গ্লুকোকোর্টিকয়েড-প্ররোচিত ইঁদুর মডেলে সিস্টানচে ডেজার্টিকোলা এবং এর রাইস ওয়াইন স্টিমিং পণ্যের নিউরোএন্ডোক্রাইন-ইমিউন ফাংশন নিয়ে অধ্যয়ন-Ⅰ

1। পরিচিতি

Cistanche deserticola, যাকে "মরুভূমির জিনসেং" বলা হয়, এটি একটি ঐতিহ্যবাহী চীনা ওষুধ যা বহু শতাব্দী ধরে ইয়াং-টনিক ভেষজ হিসাবে ব্যবহৃত হয়ে আসছে।কিডনিকে শক্তিশালী করে এবং ইয়াংকে শক্তিশালী করে[১]। আট প্রজাতি এবং একটি প্রকরণCistanche Herba চীন এবং শুধুমাত্র রেকর্ড করা হয়েছেCistanche deserticolaওয়াইসি মা ওCistanche tubulosa(Schenk) Wight চীনা ফার্মাকোপিয়া [2] নথিভুক্ত করা হয়. ফার্মাকোলজিকাল স্টাডিজ তা প্রমাণ করেছেCistanches Herbaপ্রদর্শিত নিউরোপ্রোটেক্টিভ [৩], ইমিউনোমোডুলেটরি [৪], কার্ডিওপ্রোটেক্টিভ [৫], অ্যান্টিফাটিগ [৬], অ্যান্টি-ইনফ্ল্যামেটরি [৭], হেপাটোপ্রোটেকটিভ [৮], অ্যান্টিঅক্সিডেটিভ [৯], অ্যান্টিব্যাকটেরিয়াল [১০], রেচক [১১], এবং টিউমার প্রতিরোধী প্রভাব [12]। বিস্তৃতএই বংশের রিপোর্ট করা জৈবিক কার্যকলাপের বর্ণালী এর জটিল এবং বৈচিত্র্যময় ফাইটোকেমিক্যাল রচনার জন্য দায়ী করা হয়েছে।Cistanche deserticolaফেনাইলেথানল গ্লাইকোসাইড, ইরিডয়েড, পলিস্যাকারাইড [১৩] ইত্যাদি রয়েছে। মূল ঔষধি পদার্থের মধ্যে ফেনাইলেথানয়েড গ্লাইকোসাইডের পরিমাণ সবচেয়ে বেশি [১৪]।

কিডনি PHGS75% ECH 30% অ্যাক্ট 12% শক্তিশালী করার জন্য প্রাকৃতিক সিস্টানচে টিউবুলোসা

চীনা মেটেরিয়া মেডিকা (সিএমএম) প্রক্রিয়াকরণ একটি ঐতিহ্যবাহী ফার্মাসিউটিক্যাল কৌশল যা চিরাচরিত চীনা ওষুধ তত্ত্ব অনুসারে চিকিত্সা, বিতরণ এবং প্রস্তুতির জন্য বিভিন্ন প্রয়োজনীয়তা পূরণ করে। এই প্রক্রিয়াজাত পণ্যগুলির নাম দেওয়া হয় ডিকোকশন পিস, যা ক্লিনিকগুলিতে ব্যবহৃত হয়। প্রক্রিয়াকরণের লক্ষ্য হল অশোধিত ওষুধের বিষাক্ততা কমাতে কার্যকারিতা বাড়ানো। 2015 চাইনিজ ফার্মাকোপিয়া রেকর্ড করেছে যে সিস্তানচে মোটা স্লাইস (সিডি) এবং রাইস ওয়াইন-স্টিমড সিস্তানচে (ডব্লিউসিডি) ক্লিনিকে ক্বাথের টুকরা হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে। আমাদের গবেষণা গোষ্ঠী দেখিয়েছে যে রেচক প্রভাব উপশম হয়েছে, এবং সিস্তানচেকে চালের ওয়াইন দিয়ে বাষ্প করার পরে অ্যান্টি-এজিং এবং কিডনি-ইয়াং উদ্দীপক প্রভাবগুলিকে উন্নত করা হয়েছিল [15]।

হাইপোথ্যালামাস-পিটুইটারি-অ্যাড্রিনাল গ্রন্থি-থাইমাস গ্রন্থি (HPAT) অক্ষের কার্যকারিতা কিডনি-ইয়াং ঘাটতি সিন্ড্রোমে ব্যাহত হয় [16]। কিডনি-ইয়াং-এর ঘাটতি সহ রোগীদেরও ব্যাপক রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা থাকে। এইচপিএ অক্ষের কর্মহীনতা ইমিউনোডেফিসিয়েন্সির সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত। নিউরোএন্ডোক্রাইন-ইমিউন নেটওয়ার্ক (NEI) তত্ত্ব দেখায় যে ইমিউন এবং নিউরোএন্ডোক্রাইন সিস্টেমগুলি অনেক লিগ্যান্ড এবং রিসেপ্টর ভাগ করে [17], এবং হাইপোথ্যালামাসকে ইমিউন সিস্টেমের সাথে নিউরোএন্ডোক্রাইনকে সংযুক্ত করার জন্য পিভট হিসাবে বিবেচনা করা হয়।

