সিক্রেটেড নিউট্রোফিল জেলটিনেস-সম্পর্কিত লাইপোক্যালিন ননসিক্রেটেড ফর্মের তুলনায় ADPKD কোষের সিস্টের বৃদ্ধিকে বাধা দেওয়ার শক্তিশালী ক্ষমতা দেখায় Ⅲ
Jun 25, 2024
3.4। 3D সংস্কৃতিতে 2L3 কোষের সিস্ট গঠনের উপর mNGAL-এর প্রভাব
কোষের বিস্তার2L3 ইঁদুরে অস্বাভাবিকভাবে বৃদ্ধি পায় এবং সিস্ট গঠন এবং বৃদ্ধির দিকে পরিচালিত করে [17]। পূর্ববর্তী ফলাফলের উপর ভিত্তি করে যা mNGAL বাধা দেয়2D সংস্কৃতিতে 2L3 কোষের বিস্তার(চিত্র 3), আমরা অনুমান করেছি যে mNGAL 2L3 কোষে সিস্ট গঠনকে আরও বাধা দিতে পারে। mNGAL 2L3 কোষে সিস্ট গঠনকে বাধা দিতে পারে কিনা তা তদন্ত করতে, আমরা একটি 3D সংস্কৃতি প্ল্যাটফর্ম প্রতিষ্ঠা করেছি যা সিস্ট গঠনের জন্য ম্যাট্রিজেলের সাথে একটি উপযুক্ত পরিবেশ প্রদান করে (চিত্র 6)। রাতারাতি প্রিফর্মড ম্যাট্রিজেলের উপরে কোষগুলিকে 96-ওয়েল প্লেটে (1000 কোষ/কূপ) বীজ দেওয়া হয়েছিল। কোষগুলি জেলের সাথে সংযুক্ত হওয়ার পরে, স্যান্ডউইচের মতো প্যাটার্ন তৈরি করতে কোষগুলিতে আরও ম্যাট্রিজেল যুক্ত করা হয়েছিল (চিত্র 6A)। সিস্ট গঠনের জন্য কোষগুলিকে 3D কালচারে 37 ◦C এবং 5% CO2 তে কমপক্ষে 5 দিনের জন্য বজায় রাখা হয়েছিল। 3D সংস্কৃতিতে সিস্টগুলি দীর্ঘায়িত সংস্কৃতির সময় (চিত্র 6B) এর সাথে বড় হয়েছে। 3D সংস্কৃতিতে পরিলক্ষিত গোলাকার গঠনগুলি একটি লুমেন সহ সিস্ট ছিল তা নিশ্চিত করার জন্য, আমরা যথাক্রমে কোষের নিউক্লিয়াস, সেল-সেল অ্যাডএইচ, এসিয়ন এবং অ্যাপিক্যাল মেমব্রেন সনাক্ত করতে DAPI এবং ই-ক্যাডারিন এবং অ্যাক্টিন অ্যান্টিবডি দিয়ে সেগুলিকে স্থির এবং দাগ দিয়েছি। উপরের (স্তর 1) থেকে মাঝামাঝি (স্তর 5) পর্যন্ত 3D সংস্কৃতিতে একটি 2L3 সিস্টের বিভিন্ন অপটিক্যাল z বিভাগগুলি কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি দ্বারা পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল, এবং লুমেনটি গোলাকার সিস্টের মধ্যে নিশ্চিত হয়েছিল (চিত্র 6C, পরিপূরক উপাদান
ADPKD এর জন্য নতুন হার্বস (পলিসিস্টিক কিডনি রোগ)
3D সংস্কৃতিতে 2L3 কোষের সিস্ট গঠনের উপর mNGAL-এর প্রভাবগুলি তদন্ত করতে, 3D সংস্কৃতির কোষগুলিকে সিস্ট গঠনে প্ররোচিত করার জন্য 1 থেকে 3 দিন পর্যন্ত ফোরস্কোলিন দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। কোষগুলি তারপর 4 থেকে 8 দিন পর্যন্ত mNGAL দিয়ে বা ছাড়াই চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং সিস্টের ব্যাস প্রতিদিন পরিমাপ করা হয়েছিল (চিত্র 6D)। 