অংশ Ⅰ: অটোসোমাল প্রভাবশালী পলিসিস্টিক কিডনি রোগে আক্রান্ত রোগীদের এরিথ্রয়েড প্রোজেনিটর কোষ থেকে কিডনি অর্গানয়েড তৈরি হয়

আরো তথ্যের জন্য:ali.ma@wecistanche.com

রবার্টা ফ্যাসিওলিও, ফার্নান্দো হেনরিক লোজুডিস, এবং অন্যান্য।

ভূমিকা

অটোসোমাল প্রভাবশালী পলিসিস্টিককিডনীর রোগ(ADPKD) হল বিশ্বব্যাপী দীর্ঘস্থায়ী কিডনি রোগের (CKD) সবচেয়ে ঘন ঘন জিনগত কারণ, এবং এটি সবচেয়ে প্রচলিত উত্তরাধিকারসূত্রে পাওয়া মনোজেনিক ব্যাধিগুলির মধ্যে একটি, যা আনুমানিক 1 জন জনসংখ্যাকে প্রভাবিত করে:400-1000 [1].ADPKD (অটোসোমাল ডমিন্যান্ট) পলিসিস্টিককিডনীর রোগ) PKD1 (টাইপ 1 পলিসিস্টিক কিডনি রোগ) এবং PKD2 (টাইপ 2 পলিসিস্টিক কিডনি রোগ) জিনের মিউটেশনের কারণে ঘটে, যথাক্রমে পলিসিস্টিন-1(PC1) এবং পলিসিস্টিন-2 (PC2) এর জন্য কোডিং, সিলিয়া পরিবর্তন এবং সিস্ট গঠনের ফলে। উভয় প্রোটিনই অসংখ্য আণবিক পথের পাশাপাশি টিস্যু মরফোজেনেসিস এবং ফাংশন সংশোধন করে। যাইহোক, সিস্টোজেনেসিসের অন্তর্নিহিত সঠিক আণবিক প্রক্রিয়াগুলি অস্পষ্ট থেকে যায়। এটি ভালভাবে গৃহীত হয়েছে যে সিস্টোজেনেসিস [2,3] এর জন্য স্বাভাবিক অ্যালিলে সোমাটিক মিউটেশন (দ্বিতীয়-হিট) দ্বারা অনুসরণ করা একটি জীবাণু মিউটেশন প্রয়োজনীয়। তদুপরি, অর্থলোগাস মাউস মডেলের ফলাফলের উপর ভিত্তি করে, এটি প্রমাণিত হয়েছে যে পরিপক্ক কিডনিতে দ্রুত এবং গুরুতর সিস্ট বৃদ্ধির জন্য একটি অতিরিক্ত রেনাল অপমান (তৃতীয়-হিট) প্রয়োজন [4,5]। এটা মনে হয় যে মানুষের মধ্যে, বেশিরভাগ দ্বিতীয় আঘাত কিডনি বিকাশের সময় ঘটে, যা এমনকি জরায়ুতেও সিস্টিক গঠন এবং বৃদ্ধির দিকে পরিচালিত করে। অতএব, PKD1 (টাইপ 1 পলিসিস্টিক কিডনি রোগ) এবং PKD2 (টাইপ 2 পলিসিস্টিক কিডনি রোগ) মিউটেশনের ফলে কিডনি রোগের তীব্রতা এবং অগ্রগতির হার জিনগুলির নিষ্ক্রিয়তার সময়, কিডনি বিকাশের সময় সহ বিভিন্ন কারণ দ্বারা প্রভাবিত হতে পারে। পর্যায়, পরিবেশগত প্রভাব, সহগামী রেনাল ক্ষতের উপস্থিতি এবং জেনেটিক মিউটেশনের বৈচিত্র্য।

যদিও ADPKD (অটোসোমাল ডমিনেন্ট পলিসিস্টিককিডনীর রোগ) অর্থোলোগাস এবং ননরথোলগাস মাউস মডেল নিযুক্ত করা গবেষণা থেকে সংগৃহীত, সিস্টোজেনেসিসের মানব সেলুলার মডেলের উপর ফোকাস করা মাত্র কয়েকটি অধ্যয়ন পাওয়া যায় [6]। 2007 সালে, তাকাহাশি এট আল।[জেড সফলভাবে ভ্রূণের বৈশিষ্ট্যযুক্ত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম কোষে সোম্যাটিক কোষগুলিকে পুনঃপ্রোগ্রাম করেছে, তাদের নামকরণ করেছে "প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল" (iPSCs)। তারপর থেকে, অনেক সোম্যাটিক কোষের উত্সগুলি প্রাণী বা মানুষের টিস্যু (hiPSCs)[Z] থেকে iPSCs (প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) তে পুনঃপ্রোগ্রাম করা হয়েছে, প্রাপ্তবয়স্ক ফাইব্রোব্লাস্টগুলি পরবর্তীটির প্রধান উত্স প্রতিনিধিত্ব করে। 2013 সালে, ফ্রিডম্যান এট আল। ADPKD (অটোসোমাল ডমিনেন্ট পলিসিস্টিক) এর ফাইব্রোব্লাস্ট থেকে প্ররোচিত হাইপিএসসি (প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল)কিডনীর রোগ) রোগীদের এবং পলিসিস্টিন-2-এর সিলিরি এক্সপ্রেশন হ্রাস পেয়েছে, পলিসিস্টিক ডিজিজ (PKD) প্যাথোফিজিওলজি তদন্তের জন্য এই ধরনের কোষের ব্যবহারকে সমর্থন করে। অতি সম্প্রতি, চেন এট আল 2016 সালে রিপোর্ট করেছেন যে তারা এরিথ্রয়েড প্রোজেনিটর কোষ থেকে হাইপিএস কোষ পেয়েছেন [9]।

