সিক্রেটেড নিউট্রোফিল জেলটিনেস-সম্পর্কিত লাইপোক্যালিন ননসিক্রেটেড ফর্মের তুলনায় ADPKD কোষের সিস্টের বৃদ্ধিকে বাধা দেওয়ার শক্তিশালী ক্ষমতা দেখায় Ⅱ

3. ফলাফল

3.1। M-1 ওয়াইল্ড টাইপ এবং 2L3 ADPKD কোষের মধ্যে NGAL এক্সপ্রেশন এবং কোষের বিস্তারের তুলনা

2L3 সেল লাইন Pkd1L3/L3 ইঁদুর [17] থেকে প্রাথমিক রেনাল এপিথেলিয়াল কোষগুলির SV40 ভাইরাস ট্রান্সডাকশন দ্বারা প্রতিষ্ঠিত হয়েছিল। BCRC (Hsinchu, তাইওয়ান) থেকে কেনা M-1 কোষ (মাউস ওয়াইল্ড-টাইপ রেনাল এপিথেলিয়াল সেল লাইন) নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল। 2L3 এবং M{12}} কোষের Pkd1 প্রতিলিপিগুলির PCR জিনোটাইপিং লক্ষ্যযুক্ত অ্যালিলের (চিত্র 1A) 30-এ প্রথম loxP সাইটের আগে এবং পরে প্রাইমার ব্যবহার করে জিনোটাইপগুলি পরীক্ষা করার জন্য পরিচালিত হয়েছিল। Pkd1+/+, Pkd1L3/+, এবং Pkd1L3/L3 মাউস টিস্যুগুলি জিনোটাইপিং নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল৷ M-1 কোষ থেকে PCR পণ্যগুলি একটি একক ওয়াইল্ড-টাইপ (WT) Pkd1+/+ ব্যান্ড (473 bp), যেখানে 2L3 কোষ থেকে PCR পণ্যগুলি একটি একক Pkd1L3/L3 ব্যান্ড (507 bp) দেখায় অতিরিক্ত loxP সেগমেন্টের কারণে (34 bp) (চিত্র 1B)।

M-1 এবং 2L3 কোষগুলি থেকে ছিল কিনা তা চিহ্নিত করতে৷অনুরূপ উত্সের রেনাল টিউবুলস, আমরা প্রথমে 2 টি সেল লাইনের মধ্যে রূপবিদ্যার তুলনা করেছি; M-1 কোষ এবং 2L3 কোষ একটি খুব অনুরূপ রূপবিদ্যা দেখায় (চিত্র 1C)। এছাড়াও, লোটাস টেট্রাগোনোলোবাস লেকটিন (LTL, ডিফারেনসিয়েটেড প্রক্সিমাল টিউবুলের চিহ্নিতকারী, ফ্লুরোসেসিন লেবেলযুক্ত) এবং ডলিচোস বিফ্লোরাস অ্যাগ্লুটিনিন (ডিবিএ, ডিফারেনসিয়েটেড ডিস্টাল টিউবুলস এবং সংগ্রহ নালীগুলির একটি চিহ্নিতকারী, রডোমাইন দিয়ে লেবেলযুক্ত লেবেলযুক্ত লেকটিন স্টেনিং) বা তাদের পরীক্ষা করা হয়েছিল। রেনাল টিউবুলস থেকে (চিত্র 1D)। স্টেনিং ফলাফলগুলি দেখায় যে M-1 এবং 2L3 কোষগুলি উভয়ই LTL- (বেশিরভাগই DAPI এর সাথে স্থানীয়করণ) এবং DBA-পজিটিভ (সাইটোপ্লাজমে স্থানীয়করণ) (চিত্র 1D)। এই ফলাফলটি প্রস্তাব করেছে যে M-1 এবং 2L3 কোষগুলি থেকে উদ্ভূত হয়েছে৷রেনাল টিউবুলসঅনুরূপ উত্সের এবং অনুরূপ বৈশিষ্ট্য থাকতে পারে। রিয়েল-টাইম পিসিআর ফলাফলগুলি দেখিয়েছে যে 2L3 কোষগুলি M-1 কোষের তুলনায় Pkd1 mRNA এক্সপ্রেশন স্তরকে অত্যন্ত হ্রাস করেছে (চিত্র 1E), যা 2L3 ইঁদুরের ডেটার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ ছিল Pkd1 প্রোটিন এক্সপ্রেশন স্তরের মাত্র 25%। বন্য ধরনের ইঁদুর যারা [17]. 2L3 ইঁদুরের কিডনিতে বন্য ধরণের ইঁদুরের তুলনায় এনজিএএল এবং এনজিএএল রিসেপ্টর (এনজিএএল-আর) প্রোটিনের উচ্চ মাত্রা রয়েছে বলে প্রমাণিত হয়েছে [৩১]। রিয়েল-টাইম পিসিআর ফলাফলে দেখা গেছে যে Lcn2 mRNA এক্সপ্রেশন লেভেল ছিল 15।{20}}M-1 কোষের (চিত্র 1F) তুলনায় 2L3-তে আরও বেশি গুঁজ (চিত্র 1F), 2L3 ইঁদুরের [31] জন্য রিপোর্ট করা ডেটার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। দুটি গ্রুপের মধ্যে Slc22a17 mRNA এক্সপ্রেশনে কোন উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল না (চিত্র 1G)। ওয়েস্টার্ন ব্লট ফলাফলগুলিও দেখায় যে 2L3 কোষে M-1 কোষের তুলনায় NGAL-এর উচ্চতর অভিব্যক্তি স্তর রয়েছে, যখন দুটি গ্রুপের মধ্যে NGAL-R-এর অভিব্যক্তি স্তরে কোনও উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল না (চিত্র 1H)৷ M-1 এবং 2L3 কোষের কোষ এবং সুপারনাট্যান্ট উভয়ই ELISA দ্বারা কোষের লাইসেট এবং সুপারন্যাট্যান্টস (নিঃসৃত এনজিএএল প্রতিনিধিত্ব করে) এনজিএএল পরিমাপ করার জন্য 48 ঘন্টা ধরে সংস্কৃতির পরে সংগ্রহ করা হয়েছিল। ওয়েস্টার্ন ব্লট ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, ELISA দেখিয়েছে যে M-1 (চিত্র 1I) এর তুলনায় 2L3-এর অন্তঃকোষীয় এনজিএএল এবং সুপারনাট্যান্টে এনজিএএল এর নিঃসরণ উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল।

