটোস্কেলেটাল গঠন, ঝিল্লি পরিবহন এবং অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট প্রতিরক্ষায় নির্দিষ্ট পরিবর্তনের মধ্য দিয়ে যায়।হাইপোক্সিয়া, যা তখন সম্মিলিতভাবে পুনঃঅক্সিজেনেশন আঘাতের প্রবণতা দেখায়39। রিঅক্সি-জেনেশন ইস্কেমিক স্ট্রোক, কিডনি প্রতিস্থাপন, সংবহন ব্যর্থতা বা রেনাল এবং কার্ডিওভাসকুলার সার্জারির সময় তীব্র কিডনি আঘাতে অবদান রাখে। এই প্রেক্ষাপটে, এর প্রতিরোধের সম্ভাব্য থেরাপিউটিক মানহাইপোক্সিয়া/কক্সে হস্তক্ষেপের মাধ্যমে রিঅক্সিজেনেশন-প্ররোচিত প্রক্সিমাল টিউবুলার কোষের মৃত্যু-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)/iPGE,/iEP রিসেপ্টর পাথওয়ে স্পষ্ট। অতএব, আমরা জিজ্ঞাসা করেছি যে আইপিজিই বিশেষভাবে মধ্যস্থতা করে কিনাহাইপোক্সিয়া- প্ররোচিত কোষের মৃত্যু বা মধ্যস্থতা করেহাইপোক্সিয়া/রিঅক্সিজেনেশন-প্ররোচিত কোষের মৃত্যু (একটি ইন ভিট্রো মডেল যা ভিভো রেনাল ইস্কেমিয়া/রিপারফিউশন ইনজুরির অনুকরণ করে)। Fig.2f এ দেখানো হয়েছে, কোষের মৃত্যু (ট্রাইপ্যান ব্লু ডাইভ এক্সক্লুশন টেস্ট দ্বারা মূল্যায়ন করা হয়েছে) COX দ্বারা প্রতিরোধ করা হয়েছিল-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)ইনহিবিটর celecoxib পাশাপাশি EP রিসেপ্টর বিরোধী AH6809 বা GW627368X দ্বারা। Fig.2a এর মতোই, এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে COX-2 একটি প্রাসঙ্গিক ভূমিকা পালন করেহাইপোক্সিয়া/রিঅক্সিজেনেশন-প্ররোচিত কোষের মৃত্যু এবং আরও নির্দিষ্টভাবে, সেই কোষের মৃত্যু COX দ্বারা মধ্যস্থতা করে-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)-পিজিই-এর নির্ভরশীল উত্পাদন, যেহেতু এটি ইপি রিসেপ্টরগুলির বিরোধিতা দ্বারা প্রতিরোধ করা হয়েছিল। যাইহোক, যেহেতু পিজিটি ইনহিবিটর ব্রোমোক্রেসল গ্রিন বা ব্রো-মোসালফোফথালিন (চিত্র 2এফ এবং পরিপূরক চিত্র 2 ডি) দ্বারা কোষের মৃত্যু প্রতিরোধ করা হয়নি, তাই এটি হওয়ার সম্ভাবনা বেশি।হাইপোক্সিয়া/রিঅক্সিজেনেশন-প্ররোচিত HK-2 কোষের মৃত্যু একচেটিয়াভাবে এক্সট্রা সেলুলার PGE দ্বারা মধ্যস্থতা করা হয়।

HIF-1 -COX-এর নির্ভরশীল ট্রান্সক্রিপশনাল রেগুলেশন-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)জিন অভিব্যক্তি একটি অবদানহাইপোক্সিয়া-প্রক্সিমাল টিউবুলার HK-2 কোষে iPGE-তে প্ররোচিত বৃদ্ধি। পিজিই, জৈব সংশ্লেষণে ফসফোলিপেস এ দ্বারা অ্যারাকিডোনিক অ্যাসিডের ঝিল্লি গ্লিসারোফসফোলিপিড থেকে নিঃসরণ জড়িত, তারপরে অ্যারাকিডোনিক অ্যাসিডের COX আইসোএনজাইমগুলি প্রোস্টাগ্ল্যান্ডিন এইচ-এ রূপান্তরিত হয় এবং অবশেষে, এইচ-এর প্রোস্টা গ্রন্থির আইসোমারাইজেশন দ্বারা, প্রোস্টাগ্ল্যান্ডিন