মেলানোজেনেসিস এবং মেলানোসোম পরিবহনে কারকিউমিন ডেরিভেটিভ J147 এর প্রতিরোধমূলক প্রভাব ইআরকে-মধ্যস্থ এমআইটিএফ অবক্ষয় পার্ট 1 সুবিধা দিয়ে

মেলানোজেনেসিস এবং টাইরোসিনেজ কার্যকলাপ দমনের জন্য কারকিউমিন এবং রাসায়নিকভাবে পরিবর্তিত কারকিউমিন (সিএমসি) এর থেরাপিউটিক ব্যবহার স্বীকৃত হয়েছে। J147 উচ্চতর জৈব উপলভ্যতা এবং স্থায়িত্ব সহ কার্কিউমিনের একটি পরিবর্তিত সংস্করণ। যাইহোক, ভিট্রো এবং ভিভোতে পিগমেন্টেশনের উপর J147-এর প্রভাব সম্পর্কে কোনও রিপোর্ট নেই। আমাদের গবেষণায়, আমরা মেলানোসাইটগুলিতে J147 চিকিত্সার হাইপো পিগমেন্টারি প্রভাবগুলি তদন্ত করেছি এবং অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়াটি অন্বেষণ করেছি। বর্তমান গবেষণায় পরামর্শ দেওয়া হয়েছে যে J147 বেসাল এবং -এমএসএইচ-প্ররোচিত মেলানোজেনেসিস উভয়ই দমন করেছে, সেইসাথে মেলানোসাইট ডেনড্রাইট এক্সটেনশন এবং মেলানোসোম পরিবহন হ্রাস করেছে। J147 মূলত এক্সট্রা সেলুলার সিগন্যাল-নিয়ন্ত্রিত প্রোটিন কিনেস (ERK) পাথওয়ে সক্রিয় করে এই ভূমিকা পালন করেছে। একবার সক্রিয় হয়ে গেলে, এটি MITF এর অবক্ষয় ঘটায় এবং টাইরোসিনেজ, TRP-1, TRP-2, Myosin Va, Rab27a, এবং Cdc42 এর অভিব্যক্তিকে আরও নিম্ন-নিয়ন্ত্রিত করে, যা শেষ পর্যন্ত মেলানিন সংশ্লেষণ এবং মেলানোসোম পরিবহনকে বাধা দেয়। অধিকন্তু, J147 এর হাইপো পিগমেন্টারি প্রভাবগুলি ভিভোতে জেব্রাফিশ মডেল এবং বাদামী গিনিপিগগুলিতে UVB-প্ররোচিত হাইপারপিগমেন্টেশন মডেলে প্রদর্শিত হয়েছিল। আমাদের অনুসন্ধানগুলি আরও পরামর্শ দিয়েছে যে J147 ভিট্রো এবং ভিভোতে কোনও সাইটোটক্সিসিটি প্রদর্শন করেনি। একসাথে নেওয়া, এই তথ্যগুলি নিশ্চিত করেছে যে J147 একটি নিরাপদ প্রাকৃতিক ত্বক-সাদা করার এজেন্ট হিসাবে বেশ কার্যকর প্রমাণিত হতে পারে।

সিস্তানচেএছাড়াও ফাংশন আছেকোলাজেন উত্পাদন প্রচার, যা ত্বকের স্থিতিস্থাপকতা এবং দীপ্তি বাড়াতে পারে এবং ক্ষতিগ্রস্ত ত্বকের কোষগুলি মেরামত করতে সাহায্য করতে পারে। সিস্তানচেফেনিলেথানল গ্লাইকোসাইডসএকটি উল্লেখযোগ্য ডাউন-নিয়ন্ত্রক প্রভাব আছেটাইরোসিনেজকার্যকলাপ, এবং টাইরোসিনেজের উপর প্রভাব প্রতিযোগিতামূলক এবং বিপরীতমুখী বাধা হিসাবে দেখানো হয়, যা বিকাশ এবং ব্যবহারের জন্য একটি বৈজ্ঞানিক ভিত্তি প্রদান করতে পারে।সাদা করার উপাদানসিস্তানচে তাই ত্বক ফর্সা করার ক্ষেত্রে সিস্টানচে একটি মুখ্য ভূমিকা রয়েছে। এটা হতে পারেমেলানিন উৎপাদনে বাধা দেয়বিবর্ণতা এবং নিস্তেজতা কমাতে; এবং কোলাজেন উত্পাদন প্রচার করেত্বকের স্থিতিস্থাপকতা উন্নত করুনএবং দীপ্তি। cistanche এই প্রভাব ব্যাপক স্বীকৃতি কারণে, অনেকত্বক সাদা করাপণ্যগুলি ভোক্তাদের চাহিদা মেটাতে Cistanche-এর মতো ভেষজ উপাদানগুলিকে সংযোজন করতে শুরু করেছে, এইভাবে ত্বক সাদা করার পণ্যগুলিতে Cistanche-এর বাণিজ্যিক মূল্য বৃদ্ধি করছে। সংক্ষেপে, ত্বক ফর্সা করার ক্ষেত্রে সিস্টাঞ্চের ভূমিকা অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ। এর অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট প্রভাব এবং কোলাজেন-উত্পাদক প্রভাব বিবর্ণতা এবং নিস্তেজতা হ্রাস করতে পারে, ত্বকের স্থিতিস্থাপকতা এবং দীপ্তি উন্নত করতে পারে এবং এইভাবে একটি ঝকঝকে প্রভাব অর্জন করতে পারে। এছাড়াও, ত্বক সাদা করার পণ্যগুলিতে Cistanche এর ব্যাপক প্রয়োগ দেখায় যে বাণিজ্যিক মূল্যে এর ভূমিকাকে অবমূল্যায়ন করা যায় না।