2L3 ইঁদুরগুলি বন্য ধরণের ইঁদুরের তুলনায় উচ্চ কোষের বিস্তার দেখানোর জন্য প্রদর্শিত হয়েছে [17]। এমটিটি এবং বিআরডিইউ ইনকর্পোরেশন অ্যাসগুলি 2L3 সেল লাইনটি বন্য ধরণের কোষগুলির (চিত্র 2A-C) তুলনায় আরও ভাল কার্যকারিতা এবং বিস্তার দেখিয়েছে কিনা তা তদন্ত করার জন্য পরিচালিত হয়েছিল। প্রতিনিধি চিত্রগুলি একই প্রাথমিক বীজ সংখ্যা (চিত্র 2A) সহ 48 ঘন্টা ধরে সংস্কৃতির পরে M{10}} কোষের তুলনায় 2L3 কোষের একটি বৃহত্তর সংগম প্রকাশ করেছে। MTT অ্যাসেস দেখায় যে 24 এবং 48 ঘন্টা (চিত্র 2B) জন্য সংষ্কৃত M-1 কোষের তুলনায় 2L3 কোষের উল্লেখযোগ্যভাবে ভাল কার্যকারিতা ছিল। M-1 এবং 2L3 কোষের প্রসারণ ক্ষমতার তুলনা করার জন্য, BrdU ইনকরপোরেশন অ্যাস অনুসরণ করে কোষগুলিকে 24 ঘন্টার জন্য সংষ্কৃত করা হয়েছিল, যা দেখায় যে 2L3 কোষগুলির M-1 কোষের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে ভাল বিস্তার ছিল (চিত্র 2C) .

