সাইক্লোস্ট্রাজেনল দ্বারা ক্যাথেপসিন বিকে লক্ষ্য করা MHC-I অবক্ষয় রোধের মাধ্যমে CD8 T কোষের অ্যান্টিটিউমার প্রতিরোধ ক্ষমতা বাড়ায় পার্ট 1

বিমূর্ত

পটভূমিটিউমার অ্যান্টিজেনের ক্ষতি এবং PD-1/PD-L1 পথ দ্বারা সৃষ্ট CD8 T কোষের ক্ষয় হল টিউমার প্রতিরোধ ক্ষমতা থেকে রক্ষা পাওয়ার জন্য গুরুত্বপূর্ণ কারণ। সাম্প্রতিক বছরগুলিতে, টিউমার চিকিত্সার ক্ষেত্রে ঐতিহ্যগত চীনা ওষুধের উপর গবেষণা বাড়ছে। সাইক্লোস্ট্রাজেনল (সিএজি), অ্যাস্ট্রাগালাস মেমব্রেনাসিয়াসের একটি কার্যকরী সক্রিয় অণু, এর অ্যান্টিভাইরাল, অ্যান্টি-এজিং, অ্যান্টি-ইনফ্লেমেটরি এবং অন্যান্য ফাংশন পাওয়া গেছে। যাইহোক, এর অ্যান্টিটিউমার প্রভাব এবং প্রক্রিয়া স্পষ্ট নয়।

সিস্টানচে গ্লাইকোসাইড হৃৎপিণ্ড ও যকৃতের টিস্যুতে SOD-এর কার্যকলাপকেও বাড়িয়ে তুলতে পারে এবং প্রতিটি টিস্যুতে lipofuscin এবং MDA-এর উপাদানকে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করতে পারে, কার্যকরভাবে বিভিন্ন প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন র‌্যাডিকেল (OH-, H₂O₂, ইত্যাদি) এবং ডিএনএ-এর ক্ষতি থেকে রক্ষা করে। OH-র্যাডিক্যাল দ্বারা। Cistanche phenylethanoid glycosides মুক্ত র্যাডিকেলগুলির একটি শক্তিশালী স্ক্যাভেঞ্জিং ক্ষমতা, ভিটামিন C-এর তুলনায় উচ্চ হ্রাস করার ক্ষমতা, শুক্রাণু সাসপেনশনে SOD-এর কার্যকলাপকে উন্নত করে, MDA-এর বিষয়বস্তু হ্রাস করে এবং শুক্রাণুর ঝিল্লির কার্যকারিতার উপর একটি নির্দিষ্ট প্রতিরক্ষামূলক প্রভাব ফেলে। সিস্টানচে পলিস্যাকারাইডগুলি ডি-গ্যালাকটোজ দ্বারা সৃষ্ট পরীক্ষামূলকভাবে সেনসেন্ট ইঁদুরের এরিথ্রোসাইট এবং ফুসফুসের টিস্যুতে এসওডি এবং জিএসএইচ-পিএক্সের কার্যকলাপকে বাড়িয়ে তুলতে পারে, সেইসাথে ফুসফুস এবং প্লাজমাতে এমডিএ এবং কোলাজেনের উপাদান হ্রাস করতে পারে এবং ইলাস্টিনের উপাদান বাড়াতে পারে। ডিপিপিএইচের উপর একটি ভাল স্ক্যাভেঞ্জিং প্রভাব, সেন্সেন্ট ইঁদুরের হাইপোক্সিয়ার সময়কে দীর্ঘায়িত করে, সিরামে এসওডির কার্যকলাপকে উন্নত করে এবং পরীক্ষামূলকভাবে সেন্সেন্ট ইঁদুরের ফুসফুসের শারীরবৃত্তীয় অবক্ষয়কে বিলম্বিত করে সেলুলার মরফোলজিক্যাল অবক্ষয়ের সাথে, পরীক্ষাগুলি দেখিয়েছে যে সিস্টানচে ভাল অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট ক্ষমতা রয়েছে। এবং ত্বকের বার্ধক্যজনিত রোগ প্রতিরোধ ও চিকিত্সার জন্য একটি ওষুধ হওয়ার সম্ভাবনা রয়েছে। একই সময়ে, সিস্তানচে ইচিনাকোসাইডের DPPH ফ্রি র‌্যাডিকেলগুলিকে স্ক্যাভেঞ্জ করার একটি উল্লেখযোগ্য ক্ষমতা রয়েছে এবং এটি প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতিকে স্ক্যাভেঞ্জ করার এবং মুক্ত র‌্যাডিক্যাল-প্ররোচিত কোলাজেনের অবক্ষয় রোধ করার ক্ষমতা রাখে এবং থাইমিন ফ্রি র‌্যাডিক্যাল অ্যানিয়নের ক্ষতির উপর একটি ভাল মেরামত প্রভাব ফেলে।

cistanche সুবিধা এবং অসুবিধা ক্লিক করুন

【আরো তথ্যের জন্য:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

পদ্ধতিMC38 এবং CT26 মাউস-ট্রান্সপ্লান্টেড টিউমার মডেলগুলিতে CAG-এর অ্যান্টিটিউমার প্রভাব তদন্ত করা হয়েছিল। সিএজি-এর অ্যান্টিটিউমার প্রভাবটি একক-কোষ মাল্টি-ওমিক্স সিকোয়েন্সিংয়ের মাধ্যমে আরও বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। লক্ষ্য-প্রতিক্রিয়াশীল অ্যাক্সেসিবিলিটি প্রোফাইলিং প্রযুক্তি CAG-এর লক্ষ্য প্রোটিন খুঁজে পেতে ব্যবহার করা হয়েছিল। পরবর্তীকালে, কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি, ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন এবং মিউট্যান্ট প্লাজমিডের স্থানান্তর ব্যবহার করে সিএজি-র অ্যান্টিটিউমার প্রক্রিয়াটি অনুসন্ধান করা হয়েছিল। অবশেষে, ইঁদুর বা অর্গানয়েডগুলিতে CAG এবং PD-1 অ্যান্টিবডিগুলির সম্মিলিত অ্যান্টিটিউমার প্রভাব তদন্ত করা হয়েছিল।

ফলাফলআমরা দেখতে পেয়েছি যে সিএজি কার্যকরভাবে ভিভোতে টিউমার বৃদ্ধিকে বাধা দিয়েছে। আমাদের একক-কোষ মাল্টি-ওমিক্স অ্যাটলাস দেখিয়েছে যে সিএজি টিউমার সেল-সারফেস অ্যান্টিজেনগুলির উপস্থাপনাকে উন্নীত করেছে এবং সিডি 8 প্লাস টি কোষের বর্ধিত হত্যাকাণ্ডের দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছে। যান্ত্রিকভাবে, সিএজি তার লক্ষ্য প্রোটিন ক্যাথেপসিন বি এর সাথে আবদ্ধ, যা তখন প্রধান হিস্টোকম্প্যাটিবিলিটি কমপ্লেক্স I (MHC-I) এর লাইসোসোমাল অবক্ষয়কে বাধা দেয় এবং MHC-I এর সমষ্টি n কে কোষের ঝিল্লিতে উন্নীত করে, টিউমার অ্যান্টিজেনের প্রাক-স্টেশনকে বাড়িয়ে তোলে। . ইতিমধ্যে, PD-1 অ্যান্টিবডির সাথে CAG-এর সংমিশ্রণ কার্যকরভাবে জেনোগ্রাফ্ট ইঁদুর এবং কোলোরেক্টাল ক্যান্সার অর্গানয়েডের টিউমার-হত্যাকারী CD8 প্লাস টি কোষকে কার্যকরভাবে উন্নত করেছে। উপসংহার আমাদের ডেটা প্রথমবারের মতো রিপোর্ট করেছে যে ক্যাথেপসিন বি ডাউনরেগুলেশন অ্যান্টিটিউমার অনাক্রম্যতা প্রদান করে এবং প্রাকৃতিক পণ্য সিএজি-এর অ্যান্টিটিউমার প্রক্রিয়ার মেয়াদ শেষ করে।