গত কয়েক বছরে, iPSCs (ইনডিউসড প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) [Z,10-12] থেকে 3-মাত্রিক অর্গানয়েড তৈরিতে উল্লেখযোগ্য অগ্রগতি হয়েছে। প্রাথমিককিডনিটিউবুলার এপিথেলিয়াল অর্গানয়েডগুলি কিডনি টিস্যু এবং সেইসাথে প্রস্রাব থেকে প্রাপ্ত হতে পারে এবং এই অর্গানয়েডগুলি ব্যক্তিগতকৃত রোগের মডেলিংয়ের জন্য একটি গুরুত্বপূর্ণ হাতিয়ার, যেমনটি শুটজেনস এট আল দ্বারা দেখানো হয়েছে। [১৩] পরবর্তী গবেষণায়, ফ্রিডম্যান এট আল [১৪] উৎপন্ন করতে সক্ষম হয়েছিলকিডনিবাণিজ্যিকভাবে উপলব্ধ hiPS সেল লাইন থেকে প্রাপ্ত organoids, মেটা-নেফ্রিক ভরে উপস্থিত কোষের প্রকারগুলি তৈরি করার জন্য একটি প্রোটোকল প্রতিষ্ঠা করে যা নেফ্রনের সমস্ত কাঠামোর জন্ম দেয়। তারপরে, PKD1 (টাইপ 1 পলিসিস্টিক) ছিটকে দিয়েকিডনিরোগ) বা PKD2 (টাইপ 2 পলিসিস্টিক কিডনি রোগ) জিন, এই তদন্তকারীরা সিস্ট গঠন পর্যবেক্ষণ করেছেনকিডনিটিউবুলস এই সমস্ত উন্নত এবং উদ্ভাবনী প্রযুক্তির পরিপ্রেক্ষিতে, আমরা ADPKD (অটোসোমাল ডমিনেন্ট পলিসিস্টিক) এর সঞ্চালনকারী এরিথ্রয়েড প্রোজেনিটর কোষ থেকে iPSCs (প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) প্রাপ্ত করার লক্ষ্য রেখেছিলামকিডনীর রোগ)রোগীদের এবং অর্গানোজেনেসিসের সাথে জড়িত পদক্ষেপগুলি পুনঃনির্ধারণ করতে ভিট্রোতে কিডনি অর্গানয়েডের বিকাশ পরীক্ষা করে, প্রাথমিক সিস্টোজেনেসিসের সাথে সম্পর্কিত কিছু প্যাথোফিজিওলজিকাল ইভেন্টগুলিকে জাগানোর চেষ্টা করে।

কিডনির জন্য cistanche এর পার্শ্বপ্রতিক্রিয়া এবং উপকারিতা জানতে ক্লিক করুন

পদ্ধতি রোগী নির্বাচন

ADPKD (অটোসোমাল ডমিনেন্ট পলিসিস্টিক কিডনি ডিজিজ) (PT1:66 বছর বয়সী, eGFR 43.8 mL/min per 1.73 m2 এবং PT2:56 বছর বয়সী, eGFR0/6 বছর বয়সী, eGFR 43.8 mL/min) ক্লিনিক্যালি নির্ণয় করা দুইজন সম্পর্কহীন মহিলা রোগীর (PT1 এবং PT2) থেকে রক্তের নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল। মিনিট প্রতি 1.73 m2), পলিসিস্টিক কিডনি রোগে অনুসরণ করা হয়। ফেডারেল ইউনিভার্সিটি অফ সাও পাওলো (UNIFESP) এর নেফ্রোলজি বিভাগের বহির্বিভাগের রোগীর ক্লিনিক এবং একজন সুস্থ মহিলার কাছ থেকে অন্য একটি নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল, যা কৌশলটিকে স্থিতিশীল এবং স্বাভাবিক করার জন্য একটি নিয়ন্ত্রণ হিসাবে কাজ করেছিল। ADPKD (অটোসোমাল ডমিনেন্ট পলিসিস্টিক কিডনি ডিজিজ) রোগ নির্ণয়টি পেই এট আল-এর আল্ট্রাসনোগ্রাফিক ডায়াগনস্টিক মানদণ্ড অনুসারে ইতিবাচক পারিবারিক ইতিহাস এবং রেনাল সিস্টের উপস্থিতির উপর ভিত্তি করে করা হয়েছিল।[15]। উভয় রোগীরই সিস্টিক কিডনি এবং লিভার ছিল (চৌম্বকীয় অনুরণন চিত্রগুলি S1B চিত্রে উপস্থাপন করা হয়েছে)। সমীক্ষাটি বিশ্ববিদ্যালয়ের নীতিশাস্ত্র উপদেষ্টা কমিটি (CEP UNIFESP, "Comite de Etica em Pesquisa da Universidade Federal de Sao Paulo", Nr.1199) দ্বারা পর্যালোচনা এবং অনুমোদিত হয়েছে৷ অধ্যয়নের উদ্দেশ্য ব্যাখ্যা করার জন্য একটি সাক্ষাত্কারের পরে, রোগী এবং সুস্থ নিয়ন্ত্রণ উভয়ই অবহিত সম্মতি ফর্মে স্বাক্ষর করেছেন।