এই গবেষণায়, আমরা এক্সোজেনাস কর্টিকোস্টেরয়েড ইনজেকশন সহ মডেল ইঁদুরের কিডনি-ইয়াং ঘাটতি প্রতিলিপি করেছি এবং অন্তঃস্রাব-ইমিউন ফাংশনের দৃষ্টিকোণ থেকে সিস্তানচে ডেসার্টিকোলার বিভিন্ন প্রক্রিয়াজাত পণ্যের প্রতিক্রিয়া হিসাবে কিডনি-ইয়াং ঘাটতির প্রক্রিয়াটি অন্বেষণ করেছি।

2। সামগ্রী ও পদ্ধতি

2.1। উপকরণ এবং বিকারক

Cistanche deserticola 2019.5 সালে Alashan Neimenggu থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং Pro. Yanjun Zhai (School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, China) দ্বারা Cistanche deserticola YC Ma-এর শুকনো মাংসল কান্ড হিসেবে চিহ্নিত করা হয়েছিল। ভাউচারের নমুনাগুলি লিয়াওনিং প্রসেসিং ইঞ্জিনিয়ারিং টেকনোলজি সেন্টারে সংরক্ষিত ছিল।

চেংদু পিওর কেম-স্ট্যান্ডার্ড কোং লিমিটেড (চেংদু, চীন) থেকে অজুগোলের মানক যৌগ কেনা হয়েছিল; সিস্টানোসাইড এফ,echinacoside, cistanoside A, এবং isoacteosideমাস্ট কোম্পানি (সিচুয়ান চীন) থেকে কেনা হয়েছিল; অ্যাক্টোসাইড ডালিয়ান মেইলুন বায়ো থেকে কেনা হয়েছিল। কোং, লিমিটেড (ডালিয়ান, চীন)। এমএস-গ্রেড অ্যাসিটোনিট্রিল এবং মিথানল মার্ক কেজিএ (ডার্মস্ট্যাড, জার্মানি) থেকে কেনা হয়েছিল। এইচপিএলসি-গ্রেড ফর্মিক অ্যাসিড Merck KGaA (Darmstadt, জার্মানি) থেকে কেনা হয়েছিল। রাইস ওয়াইন Zhejiang ব্র্যান্ড টাওয়ার Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, China) থেকে কেনা হয়েছিল।

কর্টিকোস্টেরন (CAS: 50-22-6, বিশুদ্ধতা > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), chinkuei shin chewan pills (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), rat ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF- , IL-2, এবং IL-10 ELISA সনাক্তকরণ কিটগুলি Nanjing Jiancheng Co., Ltd থেকে কেনা হয়েছিল৷ ইঁদুর কর্টিসল ELISA কিটটি BOSK কোং দ্বারা সরবরাহ করা হয়েছিল, rat CD4 অ্যান্টিবডি, CD8a অ্যান্টিবডি (নম্বর. 561833 এবং 559976), RBC lysate (Solarbio, R1010), PBS বাফার সলিউশন (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM, এবং -অ্যাক্টিন ডাউনস্ট্রিম গুয়াংঝো ইনভিট্রোজেন কোং. রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন কিট (নং RR037A) এবং সিডিএনএ সিন্থেসিস কিট (নং 10000068167) দ্বারা সরবরাহ করা হয়েছে বোলে লাইফ মেডিসিন প্রোডাক্টস (সাংহাই) কোং, লিমিটেড। ক্লোরোফর্ম, আইসোপ্রোপ্যানল, 75% ইথানল, এবং সমাধানটি বিশ্লেষণাত্মকভাবে বিশুদ্ধ এবং সিনোফার্ম কেমিক্যাল রিএজেন্ট কোং লিমিটেড দ্বারা উত্পাদিত হয়েছিল। মিলি-কিউ সিস্টেম (18.2 MΩ, মিলিপুর, এমএ, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) দ্বারা অতি বিশুদ্ধ জল উত্পাদিত হয়েছিল।