কীওয়ার্ড: J147, হাইপো পিগমেন্টারি প্রভাব, মেলানোসোম পরিবহন, ERK পথ, MITF অবক্ষয়

সাদা করার জন্য Cistanche Tubulosa-এ ক্লিক করুন

আরও তথ্যের জন্য: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

ভূমিকা

ত্বকের পিগমেন্টেশন মেলানিন সংশ্লেষণ এবং এপিডার্মিস স্তরে বিতরণ উভয়ের উপর নির্ভর করে। মেলানিন প্রধানত মেলানোসাইটের নিউক্লিয়াসের চারপাশে উত্পাদিত হয় এবং মেলানোসোমে সংরক্ষিত হয় (তিয়ান এট আল।, 2021)। পরিপক্ক হওয়ার পরে, মেলানোসোমগুলি মাইক্রোটিউবুলস এবং অ্যাক্টিন ফিলামেন্টের সাথে কোষের ডেনড্রাইট টিপসে এবং অবশেষে প্রতিবেশী কেরাটিনোসাইটগুলিতে বন্টন প্রক্রিয়া শেষ করার জন্য স্থানান্তরিত হয় (Beaumont et al., 2011; Ohbayashi and Fukuda, 2012)। স্বাভাবিক শারীরবৃত্তীয় অবস্থার অধীনে, মেলানিন মানুষের ত্বককে অতিবেগুনী (UV) ক্ষতি, বিষাক্ত রাসায়নিক পদার্থ এবং অন্যান্য পরিবেশগত কারণ থেকে রক্ষা করে (Slominski et al., 2004; Yousaf et al., 2020)। যাইহোক, অত্যধিক উত্পাদন এবং সঞ্চয়ন হাইপারপিগমেন্টেশনকে প্ররোচিত করে এবং পোস্ট-ইনফ্ল্যামেটরি মেলানোডার্মা, মেলাসমা এবং সোলার লেন্টিজিনের মতো ত্বকের ব্যাধিগুলির সাথে যুক্ত, যা একটি উল্লেখযোগ্য মনোসামাজিক বোঝার দিকে পরিচালিত করে (পিল্লাইয়ার এট আল।, 2017)। অতএব, কার্যকর এবং নিরাপদ ত্বক সাদা করার এজেন্ট তৈরি করা প্রয়োজন।

সাম্প্রতিক বছরগুলিতে, মেলানিন কোষ জীববিজ্ঞান একটি বিস্তৃত গবেষণার ক্ষেত্র হয়ে উঠেছে এবং মেলানোজেনেসিস এবং মেলানোসোম পরিবহনে অবদান রাখে এমন বেশ কয়েকটি গুরুত্বপূর্ণ প্রোটিন ব্যাখ্যা করা হয়েছে, যা মেলানিন সংশ্লেষণ প্রতিরোধকদের সনাক্তকরণের পথ প্রদান করে। টাইরোসিনেজ মেলানোজেনেসিসের জন্য একচেটিয়াভাবে প্রয়োজনীয় এবং টাইরোসিনেজ অনুঘটক ক্রিয়াকে বাধা দেওয়া হল মেলানিন উৎপাদন কমানোর সবচেয়ে সাধারণ পদ্ধতি (ডি'মেলো এট আল।, 2016)। আরবুটিন এবং কোজিক অ্যাসিড সহ বেশ কয়েকটি পরিচিত টাইরোসিনেজ ইনহিবিটর ইতিমধ্যেই প্রসাধনী সংযোজন হিসাবে তৈরি করা হয়েছে (ডিং এট আল।, 2020)। KIF5b এবং Rab27A-Melanophilin-Myosin Va কমপ্লেক্স বাহ্যিক মেলানোসোম পরিবহনে অবদান রাখে (Ohbayashi and Fukuda, 2012; Noguchi et al., 2014)। Cdc42 ডেনড্রাইট প্রসারণ নিয়ন্ত্রণ করে, যা মেলানোসোম স্থানান্তরের জন্য অপরিহার্য (Luo, 2000)। উপরের এই প্রোটিনগুলির বাধা মেলানোসোম পরিবহনকে উল্লেখযোগ্যভাবে দমন করতে পারে, যা ত্বক সাদা করার এজেন্টগুলির বিকাশের জন্য একটি গুরুত্বপূর্ণ প্রক্রিয়া। মাইক্রোফথালমিয়া-সম্পর্কিত ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর (MITF) হল মেলানোজেনেসিসের একটি মাস্টার ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর। এছাড়াও, MITF এছাড়াও Rab27a এবং Cdc42 (নোগুচি এট আল।, 2016) এর অভিব্যক্তিকে প্ররোচিত করে মেলানোসোম পরিবহন নিয়ন্ত্রণ করে। একাধিক সিগন্যালিং পথ MITF-এর এক্সপ্রেশন লেভেল নিয়ন্ত্রণ করে পিগমেন্টেশনে অংশগ্রহণ করে। সিএএমপি প্রোটিন কিনেস এ (পিকেএ) সক্রিয়করণ সিএএমপি রেসপন্স এলিমেন্ট বাইন্ডিং প্রোটিন (সিআরইবি) এমআইটিএফ এক্সপ্রেশনের উপর নির্ভরশীল আপগ্র্যুলেশনের মাধ্যমে পিগমেন্টেশনকে উদ্দীপিত করে (রড্রিগেজ এবং সেটলুরি, 2014)। বিপরীতভাবে, এক্সট্রা সেলুলার সিগন্যাল-নিয়ন্ত্রিত প্রোটিন কিনেস (ERK) সক্রিয়করণ MITF অবক্ষয়কে ত্বরান্বিত করে মেলানোজেনেসিসকে বাধা দেয় (Lv et al., 2020a)। টাইরোসিনেজ কার্যকলাপ, মেলানোসোম স্থানান্তর বা মেলানোজেনিক-সম্পর্কিত সংকেত পথকে লক্ষ্য করে এমন অসংখ্য মেলানোজেনিক এজেন্ট তৈরি করা হয়েছে। যাইহোক, কিছু ইনহিবিটার ভিভোতে অধ্যয়ন করেছেন এবং ভাল ফলাফল দেখিয়েছেন (পিল্লাইয়ার এট আল।, 2017)।