পুরো রক্ত ​​থেকে বিচ্ছিন্ন এরিথ্রয়েড প্রোজেনিটর কোষের প্রসারণ রক্তের নমুনা ঘরের তাপমাত্রায় EDTA (একটি অ্যান্টিকোয়াগুল্যান্ট হিসাবে) ধারণকারী একটি ভ্যাকুটেইনার টিউবে সংগ্রহ করা হয়েছিল। এরিথ্রয়েড প্রোজেনিটার (ইপি) কোষগুলিকে তারপরে একটি রোসেটসেপ পদ্ধতির (15216; স্টেম সেল টেকনোলজিস) মাধ্যমে আলাদা করা হয়েছিল, যা পছন্দসই EP জনসংখ্যা বজায় রেখে পরিপক্ক RBC এবং প্লেটলেটগুলির মতো অবাঞ্ছিত কোষগুলিকে সরিয়ে দেয়। পুরো রক্তে EP-এর কম ঘনত্বের কারণে, কোষগুলি সাইটোকাইনস এবং সম্পূরক (এক্স-ভিভো মিডিয়াম, লোনজা) সমন্বিত একটি নির্দিষ্ট কালচার মিডিয়ামে প্রসারিত এবং সংস্কৃত করা হয়েছিল। ট্রান্সফারিন রিসেপ্টর (CD71) ব্যবহার করে ফ্লো সাইটোমেট্রির মাধ্যমে ইপি কোষগুলি চিহ্নিত করা হয়েছিল। GFP (S2 Fig) দিয়ে লেবেলযুক্ত মার্কার হিসাবে গ্লাইকোফোরিন A(Gly A)।

রিপ্রোগ্রামিং এরিথ্রয়েড প্রোজেনিটার কোষ

প্রসারিত ইপি কোষগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং একটি Epi5 এপিসোমাল iPSC (ইনডিউসড প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) রিপ্রোগ্রাম-মিং কিট (থার্মো ফিশার) ব্যবহার করে নিউক্লিওফেক্ট করা হয়েছিল যাতে পাঁচটি রিপ্রোগ্রামিং ফ্যাক্টরের একটি অপ্টিমাইজড মিশ্রণ রয়েছে (অক্টোবর-4, Sox2, Lin28, L-My, এবং Klf4)। লোনজা নিউক্লিও ফ্যাক্টর কিট থেকে এপিসোমাল ভেক্টর (ভাইরাস-মুক্ত, অসংহত) দিয়ে ট্রান্সফেকশন (ইলেক্ট্রোপোরেশন) করা হয়েছিল। ট্রান্সফেকশনের পর, কোষগুলিকে রিপ্রোগ্রামিং (স্টেম সেল টেকনোলজিস) এর জন্য ReproTeSR-নির্দিষ্ট কালচার মিডিয়ামে প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল স্ট্যান্ডার্ড সেল কালচার অবস্থার অধীনে (37C, 95 শতাংশ CO, এবং 5 শতাংশ O,)।

ক্যারিওটাইপিং

রিপ্রোগ্রামিং প্রক্রিয়াটি ক্রোমোসোমাল অখণ্ডতা রক্ষা করেছে কিনা তা যাচাই করার জন্য, ইউনিফেসপি-এর জেনেটিক বিভাগে ক্যারিওটাইপ বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। কোষগুলিকে 5 মিলি আইপিএসে 100 উল অফ কোলচিসিন (0.08ug/ml) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। সেল কালচার মাধ্যম কোষ চক্র গ্রেপ্তারে প্ররোচিত করার জন্য, যা পরমাণু ফোলাভাব প্ররোচিত করার জন্য একটি 0.075 M হাইপোটোনিক KCl দ্রবণ যোগ করার দ্বারা অনুসরণ করা হয়েছিল; কোষগুলি তখন মিথানল এবং অ্যাসিটিক অ্যাসিডের মিশ্রণ (3:1) দিয়ে স্থির করা হয়েছিল। মেটাফেজ ক্রোমোজোম সংগ্রহ করা হয়েছিল, এবং রাইট স্টেনিং জি-ব্যান্ডের সাইটোজেনিক বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল (S3 চিত্র)।

আইপিএসসি (প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) কলোনি চরিত্রায়ন

ইপি কোষগুলিকে এপিসোমাল ভেক্টর দ্বারা পুনঃপ্রোগ্রাম করা হয়েছিল যা সাধারণ আইপিএসসি (প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) উপনিবেশ তৈরি করেছিল এবং একটি সাধারণ ক্যারিওটাইপ (এস 3 চিত্র) উপস্থাপন করেছিল। আইপিএসসি (ইনডিউসড প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) কলোনির বৈশিষ্ট্যগুলিকে H9 লাইন সেল (hESC, হিউম্যান এমব্রায়োনিক স্টেম সেল, WA09, উইসেল রিসার্চ ইনস্টিটিউট, USA থেকে উপলব্ধ) থেকে প্রাপ্ত একটি প্রতিষ্ঠিত নিয়ন্ত্রণের সাথে তুলনা করা হয়েছিল ( চিত্র 1B)। যেহেতু iPSCs (প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) সাধারণ রূপবিদ্যা উপস্থাপন করে, তাই প্লুরিপোটেন্সি মার্কারগুলি ইমিউনোফ্লোরোসেন্স দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল। ঘরের তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য 4 শতাংশ প্যারাফর্মালডিহাইড দিয়ে কোষগুলি স্থির করা হয়েছিল। ঠিক করার পরে, নমুনাগুলি পিবিএস দিয়ে তিনবার ধৌত করা হয়েছিল, 5 শতাংশ পিএসএ এবং 0.3 শতাংশ ট্রাইটন-এক্স-100/ডিপিবিএসে ব্লক করা হয়েছিল, এবং প্রাথমিক অ্যান্টিবডি (সেল সিগন্যালিং, মা, ইইউএ), যথা, OCT4(1) দিয়ে রাতারাতি ইনকিউব করা হয়েছিল :400 dilution) pluripotency পরীক্ষা হিসাবে। পরের দিন, একটি নতুন স্লাইড প্রস্তুত করা হয়, পিবিএস-এ ধুয়ে ফেলা হয় এবং একটি আলেক্সা ফ্লুর সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (1:200 ডাইলিউশন, সেল সিগন্যালিং), এবং DAPI (1:1000, ইনভিট্রোজেন, এমএ, ইউএসএ) নিউক্লিয়ার জন্য যোগ করা হয়। সনাক্তকরণ