2.2। পরীক্ষামূলক যন্ত্র

একটি এনজাইম মার্কার (থার্মো, মডেল 3530911931), স্বয়ংক্রিয় প্লেট ওয়াশার (মডেল HBS- 4009), ডিজিটাল ডিসপ্লে পুশ-পুল ফোর্স মিটার (মডেল ভিক্টর- 50এন), হাই-স্পিড ফ্রিজিং সেন্ট্রিফিউজ (মডেল সিগমা 3k15 ), আল্ট্রামাইক্রো স্পেকট্রোফোটোমিটার (মডেল B-50Q), জিন অ্যামপ্লিফায়ার (মডেল L96G), রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্স কোয়ান্টিটেটিভ পিসিআর (মডেল স্টেপওন), ফ্লো সাইটোমিটার (মডেল AC66051710132), প্যারাফিন মাইক্রোটোম (মডেল লাওকাসলিপি), , মডেল BS-53), এবং একটি বিশুদ্ধ জলের যন্ত্র (মডেল F7JA36507) ব্যবহার করা হয়েছিল৷

2.3। UPLC-Q-TOF-MS এবং ফার্মাকোলজিক্যাল পরীক্ষা-নিরীক্ষার জন্য নমুনা তৈরি করা

WCD একই ব্যাচ থেকে প্রক্রিয়া করা হয়েছিলCistanche deserticolaআমাদের পরীক্ষাগারে। ডাব্লুসিডি তৈরির জন্য, শুকনো সিডি টুকরা (5 মিমি পুরু) (100 গ্রাম) রাইস ওয়াইন (30 মিলি) দিয়ে মিশ্রিত করা হয়েছিল, উচ্চ চাপে (1.25 কেপিএ) 4 ঘন্টার জন্য বাষ্প করা হয়েছিল এবং তারপরে 55 ডিগ্রিতে শুকানো হয়েছিল।

CD এবং WCD এর মোটা পাউডারগুলি 0.5 ঘন্টার জন্য 10 বার 95% ইথানলে ভিজিয়ে রাখা হয়েছিল, প্রতিবার 1 ঘন্টার জন্য 3 বার রিফ্লাক্স-নিষ্কাশিত, এবং ফিল্টার করা হয়েছিল, এবং ফিল্টারগুলি 3 বার একত্রিত করা হয়েছিল। কম চাপে ইথানল পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল, এবং নির্যাসটি প্রশাসনের জন্য প্রাপ্ত হয়েছিল। নির্যাস (1 mL) 50% মিথানলে যোগ করা হয়েছিল, যা মোট আয়তনকে 20 mL এ নিয়ে আসে এবং বিষয়বস্তু বিশ্লেষণের জন্য 4 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়।

PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4। UPLC-QqQ-MS CD এবং WCD নির্যাস বিশ্লেষণের শর্তাবলী

2.4.1। LCThMS বিশ্লেষণাত্মক শর্তাবলী

MassLynx 4.1 বিশ্লেষক সফ্টওয়্যার সহ UPLC-MSThMS সিস্টেম ডেটা অধিগ্রহণ এবং প্রক্রিয়াকরণ সম্পাদন করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। বিশ্লেষণাত্মক কলামটি ছিল একটি অ্যাকুইটি UPLC BEH C18 (1{{10}}0 মিমি × 2.1 মিমি, 1.7 μm) 40 ডিগ্রি সেলসিয়াস তাপমাত্রায়। মোবাইল ফেজ ছিল 0.1% ফরমিক অ্যাসিড জলীয় দ্রবণ (A) এবং 0.1% ফর্মিক অ্যাসিড (B) ধারণকারী অ্যাসিটোনিট্রিল। ইলুশন গ্রেডিয়েন্ট ছিল 0৷{15}}–1৷{17}} মিনিট সহ 3% B, 1.01–2৷{22}} মিনিট সহ 3%–11.5% B, 2.01–3৷{29} }} মিনিট 12% B সহ, 3.01–4৷{34}} মিনিট 15% B সহ, 4.01–5৷{39}} মিনিট 20% B সহ, 5.01–6৷{44}} মিনিট 22 সহ % B, 6.01–8।{49}} মিনিট 25% B সহ, এবং 8.01–9।

একটি ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়নাইজেশন (ESI) উত্স দিয়ে সজ্জিত ওয়াটারস ট্রিপল কোয়াড্রপল ভর স্পেকট্রোমিটার (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, USA) নেতিবাচক আয়ন মোডে ব্যবহার করা হয়েছিল। 250 ডিগ্রী তাপমাত্রায় 500 এলটিএইচএইচ এর প্রবাহ হার সহ দ্রবীভূতকরণ গ্যাসটি নাইট্রোজেন ছিল। সমস্ত শনাক্ত যৌগ একাধিক প্রতিক্রিয়া পর্যবেক্ষণ (MRM) মোডে পরিমাপ করা হয়েছিল; সারণী 1 শক্তির পরামিতি দেখায়, এবং সারণী 2 বিশ্লেষণকৃত উপাদানগুলির জন্য ক্রমাঙ্কন বক্ররেখা দেখায়।