কারকিউমিন হল একটি ডায়েরিলহেপ্টেনয়েড যৌগ যা কারকুমা লঙ্গা (জিঙ্গিবেরাসি) এর রাইজোম থেকে বিচ্ছিন্ন এবং খাবারে হলুদ গন্ধ বা রঙ্গক হিসাবে ব্যবহৃত হয় (ঝেং জে. এট আল।, 2018)। অধ্যয়নগুলি এর বিভিন্ন শারীরবৃত্তীয় ফাংশন নির্দেশ করেছে, যার মধ্যে রয়েছে প্রদাহ-বিরোধী, অ্যান্টি-অক্সিডেটিভ, অ্যান্টি-অ্যামাইলয়েড এবং অ্যান্টি-টিউমার কার্যকলাপ (লিউ এট আল।, 2016; ঝেং ওয়াই। এট আল।, 2018)। এগুলি ছাড়াও, কারকিউমিন টাইরোসিনেজ কার্যকলাপকে বাধা দেয় এবং মেলানোসাইটের মেলানোজেনেসিসকে দমন করে (লি এট আল।, 2010; টু এট আল।, 2012)। কিন্তু, কার্কিউমিনের দুর্বল জৈব উপলভ্যতা এর প্রয়োগকে সীমিত করে (কার্তিকেয়ান এট আল।, 2020)। এই সমস্যাটি সমাধানের জন্য, J147 বৃহত্তর স্থিতিশীলতা এবং জৈব উপলভ্যতার সাথে কারকিউমিন ডেরিভেটিভের একটি শক্তিশালী যৌগ হিসাবে তৈরি করা হয়েছে (লি এট আল।, 2020)। J147 এর একটি নিউরোপ্রোটেক্টিভ প্রভাব রয়েছে এবং বর্তমানে আলঝেইমার রোগের জন্য প্রথম পর্যায়ের ক্লিনিকাল ট্রায়ালে রয়েছে। যাইহোক, ভিট্রো এবং ভিভোতে পিগমেন্টেশনের উপর J147-এর প্রভাব সম্পর্কে এখনও কোনও রিপোর্ট নেই।

উপকরণ এবং পদ্ধতিসমূহ

বিকারক

J147 (J302241), -MSH (M118985), এবং মাশরুম থেকে টাইরোসিনেস (T128536) আলাদিন (সাংহাই, চীন) থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। আমরা Myosin Va (sc-365986), KIF5b (sc-133184), GP100 (sc-393094), Cdc42 (sc-8401), Rab27a (sc{{) এর বিরুদ্ধে অ্যান্টিবডি পেয়েছি 13}}), p-JNK (sc-6254), JNK (sc-7345), p-p38 MAPK (sc-166182) এবং p38 MAPK (sc-398546) সান্তা ক্রুজ (CA, USA) থেকে। MITF (97800), p-MEK (2338), MEK (4694), p-ERK (4370), এবং ERK (4695) এর বিরুদ্ধে অ্যান্টিবডিগুলি সেল সিগন্যালিং প্রযুক্তি (MA, USA) থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। টাইরোসিনেস (ab180753), TRP-1 (ab235447), TRP-2 (ab221144), সাইটোকেরাটিন (ab7753), এবং S100 (ab133519) অ্যাবক্যাম (কেমব্রিজ, ইউকে) থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। p38 ইনহিবিটর SB203580 (S1863), ERK ইনহিবিটর PD98059 (S1805), BCA প্রোটিন অ্যাস কিট (P0012), সেল লাইসিস বাফার (P0013), এবং -actin (AF5001) Beyotime (সাংহাই, চীন) থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। RT-qPCR কিট (RR036A) টাকারা বায়োমেডিকেল টেকনোলজি (বেইজিং, চীন) থেকে কেনা হয়েছিল।