চিত্র 1. iPSC-এর প্রজন্ম এবং বৈশিষ্ট্য(প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল). iPSC গুলি একটি স্বাস্থ্যকর নিয়ন্ত্রণ (HC) এবং দুটি ভিন্ন ADPKD রোগী (PT1 এবং PT2) থেকে প্রসারিত এরিথ্রয়েড প্রজেনিটার (EP) কোষ থেকে পুনরায় প্রোগ্রাম করা হয়েছিল।

A. কিডনি অর্গানয়েডের পরিকল্পিত ধাপে ধাপে প্রজন্ম B. iPSC-এর সাদৃশ্য (a. বাণিজ্যিক H9 ভ্রূণ কোষ থেকে iPSC-এর সাধারণ চিত্র। b. স্বাস্থ্যকর নিয়ন্ত্রণ থেকে পূর্বপুরুষ এরিথ্রয়েড কোষ থেকে iPSC)

C. iPSC উপনিবেশগুলির রূপবিদ্যা D. একটি EVOS fl উল্টানো ডিজিটাল ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের অধীনে পর্যবেক্ষণ করা iPSC প্লুরিপোটেন্সির বৈশিষ্ট্য।

OCT4 অ্যান্টিবডি লেবেলিং HC, PT1 এবং PT2 উপনিবেশগুলির প্লুরিপোটেন্সি প্রকৃতিকে চিহ্নিত করতে প্লুরিপোটেন্সি চিহ্নিতকারী হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।

কোষের নিউক্লিয়াসকে DAPI দিয়ে লেবেল করা হয়েছে (চিত্র 1B এর জন্য স্কেল বার: 200 μm; চিত্র 1C এর জন্য স্কেল বার: 1000 μm; স্কেল বার HC / PT2 চিত্র 1D: 1000 μm; চিত্র 1D এর জন্য স্কেল বার PT1: 200μm)।

তিনটি জীবাণু স্তরের মধ্যে পার্থক্য করার জন্য iPSCs (প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) এর ক্ষমতা

iPSCs(ইনডিউসড প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) mTeSR1 কালচার মিডিয়ামে (স্টেম সেল টেকনোলজিস, বিসি, কানাডা) ম্যাট্রিজেল (1:10,বিডি বায়োসায়েন্সেস,এনওয়াই,ইউএ) দিয়ে প্রলিপ্ত 6-ওয়েল প্লেটে জন্মানো হয়েছিল। আইপিএসসি (প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) পার্থক্য করা থেকে প্রতিরোধ করার জন্য, উপনিবেশগুলিকে একটি মাইক্রোস্কোপের নীচে একটি পাইপেট টিপ দিয়ে যান্ত্রিক বিভক্তকরণের মাধ্যমে ম্যানুয়ালি পাস করা হয়েছিল, অথবা তারা জেন্টল সেল (লাইফ টেকনোলজিস) (S4 চিত্র) ব্যবহার করে এনজাইমেটিক হজম দ্বারা বিচ্ছিন্ন হয়েছিল। এই পদ্ধতিগুলি ব্যবহার করে, iPSCs (প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) 22টি সিরিয়াল প্যাস-সেজেসের জন্য রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল যাতে কোষগুলি পুনঃপ্রোগ্রামিং ফ্যাক্টরগুলিকে সঠিকভাবে অন্তর্ভুক্ত করেছে। iPSCs (প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) তারপরে একটি STEMdiff ট্রিলিনেজ ডিফারেনটিয়েশন কিট (স্টেম সেল টেকনোলজিস) ব্যবহার করে তিনটি জীবাণু স্তরের মধ্যে পার্থক্য করার জন্য উদ্দীপিত হয়েছিল। পাঁচ দিন পর, মেসোডার্ম এবং এন্ডোডার্মের লাইন-বয়স-নির্দিষ্ট মার্কারগুলির বিশ্লেষণের জন্য কোষগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং STEMdiff ট্রিলিনেজ ডিফারেনটিয়েশন প্রোটোকল (S5 Fig) অনুসারে সাত দিন পরে এক্টোডার্মের জন্য বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