ভূমিকা

কোলোরেক্টাল ক্যান্সার বিশ্বব্যাপী সবচেয়ে সাধারণ ক্যান্সারগুলির মধ্যে একটি। এর প্রকোপ হার এবং মৃত্যুর হার শীর্ষ তিনটির মধ্যে রয়েছে, যা মানব জীবন ও স্বাস্থ্যকে মারাত্মকভাবে হুমকির মুখে ফেলে।১ সাধারণ চিকিৎসা পদ্ধতির মধ্যে রয়েছে সার্জারি কেমোথেরাপি এবং রেডিওথেরাপি, লক্ষ্যযুক্ত ওষুধ এবং ইমিউনোথেরাপি। ২-৪ যাইহোক, ক্যান্সার কোষ সাধারণত পৃষ্ঠের অ্যান্টিজেনের ক্ষতি প্রদর্শন করে এবং প্রকাশ করে। ইমিউন কোষের নজরদারি এড়াতে অণুকে বাধা দেয় উচ্চ মাত্রা। তাই, টিউমার ইমিউন এস্কেপের সমস্যা সমাধানের জন্য, গবেষকরা ইমিউন চেকপয়েন্ট ইনহিবিটরস এবং নিউওএন্টিজেন থেরাপি তৈরি করেছেন যাতে ক্যান্সার কোষের মুখোশ প্রতিরোধক কোষে আটকে যায়। কোষ উল্লেখযোগ্যভাবে im ved করা হয়নি. তাই, টিউমার সারফেস অ্যান্টিজেনের ই-প্রেজেন্টেশনকে উৎসাহিত করতে পারে এমন ওষুধ খুঁজে পাওয়া বিশেষভাবে গুরুত্বপূর্ণ সাইটোটক্সিক CD8 প্লাস T কোষ দ্বারা ক্যান্সার কোষের স্বীকৃতি TCR/CD3/প্রধান হিস্টোকম্প্যাটিবিলিটি কমপ্লেক্স (MHC-I) পথের উপর নির্ভর করে। টিসিআর ডেনড্রাইটিক কোষ/ক্যান্সার কোষের ঝিল্লি প্রোটিন CI দ্বারা উপস্থিত অ্যান্টিজেন গ্রহণ করে এবং CD3 এর সাথে শক্তভাবে সংযোগ করার জন্য সংকেত প্রেরণ করে, যা তারপর সাইটোপ্লাজমের গভীরে প্রসারিত হয়।{10}} একই সময়ে, CD28/ B7 সংকেত সক্রিয় করার সাথে সাথে , CD8 প্লাস T কোষগুলি ক্যান্সার কোষগুলিকে চিনতে এবং মেরে ফেলার জন্য সক্রিয় করা যেতে পারে। 11 সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে, টিউমারের অগ্রগতির প্রক্রিয়ায়, লাইসোসোমগুলি ক্যান্সার কোষের পৃষ্ঠে MHC-I একত্রিতকরণ হ্রাস করে, যা কার্যকরভাবে নয়। উপস্থিত অ্যান্টিজেন।{16}} লিউ এট আল রিপোর্ট করেছেন যে PCSK9-এর বাধা লাইসোসোমে MHC-I এর অবক্ষয় রোধ করতে পারে এবং MHC-I কে কোষের ঝিল্লিতে ফিরে অ্যান্টিজেন উপস্থাপন করতে সক্ষম করে। MHC-I টিউমার প্রতিরোধ ক্ষমতা রোধ করার জন্য বিশেষভাবে গুরুত্বপূর্ণ।

একটি ক্রমবর্ধমান সংখ্যক গবেষণায় দেখা গেছে যে ঐতিহ্যবাহী চীনা ওষুধ এন টিউমার হস্তক্ষেপের সক্রিয় অণুর প্রয়োগের দুর্দান্ত সম্ভাবনা রয়েছে৷{0}} সাইক্লোস্ট্রাজেনল (সিএজি) হল একটি কার্যকর সক্রিয় অণু এন অ্যাস্ট্রাগালাস মেমব্রেনাসিয়াস, যা অ্যান্টিভাইরাল, অ্যান্টিব্যাকটেরিয়াল, অ্যান্টি-ব্যাকটেরিয়াল প্রদাহজনক, এবং অন্যান্য ফার্মাকোলজিকাল প্রভাব, কিন্তু এর অ্যান্টিটিউমার প্রভাব খুব কমই রিপোর্ট করা হয়। 16-19 এই গবেষণায়, আমরা দেখেছি যে CAG কোলন ক্যান্সারের টিউমারের ট্রান এন্টেড টিউমারের বৃদ্ধিতে বাধা দেয়। প্রক্রিয়াটি মূলত MHC-I এর অবক্ষয়কে বাধা দেয়, মধ্যস্থতা করে। ক্যাথেপসিন বি (সিটিএসবি), ক্যান্সার কোষের অ্যান্টিজেন উপস্থাপনাকে প্রচার করে এবং তারপরে CD8 প্লাস টি কোষের হত্যার ক্ষমতা বৃদ্ধি করে।

উপকরণ এবং পদ্ধতিসমূহ

অ্যান্টিবডি এবং বিকারক

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 শতাংশ)। CTSB এর অ্যান্টিবডি (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID: AB_1557426), Actin (Cat#{{ 5}Ig, PRID: AB_2782959 ), Tubulin (Cat#10094-1-AP, PRID: AB_2210695 ), এবং অ্যান্টি-মাউস/খরগোশ ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি ডিটেকশন কিট (বিড়াল#PK10006) প্রোটিনটেক থেকে কেনা হয়েছিল। H2-Kd এর অ্যান্টিবডি (Cat#sc-53852, PRID: AB_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID: AB_626853), এবং CTSB (Cat#sc-365558, PRID: AB_10842446) সান্তা ক্রুজ বায়োটেকনোলজি থেকে কেনা হয়েছে৷ কি-67 (বিড়াল#12202, PRID: AB_2620142 ) এর অ্যান্টিবডি সেল সিগন্যালিং প্রযুক্তি থেকে কেনা হয়েছিল৷ Na/K ATPase এর অ্যান্টিবডি (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) Abcam থেকে কেনা হয়েছিল। CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB_2833003 ) এবং CD{এর ফ্লো সাইটোমেট্রি অ্যান্টিবডি {31}}PerCP (Cat#345774, RRID: AB_2868802 ) BD বায়োসায়েন্স থেকে কেনা হয়েছে৷ Gzmb-FITC (Cat# 515403, RRID: AB_2114575 ) এর ফ্লো সাইটোমেট্রি অ্যান্টিবডি বায়োলেজেন্ড থেকে কেনা হয়েছিল৷ NK1 এর ফ্লো সাইটোমেট্রি অ্যান্টিবডি।{38}}PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB_469664) এবং IFN- -PE (Cat#12-7311-81, RRID :AB_466192) Thermo Fisher Scientific থেকে কেনা হয়েছে৷ DMEM মাধ্যম (Cat#01-052-1ACS), PenicilinStreptomycin (Cat#15140122), এবং Fetal Bovine Serum (Cat#C04001-500) জৈবিক শিল্প থেকে কেনা হয়েছিল৷ ছাগলের সিরাম (বিড়াল#88RNG001) এবং পিয়ার্স বিসিএ প্রোটিন অ্যাস কিট (বিড়াল#23225) থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক থেকে কেনা হয়েছিল। অ্যান্টি-হিউম্যান PD-1 (Cat#BE0188, RRID: AB_1095031 8) এবং অ্যান্টি-মাউস PD-1 (Cat#BE0146, RRID: AB_1094905 3) এর অ্যান্টিবডি বায়ো এক্স সেল থেকে কেনা হয়েছে। MACS টিউমার টিস্যু ডিসোসিয়েশন কিট (Cat#130-095-929) Miltenyi Biotec থেকে কেনা হয়েছিল।

সেল সংস্কৃতি

মাউসের কোলন ক্যান্সার সেল লাইন MC38 এবং CT26 আমাদের পরীক্ষাগারে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল৷20 মানুষের কোলন ক্যান্সার l লাইন HCT-116 চাইনিজ একাডেমি অফ সায়েন্সেস (সাংহাই, চীন) এর টাইপ কালচার কালেকশন থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল৷ MC38, CT26, এবং HCT-116 কোষগুলিকে 5 শতাংশ CO2 ইনকিউবেটরে 37 ডিগ্রীতে 10 শতাংশ ভ্রূণের বোভাইন সিরাম এবং 1 শতাংশ পেনিসিলিন/স্ট্রেপ্টোমাইসিন ধারণকারী একটি DMEM মাধ্যমে সংষ্কৃত করা হয়েছিল।