2.4.2। রেফারেন্স পদার্থ প্রস্তুতি

টিউবুলসাইড এ (৩৷{10}}2 মিলিগ্রাম), ইচিনাকোসাইড (3৷{3}} মিলিগ্রাম), 2′-অ্যাসিটিল্যাকটিওসাইড (2.34 মিলিগ্রাম), অ্যাকটিওসাইড (2.45 মিলিগ্রাম), আইসোঅ্যাকটিওসাইড (0.61 মিলিগ্রাম), সিস্টানোসাইড এফ ( 2.14 মিলিগ্রাম), স্যালিড্রোসাইড (3.39 মিলিগ্রাম), জেনিপোসিডিক অ্যাসিড (2.84 মিলিগ্রাম), অজুগোল (1.58 মিলিগ্রাম), এবং ক্যাটালপোল (2.39 মিলিগ্রাম) একটি স্টক দ্রবণ প্রস্তুত করতে মিথানলে দ্রবীভূত করা হয়েছিল। কাজের মান সমাধানের জন্য উপযুক্ত ঘনত্ব পেতে স্টক দ্রবণটি মিথানল দিয়ে পাতলা করা হয়েছিল। সমস্ত প্রস্তুত সমাধান ব্যবহারের আগে 4 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়েছিল।

2.5। পশু মডেলের প্রস্তুতি এবং গ্রুপিং

এসডি পুরুষ ইঁদুর (180-220 গ্রাম) লিয়াওনিং চ্যাংশেং বায়োটেকনোলজিকাল কোং থেকে কেনা হয়েছিল, পশু পারমিট নম্বর: SCXK (লিয়াও) 2015-0001। সমস্ত ইঁদুর 25 ডিগ্রি এবং 30-50% আপেক্ষিক আর্দ্রতার সাথে খাবার এবং জলের বিনামূল্যে অ্যাক্সেসের সাথে বজায় রাখা হয়েছিল। পরীক্ষার আগে প্রাণীগুলিকে 7 দিন ধরে রাখা হয়েছিল।

একশো ইঁদুরকে এলোমেলোভাবে 10 গ্রুপে ভাগ করা হয়েছিল: ফাঁকা নিয়ন্ত্রণ (BC) গ্রুপ, মডেল কন্ট্রোল (MC) গ্রুপ, পজিটিভ কন্ট্রোল (PC) গ্রুপ, রাইস ওয়াইন কন্ট্রোল (WC) গ্রুপ, CD হাই-ডোজ (CD) -এইচডি) গ্রুপ, সিডি মিডল-ডোজ (সিডি-এমডি) গ্রুপ, সিডি লো-ডোজ (সিডি-এলডি) গ্রুপ, ডাব্লুসিডি হাই-ডোজ (ডব্লিউসিডি-এইচডি) গ্রুপ, ডাব্লুসিডি মিডল-ডোজ (ডব্লিউসিডি-এমডি) গ্রুপ, এবং WCD লো-ডোজ (WCD-LD) গ্রুপ। CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD, এবং CD-LDThWCD-LD এর ডোজ ছিল যথাক্রমে 5.48 gTh(kg ∙ d), 2.74 gTh (kg ∙ d), এবং 1.37 gTh (kg ∙ d),। PC গ্রুপের জন্য ডোজ ছিল 1.646 gTh(kg ∙ d), এবং WC গ্রুপের জন্য, 40 দিনের জন্য 1 mLTh100 গ্রাম। প্রশাসনের 6 তম দিনে, ইঁদুরগুলিকে কর্টিকোস্টেরন ওয়াটার সাসপেনশন (কর্টিকোস্টেরন + 0.1% ডাইমিথাইল সালফক্সাইড + 0.1% টুইন-80 + 0.9% সোডিয়াম ক্লোরাইড) দিয়ে সাবকুটেনে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। বিসি গ্রুপের জন্য [১৮]। কর্টিকোস্টেরনের ঘনত্ব ছিল 5 gThL, এবং ডোজ ছিল 0.1 mLTh100 গ্রাম। বিসি গ্রুপের ইঁদুরগুলিকে একই ডোজে ইনজেকশনের মাধ্যমে সাধারণ স্যালাইন + 0.1% ডাইমিথাইল সালফক্সাইড + 0.1% টুইন- 80 + 0.9% সোডিয়াম ক্লোরাইড দেওয়া হয়েছিল।