qRT-PCR দ্বারা তিনটি জীবাণু লাইনের আণবিক বৈশিষ্ট্য

তিনটি জীবাণু স্তরের সংস্কৃতি থেকে মোট আরএনএ একটি জিই আরএনএ স্পিন মিনি কিট (জিই হেলথকেয়ার, ইউএসএ) ব্যবহার করে বের করা হয়েছিল এবং তারপর নির্মাতার নির্দেশ অনুসারে একটি উচ্চ ক্ষমতার বিপরীত ট্রান্সক্রিপশন কিট (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেম, ইউএসএ) ব্যবহার করে সিডিএনএতে রূপান্তরিত করা হয়েছিল। পরিমাণগত রিয়েল-টাইম পিসিআর (জিআরটি-পিসিআর) একটি SYBR গ্রিন পিসিআর কিট (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেম, ইউএসএ) ব্যবহার করে প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে পরিচালিত হয়েছিল। mRNA এক্সপ্রেশন স্তরগুলি 2^Ct পদ্ধতি ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল। হাইড্রোক্সিমিথাইলবিলেন সিন্থেস (এইচএমবিএস) এবং গ্লিসারালডিহাইড 3-ফসফেট ডিহাইড্রোজেনেস (জিএপিডিএইচ) অভ্যন্তরীণ নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল, এবং ওসিটি 4-এর অভিব্যক্তিটি পরিমাণগত নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। SOX17 এর অভিব্যক্তিটি এন্ডোডার্মের মধ্যে পার্থক্য সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল, CXCR4 ব্যবহার করা হয়েছিল মেসোডার্মের মধ্যে পার্থক্য সনাক্ত করতে এবং PAX6 ব্যবহার করা হয়েছিল ইক্টোডার্মে পার্থক্য সনাক্ত করতে (S6 চিত্র)। সমস্ত প্রাইমার ক্রম S1 টেবিলে নির্দিষ্ট করা হয়েছে, এবং প্রতিটি প্রাইমার জোড়ার জন্য কার্যকারিতা বক্ররেখা মূল্যায়ন করা হয়েছে।

বিভিন্ন জীবাণু স্তরের জন্য ইমিউনোফ্লোরেসেন্স

আইপিএসসি (প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) ছয়-ওয়েল প্লেটে কভারস্লিপগুলিতে পার্থক্য করতে প্ররোচিত হয়েছিল। পার্থক্যের পরে, কভারস্লিপগুলি মূল কূপগুলি থেকে সরানো হয়েছিল এবং একটি নতুন প্লেটে স্থানান্তরিত হয়েছিল, যেখানে কোষগুলিকে 4 শতাংশ প্যারাফর্মালডিহাইড দিয়ে স্থির করা হয়েছিল এবং তারপরে উপরে বর্ণিত হিসাবে পিবিএস দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। OCT4 (1:400; সেল সিগন্যালিং), CXCR4 (1;100; সেল সিগন্যালিং), PAX6 (1:100; থার্মো ফিশার), এবং SOX17 (1:100; R&D সিস্টেম) এর বিরুদ্ধে প্রাথমিক অ্যান্টিবডি ব্যবহার করা হয়েছিল৷ ব্যবহার করে ফ্লুরোসেন্স মূল্যায়ন করা হয়েছিল একটি আলেক্সা ফ্লুর সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (1:200; সেল সিগন্যালিং)।

iPSCs থেকে কিডনি অর্গানয়েড পার্থক্য (প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল)

ক্রুজ এট আল দ্বারা বর্ণিত প্রোটোকল অনুসরণ করে রেনালরগ্যানয়েডগুলি তৈরি হয়েছিল। [৬] কিছু অভিযোজন সহ। সংক্ষেপে, HCand দুই ADPKD (অটোসোমাল ডমিনেন্ট পলিসিস্টিক কিডনি রোগ) থেকে 50,000 iPSCs (প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) রোগীদের Accutase ডিটাচমেন্ট সলিউশন (স্টেম সেল টেকনোলজিস) দিয়ে একক কোষের সাসপেনশন তৈরি করতে ব্যবহার করা হয়েছিল। একক কোষকে 10uM Rho-kinase ইনহিবিটর (Y27632, স্টেম সেল টেকনোলজিস বা স্টেমজেন্ট) দিয়ে পরিপূরক করা হয়েছিল। 16 ঘন্টা পরে, কালচার মিডিয়ামটি mTeSR1 এর 1 মিলি প্লাস 2.5 শতাংশ ম্যাট্রিজেল প্লাস 10 μuM Y27632 দিয়ে প্রতিস্থাপিত হয়েছিল। 20 ঘন্টা পরে, মাধ্যমটি শুধুমাত্র 1mTeSRI এর 1 মিলি দ্বারা প্রতিস্থাপিত হয়েছিল; 14 ঘন্টা পরে, কালচার মিডিয়ামটি প্রতিস্থাপিত হয়েছিল, এবং কোষগুলির সাথে প্রতিস্থাপিত হয়েছিল। 6 uM CHIR99021 (AT104; স্টেম সেল বা স্টেমজেন্ট GSK-3b ইনহিবিটর/Wnt পাথওয়ে অ্যাগোনিস্ট) প্লাস অ্যাডভান্সড RPMI (থার্মো ফিশার) প্লাস গ্লুটাম্যাক্স (লাইফ টেকনোলজিস) প্লাস 10 ug/ml অ্যান্টিবায়োটিক (Ampicillin;0mp01; ) অবশেষে, 36 ঘন্টা পরে, সংস্কৃতির মাধ্যমটিকে DRB মাধ্যম দিয়ে প্রতিস্থাপিত করা হয় যার মধ্যে উন্নত RPMI(থার্মো ফিশার) প্লাস গ্লুটাম্যাক্স(থার্মো ফিশার) প্লাস B27 সাপ্লিমেন্ট (17504-044; লাইফ টেকনোলজিস) প্লাস অ্যান্টিবায়োটিক রয়েছে। DRB মাধ্যম প্রতি তিন দিনে 28 দিনের জন্য পরিবর্তন করা হয়েছিল। এই সময়কাল (28 দিন) অর্গানয়েডগুলি মাইক্রোস্কোপি দ্বারা দৃশ্যমান হওয়ার জন্য যথেষ্ট ছিল।