ট্রান্সপ্লান্টেশন টিউমার পরীক্ষা

ছয়-আট সপ্তাহ বয়সী মহিলা C57BL/6JGpt ইঁদুর, BALB/c ইঁদুর, এবং BALB/,c নগ্ন ইঁদুরগুলি জেমফার্মাটেক (নানজিং, চীন) থেকে কেনা হয়েছিল। MC38 বা CT26 ক্যান্সার কোষ (1×106) প্রতিটি মাউসের মধ্যে সাবকিউটেনিওসভাবে টিকা দেওয়া হয়েছিল। টিউমারটি 100 মিমি 3 পর্যন্ত বেড়ে গেলে, মাইকটিকে এলোমেলোভাবে ফসফেট বাফার স্যালাইন (পিবিএস) গ্রুপে (যেমন, দিনে একবার) এবং সিএজি গ্রুপে (যেমন, 50 মিলিগ্রাম/কেজি দিনে একবার) ভাগ করা হয়েছিল। টিউমারের পরিমাণ V=দৈর্ঘ্য×প্রস্থ2/2 সূত্র ব্যবহার করে ক্যালিপার পরিমাপের মাধ্যমে নির্ধারণ করা হয়েছিল। যখন পিবিএস গ্রুপের ইঁদুরের টিউমারের পরিমাণ 1000 মিমি 3 এ পৌঁছেছিল, তখন ইঁদুরের টিউমারটি বের করা হয়েছিল, ছবি তোলা হয়েছিল এবং ওজন করা হয়েছিল।

একক-কোষ RNA/ATACseq-এর জন্য মাউস থেকে একক-কোষ বিচ্ছিন্নতা

একক কোষ একক-কোষ পেতে টিউমার ডিসোসিয়েশন কিট ব্যবহার করে ইঁদুর থেকে কঠিন টিউমার হজম করা হয়েছিল। 10×জিনোমিক্স নির্মাতার প্রোটোকল অনুসরণ করে 10×জিনোমিক্স ক্রোমিয়াম কন্ট্রোলার একক কোষ একক-কোষে লোড করা 1000 কোষ/1000 কোষের ঘনত্ব সহ একক সেল একক-কোষ। রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন রিএজেন্ট, বারকোডেড জেল পুঁতি, এবং পার্টিশনিং তেলকে কোষের সাথে মিশ্রিত করা হয়েছিল যাতে জেন এর জন্য ইমালশনে (GEM) জেল পুঁতি তৈরি হয়। scRNA-seq ডেটা প্রিপ্রসেসিং এবং কোয়া y কন্ট্রোল।

মাউস রেফারেন্স জিনোম GRCm38 (mm10), CellRanger V.4৷{4}}৷{9}} পাইপলাইন (10×Genomics) একক-কোষ RNA প্রক্রিয়া করার জন্য প্রতিটি পরীক্ষার জন্য সিকোয়েন্স ডেটা (GSE197229)। সিউরাট (V.4.0.0) প্যাকেজ ব্যবহার করে ডিজিটাল জিন এক্সপ্রেশন ম্যাট্রিক্সগুলি R (V.4।{13}}.4) এ জেড করা হয়েছিল।21 dBeforem বিশ্লেষণের আগে, কোষগুলি UMI নম্বর দ্বারা ফিল্টার করা হয়েছিল (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

SeaTac-seq ডেটা প্রিপ্রসেসিং এবং মান নিয়ন্ত্রণ

একক সেল ATAC-seq ডেটা (GSE197229) সেল রেঞ্জার-এট (V.20.0) দ্বারা গণনা কমান্ড লাইনের মাধ্যমে প্রিপ্রসেস করা হয়েছিল৷ পরবর্তী scATAC-seq ডেটা প্রক্রিয়াকরণ এবং বিশ্লেষণের জন্য, আমরা ArchR (V.1.0.1) প্যাকেজ ব্যবহার করেছি৷24 তারপর, আমরা জিনোম টীকাটির জন্য addArchRGethe নোম ('mm10') ফাংশন ব্যবহার করেছি এবং একটি তৈরি করেছি ডিফল্ট প্যারামিটার সহ cre ArrowFiles ফাংশন সহ arrow ফাইল। এর পরে, আমরা সম্ভাব্য ডবলটগুলি মুছে ফেলার জন্য ফিল্টারডুবলেট ফাংশন ব্যবহার করেছি এবং ডিফল্ট প্যারামিটার সহ ArchRPproject ফাংশন ব্যবহার করে একটি ArchR প্রকল্প তৈরি করেছি। আমরা তারপর অ্যাডহার্মনি ফাংশন দ্বারা ব্যাচ প্রভাব অপসারণ করতে হারমনি প্যাকেজ ব্যবহার করি। 25 মাত্রা হ্রাসের জন্য, আমরা ডিফ টি প্যারামিটারের সাথে চালানোর জন্য ArchR-এ addIterativeLSI ফাংশন ব্যবহার করি। একক-কোষ এম্বেডিংয়ের জন্য, আমরা সঙ্গতি সহ হ্রাসকৃত ডিমস অবজেক্টটি নির্বাচন করেছি এবং ভিজ্যুয়ালাইজেশনের জন্য 'বিভ্রান্তি=30' প্যারামিটার সহ addTSNE ফাংশন ব্যবহার করেছি।

siRNA-seq এবং scATAC-seq ডেটার সমন্বিত বিশ্লেষণ

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.৫. দুটি ডেটাসেটকে আরও ভালভাবে সংহত করার জন্য ভবিষ্যদ্বাণীগুলির যথার্থতা উন্নত করতে, আমরা আবার 'সীমাবদ্ধ ইন্টিগ্রেশন' মোড ব্যবহার করে scATAC-seq এবং scRNA-seq ডেটা সংহত করেছি। সংক্ষেপে, আমরা scATAC-seq-এর জিনের স্কোরের উপর ভিত্তি করে কোষের ধরন সহ scATAC-seq ডেটা টীকা করেছি। তারপরে, আমরা একটি সীমাবদ্ধ তালিকা তৈরি করেছি যাতে জিনের অভিব্যক্তির সাদৃশ্য শুধুমাত্র scATAC-seq এবং scRNA-seq উভয়ের জন্য একই কোষের ধরনে গণনা করা হয়েছিল। টি-এসএনই-এর সাথে তত্ত্বাবধানহীন ক্লাস্টারিং 13টি সাব-সেল ক্লাস্টার প্রকাশ করেছে, যা অনলাইন সম্পূরক সারণি 1-এ পরিচিত বা পুটেটিভ মার্কার দ্বারা টীকা করা হয়েছে।

সিউডোটাইম বংশের গতিপথ

ক্যান্সার কোষের কোষের বংশের গতিপথ Monocle2 (V.2.18.0) R প্যাকেজ ব্যবহার করে অনুমান করা হয়েছিল। 26 একক কোষের জিনোমিক্স ডেটা থেকে একক-কোষের জিনোমিক্স ডেটা থেকে সুস্পষ্ট মাস্টার গ্রাফ শেখে মনোসাইট কোষগুলিকে সাজানোর জন্য বিপরীত গ্রাফ এমবেডিং দ্বারা, এইভাবে জটিল সমাধান করে জৈবিক প্রক্রিয়াগুলি দৃঢ়ভাবে এবং নির্ভুলভাবে। 27 আমরা প্রতিটি ক্লাস্টার থেকে ডিইজি বের করার জন্য ''ডিফারেনশিয়ালজিনটেস্ট'' ফাংশন ব্যবহার করেছি, এবং কোষের গতিপথ তৈরি করার পরে, আমরা ছদ্ম সময়ে পৃথকভাবে প্রকাশিত জিনগুলি সনাক্ত করেছি। সমস্ত ছদ্ম-সময়-নির্ভর জিন একটি CellDataSet অবজেক্ট গ্রহণ করে প্লট_সিউডোটাইম_হিটম্যাপ ফাংশন দ্বারা কল্পনা করা হয়েছিল। CellDataSet-এর উপর ভিত্তি করে বংশগত ট্র্যাজেক্টরি প্লট এবং মসৃণ এক্সপ্রেশন বক্ররেখাগুলি যথাক্রমে প্লট_সেল_ট্র্যাজেক্টরি এবং প্লট_জিন_সিউডোটাইমে_জেনারেট করেছিল৷28