সেল সংস্কৃতি

এমটিটি অ্যাস

কোষের কার্যক্ষমতা এমটিটি অ্যাস দ্বারা পরীক্ষা করা হয়েছিল (ইউন এট আল।, 2020)। সংক্ষেপে, কোষগুলিকে 96-কূপ প্লেটে বীজ দেওয়া হয়েছিল এবং 48 ঘণ্টার জন্য J147 (1–8 μM) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। তারপরে, কোষগুলি পিবিএস দিয়ে ধুয়ে MTT সমাধান (20 μL) দিয়ে প্রতিস্থাপিত হয়েছিল। অতিরিক্ত 4 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেশনের পরে, সুপারনাট্যান্ট দ্রবণটি সরানো হয়েছিল এবং প্রতিটি কূপে DMSO (200 μL) যুক্ত করা হয়েছিল। অবশেষে, 570 এনএম এ অপটিক্যাল শোষণ নির্ধারণ করা হয়েছিল।

মেলানিন সামগ্রীর পরিমাপ

2 × 105 কোষ/mL ঘনত্বের কোষগুলিকে 6-ওয়েল কালচার প্লেটে বীজ দেওয়া হয়েছিল। 24 ঘন্টা ইনকিউবেশনের পরে, কোষগুলিকে J147 (1, 2, 4 μM) এর বিভিন্ন ডোজ এবং -MSH (60 nM) উদ্দীপনা সহ বা ছাড়াই সংস্কৃতি করা হয়েছিল। 48 ঘন্টা চিকিত্সার পরে, কোষগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং কোষের প্যালেটের মোট মেলানিন 100 μL NaOH কার্যকরী দ্রবণে (1 mol/L, 10 শতাংশ DMSO) 1 ঘন্টার জন্য 80 ডিগ্রি সেলসিয়াসে দ্রবীভূত হয়েছিল এবং শোষণ 405 এ পরিমাপ করা হয়েছিল। nm (Lv et al., 2015; Lv et al., 2019)।

টাইরোসিনেস অ্যাকটিভিটি অ্যাস

সেলুলার টাইরোসিনেজ কার্যকলাপ পূর্বে বর্ণিত হিসাবে পরীক্ষা করা হয়েছিল (লিয়াও এট আল।, 2017; এলভি এট আল।, 2020a)। সংক্ষেপে, কোষগুলি তিনবার ধোয়ার পরে সেল লাইসিস বাফার দ্বারা লাইস করা হয়েছিল এবং তারপরে লাইসেটগুলিকে সেন্ট্রিফিউজ করে টাইরোসিনেজ অ্যাকটিভিটি অ্যাসের জন্য সুপারনাট্যান্ট পাওয়া গিয়েছিল। 100 μL PBS (0.1M, pH 6.5) কন্টেন্টিং 10 ug প্রোটিনের সাথে 100 μL 0.1 শতাংশ L-DOPA মিশ্রিত। প্লেটটি 1 ঘন্টার জন্য 37 ডিগ্রিতে ইনকিউবেট করা হয়েছিল এবং তারপরে 475 এনএম-এ অপটিক্যাল শোষণ পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।

টাইরোসিনেজ কার্যকলাপের উপর J147 এর সরাসরি প্রভাব পূর্বে বর্ণিত হিসাবে একটি কোষ-মুক্ত সিস্টেম দ্বারা পরীক্ষা করা হয়েছিল (Lv et al., 2020a)। সংক্ষেপে, মাশরুম টাইরোসিনেজ কার্যকলাপ নির্ধারণের জন্য প্রতিক্রিয়া একটি 96-ওয়েল প্লেটে পরিচালিত হয়েছিল এবং প্রতিক্রিয়া মিশ্রণে মাশরুম টাইরোসিনেজ (10 ইউনিট), এল-টাইরোসিন (0.03 শতাংশ, 50 μL), এবং 100 μL পিবিএস রয়েছে। (0.1 M, pH 6.5) J147 এর বিভিন্ন ঘনত্বের সাথে যোগ করা। 10 মিনিটের জন্য 37 ডিগ্রিতে ইনকিউবেশনের পরে, একটি মাইক্রোপ্লেট স্পেকট্রোফোটোমিটার ব্যবহার করে 475 এনএম-এ শোষণ পরিমাপ করা হয়েছিল।