আরটি-পিসিআর দ্বারা অর্গানয়েডের আণবিক বৈশিষ্ট্য

আধা-পরিমাণগত জিনের অভিব্যক্তিটি RT-PCR দ্বারা ভ্রূণজনিত প্রক্রিয়ার সময় মূল্যায়ন করা হয়েছিল যে দিনগুলিতে গঠিত কোষ কাঠামো থেকে মোট RNA শুদ্ধ করা হয়েছিল 0(iPSCs(প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল)) এবং 14,21, 28, এবং পার্থক্য আনয়নের 35 দিন পর। WT1 (বিকাশকারী কিডনি), AQP1 (প্রক্সিমাল টিউব), এবং ECAD (সিস্ট এপিথেলিয়াম মার্কার) এর অভিব্যক্তি মূল্যায়ন করা হয়েছিল। GAPDH একটি অভ্যন্তরীণ নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। OCT4 এর অভিব্যক্তিটি একটি পরিমাণগত মান হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।

ফলাফল

erythroid progenitors (EPs) থেকে iPSCs (প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) প্রাপ্ত করা

erythroid progenitors থেকে কিডনি organoids প্রাপ্ত করার জন্য নিযুক্ত প্রোটোকল সংক্ষিপ্ত করা হয়। EPs সম্প্রসারণের ফলে আনুমানিক 20 দিন পর 1x10 ডিগ্রী কোষ তৈরি হয় (S2A Fig), এবং প্রায় দুই মাস পরে, EPs চিহ্নিত করা হয়েছিল তাদের চিহ্ন CD71 এবং Gly A-এর অভিব্যক্তি দ্বারা। পৃথকীকরণ পদ্ধতির কার্যকারিতা অভিব্যক্তি প্রকাশ করেছে; কোষের 88 শতাংশ CD71 পজিটিভ ছিল, এবং 57,4 শতাংশ ছিল Gly A পজিটিভ (S2BFig)।

কোষগুলি EPs ছিল তা যাচাই করার পরে, তারা পুনরায় প্রোগ্রামিং ফ্যাক্টরগুলির সাথে স্থানান্তরিত হয়েছিল (Oct-4, Sox2, Lin28, L-Myc, এবং klf4) এবং তারপরে পুনঃপ্রোগ্রামিংয়ের জন্য একটি নির্দিষ্ট মাধ্যমে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল (ReproTeSR, স্টেম সেল টেকনোলজিস) প্রায় পাঁচ দিনের জন্য। iPSCs (প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) একই কোষ সংস্কৃতিতে উপস্থিত নন-প্রোগ্রামড কোষগুলির থেকে আলাদা একটি রূপবিদ্যা সহ উপনিবেশ গঠন করে সাধারণ কোষীয় বৈশিষ্ট্যগুলি বিকাশ করে। যতক্ষণ না আমরা সাধারণ iPSC (ইনডিউসড প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল)-এর মতো উপনিবেশগুলি পর্যবেক্ষণ করি, যেগুলি বাণিজ্যিক H9 সেল লাইনের (Eig 1B) উপনিবেশগুলির মতো ছিল, ততক্ষণ পর্যন্ত কোষগুলি পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল৷ টাইট সেল প্যাকিং, ভাল-সংজ্ঞায়িত একজাত আকৃতি, এবং নিয়মিত প্রান্ত. একটি ফিডার-মুক্ত রিপ্রোগ্রামিং মাধ্যমের (Eig 1C) মধ্যে পৃথক কোষ থেকে উপনিবেশের অতিবৃদ্ধির কম ডিগ্রি দ্বারা সনাক্তকরণ সহজতর হয়েছিল। এইচসি এবং ADPKD (অটোসোমাল ডমিনেন্ট পলিসিস্টিক কিডনি রোগ) রোগীদের (PTl এবং PT2) কলোনি আকারবিদ্যা এবং প্লুরিপোটেন্সি মার্কারগুলির পরিপ্রেক্ষিতে আইপিএসসি উপনিবেশগুলির মধ্যে কোনও সনাক্তযোগ্য পার্থক্য পাওয়া যায়নি, যেমন চিত্র 1D তে দেখানো হয়েছে।

iPSCs (প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) তিনটি জীবাণু স্তরের মধ্যে পার্থক্য করার ক্ষমতা দ্বারা আরও বৈশিষ্ট্যযুক্ত ছিল। HC থেকে কোষে জীবাণু স্তরের বিকাশের অগ্রগতির সাধারণ চিত্রগুলি S5 চিত্রে দেখানো হয়েছে। তিনটি জীবাণু স্তরের বিকাশ সাধারণ রূপবিদ্যা (Eig 2A) এবং পার্থক্য চিহ্নিতকারীর জন্য ইমিউনোফ্লুরোসেন্স লেবেলিং দ্বারা যাচাই করা হয়েছিল, যথা, এন্ডো-ডার্মের জন্য FOXA2 , মেসোডার্মের জন্য মসৃণ পেশী অ্যাক্টিন (SMA) এবং ইক্টোডার্মের জন্য SOX2 (Eig2B-2D)। অ্যান্টিবডিগুলির জন্য নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণগুলি S7 চিত্রে দেখানো হয়েছে৷ চিত্র 2E এন্ডোডার্ম (SOX17), মেসোডার্ম (CXCR4) এবং ectoderm (PAX6) এর নির্দিষ্ট মার্কারগুলির জিনের প্রকাশের মাত্রা দেখায়, যেমনটি RT-PCR দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছে৷

চিত্র 2. তিনটি জীবাণু স্তরের বৈশিষ্ট্য। স্বাস্থ্যকর নিয়ন্ত্রণ (HC) এবং ADPKD1 রোগী (PT1 এবং PT2)।

উ: তিনটি জীবাণুর স্তরের সাধারণ রূপবিদ্যা। জীবাণুর স্তরগুলি নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে ইমিউনোফ্লোরেসেন্স স্টেনিং দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল। B. এন্ডোডার্ম (FOXA2),