এইচ-এ প্রোস্টাগ্লান্ডে রূপান্তরিত হয়। যেমন মাইক্রোসোমাল পিজিই সিন্থেস-1 (এমপিজিইএস-1)19। আমরা সেটা খুঁজে পেয়েছিহাইপোক্সিয়াHK-2 কোষে প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিস সম্ভবত একটি COX-2 দ্বারা মধ্যস্থতা হয়(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)PGE উৎপাদনে নির্ভরশীল বৃদ্ধি,(চিত্র 2)। প্রদত্ত যে COX-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)একটি এনজাইম যার অভিব্যক্তি দ্বারা প্ররোচিত হতে পারেহাইপোক্সিয়া, আমরা অনুমান করেছিলাম যে একটিহাইপোক্সিয়াPGE-তে প্ররোচিত বৃদ্ধি, HK-2 কোষে উৎপাদন COX-2 এর অভিব্যক্তি বৃদ্ধির ফল হতে পারে(সাইক্লো-অক্সিজেনেস). আমাদের অনুমান নিশ্চিত করার জন্য, আমরা (i) এর প্রভাব অধ্যয়ন করেছিহাইপোক্সিয়াCOX এর অভিব্যক্তিতে-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)প্রোটিন এবং mRNA এবং (ii) COX এর প্রভাব-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)ইনহিবিটর celecoxib উপরহাইপোক্সিয়া-আইপিজিই-তে প্ররোচিত বৃদ্ধি, আমাদের ফলাফল এটি নির্দেশ করেহাইপোক্সিয়াCOX এর ট্রান্সক্রিপশনাল আপ-রেগুলেশন একটি ক্ষণস্থায়ী পদ্ধতিতে নির্ধারিত হয়-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)অভিব্যক্তি (চিত্র 3a,b)এবং সেই COX-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)ইনহিবিশন এইচকে-2 কোষের অধীনে iPGE বৃদ্ধিকে ভোঁতা করেহাইপোক্সিয়া(Fig.3c)। মজার ব্যাপার হল,হাইপোক্সিয়াএছাড়াও mPGES-1 প্রোটিন এক্সপ্রেশনের ক্ষণস্থায়ী আপ-নিয়ন্ত্রণ (চিত্র, 3a, ইনসেট) নির্ধারণ করেছে, কিন্তু mPGES-1 mRNA অভিব্যক্তিকে প্রভাবিত করেনি (চিত্র, 3b. ইনসেট)। এই ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে COX-2 এর অভিব্যক্তি বৃদ্ধি পেয়েছে(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)এবং mPGES-1 এর জন্য দায়ীহাইপোক্সিয়া-আইপিজিই-তে প্ররোচিত বৃদ্ধি।

চিত্র 3. COX-2-এর HIF-la-নির্ভর ট্রান্সক্রিপশনাল রেগুলেশন(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)জিনের অভিব্যক্তি iPGE-তে হাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত বৃদ্ধিতে অবদান রাখে, প্রক্সিমাল টিউবুলার HK-2 কোষে।(ক) COX এর অভিব্যক্তি-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)প্রোটিন ক্ষণস্থায়ীভাবে বৃদ্ধি পায়হাইপোক্সিয়া(ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ)। ইনসেট: এক্সপ্রেশন mPGES-1 প্রোটিনও ক্ষণস্থায়ীভাবে আপ-নিয়ন্ত্রিত হয়হাইপোক্সিয়া. (খ) এক্সপ্রেশন COX-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)mRNA