ম্যাসন-ফন্টানা অ্যামোনিয়াকাল সিলভার স্টেনিং

মেলানিন রঙ্গক সনাক্ত করতে, ত্বকের টুকরো এবং মেলানোসাইটগুলি ফর্মালিনের মধ্যে স্থির করা হয়েছিল এবং স্ট্যান্ডার্ড প্রোটোকল অনুসরণ করে দাগ দেওয়া হয়েছিল (গু এট আল।, 2018; এলভি এট আল।, 2020বি)। সংক্ষেপে, স্লাইডগুলিকে ডিওনাইজড জল দিয়ে 3 বার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং তারপরে 12 ঘন্টার জন্য ঘরের তাপমাত্রায় অ্যামোনিয়াকাল সিলভার দ্রবণে সেদ্ধ করা হয়েছিল। ডিওনাইজড জলে ভালভাবে ধুয়ে ফেলার পরে, স্লাইডগুলি হাইপো দ্রবণে 5 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। এরপরে, স্লাইডগুলি আবার ধুয়ে ফেলা হয় এবং আরও 5 মিনিটের জন্য একটি নিরপেক্ষ লাল দাগ দিয়ে পাল্টা দাগ দেওয়া হয়। অবশেষে, পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে ধুয়ে ফেলার পরে, একটি নিকন-ইক্লিপস-টি মাইক্রোস্কোপের নীচে স্লাইডগুলি পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।

মেলানোসোম স্থানান্তরের জন্য ইমিউনোফ্লোরেসেন্স

B16F10 এবং HaCaT কোষগুলির coculture সিস্টেমটি কনফোকাল ডিশে প্রতিষ্ঠিত হয়েছিল, যেমনটি পূর্বে বর্ণিত হয়েছে (লি এট আল।, 2015; এলভি এট আল।, 2020c)। J147 চিকিত্সার পরে, কোষগুলিকে স্ট্যান্ডার্ড প্রোটোকল অনুসারে অ্যান্টি-GP100 এবং অ্যান্টি-সাইটোকেরাটিন দিয়ে ইমিউনোস্টেইন করা হয়েছিল। চিত্রগুলি নিকন-ইক্লিপস-টি মাইক্রোস্কোপ থেকে নেওয়া হয়েছিল।

S-100 এর জন্য ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি

S-100 এর জন্য ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি পূর্বে বর্ণিত হিসাবে সম্পাদিত হয়েছিল (লি এট আল।, 2013; এলভি এট আল।, 2020বি)। একটি সংক্ষিপ্ত বিবরণ নিম্নরূপ ছিল: স্লাইডগুলিকে 5 শতাংশ BSA দিয়ে 25 ডিগ্রি সেলসিয়াসে 1 ঘন্টার জন্য অবরুদ্ধ করা হয়েছিল এবং তারপর রাতারাতি 4 ডিগ্রি সেন্টিগ্রেডে অ্যান্টি-এস-100 প্রাথমিক অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। পরের দিন, স্লাইডগুলি টিবিএসটি দ্রবণ দিয়ে 3 বার ধুয়ে সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। তারপরে, বিভাগগুলি বিকাশের জন্য স্লাইডগুলিকে অ্যামিনোইথাইল কার্বাজোল দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং একটি মাইক্রোস্কোপের নীচে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।

বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন-পিসিআর

সেলুলার মোট আরএনএ TRIzol বিকারক দ্বারা নিষ্কাশিত হয়েছিল এবং বর্ণালী ফোটোমেট্রিকভাবে পরিমাপ করা হয়েছিল। তারপরে, সুপারস্ক্রিপ্ট II রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ সিঙ্গেল-স্ট্র্যান্ডেড সংশ্লেষ করতে ব্যবহৃত হয়েছিলসিডিএনএ উত্পাদন নির্দেশাবলী অনুসরণ করে।অলিগোনিউক্লিওটাইড প্রাইমারগুলি জেনস্ক্রিপ্ট থেকে কেনা হয়েছিল(নানজিং, চীন)। এর ক্রমএমআইটিএফজিন প্রাইমার 5′- AGAGCAGGGCAGAGTGAGTG -3′, 5′-AACTTGATTCCAGGCTGATGATGTC -3′. এর ক্রমGAPDHজিনপ্রাইমার 5টি′- AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′, 5′- টিজিটিAGACCATGTAGTTGAGGTCA -3′. পিসিআর পণ্য ছিল1 শতাংশ অ্যাগারোজ জেলে ইলেক্ট্রোফোরসিস দ্বারা পৃথক করা হয়েছে এবং সনাক্ত করা হয়েছেঅতিবেগুনি রশ্মির অধীনে (লি এট আল।, 2013).

পশ্চিমা শোষক

প্রোটিন (40 ug) SDS-PAGE জেল দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল এবং একটি ইলেক্ট্রোফোরেটিক ট্রান্সফার সিস্টেম (বায়ো-র্যাড) দ্বারা নাইট্রোসেলুলোজ ফিল্টার (এনসি) ঝিল্লিতে স্থানান্তরিত হয়েছিল। 1.5 ঘন্টার জন্য ঘরের তাপমাত্রায় TBST দ্রবণে 3 শতাংশ BSA দিয়ে NC ঝিল্লি ব্লক করা হয়েছিল। তারপরে ঝিল্লিগুলি রাতারাতি 4 ডিগ্রিতে প্রাথমিক অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। পরের দিন, দাগগুলি টিবিএসটি দ্রবণ দিয়ে 3 বার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং তারপরে 1 ঘন্টার জন্য 25 ডিগ্রিতে পারক্সিডেস-কনজুগেটেড সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল এবং বর্ধিত কেমিলুমিনিসেন্স (Lv et al., 2020d) ব্যবহার করে কল্পনা করা হয়েছিল।