2.6। HPA অক্ষ ফাংশন নির্ধারণ

2.6.1। ওজন, তাপমাত্রা এবং হোল্ডিং পাওয়ার টেস্ট

প্রতি 3 দিনে একটি ওজন পরীক্ষা করা হয়েছিল এবং প্রতি 6 দিনে তাপমাত্রা নেওয়া হয়েছিল। পরীক্ষার সময়। 39 তম দিনে, পিছনের অঙ্গের সর্বাধিক শক্তি একটি গ্রিপ মিটার দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল। ইঁদুরগুলিকে মসৃণ প্ল্যাটফর্মে স্থাপন করা হয়েছিল, যার ফলে তাদের পিছনের অঙ্গগুলি খুঁটিটি ধরেছিল। ইঁদুরেরা স্বতঃস্ফূর্তভাবে যেকোন বস্তুকে পিছিয়ে যাওয়া ঠেকাতে টেনে নেবে যখন লেজ টানতে হবে যতক্ষণ না টান বল গ্রিপ ছাড়িয়ে যায়। যখন ইঁদুর তার খপ্পর হারিয়ে ফেলে, তখন প্রিমপ্লিফায়ার স্বয়ংক্রিয়ভাবে সর্বাধিক গ্রিপ বল রেকর্ড করতে পারে।

2.6.2। সিরামে T, CRH, ACTH, CORT, এবং কর্টিসলের মাত্রা নির্ধারণ

শেষ প্রশাসনের এক ঘন্টা পরে, ইঁদুরগুলিকে ইউরেথেন দ্রবণ (20 gTh100 mL) এর ইন্ট্রাপেরিটোনিয়াল ইনজেকশন দ্বারা চেতনানাশক করা হয়েছিল। তারপরে, রক্তের নমুনা সংগ্রহ করা হয়, সিরাম পেতে 15 মিনিটের জন্য 3500 r এ সেন্ট্রিফিউজ করা হয় এবং −20 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়। T, CRH, ACTH, CORT, এবং কর্টিসলের ঘনত্ব প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে ইঁদুর ELISA কিট দিয়ে পরিমাপ করা হয়েছিল।

2.6.3। মাইক্রোস্কোপ পর্যবেক্ষণ

অ্যাড্রিনাল গ্রন্থি টিস্যুর আকারগত গঠন HE স্টেনিং দ্বারা পরিলক্ষিত হয়েছিল। অ্যাড্রিনাল টিস্যুকে 10% প্যারাফর্মালডিহাইডে স্থির করা হয়েছিল, ইথানলে ডিহাইড্রেট করা হয়েছিল, একটি জাইলিন দ্রবণ দ্বারা স্বচ্ছ করা হয়েছিল, প্রচলিত পদ্ধতি দ্বারা এমবেড করা হয়েছিল, 4 μm পুরু স্লাইসগুলিতে কাটা হয়েছিল, জাইলিন দ্রবণ দিয়ে ডিওয়াক্স করা হয়েছিল, ইথানল গ্রেডিয়েন্ট দিয়ে হাইড্রেট করা হয়েছিল, এবং তারপরে দাগ দেওয়া হয়েছিল এবং ইথানল দ্রবণ দিয়ে। স্টেনিং সমাধান। জাইলিন দিয়ে স্বচ্ছ করার পরে, প্লেটটিকে নিরপেক্ষ গাম দিয়ে সিল করা হয়েছিল এবং একটি মাইক্রোস্কোপের নীচে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।

2.6.4। অ্যাড্রিনাল গ্রন্থিতে ব্যাক্স, বিসিএল-2, ক্যাসপেস-3, ফাস এবং ফাএসএল প্রোটিনের প্রকাশের ইমিউনোহিস্টোকেমিক্যাল স্টেইনিং

ফরমালিন-স্থির, প্যারাফিন-এমবেডেড ইঁদুরের অ্যাড্রিনাল বিভাগগুলি 4 μm পুরুত্বে কাটার পরে ডিপারাফিনাইজ করা হয়েছিল এবং পুনরায় হাইড্রেট করা হয়েছিল। অন্তঃসত্ত্বা পারক্সিডেস ক্রিয়াকলাপকে ব্লক করার জন্য, বিভাগগুলিকে 10 মিনিটের জন্য হাইড্রোজেন পারক্সাইড ব্লকে প্রি-ইনকিউবেট করা হয়েছিল। বিভাগগুলিকে 0.01 M সাইট্রেট (pH 6.0) এ ডুবিয়ে ফুটন্ত অবস্থায় উত্তপ্ত করা হয়েছিল৷ প্রক্রিয়াটি 5-10 মিনিটের পরে পুনরাবৃত্তি হয়। ঠাণ্ডা হওয়ার পরে, বিভাগগুলিকে PBS (pH 7.2–7.6) দিয়ে 1-2 বার ধুয়ে ফেলা হয়, প্রায় 5 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় রেখে দেওয়া হয় এবং PBS (pH 7.2–7.6) দিয়ে 2-3 বার ধুয়ে ফেলা হয়। 5% BSA ব্লকিং দ্রবণ ঘরের তাপমাত্রায় যোগ করা হয়েছিল এবং 20 মিনিট পরে অংশের অতিরিক্ত তরলটি ঝেড়ে ফেলা হয়েছিল। FasTh FasL, Bcl-2ThBax, এবং caspase-3 (PBS এর সাথে 1:100 মিশ্রিত) এর জন্য সুনির্দিষ্ট পাতলা প্রাথমিক অ্যান্টিবডি যোগ করা হয়েছিল এবং 37 ডিগ্রীতে 1 ঘন্টা বা 4 ডিগ্রী রাতারাতি ইনকিউব করা হয়েছিল। বিভাগগুলি পিবিএস (পিএইচ 7.2-7.6) দিয়ে 2-3 বার ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল। তারপরে, বায়োটিনিলেটেড গোট অ্যান্টি-মাউস আইজিজি যোগ করা হয়েছিল, এবং বিভাগগুলি 20-37 ডিগ্রিতে 20 মিনিটের জন্য শুকানো হয়েছিল এবং 5 মিনিটের জন্য পিবিএস (পিএইচ 7.2-7.6) দিয়ে 4 বার ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল। পিবিএস-এ পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে ধোয়ার পরে, বিভাগগুলিকে 30 মিনিটের জন্য বিকারক A এবং B এর মিশ্রণ দিয়ে ধূপিত করা হয়েছিল, 45 মিনিটের জন্য PBS দিয়ে ধূসরিত করা হয়েছিল এবং অবশেষে হেমাটোক্সিলিনের সাথে সামান্য প্রতিকূল হওয়ার আগে 30 মিনিটের জন্য DAB সাবস্ট্রেট (DAKO) দিয়ে বিকশিত করা হয়েছিল, ডিহাইড্রেটেড, এবং মাউন্ট করা হয়েছে।