ক্ষণস্থায়ীভাবে বৃদ্ধি পায়হাইপোক্সিয়া. ইনসেট: mPGES-1 mRNA এর এক্সপ্রেশন দ্বারা প্রভাবিত হয় নাহাইপোক্সিয়া. (c) celecoxib দ্বারা প্রতিরোধ, একটি COX-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)inhibitor, iPGE বৃদ্ধির, দ্বারা প্ররোচিতহাইপোক্সিয়া. কোষগুলিকে 3 μM সেলেকোক্সিব সহ 1 ঘন্টার জন্য প্রি-ইনকিউবেট করা হয়েছিল। Left∶PGE,-নির্ভর ইমিউনোফ্লোরোসেন্স একা বা DAPI এর সাথে পারমাণবিক দাগের সাথে একত্রিত করা দেখানো হয়েছে (অরিজিনাল ম্যাগনিফিকেশন, 40×)। ডানদিকে: ইমেজ জে সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে বাম প্যানেলে উপস্থাপিত চিত্রগুলির পরিমাণগত পদ্ধতি। (d) ট্রান্সক্রিপশনাল মেকানিজমের অবদান। বাম: ট্রান্সক্রিপশনাল ইনহিবিটর অ্যাক্টিনোমাইসিন ডি(অ্যাক্ট। ডি) প্রতিরোধ করেহাইপোক্সিয়া-কক্সে প্ররোচিত বৃদ্ধি-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)প্রোটিন এক্সপ্রেশন (ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ)। কোষগুলিকে 1 ug/ml আইন দিয়ে lh-এর জন্য প্রাক-চিকিত্সা করা হয়েছিল। ডি এর সংস্পর্শে আসার আগেহাইপোক্সিয়া3 ঘন্টার জন্য। ডান: একটি COX এর কার্যকলাপ বৃদ্ধি-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)রিপোর্টার নির্মাণ। (ঙ) এইচআইএফ-লা ওয়াইসি-1 প্রতিরোধ করেহাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত ট্রান্সক্রিপশনাল COX-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)আপ-নিয়ন্ত্রণ কোষগুলিকে 0.5 uM YC-1 দিয়ে 1 ঘন্টার জন্য প্রিঙ্কুবেট করা হয়েছিল৷ বাম: COX-2 প্রতিরোধ(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)আপ-নিয়ন্ত্রণ কোষ উন্মুক্ত ছিলহাইপোক্সিয়া8 ঘন্টার জন্য কেন্দ্র: একটি COX এর কার্যকলাপ বৃদ্ধির প্রতিরোধ-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)রিপোর্টার নির্মাণ। ডান: HRE-চালিত রিপোর্টার নির্মাণের কার্যকলাপের বাধা। কোষ উন্মুক্ত ছিলহাইপোক্সিয়া8 ঘণ্টার জন্য। উন্মুক্ত হওয়ার আগেহাইপোক্সিয়া, কোষগুলিকে 0.5 μM YC-1 দিয়ে 1 ঘন্টার জন্য প্রাক-ইনকিউবেট করা হয়েছিল৷ Inset∶ YC-1 বাধা দেয়হাইপোক্সিয়াএইচআইএফ-এ প্ররোচিত বৃদ্ধি-1একটি অভিব্যক্তি (ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ)। সাধারণ তথ্য:(1)কোষগুলি 24 ঘন্টার জন্য নরমোক্সিক (21 শতাংশ O,) বা হাইপোক্সিক (1 শতাংশ O,) অবস্থার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল, যেমনটি "পদ্ধতি" এ নির্দেশিত হয়েছে। (2) মাইক্রোফটোগ্রাফ তিনটি স্বাধীন পরীক্ষার প্রতিনিধি উদাহরণ। (3) ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ: অ্যান্টি- -অ্যাক্টিন অ্যান্টিবডি (4) গ্রাফে বার এবং ত্রুটি বারগুলি পরীক্ষা করে সমান প্রোটিন নিশ্চিত করা হয়েছিল: প্রতিটি বার 3টি ভিন্ন পরীক্ষার গড় ±SEM প্রতিনিধিত্ব করে *P<0.01 vs.="" other="">