40 থেকে 120 µm (চিত্র 6E–G) ব্যাস সহ 3D সংস্কৃতিতে সিস্টগুলি সংস্কৃতির দিনের সংখ্যার সাথে আনুপাতিকভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে, যখন mNGAL উল্লেখযোগ্যভাবে সিস্টের ব্যাস (চিত্র 6F) এবং এলাকা (চিত্র 6G) 8 তম দিন পর্যন্ত দমন করেছে। তবে , দিন 4 থেকে 8 (চিত্র 6H) পর্যন্ত নিয়ন্ত্রণ এবং এমএনজিএএল-চিকিত্সা করা গ্রুপগুলির মধ্যে সিস্টের সংখ্যা বৃদ্ধিতে কোনও উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল না। আমরা দুটি গ্রুপের মধ্যে বড় সিস্টের সংখ্যা (ব্যাস > 100 µm) বিশ্লেষণ করেছি এবং দেখতে পেয়েছি যে mNGAL 8 তম দিনে (চিত্র 6I) কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় বড় সিস্টের শতাংশ উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করেছে।
3.5। 2L3 কোষে NGAL এক্সপ্রেশন এবং কোষের বিস্তারের উপর pN + LS এবং pN − LS এর সাথে স্থানান্তরের প্রভাব
2L3 কোষের (চিত্র 6) সিস্টের বৃদ্ধি রোধ করার জন্য 3D সংস্কৃতিতে mNGAL (2 mg/mL) এর উচ্চতর ঘনত্বের প্রয়োজন mNGAL-এর পোস্ট-ট্রান্সলেশনাল পরিবর্তনের অভাবের কারণে হয়েছিল কিনা তা অধ্যয়ন করার জন্য, আমরা mNGAL-এর অতিরিক্ত এক্সপ্রেশনের জন্য একটি নির্মাণ ডিজাইন করেছি। 2L3 কোষে। এছাড়াও, এটি প্রমাণিত হয়েছে যে এনজিএএল এনজিএএল-আর-এর সাথে যোগাযোগ করতে পারে এবং আরও অ্যাপোপটোসিসকে প্ররোচিত করতে পারে [২৯]। অতএব, এনজিএএল অ্যাপোপটোসিস এবং আরও প্ররোচিত করতে এনজিএএল-আর-এর সাথে যোগাযোগ করেছে কিনা তা বোঝার জন্যকোষের কার্যক্ষমতাকে বাধা দেয়(চিত্র 3) এবং সিস্টের বৃদ্ধি (চিত্র 6), ননসিক্রেটেড এনজিএএল (লিডার সিকোয়েন্স ব্যতীত) এর অতিরিক্ত এক্সপ্রেশনের জন্য একটি গঠনও 2L3 কোষে স্থানান্তরিত হয়েছিল।
মাউস NGAL (NP_032517.1) এবং মানুষের NGAL (NP_005555.2) যথাক্রমে 200-aa এবং 198-aa প্রোটিন, এবং উভয়ের একটি {{6} আছে এনজিএএল প্রোটিনের এন-টার্মিনাসে অবস্থিত নিঃসরণের জন্য aa সংকেত পেপটাইড (চিত্র 7A)। সিকোয়েন্স তুলনা মাউস NGAL এবং মানুষের NGAL-এর মধ্যে 62% পরিচয় এবং 80% ইতিবাচকতা দেখিয়েছে। মাউস এনজিএএল-কে AA 81 এবং 85-এ অ্যাসপারাজিনে (Asn, N) দুটি এন-লিঙ্কযুক্ত গ্লাইকোসিলেশন সাইট দেখানো হয়েছিল, যখন মানব এনজিএএল-এর একটি সাইট ছিল aa 85 (চিত্র 7A), যা অনুবাদ পরবর্তী পরিবর্তনে তাদের মধ্যে পার্থক্য প্রকাশ করে।
চিত্র 7. 2L3 কোষে NGAL এক্সপ্রেশন এবং কোষের বিস্তারের উপর pN + LS এবং pN − LS দিয়ে স্থানান্তরের প্রভাব। (A) মাউস NGAL (NP_032517.1) এবং মানুষের NGAL (NP_005555.2) প্রোটিনের সারিবদ্ধকরণ। 