যৌন সংবেদন বাড়ানোর জন্য ন্যাচারাল সিস্টানচে টিউবুলোসা PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7। ইমিউন ফাংশন নির্ধারণ

2.7.1। ইমিউন অর্গান সূচকের গণনা

শেষ প্রশাসনের এক ঘন্টা পরে, ইউরেথেন দ্রবণ (20 gTh100 mL) এর ইন্ট্রাপেরিটোনিয়াল ইনজেকশন দ্বারা ইঁদুরগুলিকে অবেদন দেওয়া হয়েছিল এবং তারপরে প্লীহা এবং থাইমাস গ্রন্থিটি সরিয়ে ফেলা হয়েছিল এবং অবিলম্বে একটি জীবাণুমুক্ত হুডে ওজন করা হয়েছিল। প্লীহা বা থাইমাসের ওজন সহগ (%) � প্লীহা বা থাইমাসের ওজন (mg) শরীরের ওজন (g)।

2.7.2। পেরিফেরাল রক্তে টি লিম্ফোসাইট উপসেট সনাক্তকরণ

স্প্লেনোসাইট এবং হিমোসাইটগুলি অন্ধকারে 30 মিনিটের জন্য মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি অ্যান্টি-সিডি 4 (পিই) এবং অ্যান্টি-সিডি 8 (এফআইটিসি) দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। 2 মিলি এরিথ্রোসাইট লাইসেট যোগ করা হয়েছিল, এবং ঘূর্ণন দ্বারা সমাধান মিশ্রিত করা হয়েছিল। সমাধানটি 10 ​​মিনিটের জন্য অন্ধকারে রেখে দেওয়া হয়েছিল এবং 5 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। সুপারনাট্যান্টটি বাতিল করা হয়েছিল, এবং তারপরে দ্রবণটি বরফ-ঠান্ডা পিবিএস দিয়ে 3 বার ধুয়ে পিবিএস পারমিবিলাইজিং দ্রবণে পুনঃস্থাপন করা হয়েছিল। প্রতিটি ম্যাব স্টেনিংয়ের 1 ঘন্টার মধ্যে ফ্লো সাইটোমেট্রি দ্বারা কমপক্ষে 10,{11}} কোষ বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

2.7.3। সিরামে IL-10, IL-6, IL-2, TNF- এবং IFN-c-এর স্তর নির্ধারণ

শেষ প্রশাসনের এক ঘন্টা পরে, ইঁদুরগুলিকে ইউরেথেন দ্রবণ (20 gTh100 mL) এর ইন্ট্রাপেরিটোনিয়াল ইনজেকশন দ্বারা চেতনানাশক করা হয়েছিল এবং পেটের মহাধমনী থেকে রক্ত ​​নেওয়া হয়েছিল। সিরাম পাওয়ার জন্য রক্তকে 3500 r এ 15 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং −20 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়েছিল। IL-10, IL-6, IL-2, TNF- , এবং IFN-c-এর ঘনত্বগুলি প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে ইঁদুর ELISA কিটগুলির সাথে সনাক্ত করা হয়েছিল৷