জেব্রাফিশ মডেলে মেলানিন সামগ্রী নির্ধারণ

সংক্ষিপ্তভাবে, সিঙ্ক্রোনাইজ করা ভ্রূণগুলিকে পিপেটের মাধ্যমে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং প্রতি কূপে তিন থেকে চারটি ভ্রূণ 200 μL ভ্রূণ মাধ্যমের সাথে 96-ওয়েল প্লেটে)। তারপর, J147 এবং PTU 0.1 শতাংশ DMSO তে দ্রবীভূত করা হয়েছিল এবং 35 থেকে 60 ঘন্টা (25 ঘন্টা এক্সপোজার) পর্যন্ত ভ্রূণ মাধ্যমে যুক্ত হয়েছিল। জেব্রাফিশের মেলানোজেনেসিসের উপর J147 এর প্রভাব স্টেরিওমাইক্রোস্কোপের অধীনে পরিলক্ষিত হয়েছিল (ঝেং জে। এট আল।, 2018)।

ফেনোটাইপ-ভিত্তিক মূল্যায়ন এবং UVB-প্ররোচিত হাইপারপিগমেন্টেশন গিনি পিগ মডেল

8টি বাদামী গিনিপিগ (6 সপ্তাহ, প্রায় 250–300 গ্রাম) ইনস্টিটিউট অফ ল্যাবরেটরি অ্যানিমাল সায়েন্স (বেইজিং, চীন) থেকে কেনা হয়েছিল। এই গিনিপিগগুলিকে একটি 12-ঘন্টা আলো/অন্ধকার চক্রের অধীনে একটি ধ্রুবক তাপমাত্রা এবং আর্দ্রতার ঘরে একা রাখা হয়েছিল। হাইপারপিগমেন্টেশন মডেল স্থাপনের জন্য প্রতিটি প্রাণীর পিছনের পৃথক এলাকা (1 সেমি ব্যাসযুক্ত বৃত্ত) 500 mJ/cm2 UVB (সিগমা SH-4, সাংহাই, চীন) দিনে একবার 1 সপ্তাহের জন্য উন্মুক্ত করা হয়েছিল। তারপরে গাড়িটি (PEG400/EtOH=7:3) এবং J147 (1 শতাংশ) হাইপারপিগমেন্টযুক্ত এলাকায় (প্রতি বৃত্তে 20 μL দ্রবণ) 3 সপ্তাহের জন্য দিনে দুবার দেওয়া হয়েছিল। স্পেকট্রোফটোমিটার (YS3010, 3nh, Shenzhen, China) দ্বারা পরিমাপকৃত L-মান অনুযায়ী ΔL-মান গণনা করে পিগমেন্টেশনের ডিগ্রি মূল্যায়ন করা হয়েছিল, নিম্নরূপ: ΔL=L (প্রতিদিন পরিমাপ করা হয়)-L (0 দিনে) (লি এট আল।, 2013; এলভি এট আল।, 2020বি)। এই গবেষণায় সমস্ত প্রাণী পদ্ধতি চাংঝো বিশ্ববিদ্যালয়ের পশু যত্ন এবং ব্যবহার কমিটি দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল।

পরিসংখ্যান সংক্রান্ত বিশ্লেষণ

ফলাফল

J147 কমেছে মেলানোজেনেসিস এবং B16F10 কোষের মধ্যে ডেনড্রাইটের সংখ্যা

J147 এর গঠন চিত্র 1A এ দেখানো হয়েছে। প্রথমত, J147 B16F10 কোষে সাইটোটক্সিক কিনা তা তদন্ত করার জন্য একটি কোষের কার্যকারিতা পরীক্ষা করা হয়েছিল। চিত্র 1B-তে দেখানো হয়েছে, J147-এর কোনো সাইটোটক্সিক প্রভাব 48 ঘণ্টার পরে 1-8 μM ডোজিং পরিসরে পরিলক্ষিত হয়নি। তারপরে, আমরা মেলানিন সংশ্লেষণে J147 এর প্রভাব পরীক্ষা করেছি। চিত্র 1C-তে দেখানো হয়েছে, J147 বেসাল মেলানিন সংশ্লেষণকে বাধা দেয়। -এমএসএইচ মেলানোসাইটে মেলানোজেনেসিসকে উল্লেখযোগ্যভাবে প্রচার করে। -এমএসএইচ দ্বারা প্ররোচিত মেলানোজেনেসিসের বৃদ্ধি J147 চিকিত্সার পরে বিপরীত হয়েছিল। ধারাবাহিকভাবে, ম্যাসন-ফন্টানা অ্যামোনিয়াকাল সিলভার স্টেনিং দেখায় যে J147 উল্লেখযোগ্যভাবে B16F10 কোষে মেলানিন সামগ্রী -MSH সহ বা ছাড়া কমিয়েছে (চিত্র 1D)। এছাড়াও, ডেনড্রাইটের সংখ্যা এবং দৈর্ঘ্য এবং ডেনড্রাইটে মেলানিনের ঘনত্বও যখন চিকিত্সা না করা কোষগুলির সাথে তুলনা করা হয় (চিত্র 1D) হ্রাস পেয়েছিল। ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে J147 সাইটোটক্সিক প্রভাব ছাড়াই মেলানোজেনেসিস এবং ডেনড্রাইট গঠন হ্রাস করেছে।