COX বৃদ্ধিতে ট্রান্সক্রিপশনাল মেকানিজমের অবদান আরও পরীক্ষা করার জন্য-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)অধীনে প্রোটিন অভিব্যক্তিহাইপোক্সিয়া, COX এর অভিব্যক্তি-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)HK-2 কোষে মূল্যায়ন করা হয়েছিল, যেগুলি ট্রান্সক্রিপশন ইনহিবিটর অ্যাক্টিনোমাইসিন ডি দ্বারা প্রি-ইনকিউবেট করা হয়েছিলহাইপোক্সিয়া5 ঘন্টার জন্য Fig.3d এ দেখানো হয়েছে,হাইপোক্সিয়া-কক্সে প্ররোচিত বৃদ্ধি-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)অ্যাক্টিনোমাইসিন ডি দ্বারা প্রোটিনের প্রকাশ প্রতিরোধ করা হয়েছিল।হাইপোক্সিয়াএছাড়াও একটি COX-2 এর কার্যকলাপ বৃদ্ধি নির্ধারণ করেছে(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)HK-2 কোষে প্রবর্তক নির্মাণ পূর্বে স্থানান্তরিত (চিত্র 3d ডান)। একসাথে নেওয়া, চিত্র 3d-এ দেখানো ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে ট্রান্সক্রিপশনাল মেকানিজমগুলি একটিতে অবদান রাখেহাইপোক্সিয়া-কক্সে প্ররোচিত বৃদ্ধি-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)প্রোটিন অভিব্যক্তি। তথাপি, COX-2 প্রোমোটার সক্রিয় করার সময় এবং সর্বাধিক COX-2 এর সময়ের মধ্যে একটি পার্থক্য ছিল(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)mRNA অভিব্যক্তি: COX-এ ক্ষণস্থায়ী বৃদ্ধির সময়-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)mRNA এক্সপ্রেশন 2 ঘন্টা (Fig.3b) পরে সর্বাধিক ছিল, COX-2 প্রোমোটারটি 3 ঘন্টা (Fig.3d) পরে সক্রিয় হয়েছিল, যা সম্ভবত COX-এর বৃদ্ধিতে পোস্ট-ট্রান্সক্রিপশনাল মেকানিজমের অবদানকে প্রতিফলিত করে{{6 }}(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)অভিব্যক্তি4. সেই অনুযায়ী, আমরা অনুমান করি যে COX-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)mRNA অধীনে স্থিতিশীল হয়হাইপোক্সিয়া, যার ফলে COX এর মাত্রা বৃদ্ধি পাবে-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)COX-এর বর্ধিত কার্যকলাপের (সেই মুহূর্তে) কোনো অবদান ছাড়াই mRNA অভিব্যক্তি-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)প্রচারক যাইহোক, এটাও সম্ভব যে প্রোমোটার সক্রিয়করণ এবং পরিমাপযোগ্য সাবস্ট্রেট জমা করার মধ্যে একটি সময়ের ব্যবধানও COX-2 প্রোমোটার সক্রিয়করণের সময় এবং সর্বাধিক COX-এর সময়ের মধ্যে পার্থক্যের জন্য অবদান রাখতে পারে। }}(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)mRNA অভিব্যক্তি।