একক-কোষ কপি নম্বর বৈচিত্র কলিং

ক্লোনাল লার্জ-স্কেল ক্রোমোসোমাল কপি নম্বর বৈচিত্র্য (CNV) সহ ম্যালিগন্যান্ট কোষগুলি সনাক্ত করতে, আমরা টিউমার জিনোমের প্রতিটি ক্রোমোসোমাল অঞ্চলে বড় জিন সেটের গড় অভিব্যক্তির উপর ভিত্তি করে প্রতিটি কোষের জেনেটিক প্রোফাইলগুলি অনুমান করতে inferCNV R প্যাকেজ ব্যবহার করেছি। স্বাভাবিক কোষ। 29 নমুনা দ্বারা নমুনা ভিত্তিতে, ক্যান্সার-সম্পর্কিত কোষে CNV অনুমান করার জন্য ইমিউন কোষগুলিকে রেফারেন্স হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল।

সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণ

PValueCutoff=0 এর পরামিতি সহ R প্যাকেজ ক্লাস্টার প্রোফাইলার (V.3.11.1) ব্যবহার করে KEGG পাথওয়ে এবং GO টীকা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল৷{16}}5, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} }.05, MingsSize=10, এবং MaxGSSize=500.20Gene সেট সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণ (GSEA) 50টি হলমার্ক জিন সেট (h.all.V.7.4.symbols. gmt) ব্যবহার করে উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ শনাক্ত করার জন্য প্রয়োগ করা হয়েছিল GSEA সফ্টওয়্যার (V.4.1.0) এর মাধ্যমে কার্যকরী পথ, নামমাত্র P-মানের স্ক্রীনিং মানদণ্ড সহ<0.05and false discovery rate q<0.250.30

পরিমাণগত রিয়েল-টাইম পিসিআর বিশ্লেষণ

MC38 এবং HCT-116 কোষগুলিকে ছয়-কূপ প্লেটে 6 ঘন্টার জন্য বীজ দেওয়া হয়েছিল এবং তারপরে আরও 24 ঘন্টার জন্য CAG দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। কোষগুলিকে ঠান্ডা পিবিএস দিয়ে তিনবার ধোয়া হয়, এবং 4 ডিগ্রিতে 5 মিনিটের জন্য 180গ্রামে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়। একই সময়ে, টিউমার টিস্যু নাকাল পরে। প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে, TRIzol বিকারক ব্যবহার করে MC38, HCT-116 কোষ এবং টিউমার টিস্যু থেকে মোট RNA বের করা হয়েছিল। প্রতিক্রিয়ার পরিমাণ ছিল 20µL যার মধ্যে রয়েছে: 1µg RNA, 5µL 5×Hiscript III qRT SuperMix, এবং RNase Free dH2 O। cDNA পরিমাণগত পিসিআরের অধীন ছিল, যার প্রতিক্রিয়ার পরিমাণ ছিল 10µL এর সাথে 1µL cDNA, 5µL, 5µ7µL, 5µL, 5µL, 5µL. (ফরোয়ার্ড এবং রিভার্স), এবং 3.25µL RNase-মুক্ত dH2 O। প্রাইমারগুলি নিম্নলিখিত ক্রমানুসারে জেনস্ক্রিপ্ট বায়োটেক কর্পোরেশন (নানজিং, চীন) দ্বারা সংশ্লেষিত হয়েছিল (অনলাইন সম্পূরক সারণী 2)।

লক্ষ্য-প্রতিক্রিয়াশীল অ্যাক্সেসিবিলিটি প্রোফাইলিং পদ্ধতির মাধ্যমে লক্ষ্য আবিষ্কার

সিএজি-বাইন্ডিং প্রোটিনের স্ক্রীনিং পূর্বে বর্ণিত হিসাবে সম্পাদিত হয়েছিল।{1}} সংক্ষেপে, টার্গেট-প্রতিক্রিয়াশীল অ্যাক্সেসিবিলিটি প্রোফাইলিং (ট্র্যাপ) পদ্ধতিটি লিগ্যান্ড এনগেজমেন্ট-ইনডিউসড লাইসিন পর্যবেক্ষণ করে কোষের পরিবেশে সিএজি-র জন্য বাঁধাই প্রোটিন আবিষ্কার করার জন্য নিযুক্ত করা হয়েছিল। প্রোটিওম স্তরে অ্যাক্সেসযোগ্যতার পরিবর্তন। সংক্ষেপে, কোষের দুটি খাবার যথাক্রমে 10µM CAG এবং ডাইমিথাইল সালফক্সাইড (DMSO) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। 1-ঘণ্টা ইনকিউবেশনের পরে, কোষগুলি M-PER বাফার (থার্মো সায়েন্টিফিক) দ্বারা প্রবেশ করানো হয়েছিল এবং ফলস্বরূপ লাইসেটগুলিকে ফর্মালডিহাইড এবং বোরেন পাইরিডিন কমপ্লেক্স যোগ করে সমযোজীভাবে লেবেল করা হয়েছিল যা একত্রে অ্যাক্সেসযোগ্যতার প্রোফাইলিংয়ের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় প্রোটিনসিয়াস লাইসিনের অবশিষ্টাংশগুলিকে বিশেষভাবে লেবেল করে। . তারপরে, লাইসেটগুলিকে জৈব দ্রাবক দ্বারা প্ররোচিত করা হয়েছিল, এবং সংগৃহীত ছুরিগুলিকে 8mol/L ইউরিয়াতে পুনরায় দ্রবীভূত করা হয়েছিল, 30 মিনিটের জন্য 56 ডিগ্রিতে ডিথিওথ্রিটল (ডিটিটি) দ্বারা হ্রাস করা হয়েছিল, তারপরে 30 মিনিটের জন্য অন্ধকারে আয়োডোসেটামাইড (IAA) ব্যবহার করে অ্যালকিলেশন করা হয়েছিল। অতিরিক্ত IAA এর সাথে প্রতিক্রিয়া করার জন্য একটি উপযুক্ত পরিমাণ DTT সমাধান আবার যোগ করা হয়েছিল। পরবর্তীকালে, প্রোটিওমকে অ্যামোনিয়াম বাইকার্বোনেট দ্রবণ দিয়ে পাতলা করা হয় যতক্ষণ না ইউরিয়ার চূড়ান্ত ঘনত্ব 1mol/L এ পৌঁছায়। সংগৃহীত প্রোটিন ডাইজেস্টগুলি C18 এইচএলবি কলামে (ওয়াটারস, মিলফোর্ড, ম্যাসাচুসেটস, ইউএসএ) ডিসল্ট করা হয়েছিল এবং সমৃদ্ধ পেপটাইডগুলি শুকিয়ে 0.1 শতাংশ ফরমিক অ্যাসিড (এফএ) জলীয় দ্রবণে পুনর্গঠন করা হয়েছিল। AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF সিস্টেম (জল) লক্ষ্য আবিষ্কারের জন্য CAG বাইন্ডিংয়ের প্রতিক্রিয়া হিসাবে লাইসিন অ্যাক্সেসিবিলিটি পরিবর্তনের পরিমাণগত প্রোফাইলিংয়ের জন্য নমুনাগুলি বিশ্লেষণ করার জন্য নিযুক্ত করা হয়েছিল। ইতিবাচক মোডে ডেটা নির্ভরতা অধিগ্রহণ ডেটা অধিগ্রহণের জন্য নিযুক্ত করা হয়েছিল। PEAKS Studio V.8.5 (BSI সলিউশন, ওয়াটারলু, কানাডা) ব্যবহার করে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। বিশেষত, cys alkylation একটি নির্দিষ্ট পরিবর্তন হিসাবে নির্বাচিত হয়েছিল, এবং TRAP লেবেলিং দ্বারা অর্জিত মেথিওনাইন অক্সিডেশন এবং লাইসিন ডাইমেথিলেশন পরিবর্তনশীল পরিবর্তন হিসাবে সেট করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, যে পেপটাইডগুলি ট্র্যাপ-প্ররোচিত ডাইমেথিলেশন ধারণ করে এবং সিএজি ইনকিউবেশনের সাথে এবং ব্যতীত উল্লেখযোগ্য প্রাচুর্যের পরিবর্তনগুলি প্রদর্শন করে সেগুলি লক্ষ্য-প্রতিক্রিয়াশীল পেপটাইড হিসাবে বরাদ্দ করা হয়েছিল। প্রতিটি TRAP-লেবেলযুক্ত পেপটাইডের প্রাচুর্যের অনুপাত অ্যাক্সেসিবিলিটি পরিবর্তনের পরিমাণ নির্দেশ করে এবং লিগ্যান্ড-বাইন্ডিং অ্যাফিনিটির সাথে ঘনিষ্ঠভাবে জড়িত। লেবেলযুক্ত পেপটাইডগুলির সনাক্ত করা অ্যাক্সেসযোগ্যতা পরিবর্তনগুলি পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ কিনা তা মূল্যায়ন করার জন্য ছাত্রদের টি-পরীক্ষা করা হয়েছিল। একটি আন্তঃগ্রুপ p-মান (p<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