J147 সেলুলার টাইরোসিনেজ ক্রিয়াকলাপ এবং টাইরোসিনেস, টিআরপি-1, টিআরপি-2 এর প্রকাশকে বাধা দেয়

প্রোটিনের টাইরোসিনেজ পরিবার (টাইরোসিনেজ, টিআরপি-1, এবং টিআরপি-2) মেলানোজেনেসিসে অংশগ্রহণ করে। এর মধ্যে, টাইরোসিনেসগুলি হল মূল এনজাইম যা মেলানিন বায়োসিন্থেটিক পথ নিয়ন্ত্রণ করে (ডি'মেলো এট আল।, 2016)। J147 টাইরোসিনেজ কার্যকলাপকে প্রভাবিত করে কিনা তা নির্ধারণ করতে, আমরা প্রথমে সেলুলার টাইরোসিনেজ কার্যকলাপে J147 এর প্রভাব নির্ধারণ করতে L-DOPA অক্সিডেশন পদ্ধতি ব্যবহার করেছি। J147 (1–4 μM) B16F10 কোষে (চিত্র 2A) ডোজ-নির্ভর পদ্ধতিতে সেলুলার টাইরোসিনেজ কার্যকলাপের উপর গভীর প্রতিরোধমূলক প্রভাব প্রয়োগ করতে দেখানো হয়েছিল। এরপরে, টাইরোসিনেজ কার্যকলাপের উপর J147 এর সরাসরি প্রভাব নির্ধারণের জন্য একটি মাশরুম টাইরোসিনেজ অ্যাকটিভিটি অ্যাস করা হয়েছিল। চিত্র 2B-তে দেখানো হয়েছে, কোনও বাধামূলক প্রভাব পরিলক্ষিত হয়নি, যা ইঙ্গিত করে যে J147 মাশরুম টাইরোসিনেজ (চিত্র 2B) এর এনজাইমেটিক ক্রিয়াকলাপকে প্রভাবিত করেনি। আমরা জানি, মেলানোজেনেসিস সেই টাইরোসিনেসের কার্যকলাপ এবং পরিমাণ দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়। J147-এর অ্যান্টি-মেলানোজেনিক প্রভাবগুলি টাইরোসিনেজের অভিব্যক্তির সাথে সম্পর্কিত কিনা তা তদন্ত করতে, পশ্চিমী দাগ বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। চিত্র 2C-তে দেখানো হয়েছে, টাইরোসিনেজ এক্সপ্রেশনের মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে J147 চিকিত্সার পরে -MSH-এর সাথে বা ছাড়া, এবং একই ফলাফল TRP-1 এবং TRP-2 অভিব্যক্তিতে পরিলক্ষিত হয়েছে। এই পর্যবেক্ষণগুলি নির্দেশ করে যে J147 টাইরোসিনেজ, টিআরপি-1, এবং টিআরপি-2 এর প্রকাশের মাত্রা হ্রাস করে সেলুলার টাইরোসিনেজ কার্যকলাপ এবং মেলানোজেনেসিসকে বাধা দেয়।

J147 Myosin Va, Rab27a এবং Cdc42 এর এক্সপ্রেশন নিয়ন্ত্রণ করে মেলানোসোম পরিবহনকে বাধা দেয়

মানুষের ত্বকের পিগমেন্টেশন মেলানিন সংশ্লেষণের পাশাপাশি মেলানিনের বিতরণ দ্বারা নির্ধারিত হয়। স্তন্যপায়ী মেলানোসাইটে, মেলানিন প্রধানত কোষের শরীরে তৈরি হয় এবংঅ্যাক্টিন ফিলামেন্ট বরাবর স্থানান্তরিত হয়এবং মাইক্রোটিউবুলস থেকে ডেনড্রাইট, এবং অবশেষেপ্রতিবেশী কেরাটিনোসাইট শেষ করতেবণ্টনপ্রক্রিয়া (ওহবায়াশি এবং ফুকুদা, 2012) যেমন দেখানো হয়েছেচিত্র 1D, J147 উল্লেখযোগ্যভাবে ডেনড্রাইট গঠন হ্রাস করেছে।উপরন্তু, ডেনড্রাইটে মেলানিনের ঘনত্বও ছিলপেরিনিউক্লিয়ারে মেলানিন রঙ্গক একত্রিত হওয়ার কারণে হ্রাস পেয়েছেঅঞ্চলগুলি এরপরে, আমরা B16F10 এবং HaCaT কোষে সহ-সংস্কৃতি করেছিJ147 প্রভাবিত করে কিনা তা তদন্ত করুনমেলানোসোম স্থানান্তরকনফোকাল মাইক্রোস্কোপি দ্বারা কেরাটিনোসাইট। এর বিতরণমেলানিন সহ-সংস্কৃতিতে HaCaT কোষে দেখা গেছেমডেল (চিত্র 3A) এর বিপরীতে ছিল সহ-সংস্কৃতির মডেল48 ঘন্টার জন্য J147 দিয়ে চিকিত্সা করা হয়, মেলানোসোম দানাদার সংকেত ইনHaCaT কোষ উল্লেখযোগ্যভাবে ছিলহ্রাস (চিত্র 3A).