HIF-1 হল একটি হেটেরোডিমেরিক ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর যা অক্সিজেন-নির্ভর -সাবুনিট এবং গঠনমূলকভাবে প্রকাশ করা -সাবুনিট দ্বারা গঠিত। অধীনহাইপোক্সিয়া, HIF-l জমা হয় এবং নিউক্লিয়াসে প্রবেশ করে, যেখানে এটি HIF-1 এর সাথে ডাইমারাইজ করার পরে ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর HIF-1 তৈরি করে। HIF-1 তারপর আবদ্ধ হয়ে এর লক্ষ্য জিনের অভিব্যক্তি প্রচার করেহাইপোক্সিয়া- প্রতিক্রিয়াশীল উপাদান (HREs) তাদের নিয়ন্ত্রক অঞ্চলে উপস্থিত থাকে এবং পরবর্তীতে যুদ্ধের জন্য সেলুলার অভিযোজিত প্রতিক্রিয়া সাজায়হাইপোক্সিয়া 3. দেত্তয়া আছেহাইপোক্সিয়াCOX সক্রিয় করতে পারে-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)COX-2 প্রোমোটার সিকোয়েন্স২-এ উপস্থিত একটি কার্যকরী HRE-এর মাধ্যমে HIF-1-নির্ভরশীল পদ্ধতিতে অভিব্যক্তি, আমরা HIF-l-এর ভূমিকা পরীক্ষা করেছিহাইপোক্সিয়া-কক্সে প্ররোচিত বৃদ্ধি-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)অভিব্যক্তি আমরা HK-2 কোষে স্থানান্তরিত একটি COX-2 প্রোমোটার কনস্ট্রাক্টের কার্যকলাপও দেখেছি। চিত্র 3e-তে যেমন দেখানো হয়েছে, HIF-1একটি ইনহিবিটর YC-1 দিয়ে প্রি-ইনকিউবেশন, যা ভোঁতা হয়ে যায়হাইপোক্সিয়া-এইচআইএফ-লা এক্সপ্রেশন এবং এইচআরই রিপোর্টার গঠনের কার্যকলাপে প্ররোচিত বৃদ্ধি, যার ফলে COX-এর উভয় অভিব্যক্তির বৃদ্ধি রোধ হয়-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)এবং কক্সের কার্যকলাপ-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)HK-2-এ প্রবর্তক নির্মাণ সাপেক্ষেহাইপোক্সিয়া. সংক্ষেপে, ফলাফলগুলি চিত্রে দেখানো হয়েছে, 3a-e এই ধারণাটিকে সমর্থন করে যে HIF-1 -COX-এর নির্ভরশীল ট্রান্সক্রিপশনাল আপ-রেগুলেশন-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)জন্য দায়ীহাইপোক্সিয়াiPGE2-তে প্ররোচিত বৃদ্ধি।

যদিও HIF-1এ সক্রিয়করণের ফলাফলহাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিস বিতর্কিত (সম্ভবত কারণ তারা প্রসঙ্গ-নির্ভর হতে পারে), আমরা আমাদের পরীক্ষামূলক ব্যবস্থায় HIF-1এর ভূমিকা বিশ্লেষণ করেছি (প্রাথমিকভাবে)। যেহেতু আমরা আগে কক্স-2-এ হস্তক্ষেপ খুঁজে পেয়েছি(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)/iPGE, EP রিসেপ্টর পাথওয়ে দ্বারা ট্রিগার হওয়া HIF-la এক্সপ্রেশন বৃদ্ধিতে বাধা দেয়হাইপোক্সিয়া8,56 আমরা জিজ্ঞাসা করেছি যে এইচআইএফ-লা প্রতিরোধের ফলে প্রতিরোধ করা হয় কিনাহাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত HK-2 সেল অ্যাপোপটোসিস। চিত্র 3f-এ দেখানো হয়েছে, YC-1 এর সাথে প্রাক-ইনকিউবেশন, একটি HIF-l ইনহিবিটর, আসলে বেড়েছেহাইপোক্সিয়া- প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিস। অতএব, এটি অসম্ভাব্য যে HlF-la