অর্গানয়েড সংস্কৃতি

মানব কোলোরেক্টাল ক্যান্সার অর্গানয়েডগুলি Chongqing Kingbiotech দ্বারা তৈরি এবং চাষ করা হয়েছিল।33 অস্ত্রোপচারের মাধ্যমে অর্জিত রোগীর টিস্যু নমুনাগুলি জীবাণুমুক্ত কাঁচি দ্বারা যতটা সম্ভব ছোট টুকরো টুকরো করা হয়েছিল। বরফের উপর আনুমানিক 1:4 অনুপাতে ম্যাট্রিজেল (কর্নিং, ক্যাট # 356231) এর সাথে টিস্যুর টুকরোগুলি পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে মিশ্রিত করা হয়েছিল। পরবর্তী প্রক্রিয়াকরণ প্রকাশিত প্রোটোকল উল্লেখ করা হয়. সংক্ষেপে, টুকরো-ম্যাট্রিজেল সাসপেনশনগুলিকে মাল্টিওয়েল প্লেটে গোলার্ধীয় ফোঁটা তৈরি করার জন্য দ্রুত বীজ দেওয়া হয়েছিল এবং 15-20 মিনিটের জন্য 37 ডিগ্রিতে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল, যাতে ফোঁটাগুলি শক্ত হতে পারে। প্রতিটি কূপে যথাযথ পরিমাণে সংস্কৃতির মাধ্যম (KingcultureTM Organoid Growth Medium, Cat#KCW-2) ​​যোগ করা হয়েছে এবং প্রতি 2-4 দিনে মাধ্যম পরিবর্তন করা হয়েছে।

মানুষের CD8 T কোষের বিচ্ছিন্নতা এবং সংস্কৃতি

পুরো রক্ত ​​পাতলা করার জন্য অ্যান্টিকোয়াগুল্যান্টযুক্ত সুস্থ মানুষের পেরিফেরাল রক্তে একই পরিমাণ স্বাভাবিক স্যালাইন যোগ করুন। একটি 15mL সেন্ট্রিফিউজ টিউবে একটি নির্দিষ্ট ভলিউম বিচ্ছেদ দ্রবণ যোগ করুন, ধীরে ধীরে টিউব প্রাচীর বরাবর মিশ্রিত পুরো রক্তটি বিচ্ছেদ দ্রবণের শীর্ষে যোগ করুন এবং 20 মিনিটের জন্য 750 গ্রাম সেন্ট্রিফিউজ করুন। সেন্ট্রিফিউগেশনের পরে, মাঝখানের সাদা স্তরে থাকা মনোসাইটগুলিকে সাবধানে 15mL সেন্ট্রিফিউজ টিউবে চুষতে একটি পাইপেট ব্যবহার করুন, পুনরায় সাসপেন্ড করার জন্য PBS এর একটি নির্দিষ্ট ভলিউম যোগ করুন, 5মিনিটের জন্য 250g সেন্ট্রিফিউজ করুন এবং সুপারনাট্যান্ট বাদ দিন। মানুষের CD8 চৌম্বকীয় জপমালা কোষের প্রেসিপিটেটে যোগ করার পরে, CD8 T কোষগুলি LS সাজানোর কলাম দ্বারা বাছাই করা হয়েছিল। 5µg/mL CD3 (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক ক্যাট# 16-0032-38, RRID: AB_2865578) অ্যান্টিবডি, এবং তারপর 10ng/mL IL{{15} দিয়ে প্রি-কোটেড ছিদ্রযুক্ত প্লেটে CD8 T কোষ যোগ করা হয়েছিল } (Peprotech Cat# 212-12) এবং 5µg/mL CD28 (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক ক্যাট# 16-0281-81, RRID: AB_468920) কার্যকরী অ্যান্টিবডিগুলি 24 ঘন্টার জন্য সংষ্কৃত করা হয়েছিল৷

সংস্কৃতি

অর্গানয়েডগুলি 24 ঘন্টার জন্য সিএজি-তে ইনকিউবেট করার পরে, তাজা সংস্কৃতির মাধ্যমটি প্রতিস্থাপন করা হয়েছিল, এবং তারপরে অর্গানয়েড এবং সক্রিয় CD8 টি কোষগুলি ম্যাট্রিক্স জেলে সাসপেন্ড করা হয়েছিল, তারপর সাসপেনশনটি ছয়-ওয়েল প্লেটে যুক্ত করা হয়েছিল এবং 37-এ স্থাপন করা হয়েছিল। 15 মিনিটের জন্য ডিগ্রী ইনকিউবেটর, এবং তারপর 2 মিলি সিরাম-মুক্ত সম্পূর্ণ সংস্কৃতি মাধ্যম 24 ঘন্টার জন্য যোগ করা হয়েছিল।

পশ্চিম ফোঁটার

MC38 এবং HCT-116 কোষগুলিকে ছয়-কূপ প্লেটে 6 ঘন্টার জন্য বীজ দেওয়া হয়েছিল এবং তারপরে আরও 24 ঘন্টার জন্য CAG দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। কোষগুলি ঠান্ডা পিবিএস দিয়ে তিনবার ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল এবং 4 ডিগ্রিতে 5 মিনিটের জন্য 180 গ্রাম সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। বরফের উপর 30 মিনিটের জন্য 1 শতাংশ প্রোটেজ ইনহিবিটর ধারণকারী WB-IP লাইসিস দিয়ে মোট প্রোটিন লাইজ করা হয়েছিল। একটি বিসিএ প্রোটিন কোয়ান্টিটেশন কিট ব্যবহার করে মোট প্রোটিন মূল্যায়ন করা হয়েছিল। প্রোটিন নমুনাগুলি 10 শতাংশ -12 শতাংশ এসডিএস পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল এবং 90 মিনিটের জন্য 350 এমএতে পিভিডিএফ (পলিভিনাইলাইডিন ফ্লোরাইড) ঝিল্লিতে স্থানান্তরিত হয়েছিল। PVDF ঝিল্লি 1 ঘন্টার জন্য 5 শতাংশ BSA দিয়ে ব্লক করা হয়েছিল, রাতারাতি নির্দেশিত প্রাথমিক অ্যান্টিবডি সহ স্ট্রিপগুলি, এবং ঘরের তাপমাত্রায় 90 মিনিটের জন্য সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডির সাথে ইনকিউব করা হয়েছিল। অবশেষে, স্ট্রিপগুলি একটি LumiGLO কেমিলুমিনেসেন্ট সাবস্ট্রেট সিস্টেম (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA) ব্যবহার করে সনাক্ত করা হয়েছিল।

ফ্লো সাইটোমেট্রি

টিউমার টিস্যু এবং একক-কোষ সাসপেনশন হজমের পরে প্রস্তুত করা হয়েছিল। এফসিএম (ফ্লো সাইটোমেট্রি) বাফারে (1 শতাংশ এফবিএস ধারণকারী পিবিএস) পৃষ্ঠের অ্যান্টিজেন অ্যান্টিবডি দিয়ে সারফেস স্টেনিং করা হয়েছিল এবং 30 মিনিটের জন্য উপযুক্ত অ্যান্টিবডি সহ বরফের উপর দাগ দেওয়া হয়েছিল। প্রতিক্রিয়াশীল রঞ্জকগুলি (ইবায়োসায়েন্স) মৃত কোষগুলি নির্মূল করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। আন্তঃকোষীয় সাইটোকাইন স্টেনিং বিডি সেল ফিক্সেটিভ সলিউশন/এক্সট্রাসেলুলার মেমব্রেন দ্রবণ দিয়ে সঞ্চালিত হয়েছিল, এবং কোষগুলিকে স্থির এবং ভেদ করা হয়েছিল, এবং তারপর পার্ম/ওয়াশ বাফারে (বিডি বায়োসায়েন্সেস) সাইটোকাইনগুলির বিরুদ্ধে অ্যান্টিবডি দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল।