কিডনি রোগের জন্য নতুন ভেষজ

3.2। 2L3 কোষের কার্যক্ষমতা এবং বিস্তারের উপর mNGAL সংযোজনের প্রভাব

এক্সোজেনাস এনজিএএল-এর প্রশাসন ভিট্রোতে সিস্টের বৃদ্ধি হ্রাস করতে দেখা গেছে [25]। আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে একটি ADPKD মাউস মডেলে (Pkd1L3/L3; NGALTg/Tg মাউস) এনজিএএল-এর অত্যধিক এক্সপ্রেশন সিস্টের অগ্রগতি হ্রাস করে এবং এর সাথে জড়িত আণবিক পথের একটি সিরিজের পরিবর্তনের সাথেকোষের বিস্তার, apoptosis, এবংফাইব্রোসিস[৩১]। অতএব, আমরা MTT অ্যাস (চিত্র 3) ব্যবহার করে 2L3 কোষের কার্যকারিতার উপর রিকম্বিন্যান্ট mNGAL-এর প্রভাবগুলি তদন্ত করেছি। E. coli থেকে বিশুদ্ধ রিকম্বিন্যান্ট mNGAL (সংকেত পেপটাইড ছাড়া) এর বিশুদ্ধতা প্রথমে SDS-PAGE এবং Coomassie ব্লু দিয়ে স্টেনিং দ্বারা নির্ধারিত হয়েছিল, যা একটি একক 20-kD ব্যান্ড এবং উচ্চ ঘনত্বে একটি খুব হালকা ডাইমার ব্যান্ড প্রকাশ করেছিল ( চিত্র 3A)। এছাড়াও, সেল কালচার মিডিয়ামে এমএনজিএএল-এর স্থায়িত্ব পশ্চিমা ব্লটিং দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল, যা কমপক্ষে 48 ঘন্টা (চিত্র 3 বি) জন্য মাঝারিতে mNGAL-এর স্থায়িত্ব প্রদর্শন করে। আমরা লক্ষ্য করেছি যে mNGAL 8 ঘন্টা (চিত্র 3C) চিকিত্সার পরে নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর তুলনায় 2L3 কোষের কার্যকারিতা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করেছে। এই পরীক্ষায় র্যাপামাইসিন একটি ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল, যা এমটিওআর-এর একটি প্রতিরোধক হিসাবে স্বীকৃত এবং একটি পিকেডি মাউস মডেল [৩২] এ এপিথেলিয়াল কোষের বিস্তার এবং সিস্ট বৃদ্ধিকে বাধা দেওয়ার জন্য পরিচিত। এছাড়াও, বিআরডিইউ ইনকর্পোরেশন অ্যাসে আরও দেখিয়েছে যে 24 ঘন্টার জন্য mNGAL চিকিত্সা উল্লেখযোগ্যভাবে 2L3 কোষের বিস্তারকে বাধা দেয় (চিত্র 3D)। কোষের বিস্তার হল ADPKD-এর একটি মূল বৈশিষ্ট্য, এবং 2L3 কোষের বিস্তার mNGAL দ্বারা হ্রাস করা যেতে পারে এমন অনুসন্ধানে পরামর্শ দেওয়া হয়েছে যে mNGAL 2L3 কোষে সিস্ট গঠনকে আরও বাধা দিতে পারে।

3.3। 2L3 কোষে mNGAL যোগ করার দ্বারা প্রভাবিত সিগন্যালিং পাথওয়ে

এনজিএএল এবং এনজিএএল-আর কাপলিংকে আন্তঃকোষীয় আয়রন আলাদা করতে এবং আরও অ্যাপোপটোসিস প্ররোচিত করতে দেখানো হয়েছে [২৯]। এছাড়াও, গবেষণায় দেখা গেছে যে এনজিএএল ভিট্রো এবং ভিভোতে একটি ADPKD মডেলে অ্যাপোপটোসিস প্ররোচিত করতে পারে [25,31]। mNGAL 2L3 কোষের অ্যাপোপটোসিস প্ররোচিত করতে পারে কিনা তা তদন্ত করতে, আমরা প্রবাহ সাইটোমেট্রি দ্বারা 2L3 সেল অ্যাপোপটোসিস বিশ্লেষণ করেছি। এমএনজিএএল 8 ঘন্টা (চিত্র 3D) জন্য mNGAL চিকিত্সার পরে 2L3 কোষের বিস্তারকে বাধা দেয় এমন অনুসন্ধানের ভিত্তিতে, আমরা আগে (4 ঘন্টা) এবং পরে (12 ঘন্টা) উভয় সময়ে 2L3 কোষে mNGAL এর প্রভাবগুলি বিশ্লেষণ করেছি।