2.8। হাইপোথ্যালামাস এবং হাইপোফাইসিস টিস্যুতে CaM এর প্রকাশ

TRIzol দ্বারা হাইপোথ্যালামাস এবং হাইপোফিসিস টিস্যু থেকে মোট আরএনএ বের করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে মোট আরএনএর 10 μL তে বিপরীত প্রতিলিপি করা হয়েছিল। dsDNA-বাইন্ডিং ডাই (প্রোমেগা, USA) এবং CFX 96 রিয়েল-টাইম পিসিআর সিস্টেম (বায়ো-র্যাড, ইউএসএ) এর উপস্থিতিতে qPCR-এর মাধ্যমে সমান পরিমাণে cDNA বিশ্লেষণ করা হয়েছিল প্রাথমিক অ্যাক্টিভেশনের শর্তে বিভিন্ন জিন দেখার জন্য 10 মিনিটের জন্য 95 ডিগ্রী, 15 সেকেন্ডের জন্য 95 ডিগ্রীতে বিকৃতকরণের 40 চক্র এবং 1 মিনিটের জন্য 60 ডিগ্রিতে অ্যানিলিং এক্সটেনশন।

CaM এবং -actin-এর প্রাইমারগুলি সারণি 1 এ দেওয়া হয়েছে, এবং -actin একটি অভ্যন্তরীণ নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। প্রতিটি নমুনা টার্গেট জিন এবং অ্যাক্টিনের মধ্যে সমালোচনামূলক থ্রেশহোল্ডের (সিটি) পার্থক্য ব্যবহার করে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। ফলাফল বর্ণনা করার জন্য নিম্নলিখিত সমীকরণটি ব্যবহার করা হয়েছিল: ΔΔCt � (Ct টার্গেট জিন − Ct -actin জিন) পরীক্ষামূলক গ্রুপ − (Ct টার্গেট জিন − Ct -actin জিন) নিয়ন্ত্রণ গ্রুপ। তারপর প্রতিটি নমুনার mRNA স্তরগুলি 2- ΔΔCt টার্গেট জিন ব্যবহার করে তুলনা করা হয়েছিল। প্রতিটি গ্রুপের ফলাফল গড় ছিল (সারণী 3)।

2.9। পরিসংখ্যান সংক্রান্ত বিশ্লেষণ

সমস্ত ডেটা SPSS সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল (সংস্করণ 19৷{1}}, SPSS Institute Inc., Chicago, IL)৷ গোষ্ঠীগুলির মধ্যে পার্থক্যগুলি একমুখী পুনরাবৃত্তি-পরিমাপ বিশ্লেষণের বৈচিত্র্য (ANOVA) দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। গ্রাফপ্যাড প্রিজম সফ্টওয়্যার (সংস্করণ 6৷{5}}, সান দিয়েগো, CA, USA) ব্যবহার করে ফলাফলগুলিকে গড় ± স্ট্যান্ডার্ড বিচ্যুতি (SD) হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছিল৷ 0.05 এর চেয়ে কম P মানের সাথে পার্থক্যগুলি পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল৷

3. পরীক্ষামূলক ফলাফল

3.1। UPLC-QqQ-MSAnalysis

সর্বোত্তম বিচ্ছেদ, শিখর আকৃতি এবং একটি সংক্ষিপ্ত বিশ্লেষণের সময় অর্জন করতে, কলাম, মোবাইল ফেজ এবং গ্রেডিয়েন্ট প্রোগ্রাম সহ ক্রোমাটোগ্রাফিক শর্তগুলি আমাদের প্রাথমিক পরীক্ষায় অধ্যয়ন করা হয়েছিল। এমআরএম মোড সহ সাধারণ ক্রোমাটোগ্রামগুলি চিত্র 1 এ উপস্থাপন করা হয়েছে।

সারণি 4 থেকে, আমরা দেখতে পাচ্ছি যে ডব্লিউসিডিতে ফেনাইলেথানয়েড গ্লাইকোসাইডের বিষয়বস্তু সিডির তুলনায় বেড়েছে, বিশেষ করে ইচিনাকোসাইড এবং অ্যাক্টিওসাইডের জন্য, যখন ডব্লিউসিডিতে ইরিডয়েডের বিষয়বস্তু হ্রাস পেয়েছে।