আলোচনা

টিস্যুহাইপোক্সিয়াদীর্ঘস্থায়ী কিডনি রোগ এবং তীব্র কিডনি আঘাত উভয়ের প্যাথোফিজিওলজিতে এটি সমালোচনামূলকভাবে প্রাসঙ্গিক বলে মনে করা হয়, পিটিসি রেনাল টিউবুলের বিরুদ্ধে সবচেয়ে সংবেদনশীল অংশহাইপোক্সিয়া. এখানে আমরা PGE এর ভূমিকা পরীক্ষা করে দেখেছি, যে ক্ষতি হয়েছেহাইপোক্সিয়ামানুষের কাছে পিটিসিএবং পাওয়া গেছে যে আইপিজিই-এর বর্ধিত উৎপাদন COX-এর HIF-la-নির্ভর আপ-রেগুলেশন থেকে উদ্ভূত হয়েছে-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)জিনের অভিব্যক্তি এবং mpGES-1 এর বর্ধিত অভিব্যক্তি, এতে অবদান রাখেহাইপোক্সিয়া-এইচকে-2 কোষে অ্যাপোপটোটিক কোষের মৃত্যু প্ররোচিত। প্রদত্ত যে টিউবুলার হাইপোক্সিয়া তীব্র এবং দীর্ঘস্থায়ী উভয় কিডনি রোগের জন্য একটি প্রাসঙ্গিক কারণ-2, এই ফলাফলগুলি প্রোস্টাগ্ল্যান্ডিন ট্রান্সপোর্টার PGT কে রেনাল রোগের একটি নতুন থেরাপিউটিক লক্ষ্য হিসাবে নির্দেশ করে।

হাইপোক্সিয়াশুধুমাত্র iPGEই বাড়ায় না বরং এর বহিঃকোষী মাধ্যমের মুক্তিও 8 যাতে নিঃসৃত (অতিরিক্ত-সেলুলার) PGE এর ক্ষেত্রেও ভূমিকা রাখতে পারেহাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিস (উদাহরণস্বরূপ, কোষের ঝিল্লিতে অবস্থিত ইপি রিসেপ্টরগুলির ক্যানোনিকাল অ্যাক্টিভেশনের মাধ্যমে অ্যাপোপটোটিক ক্যাসকেডগুলিকে ট্রিগার করে)। আগের দুটি গবেষণায় দেখা গেছে যে কোষের মৃত্যু হয়হাইপোক্সিয়াCOX-2 এর কারণেও হয়েছিল(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)PGE, 1345-এর উপর নির্ভরশীল উৎপাদন। অন্যদিকে, নির্দিষ্ট কোষের প্রকারে (ফাইব্রোব্লাস্ট, মাইক্রোগ্লিয়া, নিউরন এবং তীব্র লিম্ফোব্লাস্টিক লিউকেমিয়া সেল লাইন), পিজিই-প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিস পিজিই দ্বারা মধ্যস্থতা করা হয়, ইপি-রিসেপ্টরগুলির নির্ভরশীল সক্রিয়করণ46-48। আমরা এখানে যে খুঁজে পেয়েছিহাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত এইচকে-2 সেল অ্যাপোপটোসিস ইপি রিসেপ্টরগুলির বিরোধীতা দ্বারাও প্রতিরোধ করা হয়েছিল (চিত্র 2a, উপরের প্যানেল, ডানদিকে)। কিন্তু যেহেতু EP রিসেপ্টরগুলিকে ক্লাসিকভাবে প্লাজমা মেমব্রেন রিসেপ্টর হিসাবে বর্ণনা করা হয়েছে—যাতে তারা iPGE এর জন্য অ্যাক্সেসযোগ্য নয়2-আমরা অনুমান করি যে EP রিসেপ্টরগুলি যেগুলি iPGE-এর অ্যাপোপটোটিক প্রভাবের মধ্যস্থতা করে, হাইপোক্সিক HK-2 কোষে একটি উপসেট অন্তঃকোষীয়ভাবে অবস্থিত (যেমন iEP রিসেপ্টর)।