20-a সংকেত পেপটাইডগুলি নীল রঙে দেখানো হয়েছে। মাউস NGAL-এর AA 81 এবং 85-এ Asn (N)-এ দুটি রিপোর্ট করা N-সংযুক্ত গ্লাইকোসিলেশন সাইট এবং মানব NGAL-এর AA 85-এ একটি তারকাচিহ্ন (*) দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছে। পরিচয়: কঠিন লাইন; ইতিবাচক: জোড়া বিন্দু। ন্যাশনাল সেন্টার ফর বায়োটেকনোলজি ইনফরমেশন (NCBI) ওয়েবসাইটে BLASTP প্রোগ্রাম থেকে উপরের ক্রম তথ্য। (B) pLAS2.1w.PeGFP-I2-Bsd ভেক্টরে সিক্রেটেড Igκ লিডার সিকোয়েন্স (pN + LS) সহ বা (pN − LS) ছাড়া mNGAL-এর একটি ডায়াগ্রাম তৈরি করুন। (C) জেল ইলেক্ট্রোফোরসিসের ফলাফল NheI এবং NotI দ্বারা হজমকৃত pN + LS (647 bp) এবং pN − LS (587 bp) এর গঠন নিশ্চিত করেছে। (D) সংক্রমণের সময়রেখা এবং pN + LS সহ 2L3 কোষের নির্বাচনএবং pN − LS, যথাক্রমে। 2L3 কোষ 1 দিনে 6a-ওয়েল প্লেটে pN + LS বা pN − LS সংক্রামিত হয়েছিল। ব্লাস্টিসিডিন দিয়ে নির্বাচন 2 দিন থেকে শুরু হয়েছিল এবং মাধ্যমটি প্রতি 3 দিন পর পর পরিবর্তন করা হয়েছিল। এক সপ্তাহের জন্য নির্বাচন করার পরে, কোষগুলি RT-QPCR, ওয়েস্টার্ন ব্লট এবং ELISA দ্বারা বিশ্লেষণ করার জন্য সংগ্রহ করা হয়েছিল। (E) ২য় দিনে pN + LS এবং pN − LS-এর ট্রান্সফেকশন দক্ষতা পরীক্ষা করার জন্য রিপোর্টার eGFP-এর অভিব্যক্তি সনাক্তকরণ। প্রায় 10% কোষ GFP গঠন দ্বারা সংক্রামিত হয়েছিল। স্কেল বার: 50 µm। RT–qPCR ফলাফলগুলি দেখিয়েছে যে pN + LS এবং pN − LS উভয়েরই কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় Lcn2 (প্রতিনিধিকৃত মোট NGAL স্তর) (F) এবং c-myc (প্রতিনিধিকৃত ট্রান্সফেক্টেড এক্সোজেনাস NGAL স্তর) (G) এর উচ্চতর অভিব্যক্তি ছিল। (এইচ) গ্রুপগুলির মধ্যে কোন উল্লেখযোগ্য পার্থক্য oinSlc22a17 (NGAL-R) ছিল না। RQ: আপেক্ষিক পরিমাপ=2−∆∆Ct; Gapdh প্রতিটি নমুনার অভ্যন্তরীণ নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। মান নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীতে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। (I) ওয়েস্টার্ন ব্লট ফলাফলগুলি দেখিয়েছে pN + LS এবং pN − LS-এ কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় NGAL-এর উচ্চতর অভিব্যক্তি ছিল। (J) ELISA দেখিয়েছে যে pN + LS এবং pN − LS কোষ উভয়ইকন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি এনজিএল নিঃসৃত হয়েছে, যখন পিএন − এলএস কোষের নিঃসৃত এনজিএল পরিমাণ pN + এলএস কোষের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে কম ছিল। (K) BrdU সংযোজন দেখায় যে pN + LS এবং pN − LS কোষগুলির কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় কম কোষের বিস্তারের অনুপাত ছিল, যখন pN − LS কোষগুলির pN + LS কোষগুলির চেয়ে বেশি ছিল৷ ছাত্রদের টি-পরীক্ষা দুটি গ্রুপের মধ্যে তাত্পর্য নির্ধারণের জন্য সঞ্চালিত হয়েছিল (RT–qPCR এবং ELISA-এ n=3, ওয়েস্টার্ন ব্লট এবং BrdU অন্তর্ভুক্তিতে n=4)। *p < 0৷{8}}৫; ** পি < {{10}}৷{16}}1; *** p < 0.001 বনাম 2L3 প্রতিটি গ্রুপের; # পি < ০.০৫; ### p < 0.001 বনাম pN + LS গ্রুপ; ns: কোন উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নেই।