C. মেসোডার্ম (SMA) এবং D. Ectoderm (SOX2)। কোষের নিউক্লিয়াস DAPI দিয়ে দাগযুক্ত ছিল। শেষ কলামগুলি মার্জ করা ছবিগুলি দেখায়৷

E. OCT4-এর জিন অভিব্যক্তি iPSC-এর প্লুরিপোটেন্সি নির্দেশ করে, SOX17 ছিল এন্ডোডার্মের জন্য একটি চিহ্নিতকারী, CXCR4 ছিল মেসোডার্মের জন্য একটি চিহ্নিতকারী এবং PAX6 ছিল এক্টোডার্মের (n=2) চিহ্নিতকারী।

আইপিএসসি দ্বারা OCT4 এক্সপ্রেশন একটি অভ্যন্তরীণ পরিমাণগত নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। OCT4 এক্সপ্রেশনটি তিনটি জীবাণু স্তরের কোষে সনাক্ত করা যায় না (স্কেল: 200 μm)।

আইপিএসসি (প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) থেকে কিডনি অর্গানয়েড তৈরি করা

HC থেকে প্রাপ্ত iPSCs (ইনডিউসড প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) এবং উভয় ADPKD (অটোসোমাল ডমিনেন্ট পলিসিস্টিক কিডনি ডিজিজ) রোগীদের দ্বারা ত্রিমাত্রিক রেনাল স্ট্রাকচার তৈরি করা হয়েছিল যা ভ্রূণের বিকাশের পুনর্নির্মাণ করে। চিত্র 3 সংশ্লিষ্ট ভ্রূণের গঠনগুলি পাওয়ার জন্য প্রয়োজনীয় পদক্ষেপগুলি দেখায়। iPSC (ইনডিউসড প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) কলোনিগুলি (Eig 3A) একক iPSC (ইনডিউসড প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) (Fig3C) পাওয়ার জন্য Accutase (Fig 3B) এর সাথে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। স্বাভাবিক ভ্রূণজনিত প্রক্রিয়া বিবেচনা করে, উপনিবেশগুলি একটি ব্লাস্টুলা এবং তারপর একটি গ্যাস্ট্রুলায় পার্থক্য করবে বলে আশা করা হবে, তবে সংস্কৃতিতে আইপিএসসি (প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) এর স্বতঃস্ফূর্ত পার্থক্য এখনও একটি চ্যালেঞ্জ যেহেতু কোষগুলি স্বতঃস্ফূর্তভাবে অ্যাপোপটোসিস [16] এর মধ্য দিয়ে যায়। এই অবাঞ্ছিত ফলাফল এড়াতে, সিগন্যালিং এর একটি ROCK ইনহিবিটর (10μM Rho-kinase ইনহিবিটর Y27632) একক-কোষ পর্যায়ের 16 ঘন্টা পরে যোগ করা হয়েছিল। ROCK পথের বাধা কোষগুলিকে মৃত্যুর পথগুলিকে ট্রিগার করতে বাধা দেয়, তাদের বেঁচে থাকতে এবং পার্থক্য প্রক্রিয়ার দিকে এগিয়ে যাওয়ার জন্য সামঞ্জস্য করতে দেয়। iPSCs (প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল) তারপর এপিব্লাস্ট পর্যায়ে পৌঁছানো পর্যন্ত বৃদ্ধি পায়, যা গোলক গহ্বরের (চিত্র 3D) উপস্থিতি দ্বারা চিহ্নিত করা হয়। এরপরে, একটি শক্তিশালী GSK-3b ইনহিবিটর/Wnt পাথওয়ে অ্যাগোনিস্ট(CHIR99021) যোগ করা হয়েছিল, যা এপিথেলিয়াল-মেসেনকাইমাল ট্রানজিশন (চিত্র 3E এবং 3E) এবং অবশেষে মেসেনকাইম-এপিথেলিয়াল ট্রানজিশন (চিত্র 3E এবং 3E) প্ররোচিত করার জন্য DRB মাধ্যম যুক্ত করা হয়েছিল। চিত্র 3G); এই পদক্ষেপগুলি প্রি-টিউবুলার অ্যাগ্রিগেটস এবং রেনাল ভেসিকেলস (Eig 3H) এর এপিথেলিয়ালাইজেশন এবং অনুক্রমিক গঠনকে সক্ষম করে, যা শেষ পর্যন্ত রেনাল টিউবুলার অর্গানয়েডস (চিত্র 3D) গঠনে সক্ষম করে। এই সমস্ত ইন ভিট্রো ভ্রূণজনিত পদক্ষেপগুলি উভয় HCand ADPKD (অটোসোমাল ডমিনেন্ট পলিসিস্টিক কিডনি রোগ) রোগীদের থেকে প্রাপ্ত কোষগুলির জন্য একই রকম ছিল।

টিউবুলার স্ট্রাকচারের উপস্থিতি ইমিউনোফ্লোরোসেন্স দ্বারা নির্দিষ্ট মার্কারগুলির অভিব্যক্তি দ্বারা যাচাই করা হয়েছিল: প্রক্সিমাল টিউবুলের জন্য NHE3 এবং AQP1 (Eig4A) এবং glomeruli (Eig 4B) এর জন্য NPHS2। বিপরীতে, AQP2 লেবেলিং সনাক্ত করা যায়নি (Eig 4B), নিশ্চিত করে যে এটি পদ্ধতিটি শুধুমাত্র মেটানেফ্রিক ভরের বিকাশের অনুমতি দেয় তবে ইউরেটেরিক কুঁড়ির নয়। ফরস্কোলিনের (চিত্র 4B) অনুপস্থিতিতে চিহ্নিতকারী ECAD সনাক্ত করা যায়নি।