J147 দ্বারা মেলানোসোম স্থানান্তরের বাধা প্রভাবের অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়াটিকে আরও স্পষ্ট করার জন্য, আমরা মেলানোসোম পরিবহনের সাথে জড়িত বেশ কয়েকটি গুরুত্বপূর্ণ কারণ পরীক্ষা করেছি। KIF5b মাইক্রোটিউবুলস বরাবর বাহ্যিক মেলানোসোম পরিবহনের মধ্যস্থতা করে, এবং Rab27a মেলানোফিলিন-মায়োসিন ভা কমপ্লেক্স মেলানোসাইটের অ্যাক্টিন ফিলামেন্টের সাথে মেলানোসোম পরিবহনে অবদান রাখে (রিনার এট আল।, 2020)। এছাড়াও, Cdc42 মেলানোসাইটগুলিতে ডেনড্রাইট গঠনকে উদ্দীপিত করে, যা মেলানোসোম পরিবহনে একটি অপরিহার্য ভূমিকা পালন করে। চিত্র 3B-তে দেখানো হয়েছে, Cdc42, Myosin Va, এবং Rab27a-এর অভিব্যক্তি, কিন্তু KIF5b নয়, J147 চিকিত্সার পরে -MSH সহ বা ছাড়া অবস্থায় উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে। আমাদের অনুসন্ধানগুলি ইঙ্গিত করে যে J147 মায়োসিন ভা, রাব27এ এবং সিডিসি 42 এর অভিব্যক্তি হ্রাস করে মেলানোসোম পরিবহনকে বাধা দেয়।

J147 ত্বরান্বিত MITF অবক্ষয়

MITF হল মেলানোজেনেসিসের অন্যতম প্রধান নিয়ামক এবং এটি টাইরোসিনেজ, TRP-1, TRP-2, Cdc42, এবং Rab27a (Noguchi et al., 2016; Kim et al., 2019) এর জিন ট্রান্সক্রিপশন নিয়ন্ত্রণ করে ) আমরা প্রথমে MITF ট্রান্সক্রিপ্টগুলিতে J147 এর প্রভাব পরীক্ষা করেছি। চিত্র 4A-তে দেখানো হয়েছে, -MSH উল্লেখযোগ্যভাবে MITF ট্রান্সক্রিপশন বৃদ্ধি করেছে, তবে J147 চিকিত্সার পরে কোনো পরিবর্তন দেখা যায়নি, যা ইঙ্গিত করে যে J147 MITF অভিব্যক্তিকে হ্রাস করে না। এর পরে, আমরা পরীক্ষা করেছি যে J147 MITF-এর অনুবাদকে প্রভাবিত করে কিনা। চিত্র 4B-তে যেমন দেখানো হয়েছে, -MSH চিকিত্সার পরে, MITF প্রোটিনের মাত্রা বৃদ্ধি পায়, 4 ঘন্টায় শীর্ষে, এবং 8 ঘন্টা (চিত্র 4B) এ হ্রাস পেতে শুরু করে। ভিন্নভাবে, J147 চিকিত্সার পর MITF-এর প্রোটিনের মাত্রা 4 ঘণ্টায় কমেনি, কিন্তু 8 ঘণ্টায় MITF প্রোটিনের মাত্রা দ্রুত অজ্ঞাত মাত্রায় হ্রাস পেয়েছে, যা নির্দেশ করে যে J147 MITF-এর অনুবাদকে প্রভাবিত করে না কিন্তু উল্লেখযোগ্যভাবে MITF প্রোটিনের অবক্ষয়কে ত্বরান্বিত করে।

MEK/ERK সিগন্যালিং পাথওয়ের মাধ্যমে J147 দমন করা মেলানোজেনেসিস

মাইটোজেন-অ্যাক্টিভেটেড প্রোটিন কাইনেস (MAPK) সিগন্যালিং পাথওয়ে, এক্সট্রা সেলুলার সিগন্যাল-নিয়ন্ত্রিত প্রোটিন কিনেস (ERK), p38, এবং c-jun N-টার্মিনাল kinase (JNK), পিগমেন্টেশনে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে (লি এট আল।, 2013)। ERK ফসফোরিলেশন MITF-এর অবক্ষয়কে সহজতর করে এবং অবশেষে মেলানোজেনিক উদ্দীপনাকে বিলুপ্ত করে, যা একটি প্রধান নেতিবাচক প্রতিক্রিয়া প্রক্রিয়ার প্রতিনিধিত্ব করে (Kwon et al., 2017)। যাইহোক, p38 এবং JNK পাথওয়ের কাজটি বিতর্কিত রয়ে গেছে। অতএব, আমরা MAPK সিগন্যালিং পাথওয়েতে J147 এর প্রভাব পরীক্ষা করেছি। চিত্র 5A তে দেখানো হয়েছে, J147 MEK/ERK এবং p38 সক্রিয় করেছে, যেখানে JNK সংকেত পথের ফসফোরিলেশনে কোনও প্রভাব পাওয়া যায়নি।

আরও তথ্যের জন্য: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501