iPGE2 এর ভূমিকার বিপরীতেহাইপোক্সিয়াHK-2 কোষে প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিস, আমরা দেখেছি যে শুধুমাত্র বহির্মুখী PGE মধ্যস্থতা করেহাইপোক্সিয়া/রিঅক্সিজেনেশন-প্ররোচিত HK-2 কোষের মৃত্যু কারণ এটি PGT (চিত্র 2f) এর ইনহিবিটার দ্বারা প্রতিরোধ করা হয়নি। যদিও পরে সেলুলার আঘাত প্যাথলজিকাল প্রক্রিয়াহাইপোক্সিয়া/রিঅক্সিজেনেশন সম্পূর্ণরূপে বোঝা যায় না, এটা গৃহীত হয় যে কোষের মৃত্যু মূলত অত্যধিক প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতির (ROS) উৎপাদনের মাধ্যমে ঘটে। এটি বিশেষ করে HK-2 সেল 49,50 এর জন্য সত্য। যাইহোক, যদিওহাইপোক্সিয়াএছাড়াও ROS-এর উৎপাদন বাড়াতে পারে, আমাদের সর্বোত্তম জ্ঞান অনুযায়ী এমন কোন প্রমাণ নেই যে ROS প্রাসঙ্গিক ভূমিকা পালন করেহাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত HK-2 কোষের মৃত্যু। এটি পরামর্শ দেয় যে HK-2 কোষে হাইপোক্সিয়া এবং হাইপোক্সিয়া/রিঅক্সিজেনেশনের মারাত্মক প্রভাবগুলি বিভিন্ন প্রক্রিয়া দ্বারা মধ্যস্থতা করা হয়, যা ব্যাখ্যা করতে পারে কেন BG এবং BS এর বিরুদ্ধে সুরক্ষামূলকহাইপোক্সিয়াকিন্তু বিরুদ্ধে নাহাইপোক্সিয়া/রিঅক্সিজেনেশন। ফলস্বরূপ, PGT-এর বাধা হাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত কোষের আঘাতের বিরুদ্ধে PTC-তে থেরাপিউটিক সুবিধা প্রদান করতে পারে কিন্তু এর ক্ষতিকর প্রভাবের বিরুদ্ধে নয়হাইপোক্সিয়া/রিঅক্সিজেনেশন।

HIF-1 -COX-এর উপর নির্ভরশীল আপ-নিয়ন্ত্রণ-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)জন্য একটি সমালোচনামূলক ঘটনা ছিলহাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত HK-2 সেল অ্যাপোপটোসিস (চিত্র 3e)। যাইহোক, আমাদের পর্যবেক্ষণ যে এইচআইএফ ইনহিবিটর YC-1 বর্ধিত অ্যাপোপটোটিক কোষের মৃত্যু(Fig.3f) বিস্ময়কর, যদিও পূর্ববর্তী রিপোর্টগুলি ইতিমধ্যে একই রকম ফলাফল দেখিয়েছে। একটি সম্ভাব্য ব্যাখ্যা হল একটি অনুমান-পরিকল্পনা যেখানে HIF-la শুধুমাত্র COX-এর প্রো-অ্যাপোপ্টোটিক আপ-রেগুলেশনের মধ্যস্থতা করে না-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)কিন্তু প্রতিরক্ষামূলক অণু আপ-নিয়ন্ত্রণ. প্রকৃতপক্ষে, HIF-1-এর বিরুদ্ধে প্রতিরক্ষামূলক অণুর নিয়ন্ত্রিত অভিব্যক্তিহাইপোক্সিয়াযেমন দীর্ঘ নন-কোডিং RNA DARS-AS1' এবং microRNA-2103 বিশেষভাবে HK-2 কোষে পাওয়া গেছে। যাইহোক, যদিও প্রমাণের এই টুকরোগুলি আমাদের অনুমানমূলক দৃশ্যকল্পকে সমর্থন করে, তবে এটি নিশ্চিত করার জন্য নির্দিষ্ট পরীক্ষা-নিরীক্ষা করা উচিত।