CTSB মিউট্যান্ট প্লাজমিড স্থানান্তরিত

HCT-116 কোষগুলিকে 12 ঘন্টার জন্য 6-কূপ প্লেটে বীজ দেওয়া হয়েছিল এবং তারপর CTSB-WT-EGFP বা CTSB মিউট্যান্ট প্লাজমিড (Y75A, A77V, এবং G198A) দিয়ে 36 ঘন্টার জন্য স্থানান্তরিত হয়েছিল৷

MC38 কোষ বা HCT-116 কোষে CTSB-এর ট্রান্সফেকশন হস্তক্ষেপ বা ওভার-এক্সপ্রেশন প্লাজমিড

MC38 কোষগুলিকে (1×106/ওয়েল) 6 ঘন্টার জন্য 6-কূপ প্লেটে টিকা দেওয়া হয়েছিল, তারপরে CTSB হস্তক্ষেপকারী RNA (ক্রম: ফরোয়ার্ড-GGACAUAGAUCUACCUGAATT এবং বিপরীত-UUCAGGUAGAUCUACCUGAATT) 48 ঘন্টার জন্য ট্রান্সফেক্ট করা হয়েছিল, এবং প্রোটিনের প্রকাশের মাত্রা mRNA। Ctsb এবং H2-k1 সনাক্ত করা হয়েছে। HCT-116 কোষগুলিকে (1×106 /ওয়েল) 6 ঘন্টার জন্য 6-ওয়েল প্লেটে ইনোকুলেশন করা হয়েছিল, তারপর CTSB হস্তক্ষেপ (ক্রম: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) বা 48 ঘন্টার জন্য ওভার-এক্সপ্রেশন প্লাজমিড দিয়ে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল, এবং mRNA বা CTSB এবং HLA-A এর প্রোটিন এক্সপ্রেশনের মাত্রা সনাক্ত করা হয়েছিল।

ডকিং প্রযুক্তি

CTSB-এর 3D কাঠামো প্রোটিন ডেটাবেস (PDB ID: 2iPP) থেকে ডাউনলোড করা হয়েছে এবং CAG-এর কাঠামোগুলি PubChem থেকে ডাউনলোড করা হয়েছে। ডকিং প্রক্রিয়াটি অটোডক 2-এ একটি সিমুলেটেড অ্যানিলিং অ্যালগরিদম ব্যবহার করে মোটা ডকিং এবং একটি জেনেটিক অ্যালগরিদম ব্যবহার করে পরবর্তী পরিমার্জন সহ সম্পাদিত হয়েছিল।

সেলুলার থার্মাল শিফট অ্যাস

MC38 কোষ রাতারাতি 10সেমি প্লেটে বীজ করা হয়েছিল এবং তারপরে CAG বা 0.1 শতাংশ DMSO দিয়ে আরও 2 ঘন্টার জন্য চিকিত্সা করা হয়েছিল। কোষগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল, ঠান্ডা পিবিএস দিয়ে ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল এবং 5 মিনিটের জন্য 180g এ সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। কোষগুলিকে তখন সমানভাবে সেন্ট্রিফিউগেশন টিউবে বিভক্ত করা হয়েছিল (প্রতিটি নল 70µL) এবং নিম্নলিখিত তাপমাত্রায় 3 মিনিটের জন্য উত্তপ্ত করা হয়েছিল: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 এবং 67 ডিগ্রি, নমুনাগুলি তাপমাত্রায় 3 মিনিটের জন্য ঠান্ডা করা হয়েছিল এবং তারপর বরফ রাখা. তারপরে, নমুনাগুলি রাতারাতি −80 ডিগ্রিতে একটি রেফ্রিজারেটরে রাখা হয়েছিল। নমুনাগুলি ঘরের তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য গলানো হয়েছিল এবং তারপরে 4 ঘন্টার জন্য −80 ডিগ্রিতে ফ্রিজে রাখা হয়েছিল। অবশেষে, নমুনাগুলিকে 25 মিনিটের জন্য 12, 000g এ সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল, লোডিং বাফারে সুপারনাট্যান্ট যোগ করা হয়েছিল এবং ওয়েস্টার্ন ব্লটিং দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

ইমিউনোহিস্টোকেমিক্যাল স্টেনিং

টিউমার টিস্যুর প্যারাফিন অংশগুলিকে 20 মিনিটের জন্য জাইলিনের মধ্যে ডুবিয়ে দেওয়া হয়েছিল ডিওয়াক্স করার জন্য, এবং তারপরে 100 শতাংশ, 75 শতাংশ এবং 50 শতাংশ ইথানলে 10 মিনিটের জন্য। স্লাইসগুলি সোডিয়াম সাইট্রেট অ্যান্টিজেন মেরামত দ্রবণ দিয়ে অ্যান্টিজেন মেরামতের শিকার হওয়ার পরে, অন্তঃসত্ত্বা হাইড্রোজেন পারক্সাইড 3 শতাংশ হাইড্রোজেন পারক্সাইড দিয়ে নিষ্ক্রিয় করা হয়েছিল। 1 ঘন্টার জন্য 5 শতাংশ ছাগলের সিরাম দিয়ে ব্লক করার পরে, অ্যান্টি-কি67 অ্যান্টিবডি (1:200) যোগ করা হয়েছিল এবং 4 ডিগ্রিতে রাতারাতি ইনকিউব করা হয়েছিল। অ্যান্টি-মাউস/খরগোশ HRP লেবেলযুক্ত পলিমার (100µL) যোগ করা হয়েছিল এবং নমুনাগুলিকে 37 ডিগ্রিতে 30 মিনিটের জন্য ইনকিউবেশন করা হয়েছিল, তারপরে 100µL DAB কার্যকরী সমাধান এবং 5 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউবেশন করা হয়েছিল। হেমাটোক্সিলিন দিয়ে দাগ দেওয়ার 1 মিনিট পরে, নমুনাগুলি 50 শতাংশ, 75 শতাংশ এবং 100 শতাংশ ইথানল এবং জাইলিন 5 মিনিটের জন্য ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং ফিল্মটি সিল করার জন্য নিরপেক্ষ গাম ব্যবহার করা হয়েছিল। ফিল্মটি পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল এবং একটি মাইক্রোস্কোপের নীচে ছবি তোলা হয়েছিল।

পরিসংখ্যানগতবিশ্লেষণ

গ্রাফপ্যাড প্রিজম সফ্টওয়্যার (V.80) ব্যবহার করে পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সমস্ত ফলাফল তিনটি স্বাধীন পরীক্ষার গড় ± SEM হিসাবে প্রকাশ করা হয়। দু'টির বেশি গোষ্ঠী থাকাকালীন পার্থক্যগুলি মূল্যায়ন করতে Dunnett এর পোস্ট-হক পরীক্ষা অনুসরণ করে ভিন্নতার একটি একমুখী বিশ্লেষণ ব্যবহার করা হয়েছিল। ছাত্রদের টি-পরীক্ষা দুটি গ্রুপের মধ্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য মূল্যায়ন করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। একটি পরিসংখ্যানগত তাত্পর্য p এ সেট করা হয়েছিল<0.05.

ফলাফল

সিএজি-র একক-কোষ মাল্টি-ওমিক্স বিশ্লেষণ ইঁদুরের মধ্যে প্রতিস্থাপিত কোলন ক্যান্সারের বৃদ্ধিকে বাধা দেয়

CAG-এর অ্যান্টিটিউমার প্রভাব আছে কিনা তা তদন্ত করতে, আমরা প্রথমে C57BL/6 ইঁদুরে MC38 ক্যান্সার কোষ প্রতিস্থাপন করেছি। আমরা লক্ষ করেছি যে সিএজি উল্লেখযোগ্যভাবে টিউমারের বৃদ্ধিকে বাধা দেয় (অনলাইন পরিপূরক চিত্র S1A, B)। পরবর্তীকালে, আমরা BALB/c ইঁদুরে CT26 কোষ প্রতিস্থাপন করেছি এবং দেখতে পেয়েছি যে CAG টিউমারের বৃদ্ধিকেও বাধা দেয় (অনলাইন সম্পূরক চিত্র S1C, D)।