এই গবেষণায়, আমরা বহিরাগত mNGAL প্রোটিনের বর্ধিত নিঃসরণ নিশ্চিত করতে mNGAL-এর মূল সংকেত পেপটাইডের পরিবর্তে একটি মুরিন Igκ-চেইন লিডার সিকোয়েন্স (LS) [44] ব্যবহার করেছি। সিক্রেটেড বা ননসিক্রেটেড এনজিএএল, এনজিএএল-কে LS সহ বা ছাড়াই pLAS2.1w.PeGFP-I2-Bsd ভেক্টর, যথা, pN + LS এবং pN − LS ব্যবহার করা হয়েছিল এবং চিত্র 7B-তে দেখানো হয়েছে। দুটি প্রোমোটার, pCMV এবং hPGK, দুটি প্রোটিনের স্বাধীন অভিব্যক্তি, NGAL-c-myc-His6 এবং eGFP চালাতে ব্যবহৃত হয়েছিল। কনস্ট্রাক্টের সন্নিবেশ নিশ্চিত করার জন্য, NheI এবং NotI দুটি প্লাজমিড হজম করতে ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস ফলাফলগুলি pN + LS থেকে একটি 647-bp ব্যান্ড এবং pN − LS থেকে একটি 587-bp ব্যান্ড দেখায় (একটি 60-bp লিডার সিকোয়েন্সের অভাবের কারণে) (চিত্র 7C)।
2L3 কোষে pN + LS এবং pN-SP-এর সংক্রমণের জন্য, পলিব্রিন এবং লেন্টিভাইরাস কোষে যোগ করা হয়েছিল এবং 24 ঘন্টার জন্য 37 ◦C তাপমাত্রায় ইনকিউব করা হয়েছিল, তারপরে ব্লাস্টিসিডিন (চিত্র 7D) দিয়ে নির্বাচন করা হয়েছিল। GFP এক্সপ্রেশন সনাক্তকরণ সংক্রমণের পরে ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি দ্বারা সঞ্চালিত হয়েছিল (চিত্র 7E)। এনজিএএল এক্সপ্রেশনের স্তর বিশ্লেষণ করতে RT–qPCR, ওয়েস্টার্ন ব্লট এবং ELISA-এর জন্য ব্লাস্টিসিডিন নির্বাচনের এক সপ্তাহ পরে সংক্রামিত কোষগুলি কাটা হয়েছিল (চিত্র 7F-J)। RT–qPCR ফলাফলগুলি দেখিয়েছে যে pN + LS এবং pN − LS সহ 2L3 কোষের সংক্রমণের ফলে Lcn2 (চিত্র 7F) এবং Lcn2-c-myc (চিত্র 7G) এর প্রকাশ বৃদ্ধি পেয়েছে, যা মোট স্তরের প্রতিনিধিত্ব করে এবং বহির্মুখী এনজিএএল, যথাক্রমে, যখন Slc22a17 (NGAL-R) অভিব্যক্তির স্তরে কোন পার্থক্য ছিল না (চিত্র 7H)। ওয়েস্টার্ন ব্লট ফলাফলগুলি দেখিয়েছে যে pN + LS এবং pN − LS কোষগুলিতে নিয়ন্ত্রণ 2L3 কোষের (চিত্র 7I) তুলনায় অন্তঃকোষীয় এনজিএল এক্সপ্রেশনের উচ্চ স্তর রয়েছে। সেল সুপারনাট্যান্টের জন্য ELISA ফলাফল দেখায় যে pN + LS এবং pN − LS কোষ উভয়েই 2L3 কোষ নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর (চিত্র 7J) তুলনায় নিঃসৃত NGAL-এর উচ্চ মাত্রা ছিল। উপরন্তু, pN − LS কোষ দ্বারা নিঃসৃত NGAL-এর পরিমাণ pN + LS কোষ (চিত্র 7J) দ্বারা নিঃসৃত হওয়া তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে কম ছিল, যখন দুটি গ্রুপের একই রকম NGAL অভিব্যক্তি স্তর ছিল (চিত্র 7I)। এই অনুসন্ধানটি আমাদের ভবিষ্যদ্বাণীকে সমর্থন করেছিল যে সিগন্যাল পেপটাইড (pN − LS) ছাড়াই NGAL-এর অত্যধিক এক্সপ্রেশন অন্তঃকোষীয় NGAL-এর উচ্চ স্তরের উপস্থিতি সত্ত্বেও NGAL-এর নিঃসরণকে সীমিত করে। ননসিক্রেটেড এনজিএএল এর পরিবর্তে সিক্রেটেড এনজিএএল কোষের বিস্তারকে বাধা দেয় কিনা তা তদন্ত করার জন্য, একটি বিআরডিইউ ইনকর্পোরেশন অ্যাস সঞ্চালিত হয়েছিল, যা দেখায় যে pN + LS এবং pN − LS কোষগুলির নিয়ন্ত্রণ গ্রুপের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে কম বিস্তার ছিল (চিত্র 7K)। উপরন্তু, pN − LS কোষগুলির pN + LS কোষের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে উচ্চ বিস্তার ছিল (চিত্র 7K)। এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে কোষের বিস্তার রোধ করতে 2L3 কোষ থেকে NGAL নিঃসরণ প্রয়োজন।
3.6। মানসিক অত্যধিক এক্সপ্রেশনের প্রভাব 2L3 কোষে সিগন্যালিং পাথওয়ের দিকে নিয়ে যায়
আমাদের পূর্ববর্তী ফলাফলের উপর ভিত্তি করে যে mNGAL 2L3 কোষে ERK এবং AKT পথগুলিকে বাধা দিতে পারে (চিত্র 4) এবং কোষের বিস্তার (চিত্র 3) এবং সিস্টের বৃদ্ধি (চিত্র 6) আরও হ্রাস করতে পারে, আমরা ERK এবং AKT কিনা তা বিশ্লেষণ করতে ওয়েস্টার্ন ব্লটিং ব্যবহার করেছি। পথগুলি pN + LS এবং pN − LS কোষগুলিতে প্রভাবিত হয়েছিল (চিত্র 8)। ওয়েস্টার্ন ব্লট ফলাফলগুলি দেখিয়েছে যে pN + LS এবং pN − LS গ্রুপগুলির p-ERK (T202/Y204)/ERK এর অনুপাত নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে কম ছিল এবং pN − LS গ্রুপে p-ERK অনুপাত বেশি ছিল (T202/Y204)/ERK pN + LS গ্রুপের তুলনায় (চিত্র 8A)। p-AKT (S473)/AKT-এর অনুপাত pN + LS গোষ্ঠীতে নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর তুলনায় কম ছিল, যখন pN − LS কোষগুলি নিয়ন্ত্রণে থাকা এবং pN + LS গোষ্ঠীগুলির থেকে উল্লেখযোগ্যভাবে আলাদা ছিল না (চিত্র 8B)। p-CREB (S133)/CREB এর অনুপাত pN + LS গ্রুপের তুলনায় pN − LS গ্রুপে উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল, যখন pN + LS বা pN − LS কন্ট্রোল গ্রুপ থেকে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখায়নি (চিত্র 8C)। এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে pN + LS এবং pN − LS-এর p-ERK/ERK (চিত্র 8A) অনুপাতের পরিসংখ্যানগতভাবে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল, যখন pN + LS গ্রুপ AKT (চিত্র 8B) এবং CREB (চিত্র 8B) এ ভাল প্রভাব দেখায়নি। চিত্র 8C) সক্রিয়করণ।