3.2। HPA অক্ষ ফাংশনের জন্য প্রবিধান

3.2.1। ওজন, তাপমাত্রা এবং হোল্ডিং পাওয়ার টেস্ট

এমসি গ্রুপ এবং পরীক্ষামূলক গ্রুপের ইঁদুরগুলি কর্টিকোস্টেরন দেওয়ার পরে ধীরে ধীরে কিডনি-ইয়াং ঘাটতির লক্ষণগুলি দেখায়। ওজন হ্রাস, হাইপোথার্মিয়া, চুলের দীপ্তি কমে যাওয়া, আত্মা ঝুলে যাওয়া, প্রতিক্রিয়ায় পিছিয়ে যাওয়া, এবং জলের ব্যবহার এবং কার্যকলাপে উল্লেখযোগ্য হ্রাসের মতো লক্ষণগুলি সিডি এবং ডাব্লুসিডি গ্রুপগুলিতে ব্যাপকভাবে উন্নত হয়েছে। চিত্র 2(a) ওজন পরিবর্তন দেখায়। ওষুধের প্রতিটি গ্রুপের ওজন বেড়েছে, বিশেষ করে CDHD এবং WCD-HD গ্রুপে। এমসি গ্রুপে ওজন বৃদ্ধি সর্বনিম্ন ছিল। চিত্র 2(b) তাপমাত্রার পরিবর্তন দেখায়, যা MC গ্রুপে সর্বনিম্ন ছিল এবং WCD-HD, WCD-MD, এবং WCD-LD গ্রুপে তাপমাত্রা বৃদ্ধি পেয়েছে।

চিত্র 2(c) দেখায় যে BC গ্রুপ এবং প্রতিটি পরীক্ষামূলক গোষ্ঠীর জন্য ধারণ ক্ষমতা বৃদ্ধি পেয়েছে, এবং WCD-MD গ্রুপ সর্বোচ্চ ছিল, যা প্রমাণ করে যে প্রশাসনের পরে কিডনি-ইয়াং ঘাটতি দ্বারা প্ররোচিত দুর্বলতার লক্ষণগুলি উন্নত হয়েছে।

3.2.2। T, CRH, ACTH, CORT, এবং কর্টিসলের স্তর

চিত্র 3 দেখায় যে বিসি গ্রুপের তুলনায়, ইঁদুরের সিরামে T, CRH, ACTH এবং CORT-এর মাত্রা কমেছে (P < 0।{3}}1) এবং কর্টিসলের মাত্রা কমেছে (P < 0৷{11}}5) MC গ্রুপে৷ MC গ্রুপের তুলনায়, WCD-HD এবং WCD-MD গ্রুপে T-এর মাত্রা বেড়েছে (P < 0।{21}}1), WCD-LD-তে CRH-এর মাত্রা, WCD-MD, এবং WC গ্রুপের উন্নতি হয়েছে (P < 0.01), ACTH-এর বিষয়বস্তু CD-HD, WCD-MD, এবং WCD-HD গ্রুপগুলিতে (P <0.01), CORT স্তরে আপগ্রেড হয়েছে CD-MD, WCD-MD, এবং WCD-HD গ্রুপ (P <0.01) এবং CDHD এবং WCD-LD গ্রুপে বর্ধিত (P <0.05), এবং প্রতিটি ড্রাগ গ্রুপে কর্টিসলের মাত্রা বৃদ্ধি পেয়েছে।

3.2.3। মাইক্রোস্কোপ পর্যবেক্ষণের ফলাফল

অ্যাড্রিনাল গ্রন্থি টিস্যু কর্টিকাল স্তর এবং মেডুলা স্তরে বিভক্ত করা যেতে পারে। কর্টিকাল স্তরগুলির মধ্যে রয়েছে গ্লোবুলার, বান্ডিল এবং জালিকা স্তর। কোষগুলিতে আরও লিপিড থাকে এবং মেডুলা স্তরে বেশিরভাগ ফিওক্রোমাসাইটোমা কোষ এবং অল্প পরিমাণে তন্তুযুক্ত টিস্যু থাকে। চিত্র 4-এ দেখানো হিসাবে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে BC গ্রুপে সবকিছু স্বাভাবিক ছিল, যখন MC গ্রুপে, অ্যাড্রিনাল কর্টেক্সের সুস্পষ্ট হাইপারপ্লাসিয়া, সেলুলার অ্যাট্রোফি এবং ক্রমবর্ধমান ঘনত্ব ছিল। বাল্বস স্ট্রিপ পুরু হয়ে গেছে, এবং ট্রান্সলুসেন্ট ফ্যাসিকুলার জোন, সরু জোনা রেটিকুলারিস এবং ছোট কোষগুলি অসম রঙ এবং কৈশিক কনজেশন দেখায়। পিসি গ্রুপে, কর্টিকাল এবং মেডুলার সীমানা দৃশ্যমান ছিল। গ্লোবুলার এবং বান্ডিল ব্যান্ডের কোষগুলি সমানভাবে সাজানো হয়েছিল এবং রূপগত কাঠামো পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল। একই ভাল পুনরুদ্ধার WCD গ্রুপগুলিতে পরিলক্ষিত হয়েছিল এবং WCD-MD গ্রুপের প্রভাবগুলি WCD-HD এবং WCD-LD গ্রুপগুলির তুলনায় ভাল ছিল। সিডি গ্রুপে অ্যাড্রিনাল গ্রন্থির আকারবিদ্যা WCD গ্রুপের মতো ভালো ছিল না।

PHGS75% ECH 30% ACT 12%