CAG টিউমার বৃদ্ধিতে বাধা দেয় এমন নির্দিষ্ট প্রক্রিয়াটি আরও প্রকাশ করার জন্য, আমরা scRNA-seq এবং scATAC-seq কৌশলগুলি (চিত্র 1A) ব্যবহার করে এটি বিশ্লেষণ করেছি। আমরা কোষের জনসংখ্যাকে চারটি গ্রুপে বিভক্ত করেছি: ক্যান্সার কোষ, ফাইব্রোব্লাস্ট, মাইলয়েড কোষ এবং লিম্ফোসাইট (চিত্র 1B, অনলাইন সম্পূরক চিত্র S2A, B)। আমরা দেখেছি যে ক্যান্সার কোষ (52 শতাংশ) এবং ফাইব্রোব্লাস্ট (41 শতাংশ) প্রধানত টিউমার টিস্যুতে অনুপ্রবেশ করা হয়েছিল, যেখানে ইমিউন কোষগুলি শুধুমাত্র 7 শতাংশের জন্য দায়ী। তারপরে আমরা ক্যান্সার কোষকে আটটি উপসেটে এবং ফাইব্রোব্লাস্টকে তিনটি উপসেটে (চিত্র 1C-E) ভাগ করেছি। পরবর্তীকালে, প্রতিটি কোষের জনসংখ্যার মধ্যে অত্যন্ত প্রকাশিত জিনের সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে ক্যান্সার কোষে MHC-I আণবিক পথগুলি সমৃদ্ধ হয়েছে, যেমন টি কোষ এবং এনকে কোষগুলির অ্যান্টিটিউমার সংকেত (অনলাইন সম্পূরক চিত্র S2C)। তারপরে, scATAC-seq এবং scRNA-seq ইন্টিগ্রেশন বিশ্লেষণ (চিত্র 2D-G) ব্যবহার করে কোষের চারটি গ্রুপ পাওয়া গেছে। তুলনা করার পরে, আমরা দেখতে পেলাম যে ক্যান্সার কোষ (C01, C03 কোষ), CD8 প্লাস T কোষ, Spp1 প্লাস TAM কোষ এবং ফাইব্রোব্লাস্ট (F01 এবং F02 কোষ) ATAC সিকোয়েন্সিং (চিত্র 1F, G) এ উপস্থিত হয়েছে এবং আরও, অত্যন্ত প্রকাশ করা হয়েছে। ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টরগুলি এই কোষগুলিতে সমৃদ্ধ হয়েছিল (চিত্র 1H)। এই বিশ্লেষণগুলির মাধ্যমে, আমরা অনুমান করি যে সিএজি দ্বারা টিউমার বৃদ্ধির বাধা এই কোষগুলির পরিবর্তনগুলির সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত।

ক্যাগ টিউমার সেল অ্যান্টিজেন উপস্থাপনা প্রচার করে

সিএজি-এর অ্যান্টিটিউমার মেকানিজম বিশ্লেষণ করার জন্য, আমরা প্রথমে টিউমার কোষের জনসংখ্যা বিশ্লেষণ করেছি এবং ক্যান্সার কোষগুলিকে আটটি উপগোষ্ঠীতে বিভক্ত করেছি (চিত্র 2A, B, অনলাইন সম্পূরক চিত্র S3A)। ফলাফলগুলি দেখায় যে, পিবিএস গ্রুপের তুলনায়, C05 গ্রুপ কোষগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে যখন C07 গ্রুপ কোষগুলি বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 2C)। এদিকে, আমাদের টিউমার সেল ক্লাস্টারিংয়ের নির্ভুলতা যাচাই করার জন্য, আমরা লিম্ফোসাইট এবং মাইলয়েড কোষের সিএনভিকে রেফারেন্স কোষ হিসাবে তুলনা করেছি। ফলাফলগুলি দেখায় যে ক্যান্সার কোষের সিএনভি রোগ প্রতিরোধক কোষের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল (অনলাইন সম্পূরক চিত্র S3B)। ক্যান্সার কোষের উপসেটগুলি বিশ্লেষণ করার সময়, আমরা দেখতে পেলাম যে ইন্টারফেরন প্রতিক্রিয়া জিন Isg15, Irf7, Ifit3, এবং Ifi47 PBS গ্রুপের (অনলাইন সম্পূরক চিত্র S3C) এর তুলনায় CAG গ্রুপের C07 এবং C08 কোষের জনসংখ্যাতে অত্যন্ত প্রকাশ করা হয়েছিল। টিউমার কোষের জনসংখ্যার বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে অ্যান্টিজেন উপস্থাপনা-সম্পর্কিত পথগুলি একাধিক কোষের জনসংখ্যার মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে সমৃদ্ধ হয়েছিল। অতএব, আমরা অনুমান করি যে সিএজি ক্যান্সার কোষগুলির অ্যান্টিজেন উপস্থাপনাকে টিউমার প্রতিরোধী ভূমিকা পালন করতে প্রচার করতে পারে (চিত্র 2D)। তারপরে, আমরা অ্যান্টিজেন উপস্থাপনা-সম্পর্কিত জিনগুলি নির্বাচন করেছি এবং দেখতে পেয়েছি যে সিএজি গ্রুপে অভিব্যক্তি স্তরটি পিবিএস গ্রুপের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল (চিত্র 2 ই, অনলাইন সম্পূরক চিত্র S3D)। আমরা আরও দেখতে পেয়েছি যে সিএজি টিউমার টিস্যুতে অ্যান্টিজেন উপস্থাপনাকে প্রচার করেছে (চিত্র 2 এফ, জি)।

এর পরে, আমরা সিএজি-প্রোমোটিং টিউমার সেল অ্যান্টিজেন উপস্থাপনার পিছনে নির্দিষ্ট কারণগুলি বিশ্লেষণ করতে scATAC-seq ব্যবহার করেছি। আমরা দেখতে পেয়েছি যে টিউমার কোষের জনসংখ্যা Fos, Junb, Jund, Fosb, এবং Fosl1 (চিত্র 2H, I) ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টরগুলিকে অত্যন্ত প্রকাশ করেছে। পরবর্তীকালে, আমরা ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর এবং সংশ্লিষ্ট জিনগুলির মধ্যে মিথস্ক্রিয়াটির একটি মানচিত্র তৈরি করেছি ব্যাখ্যা করার জন্য যে সিএজি টিউমার সেল অ্যান্টিজেন-উপস্থাপক-সম্পর্কিত জিনের অভিব্যক্তিকে প্রচার করেছে (চিত্র 2J)। টিউমার টিস্যুতে, আমরা আরও দেখতে পেয়েছি যে CAG চিকিত্সার অধীনে PBS গ্রুপে ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর Junb, Fos, Jund এবং Fosb উল্লেখযোগ্যভাবে অতিপ্রকাশিত হয়েছিল (চিত্র 2K–N, অনলাইন সম্পূরক চিত্র S3E-I)। এখন পর্যন্ত, আমরা দেখেছি যে সিএজি অ্যান্টিজেন-উপস্থাপক-সম্পর্কিত জিনের ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টরগুলির প্রকাশকে প্রচার করতে পারে, যার ফলে ক্যান্সার কোষগুলির অ্যান্টিজেন-উপস্থাপক ফাংশন বৃদ্ধি পায়। যাইহোক, এই ক্যান্সার কোষগুলি কীভাবে ইমিউন কোষের প্রতিক্রিয়াগুলিতে প্রতিক্রিয়া জানায় তা এখনও স্পষ্ট নয়।

CAG ক্যান্সার কোষের অ্যান্টিজেন উপস্থাপনাকে প্রচার করে এমন ঘটনাটি উন্মোচন করার জন্য, আমরা কীভাবে ক্যান্সার কোষগুলি ইমিউন কোষের প্রতিক্রিয়ার প্রতিক্রিয়ায় একে অপরকে পরিবর্তন করে তা তদন্ত করার জন্য ট্র্যাজেক্টোরি বিশ্লেষণ করেছি। আমরা দেখেছি যে, সময়ের সাথে সাথে, C07 ক্যান্সার কোষ C05, C06, এবং C08 কোষে রূপান্তরিত হয়েছে এবং জিন সমৃদ্ধকরণও দেখিয়েছে যে ক্যান্সার কোষগুলি অ্যান্টিজেন উপস্থাপনায় রূপান্তরিত হবে (চিত্র 3A-E)।