ফ্লো সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণের জন্য, পূর্বে পরিচালিত এমটিটি অ্যাসেসের তুলনায় অনেক বেশি সেল নম্বর এবং একটি সংক্ষিপ্ত কালচারের সময়কাল প্রয়োজন ছিল; তাই, 2L3 কোষগুলিকে 6-ওয়েল প্লেটের উপর বীজ দেওয়া হয়েছিল, এবং কোষগুলিতে mNGAL (600–1200 μg/mL) এর উচ্চতর ঘনত্ব প্রয়োগ করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি দেখায় যে 1200 μg/mL mNGAL চিকিত্সার 4 এবং 12 ঘন্টা পরে কোষের কার্যকারিতাকে উল্লেখযোগ্যভাবে বাধা দেয়, যেখানে 600 μg/mL mNGAL চিকিত্সার 4 ঘন্টা পরে কোষের কার্যকারিতাকে বাধা দেয় (চিত্র 3E)। অ্যানেক্সিন ভি-এফআইটিসি- এবং পিআই-দাগযুক্ত কোষগুলি সনাক্ত করতে ফ্লো সাইটোমেট্রি দ্বারা অ্যাপোপটোসিস অ্যাসেস করা হয়েছিল। অ্যানেক্সিন ভি-এর ফসফ্যাটিডিলসারিন (পিএস) এর সাথে উচ্চ সম্পর্ক রয়েছে এবং এটি উন্মুক্ত পিএস [৩৩] সহ অ্যাপোপটোটিক কোষ সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়। স্টেনিং ফলাফল অনুসারে, কোষগুলিকে স্বাভাবিক (AV−/PI−), প্রারম্ভিক অ্যাপোপটোসিস (AV+/PI−), দেরী অ্যাপোপটোসিস (AV+/PI+), এবং নেক্রোসিস (AV−/PI+) হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ করা যেতে পারে এবং দেখানো হয়েছে চতুর্ভুজ চিত্র (চিত্র 3F)। প্রারম্ভিক অ্যাপোপটোটিক পর্যায়ে কোষগুলি অক্ষত ঝিল্লি ধরে রাখে, যা বিচ্ছিন্ন ঝিল্লি সহ দেরী অ্যাপোপটোটিক পর্যায়ে কোষ থেকে পৃথক হয় [৩৪]। ফলাফলগুলি দেখায় যে 2L3 কোষের অ্যাপোপটোসিস হার (প্রাথমিক AV+/PI− এবং দেরী AV+/PI+ অ্যাপোপটোসিস সহ) mNGAL (1200 µg/mL; চিত্র 3F, G) দিয়ে 12 ঘন্টা চিকিত্সার পরে নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে। )

চিত্র 1. M-1 বন্য প্রকার এবং 2L3 ADPKD কোষের মধ্যে NGAL অভিব্যক্তির তুলনা। (A) বন্য প্রকারের কাঠামো এবং Pkd1 জিনের L3 অ্যালিল। পিসিআর জিনোটাইপিং Pkd1 এর ইন্ট্রন 30 এর মধ্যে প্রথম loxP এর আগে এবং পরে প্রাইমার ব্যবহার করে পরিচালিত হয়েছিল। ভরা ত্রিভুজ: loxP; একটি mc1 প্রমোটার-চালিত নিওমাইসিন রেজিস্ট্যান্স জিন (mc1-neo) দুটি loxP সাইট দ্বারা সংলগ্ন Pkd1-এর ইন্ট্রন 34-এ ঢোকানো হয়েছিল। এবং 2L3 কোষ (507 bp)। বন্য-টাইপ (+/+), হেটেরোজাইগাস (L3/+), এবং হোমোজাইগাস (L3/L3) ইঁদুরের Pkd1 ট্রান্সক্রিপ্টগুলি নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। RT–qPCR দেখিয়েছে যে 2L3 উল্লেখযোগ্যভাবে কম Pkd1 (C) M-1 এবং 2L3 কোষগুলি অনুরূপ রূপবিদ্যা দেখায়। স্কেল বার: 100 µm। (D) M-1 এবং 2L3 কোষগুলি লোটাস টেট্রাগোনোলোবাস লেকটিন (এলটিএল, ফ্লুরেসসিন, সবুজ দিয়ে লেবেলযুক্ত) এবং ডলিচোস বিফ্লোরাস অ্যাগ্লুটিনিন (ডিবিএ, রোডা মাইন দিয়ে লেবেলযুক্ত, লাল) এবং ডিএপিআই (নীল) দিয়ে দাগযুক্ত এবং একটি দ্বারা পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ। স্কেল বার: 50 µm। RT–qPCR দেখিয়েছে যে M-1 ওয়াইল্ড-টাইপ সেলের তুলনায় 2L3-এ উল্লেখযোগ্যভাবে কম Pkd1 (E) এবং উচ্চ Lcn2 (NGAL) (F) এক্সপ্রেশন স্তর রয়েছে। (G) M-1 এবং 2L3 কোষের মধ্যে Slc22a17 (NGAL-R) এক্সপ্রেশন স্তরে কোনও উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নেই। RQ: আপেক্ষিক পরিমাপ=2 −ΔΔCt; Gapdh প্রতিটি নমুনার অভ্যন্তরীণ নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। মানগুলিকে M-1-এ স্বাভাবিক করা হয়েছে৷ (এইচ) ওয়েস্টার্ন ব্লট ফলাফল দেখিয়েছে যে 2L3