পূর্বপুরুষ কিডনি বিকাশের প্রক্রিয়া জুড়ে প্রকাশিত নির্দিষ্ট মার্কারগুলির উপস্থিতি যাচাই করার জন্য, সমস্ত নমুনা (HC, PT1, এবং PT2) পৃথকীকরণের পুরো প্রক্রিয়ার পাঁচটি পয়েন্টে সংগ্রহ করা হয়েছিল: দিন 0(iPSCs(প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম) কোষ)), দিন 14,21,28 এবং তারপর 35 দিন (সিস্ট ইনডাকশনের 7 দিন পরে)। জিনের প্রকাশের সময়ক্রম ভ্রূণজনিত প্রক্রিয়ার সময় পার্থক্য প্রকাশ করে, যেমন চিত্র 5A-5সি-তে দেখানো হয়েছে। প্লুরিপোটেন্সি চিহ্নিতকারী OCT4 আইপিএসসি (দিন ও) দ্বারা প্রকাশ করা হয়েছিল, তবে এর মাত্রা 14 দিনের মধ্যে হ্রাস করা হয়েছিল, পার্থক্যের পরে খুব নিম্ন স্তরে পৌঁছেছে। বিপরীতে, মেটানেফ্রিক মেসেনকাইম (WT1) এবং প্রক্সিমাল টিউবুল (AQP1) এর নির্দিষ্ট মার্কারগুলির অভিব্যক্তি ক্রমান্বয়ে বৃদ্ধি পায় যখন পার্থক্য প্রক্রিয়াটি 14 দিনের মধ্যে শুরু হয়, 21 দিনের মধ্যে একটি মালভূমিতে পৌঁছায়। চিত্র 5D ECAD এর অভিব্যক্তি দেখায়, একটি সিস্টোজেনেসিস। মার্কার, 35 দিনে, অর্থাৎ ফোরস্কোলিন দ্বারা সিস্ট ইনডাকশনের 7 দিন পর। ফরসকোলিনের অনুপস্থিতিতে, ECAD-এর অভিব্যক্তি খুব কম ছিল, এমনকি ADPKD (অটোসোমাল ডমিনেন্ট পলিসিস্টিক কিডনি রোগ) রোগীদের মধ্যেও। যাইহোক, যখন ফোরস্কোলিন যোগ করা হয়েছিল (28 দিন), উভয় রোগীর ইসিএডি এক্সপ্রেশন বৃদ্ধি পেয়েছে; কিন্তু একই প্যাটার্ন HC organoid-এ পরিলক্ষিত হয়নি যা ECADexpression-এর নিম্ন স্তরের সাথে এমনকি forskolin উপস্থিতিতেও ছিল।

ফোরস্কোলিন দিয়ে উদ্দীপিত অর্গানয়েড থেকে গঠিত সিস্টের উপস্থিতি ADPKD (অটোসোমাল ডমিনেন্ট পলিসিস্টিক কিডনি রোগ) রোগীদের জন্য স্পষ্ট ছিল, যেমন Eig6 এ দেখানো হয়েছে। উপরের প্যানেলটি ফরস্কোলিন (Eig6Aa) যোগ করার আগে 28 তম দিনে অর্গানয়েডের ছবি দেখায়। Eig6Ab (প্যানোরামিক ভিউ-4X) এবং 6Ac (20X ভিউ-ইং) 35 তম দিনে অর্গানয়েডগুলি দেখায় forskolin উভয় রোগীর (PT1 এবং PT2) নমুনায় সিস্ট-সদৃশ কাঠামোর উপস্থিতি দেখাচ্ছে কিন্তু HC নমুনায় নয়। সিস্টের উপস্থিতি ইমিউনোফ্লোরোসেন্স স্টেনিং (চিত্র 6B) দ্বারাও যাচাই করা হয়েছিল। এইচসি অর্গানয়েডে ইসিএডি লেবেলিং সনাক্ত করা হয়নি, তবে উভয় রোগীর অর্গানয়েডে এটি স্পষ্টভাবে পরিলক্ষিত হয়েছিল। মজার ব্যাপার হল, সিস্ট লুমেনের উপস্থিতিও লক্ষ্য করা যায়।

চিত্র 3. টিউবুলার অর্গানয়েড তৈরি করা।

HC, PT1, এবং PT2 গ্রুপ থেকে তৈরি iPSC থেকে 28 দিনে এপিথেলিয়াল টিউবুলার কিডনি অর্গানয়েড তৈরির ফেজ-কনট্রাস্ট ছবি। প্রথম 36 ঘন্টায়, iPSC গুলি 3D সংস্কৃতিতে বজায় রাখা হয়েছিল।

তারপরে, তারা বিচ্ছিন্ন হয়ে যায়, একক কোষে রূপান্তরিত হয় এবং Y-27632 দিয়ে চিকিত্সা করা হয়, যা সেলুলার পুনর্গঠন এবং বেঁচে থাকার অনুমতি দেয়, এপিব্লাস্ট স্ফেরোয়েড (ডি) তৈরি করে।

তারপরে, CHIR99201 এবং DRB যুক্ত করা হয়েছিল, Wnt/ -catenin পাথওয়েকে সক্রিয় করে এবং টিউবুলার অর্গানয়েড (I) মধ্যে পার্থক্য করার অনুমতি দেয়।

ADPKD রোগী এবং HC দাতার কাছ থেকে প্রাপ্ত স্পেরয়েডগুলির মধ্যে রূপবিদ্যা একই রকম। (a এবং f: 1000μm এর জন্য স্কেল বার; b, cd, e, g, h এবং i: 200μm এর জন্য স্কেল বার)।

অংশ নিতে এখানে ক্লিক করুনⅡ