সিএজি ইমিউন কোষের হত্যার ফাংশন বাড়ায়

এই ফলাফলগুলি দেখায় যে সিএজি টিউমার সেল অ্যান্টিজেন উপস্থাপন করতে পারে, তাই টিউমার সেল অ্যান্টিজেন উপস্থাপনা কি ইমিউন কোষের কার্যকারিতা বৃদ্ধির দিকে নিয়ে যাবে? এটি বের করার জন্য, আমরা যথাক্রমে লিম্ফোসাইট এবং মাইলয়েড কোষ বিশ্লেষণ করেছি। ফলাফলগুলি দেখায় যে সিএজি টিউমার টিস্যুতে সিডি 8 প্লাস টি কোষের অনুপ্রবেশকে প্রচার করেছে এবং সিডি 8 প্লাস টি কোষ এবং এন কে কোষগুলির অনুপ্রবেশও বৃদ্ধি পেয়েছে, প্রবাহ সাইটোমেট্রি (অনলাইন সম্পূরক চিত্র S4A-F) দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছে। আমরা আরও লক্ষ্য করেছি যে সিএজি CD8 প্লাস টি কোষে Ifitm2, Cxcr6 এবং S100a6 জিনের অভিব্যক্তিকে উন্নত করেছে,

NK কোষে Fcer1g, Gzmb, AW112010, এবং Zfp36i2 জিন এবং CD4 প্লাস T কোষে Nfkbia এবং Junb জিন (অনলাইন সম্পূরক চিত্র S4G)। CD8 প্লাস T কোষে Ifng এবং Gzmb-এর অভিব্যক্তিও উল্লেখযোগ্যভাবে বর্ধিত হয়েছে, যেমন ফ্লো সাইটোমেট্রি (অনলাইন সম্পূরক চিত্র S4H, I) দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছে। তদ্ব্যতীত, আমরা দেখতে পেয়েছি যে CAG চিকিত্সার পরে, CD8 প্লাস টি কোষের পৃষ্ঠে বাধা রিসেপ্টর Lag3, Tigit এবং Havcr2 এর অভিব্যক্তি হ্রাস পেয়েছে, এবং Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5 এবং Pdcd1 জিনের অভিব্যক্তি, বৈশিষ্ট্যযুক্ত CD8 প্লাস T কোষের সক্রিয়করণ, উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (অনলাইন সম্পূরক চিত্র S4J)। আরও যাচাই করার জন্য যে CAG বর্ধিত টিউমার অ্যান্টিজেন উপস্থাপনা প্রচার করে CD8 প্লাস T কোষের হত্যার কার্যকারিতা বাড়িয়েছে, আমরা CT26 কোষগুলিকে নগ্ন ইঁদুরের মধ্যে প্রতিস্থাপিত টিউমারে প্রতিস্থাপন করেছি এবং পর্যবেক্ষণ করেছি যে CAG কার্যকরভাবে টিউমারের বৃদ্ধিকে বাধা দিতে পারেনি (অনলাইন সম্পূরক চিত্র S4K-M) )

এটি অনুসরণ করে, আমরা মাইলয়েড কোষগুলি বিশ্লেষণ করেছি এবং দেখতে পেয়েছি যে CAG চিকিত্সার পরে Spp1 প্লাস TAM কোষ বৃদ্ধি পেয়েছে, যখন C1qc প্লাস TAM কোষের সংখ্যা হ্রাস পেয়েছে এবং Il1b প্লাস মনোসাইটের সংখ্যা বৃদ্ধি পেয়েছে (অনলাইন সম্পূরক চিত্র S5A-D)। CAG চিকিত্সার পরে, Spp1 প্লাস TAM এবং C1qc প্লাস TAM কোষগুলি প্রো-ইনফ্ল্যামেটরি TAM রূপান্তরের জন্য বেশি সংবেদনশীল ছিল। সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে এটি প্রধানত Tnf-, Ifn-g এবং প্রদাহজনক প্রতিক্রিয়া সংকেত পথের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করে (অনলাইন সম্পূরক চিত্র S5E-H)। উপরে উল্লিখিত ফলাফলের উপর ভিত্তি করে, আমরা অনুমান করি যে সিএজি ক্যান্সার কোষে অ্যান্টিজেন উপস্থাপনা প্রচার করে প্রতিরোধক কোষের স্বীকৃতি এবং হত্যার কার্যকারিতা বাড়ায়। তবে সিএজি কীভাবে নিয়ন্ত্রিত হয় তা স্পষ্ট নয়।

ফাঁদ দ্বারা সিএজি লক্ষ্য প্রোটিন CTSB আবিষ্কার

এর পরে, আমরা নির্দিষ্ট সিএজি টার্গেট প্রোটিন তদন্ত করব যা একটি অ্যান্টিটিউমার ভূমিকা পালন করে। আমরা গবেষণা অবজেক্ট হিসাবে ক্যান্সার কোষ নির্বাচন করেছি কারণ আমরা দেখতে পেয়েছি যে CAG ক্যান্সার কোষের অ্যান্টিজেন উপস্থাপনাকে উন্নত করতে পারে, যার ফলে ইমিউন কোষের হত্যার কার্যকারিতা বৃদ্ধি পায়। আমরা প্রথমে CAG-এর বায়োটিন ডেরিভেটিভ সংশ্লেষিত করেছি এবং দেখেছি যে শুধুমাত্র 3-OH প্রতিক্রিয়া করতে পারে (অনলাইন সম্পূরক চিত্র S6A)। তারপরে আমরা তদন্ত করেছি যে সিএজি-বায়োটিন মাউস MC38 টিউমার সেল লাইনে অ্যান্টিজেন উপস্থাপনা-সম্পর্কিত জিনের প্রকাশকেও প্রচার করে কিনা। ফলাফলগুলি দেখায় যে CAG-বায়োটিন H2-K1, Cd74, এবং Anxa1 জিনের (অনলাইন সম্পূরক চিত্র S6B-D) এর অভিব্যক্তিকে প্রভাবিত করেনি।

অতএব, আমরা পরীক্ষাগারে পূর্ববর্তী TRAP টার্গেট অনুসন্ধান পদ্ধতি ব্যবহার করেছি। 32 CAG এবং DMSO উভয়ই MC38 সেল লাইন (চিত্র 4A) এর সাথে ইনকিউবেটেড ছিল। আমরা সিএজি-এর প্রার্থী লক্ষ্য প্রোটিন হিসাবে FC 2 এর চেয়ে বড় বা সমান এবং ap 0.05 এর চেয়ে কম বা সমান প্রোটিন নির্বাচন করেছি। প্রোটিনের সাথে ছোট অণুর আবদ্ধতা লাইসিনের কম লেবেলিং দক্ষতার দিকে পরিচালিত করবে এই নীতি অনুসরণ করে, আমরা অধ্যয়নের জন্য CTSB নির্বাচন করেছি (চিত্র 4B)। এর পরে, আমরা CAG এবং CTSB-এর মধ্যে বন্ধন যাচাই করতে সেলুলার থার্মাল শিফট অ্যাস (চিত্র 4C) এবং মাইক্রোস্কেল থার্মোফোরেসিস (MST) (চিত্র 4D) ব্যবহার করেছি এবং দেখতে পেয়েছি যে CAG এবং CTSB-এর মধ্যে সম্পর্ক ছিল 26.6nM (চিত্র 4D)। পরবর্তীকালে, আমরা PDB লাইব্রেরিতে CTSB-এর প্রোটিন স্ফটিক কাঠামো অনুসারে CAG এবং CTSB-এর মধ্যে বাঁধাই সাইটগুলির পূর্বাভাস দিয়েছিলাম। আমরা দেখতে পেয়েছি যে CAG এর উভয় প্রান্তে হাইড্রোক্সিল গ্রুপ এবং CTSB-এর ALA77 এবং GLY198 সাইটগুলি একটি হাইড্রোজেন বন্ড দ্বারা আবদ্ধ ছিল, যেখানে CAG এবং CTSB-এর TYR75, PRO76, এবং ALA173 সাইটগুলি ভ্যান ডের ওয়ালস ফোর্স দ্বারা আবদ্ধ ছিল (চিত্র 4E) . CAG এবং CTSB-এর মধ্যে বাইন্ডিং সাইট যাচাই করার জন্য, আমরা CTSB-এর মিউট্যান্ট প্লাজমিডকে HCT-116 কোষে স্থানান্তরিত করেছি। ফলাফলগুলি দেখায় যে A77V এবং G198A এবং CAG-তে মিউট্যান্ট প্লাজমিডের মধ্যে সম্পর্ক WT প্লাজমিডের (চিত্র 4F, G) থেকে শতগুণ বেশি ছিল। পরবর্তী বিভাগে, আমরা নির্দিষ্ট প্রক্রিয়াটি অন্বেষণ করি যার দ্বারা সিএজি CTSB-এর মাধ্যমে টিউমার প্রতিরোধী ভূমিকা পালন করে।

【আরো তথ্যের জন্য:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】