প্রতিটি নমুনা। মানগুলিকে M{{0}}-এ স্বাভাবিক করা হয়েছিল৷ (H) ওয়েস্টার্ন ব্লট ফলাফল দেখায় যে 2L3 কোষে NGAL-এর উচ্চতর অভিব্যক্তি ছিল কিন্তু M-1 কোষের তুলনায় NGAL-R নয়। অ্যাক্টিন এবং GAPDH প্রতিটি নমুনার অভ্যন্তরীণ নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। মানগুলি 2L3 এর নিয়ন্ত্রণ গ্রুপে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। (I) ELISA দেখিয়েছে যে 2L3 কোষের লাইসেট এবং সুপারনাট্যান্ট উভয় ক্ষেত্রেই M-1-এর তুলনায় NGAL-এর উচ্চতর অভিব্যক্তি রয়েছে। দুই দলের মধ্যে তাৎপর্য নির্ধারণের জন্য ছাত্রদের টি-পরীক্ষা করা হয়েছিল (RT–qPCR-এ n=6, ওয়েস্টার্ন ব্লটে n=3 এবং ELISA)। * p < 0.05; *** প্রতিটি গ্রুপের পি < 0.001 বনাম M-1; ns: কোন উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নেই।

চিত্র 2. M-1 বন্য প্রকার এবং 2L3 কোষের মধ্যে কোষের কার্যক্ষমতা এবং বিস্তারের তুলনা। (A) M-1 এবং 2L3 কোষের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্রগুলি 48 ঘন্টার জন্য সংষ্কৃত। স্কেল বার: 100µm. (B) এমটিটিপরীক্ষায় দেখা গেছে যে 2L3 কোষের M-1 কোষের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে উচ্চতর কার্যক্ষমতা রয়েছে। (C) BrdUইনকর্পোরেশন অ্যাসে দেখায় যে 2L3 কোষের M-1 এর তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে ভাল বিস্তার ছিলকোষ মানগুলিকে M-1-এ স্বাভাবিক করা হয়েছিল৷ ছাত্রেরt- তাৎপর্য নির্ধারণের জন্য পরীক্ষা করা হয়েছিলদুই দলের মধ্যে (nMTT-তে=6,n