পূর্ববর্তী ফলাফল অনুসারে যে mNGAL প্রয়োগটি 2L3 কোষে অ্যাপোপটোসিস (চিত্র 3) এবং অটোফ্যাজিকে প্ররোচিত করতে পারে (চিত্র 5) এবং কোষের বিস্তার (চিত্র 3) এবং সিস্ট বৃদ্ধি (চিত্র 6) হ্রাস করতে পারে, আমরা অ্যাপোপটোসিসের উপর প্রভাব তদন্ত করতে পশ্চিমা ব্লটিং ব্যবহার করেছি। এবং pN + LS এবং pN − LS কোষে অটোফ্যাজি (চিত্র 9)। ওয়েস্টার্ন ব্লট ফলাফলগুলি দেখিয়েছে যে pN + LS কোষগুলিতে নিয়ন্ত্রণ গ্রুপের তুলনায় ক্লিভড-/প্রো-ক্যাস্পেস-3 (চিত্র 9A) এবং ক্লিভড-/প্রো-PARP (চিত্র 9B) এর অনুপাত উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল; pN − LS কোষগুলি কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় ক্লিভড-/প্রো-ক্যাস্পেস-3 (চিত্র 9A) এবং ক্লিভড-/প্রো-পিএআরপি (চিত্র 9B) অনুপাত এবং ক্লিভড-এর অনুপাতের কোন উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখায়নি। /pro-caspase-3 pN + LS গ্রুপের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে কম ছিল (চিত্র 9B)। এই ফলাফলগুলি প্রমাণ করেছে যে 2L3 কোষে নন-সিক্রেটেড এনজিএএল প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিসের পরিবর্তে সিক্রেটেড এনজিএএল-এর অতিরিক্ত এক্সপ্রেশন।
নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর তুলনায় pN + LS কোষে LC3B II/LC3B I (চিত্র 9C) এর একটি উচ্চ অনুপাত এবং p62/GAPDH (চিত্র 9D) এর একটি নিম্ন অনুপাত চিহ্নিত করা হয়েছে; pN − LS কোষগুলির LC3B II/LC3B I (চিত্র 9C) এবং p62/GAPDH (চিত্র 9D) অনুপাতের অনুপাতের মধ্যে কোন উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল না কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায়, এবং LC3B II/LC3B I এর অনুপাত উল্লেখযোগ্যভাবে কম ছিল pN + LS গ্রুপ (চিত্র 9C)। এই ফলাফলটি প্রকাশ করেছে যে 2L3 কোষে নন-সিক্রেটেড এনজিএএল প্ররোচিত অটোফ্যাজির পরিবর্তে সিক্রেটেড এনজিএএল-এর অতিরিক্ত এক্সপ্রেশন।
3.7। 3D সংস্কৃতিতে 2L3 কোষের সিস্ট গঠনের উপর mNGAL-এর ওভার এক্সপ্রেশনের প্রভাব
পূর্ববর্তী ফলাফলের উপর ভিত্তি করে যে mNGAL যথাক্রমে 2D এবং 3D সংস্কৃতিতে 2L3 কোষের বিস্তার এবং সিস্টের বৃদ্ধিকে বাধা দেয় (চিত্র 3 এবং 6), আমরা সন্দেহ করেছি যে নিঃসৃত NGAL-এর অত্যধিক এক্সপ্রেশন কোষের বিস্তারের বাধার মাধ্যমে 2L3 কোষের সিস্ট বৃদ্ধিকে আরও বাধা দিতে পারে ( চিত্র 7K)।