রেনাল কোষের প্রতিক্রিয়া তদন্তহাইপোক্সিয়ারেনাল প্যাথলজি সম্পর্কে আমাদের বোঝার উন্নতি করতে পারে। আমরা অধ্যয়ন করেছি, যদিও প্রাথমিকভাবে, প্রো-অ্যাপোপ্টোটিক প্রোটিন ব্যাক্স থেকে অ্যান্টি-অ্যাপোপ্টোটিক প্রোটিন Bcl-2 এক্সপ্রেশন অনুপাত বৃদ্ধির ভূমিকাহাইপোক্সিয়াHK-2 কোষে প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিস। আমাদের ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে PGL-এর বাধার ফলে Bcl-2 এবং Bax(Fig.2e) এর অভিব্যক্তির মধ্যে ভারসাম্য অ্যান্টি-অ্যাপোপ্টোটিক পরিবর্তনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ পরিবর্তন ঘটেনি, যা এই প্রোটিনের ভূমিকাকে সমর্থন করে না iPGE-নির্ভর HK-2 কোষের মৃত্যুহাইপোক্সিয়া. আমাদের সর্বোত্তম জ্ঞান অনুসারে, পিটিসি-তে হাইপোক্সিয়া-প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিসে Bcl{{0}}/Bax অক্ষের অন্তর্নিহিততার উপর শুধুমাত্র দুটি গবেষণা রয়েছে এবং উভয়ই অ্যানোক্সিক" বা প্রায় অ্যানোক্সিক O, ঘনত্ব 5 জড়িত। যখন PTC 0.2 শতাংশ O এর সংস্পর্শে আসে।, Bax এক্সপ্রেশন অপরিবর্তিত ছিল এবং অ্যাপোপটোসিস Bcl-2 এক্সপ্রেশন ডিগ্রী হ্রাসের সাথে যুক্ত ছিল। যাইহোক, Bcl-2 এর অভিব্যক্তি 1 শতাংশ O দ্বারা প্রভাবিত হয়নি, যদিও অ্যাপোপটোসিসের উপস্থিতি, যা আমাদের ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। অতএব, অন্যান্য প্রক্রিয়া যা অগত্যা Bcl-2 বা Bax এক্সপ্রেশনে পরিমাণগত পরিবর্তনগুলিকে জড়িত করে না সেগুলি বিবেচনা করা উচিত: উদাহরণস্বরূপ, iPGE2 দ্বারা সংস্কৃত গ্লিওমা কোষগুলিতে অ্যাপোপটোসিস অন্তর্ভুক্ত করার জন্য শুধুমাত্র প্রয়োজন Bax এর সাথে এর শারীরিক সম্পর্ক, যা Bax-এর মাইটোকন্ড্রিয়া202-এ স্থানান্তরকে ট্রিগার করে। এইভাবে, iPGE যে প্রক্রিয়ার মাধ্যমে HK-2 সেল অ্যাপোপটোসিসে অবদান রাখে তা আরও অধ্যয়নের দাবি রাখে।

আমাদের গ্রুপ খুঁজে পেয়েছে যে একটি COX-2(সাইক্লো-অক্সিজেনেস)-আইপিজিই-তে নির্ভরশীল বৃদ্ধি, সিসপ্ল্যাটিন', অ্যাপোপটোটিক বডি7" এবংহাইপোক্সিয়া(আমাদের বর্তমান ফলাফল)। যেহেতু PGE, svnthesized2 হওয়ার পরে দ্রুত কোষের বাইরে মুক্তি পায়, তাই PGl দ্বারা এর অভ্যন্তরীণ পরিবহন এইচকে-2 কোষে iPGE-প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিসে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। অতএব, যখনই আইপিজিই দ্বারা সেই পিটিসি ক্ষতির মধ্যস্থতা করা হয়, পিজিটি-এর ইনহিবিটরগুলির সাথে চিকিত্সা একটি কার্যকর থেরাপিউটিক পদ্ধতি হতে পারে সম্ভাব্য অ্যাপ্লিকেশনগুলির সাথে যেমন সিসপ্ল্যাটিন-প্ররোচিত পিটিসি ক্ষতি প্রতিরোধ, অ্যাপোপটোটিক দেহের মাধ্যমে টিউবুলার আঘাতের প্রচারে বাধা, বা সীমাবদ্ধতা। এর ক্ষতিকর প্রভাবহাইপোক্সিয়াপিটিসি-তে।