{{0}} BrdU অন্তর্ভুক্তিতে)। *p < 0.05; *** প্রতিটি গ্রুপের পি < 0.001 বনাম M-1

চিত্র 3. কোষের কার্যক্ষমতা এবং 2L3 কোষের বিস্তারের উপর mNGAL যোগ করার প্রভাব। (A) SDS-PAGE-এর ফলাফলে দেখা গেছে যে E. coli থেকে বিশুদ্ধ mNGAL (সংকেত পেপটাইড ছাড়া) এর একটি প্রধান 20-kD ব্যান্ড এবং একটি হালকা 40-kD ডাইমার সিগন্যাল ছিল। (বি) ওয়েস্টার্ন ব্লট দেখিয়েছে যে এমএনজিএএল কমপক্ষে 48 ঘন্টা সেল-কালচার মিডিয়ামে স্থিতিশীলভাবে বজায় রাখা যেতে পারে। (C) MTT পরীক্ষার ফলাফলে mNGAL ({{10}}, 20, 40, 80, 160, 320 µg/mL) এর বিভিন্ন ঘনত্বের সাথে চিকিত্সার পরে 2L3 কোষের বিস্তারে ঘনত্ব-নির্ভর হ্রাস দেখা গেছে ) 8, 24, এবং 48 ঘন্টা 24-কূপ প্লেটে। রেপামাইসিন প্রসারণ প্রতিরোধকদের জন্য একটি ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। (D) BrdU অন্তর্ভুক্তির ফলাফল দেখিয়েছে যে mNGAL (320 µg/mL) উল্লেখযোগ্যভাবে 24 ঘন্টায় 2L3 কোষের বিস্তার হ্রাস করেছে। রেপামাইসিন একটি ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। (E) MTT পরীক্ষার ফলাফল 2L3 কোষের কার্যক্ষমতা হ্রাস দেখায় যা mNGAL (0, 600, 1200 µg/mL) এর বিভিন্ন ঘনত্বের সাথে 4 এবং 12 ঘন্টা 24-কূপ প্লেটে চিকিত্সার পরে। (এফ) অ্যানেক্সিন ভি (এভি) এবং পিআই স্টেনিং কিট ব্যবহার করে ফ্লো সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণ ব্যবহার করে এমএনজিএএল-এর সাথে 4 এবং 12 ঘন্টা চিকিত্সার পরে সেল অ্যাপোপটোসিস সনাক্ত করা হয়েছিল। চতুর্ভুজ চিত্র এবং হিস্টোগ্রাম দেখায় যে mNGAL (1200 µg/mL) দিয়ে চিকিত্সা করা 2L3 কোষ 12 ঘন্টায় অ্যাপোপটোসিস বৃদ্ধি পায়। স্বাভাবিক ঘটনা

(AV−/PI−) নীচের ডান চতুর্ভুজ (Q1) এ দেখানো হয়েছে। প্রাথমিক অ্যাপোপটোসিস ইভেন্টগুলি (AV+/PI−) নীচের ডান চতুর্ভুজ (Q2) এ দেখানো হয়েছে। দেরী অ্যাপোপটোসিস ইভেন্টগুলি (AV+/PI+) নীচের ডান চতুর্ভুজ (Q3) এ দেখানো হয়েছে। নেক্রোসিস ইভেন্টগুলি (AV−/PI+) নীচের ডান চতুর্ভুজ (Q4) এ দেখানো হয়েছে। হিস্টোগ্রামে M-1 এবং M2 যথাক্রমে অ্যাপোপটোসিস (AV−) এবং অ্যাপোপটোসিস (AV+) এর মধ্য দিয়ে যাওয়া কোষগুলিকে উপস্থাপন করে। (G) যথাক্রমে 4 এবং 12 h এর চতুর্ভুজ চিত্র এবং হিস্টোগ্রামের পরিমাপ। (এইচ) ওয়েস্টার্ন ব্লট ফলাফল 2L3 কোষে 24 ঘন্টা বৃদ্ধিকৃত অ্যাপোপটোসিস মার্কারগুলির জন্য mNGAL চিকিত্সা দেখিয়েছে। ভিনকুলিন অভ্যন্তরীণ নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। মান নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীতে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। একমুখী আনোভা বা ছাত্রদের টি-পরীক্ষা করা হয়েছিল গ্রুপগুলির মধ্যে তাত্পর্য নির্ধারণের জন্য (n=3)। * p < 0৷{21}}5; ** p < 0.01; *** p < 0.001 বনাম প্রতিটি গ্রুপের নিয়ন্ত্রণ।

এছাড়াও, অ্যাপোপটোসিসের চিহ্নিতকারী, ক্যাসপেসের ক্লিভড ফর্ম-3 এবং পলি (ADP-রাইবোজ) পলিমারেজ (PARP), ওয়েস্টার্ন ব্লটিং দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ক্যাসপেস-3 অ্যাপোপটোসিসের দুটি প্রধান পথের মাধ্যমে সক্রিয় আকারে (17- এবং 19-কেডি টুকরো) বিভক্ত হয়, বহিরাগত এবং অন্তর্নিহিত [35]। ক্লিভড ক্যাসপেস-3 পর্যায়ক্রমে PARP (89 এবং 24 kD টুকরা), ডিএনএ মেরামতের সাথে জড়িত একটি পারমাণবিক এনজাইম, PARP নিষ্ক্রিয় করতে এবং আরও অ্যাপোপটোসিস [35,36] প্ররোচিত করে। ওয়েস্টার্ন ব্লট ফলাফল (চিত্র 3H) প্রবাহ সাইটোমেট্রি ডেটার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ ছিল (চিত্র 3F, G)। mNGAL এর সাথে 2L3 কোষের 24 ঘন্টার জন্য চিকিত্সা উল্লেখযোগ্যভাবে ক্লিভড/প্রো-ক্যাস্পেস-3 এবং ক্লিভড/প্রো-PARP (চিত্র 3H) অনুপাতকে প্ররোচিত করে।