সিস্ট গঠনে 2L3 কোষে এনজিএএল অত্যধিক এক্সপ্রেশনের প্রভাবগুলি তদন্ত করতে, সিস্ট গঠনে প্ররোচিত করার জন্য 2L3 নিয়ন্ত্রণ, pN + LS, এবং pN − LS কোষগুলিকে ফোরস্কোলিন দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। সিস্টের ব্যাস, ক্ষেত্রফল এবং সংখ্যাগুলি প্রতিদিন ফরস্কোলিন আনয়নের পরে পরিমাপ করা হয়েছিল (চিত্র 10A)। 3D কালচারে 2L3 কন্ট্রোল, pN + LS, এবং pN − LS কোষের সিস্টগুলি সংস্কৃতির দিনগুলির উপর নির্ভরশীল পদ্ধতিতে বৃদ্ধি পায় (চিত্র 10B) এবং 4 থেকে 8 দিন পর্যন্ত সিস্টের আকারে স্পষ্ট পার্থক্য দেখায়। pN + LS গ্রুপে দিন 4 থেকে 8 পর্যন্ত কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে ছোট সিস্ট ব্যাস (চিত্র 10C) এবং এলাকা (চিত্র 10D), যেখানে pN − LS গ্রুপের 6 এবং 8 দিন (চিত্র 10C) কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে ছোট সিস্ট ব্যাস ছিল। নিয়ন্ত্রণ এবং pN - LS গ্রুপের মধ্যে সিস্ট এলাকায় কোন উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল না। উপরন্তু, pN − LS গোষ্ঠীর সিস্টের ব্যাস এবং ক্ষেত্রফল 8 দিনে pN + LS গ্রুপের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বড় ছিল (চিত্র 10C, D)। যদিও নিয়ন্ত্রণ, pN + LS, এবং pN − LS কোষের (চিত্র 10E) মধ্যে সিস্ট সংখ্যা বৃদ্ধির হারে কোন উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল না, pN + LS এবং pN − LS গ্রুপ উভয়েরই উল্লেখযোগ্যভাবে কম শতাংশ ছিল বড় (ব্যাস > 4 থেকে 8 দিন পর্যন্ত কন্ট্রোল গ্রুপের (চিত্র 10F) তুলনায় 100 µm) সিস্ট। এই ফলাফলগুলি দেখিয়েছে যে pN + LS এবং pN − LS উভয়ই সিস্টের বৃদ্ধিকে বাধা দেয়, যখন pN − LS-এর প্রতিরোধক প্রভাব pN + LS-এর তুলনায় দুর্বল ছিল . এই অনুসন্ধানটি প্রকাশ করেছে যে সিক্রেটেড এমএনজিএএল-এর অত্যধিক এক্সপ্রেশনে নন-সিক্রেটেড এমএনজিএএলের তুলনায় 3D সংস্কৃতিতে 2L3 কোষের সিস্ট বৃদ্ধিকে বাধা দেওয়ার উচ্চতর ক্ষমতা রয়েছে।
-গোষ্ঠীর মধ্যে তাৎপর্য নির্ধারণের জন্য একটি পরীক্ষা করা হয়েছিল (n=3)। * পি < 0৷{4}}৫; *** p < 0.001 বনাম নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠী; # p < 0.05 বনাম pN + LS গ্রুপ
কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় ক্যাসপেস{{0}} (A) এবং ক্লিভড-/প্রো-পিএআরপি (বি), যা সিক্রেটেড এমএনজিএএল দ্বারা অ্যাপোপটোসিস আনয়নকে প্রতিনিধিত্ব করে। pN − LS কোষের কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় ক্লিভড-/প্রো-ক্যাস্পেস-3 এবং ক্লিভড-/প্রো-PARP অনুপাতের কোনো উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল না। pN + LS কোষগুলির LC3B II/LC3B I (C) এর উচ্চ অনুপাত এবং নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর তুলনায় p62 (D) এর নিম্ন অনুপাত ছিল। pN −LS কোষগুলির নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর তুলনায় LC3B II/LC3B I এবং p62 অনুপাতের মধ্যে কোনও উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল না। টিউবুলিন, ভিনকুলিন এবং জিএপিডিএইচ প্রতিটি নমুনার অভ্যন্তরীণ নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। মান নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীতে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। গোষ্ঠীর মধ্যে তাৎপর্য নির্ধারণ করতে ছাত্রদের টি-পরীক্ষা করা হয়েছিল (n=3)। * p < 0৷{21}}5; ** পি < 0৷{25}}1; *** পি < 0.001 বনাম নিয়ন্ত্রণ গ্রুপ; # পি < ০.০৫; ## p < 0.01 vs.pN + LS গ্রুপ।
চিত্র 9. 2L3 কোষে অ্যাপোপটোসিস এবং অটোফ্যাজিতে mNGAL প্রোটিনের অতিরিক্ত এক্সপ্রেশনের প্রভাব। ওয়েস্টার্ন ব্লট ফলাফলে দেখা গেছে যে pN + LS কোষে কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় ক্লিভড-/প্রো-ক্যাস্পেস-3(এ) এবং ক্লিভড-/প্রো-পিএআরপি (বি) এর অনুপাত উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল, যা অ্যাপোপটোসিসের আবেশকে প্রতিনিধিত্ব করে নিঃসৃত mNGAL দ্বারা। pN −LS কোষে কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় ক্লিভড-/প্রো-ক্যাস্পেস-3 এবং ক্লিভড-/প্রো-পিএআরপি অনুপাতের কোনো উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল না। pN + LS কোষগুলির LC3BII/LC3B I (C) এর উচ্চ অনুপাত এবং নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর তুলনায় p62 (D) এর নিম্ন অনুপাত ছিল। pN − LS কোষগুলির LC3B II/LC3B I এবং p62-এর rthe atio-এ কন্ট্রোল গ্রুপের তুলনায় কোন উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল না। টিউবুলিন, ভিনকুলিন এবং জিএপিডিএইচ প্রতিটি নমুনার অভ্যন্তরীণ নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। মান নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীতে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। গোষ্ঠীর মধ্যে তাত্পর্য নির্ধারণের জন্য ছাত্রদের টি-পরীক্ষা করা হয়েছিল
(n {{0}})। * p < 0৷{5}}৫; ** p < 0৷{9}}1; *** পি < 0.001 বনাম নিয়ন্ত্রণ গ্রুপ; # পি < ০.০৫; ## p < 0.01 বনাম pN + LS গ্রুপ
4-8। সিস্ট সংখ্যা অনুপাত গণনা করার জন্য প্রতিটি গ্রুপের 4 দিনে সিস্ট নম্বর নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। (F) কন্ট্রোল গ্রুপ, pN + LS, এবং pN − LS কোষের 3D সংস্কৃতিতে 4-8 দিনগুলিতে সিস্টের বড় আকারের শতাংশ। গোষ্ঠীর মধ্যে তাৎপর্য নির্ধারণ করতে ছাত্রদের টি-পরীক্ষা করা হয়েছিল (n=3)। * পি < {{10}}৷{14}}৫; ** পি < 0.01 বনাম নিয়ন্ত্রণ গ্রুপ; # পি < ০.০৫; ## p < 0.01 বনাম pN + LS গ্রুপ।