এটি প্রদর্শিত হয়েছে যে রাস/বি-রাফ/এমইকে/ইআরকে [10,11] এবং AKT/mTOR [37,38] পথগুলি ADPKD কোষগুলিতে আপ-নিয়ন্ত্রিত হয়, যা কোষের বিস্তার এবং সিস্টের বৃদ্ধির দিকে পরিচালিত করে। MEK/ERK এবং PI3K/AKT সিগন্যালিং পথগুলি সিএএমপি-প্রতিক্রিয়া উপাদান বাঁধাই প্রোটিন (CREB, S133) [39,40] এর ফসফোরিলেশন বৃদ্ধির দিকে পরিচালিত করে, একটি ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর যা কোষের বেঁচে থাকা এবং বিস্তারের সাথে জড়িত জিনগুলিকে লক্ষ্য করে [41]। এমএনজিএএল কোষের বিস্তারকে বাধা দেয় তা তদন্ত করার জন্য, 2L3 কোষে ERK এবং AKT সিগন্যালিং পাথওয়েতে mNGAL-এর প্রভাব বিশ্লেষণ করার জন্য ওয়েস্টার্ন ব্লটিং করা হয়েছিল (চিত্র 4)। ওয়েস্টার্ন ব্লট ফলাফলে দেখা গেছে যে mNGAL (1200 µg/mL) 2L3 কোষের 24 ঘন্টার জন্য চিকিত্সা p-ERK (T202/Y204)/ERK (চিত্র 4A), p-AKT (S473)/AKT (চিত্র) এর অনুপাতকে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করেছে। 4B), এবং p-CREB (S133)/CREB (চিত্র 4C)। এই ফলাফলগুলি (চিত্র 3 এবং 4) দেখিয়েছে যে mNGAL কোষের বিস্তারকে বাধা দিয়ে এবং অ্যাপোপটোসিস প্ররোচিত করে 2L3 কোষের কোষের কার্যকারিতা হ্রাস করতে পারে। এটি প্রমাণিত হয়েছে যে ADPKD জেব্রাফিশ এবং মাউস মডেলগুলিতে অটোফ্যাজি কর্মহীনতা ঘটে, যখন অটোফ্যাজি অ্যাক্টিভেটরগুলির সাথে চিকিত্সা, যেমন রেপামাইসিন এবং কার্বামাজেপাইন উল্লেখযোগ্যভাবে সিস্ট গঠনকে হ্রাস করতে পারে [12]। 2L3 কোষে অটোফ্যাজিতে mNGAL এর প্রভাব তদন্ত করতে, দুটি সুপরিচিত অটোফ্যাজি মার্কার, মাইক্রোটিউবুল-সম্পর্কিত প্রোটিন 1A/1B লাইট চেইন 3 (LC3B) এবং p62, ওয়েস্টার্ন ব্লটিং (চিত্র 5) দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। LC3B II এর পরিমাণ অটোফাগোসোম গঠনের সাথে সম্পর্কযুক্ত এবং সাধারণত অটোফ্যাজির চিহ্নিতকারী হিসাবে ব্যবহৃত হয় [42]। p62 প্রোটিন সরাসরি ইউবিকুইটিন-ট্যাগযুক্ত সাবস্ট্রেট এবং LC3B II এর সাথে লিঙ্ক করে এবং শেষ পর্যন্ত অবনমিত হয়, তাই p62 এর অবক্ষয় একটি বহুল ব্যবহৃত অটোফ্যাজি মার্কার [৪৩]। ওয়েস্টার্ন ব্লট ফলাফল অনুসারে, 24 ঘন্টার জন্য 2L3 কোষের mNGAL চিকিত্সা উল্লেখযোগ্যভাবে LC3B II/LC3B I (চিত্র 5A) এর অনুপাত বাড়িয়েছে এবং নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর তুলনায় p62 (চিত্র 5B) এর স্তরকে হ্রাস করেছে। এই অনুসন্ধানটি পরামর্শ দিয়েছে যে mNGAL 2L3 কোষে অটোফ্যাজি সক্রিয় করেছে।