সিক্রেটেড নিউট্রোফিল জেলটিনেস-সম্পর্কিত লাইপোক্যালিন ননসিক্রেটেড ফর্মের তুলনায় ADPKD কোষের সিস্টের বৃদ্ধিকে বাধা দেওয়ার শক্তিশালী ক্ষমতা দেখায়

কীওয়ার্ড: ADPKD;নিউট্রোফিল জেলটিনেস-সম্পর্কিত লিপোক্যালিন; 3D সংস্কৃতি

জন্য নতুন হার্বস

1. ভূমিকা

পলিসিস্টিক কিডনি রোগ (PKD), সবচেয়ে সাধারণ উত্তরাধিকারসূত্রে প্রাপ্ত রোগগুলির মধ্যে একটি, নেফ্রনের একাধিক অংশে তরল-ভরা সিস্টের বিকাশ দ্বারা চিহ্নিত করা হয় [1]। ADPKD হল PKD-এর সবচেয়ে সাধারণ রূপ, যা একটি প্রাপ্তবয়স্ক-সূচনা PKD যার জন্য বেশিরভাগ রোগী তাদের চল্লিশের বয়স না হওয়া পর্যন্ত লক্ষণ প্রকাশ করে না [২]। ADPKD হল PKD1 (85%) বা PKD2 (15%) জিনের মিউটেশনের ফলাফল যা যথাক্রমে পলিসিস্টিন-1 (PC1) এবং পলিসিস্টিন-2 (PC2) এনকোড করে [3,4]। PC1 বা PC2 এর ত্রুটিগুলি রেনাল এপিথেলিয়াল কোষের প্রসারণে অস্বাভাবিক বৃদ্ধির সাথে যুক্ত এবং আরও সিস্ট গঠনের কারণ হয় [5-7]। ADPKD অগ্রগতির সাথে সাথে, সিস্ট বড় হয়ে যায় এবং স্বাভাবিক কিডনি স্থাপত্যকে ব্যাহত করে, অবশেষে কিডনি ব্যর্থতার দিকে পরিচালিত করে। যাইহোক, ADPKD এর সাথে জড়িত প্রক্রিয়াটি জটিল এবং অন্বেষণ করা বাকি রয়েছে। ADPKD-তে PC1 এবং/অথবা PC2-এর কার্যকরী ক্ষতির ফলে অন্তঃকোষীয় ক্যালসিয়াম ঘনত্ব হ্রাস পায়, ক্যালসিয়াম-সংবেদনশীল অ্যাডেনাইলাইল সাইক্লেস (AC) হ্রাস করে এবং আরও ফলস্বরূপ আন্তঃকোষীয় সাইক্লিক অ্যাডেনোসিন মনোফসফেট (cAMP) [8,9] এর মাত্রা বৃদ্ধি পায়। সিএএমপি প্রোটিন কিনেস এ (পিকেএ) এবং ডাউনস্ট্রিম রাস/বি-রাফ/এমইকে/ইআরকে পাথওয়ে [10,11] সক্রিয় করে সিস্টের বৃদ্ধির প্রচারের জন্য এপিথেলিয়াল কোষের বিস্তার এবং তরল নিঃসরণকে উদ্দীপিত করে। এটি প্রমাণিত হয়েছে যে ADPKD জেব্রাফিশ এবং ভিট্রোতে ইঁদুর [12] এবং ভিভো মডেলগুলিতে ইঁদুরগুলিতে অটোফ্যাজির কর্মহীনতা ঘটে [13]। অটোফ্যাজি হল একটি গুরুত্বপূর্ণ প্রক্রিয়া যা অর্গানেল, দীর্ঘজীবী প্রোটিন এবং পুষ্টির অবনতি এবং পুনর্ব্যবহার করে কোষ এবং অঙ্গ হোমিওস্ট্যাসিস বজায় রাখে [14,15]। অটোফ্যাজি এবং অ্যাপোপটোসিস পাথওয়ের এমটিওআর পাথওয়ের মধ্যে ক্রস-টক ঘটে, যা পিকেডি [16] তে নিয়ন্ত্রণহীন। অটোফ্যাজি অ্যাক্টিভেটরগুলির সাথে চিকিত্সা, যেমন রেপামাইসিন এবং কার্বামাজেপাইন, উল্লেখযোগ্যভাবে সিস্ট গঠনকে হ্রাস করতে পারে [12]। পূর্বে, আমরা Pkd1L3/L3 (C57BL/6 জেনেটিক ব্যাকগ্রাউন্ডে) [17] নামে একটি ADPKD মাউস মডেল স্থাপন করেছি এবং Pkd1 জিনের 30 এবং 34 নম্বরে একটি loxP সাইট এবং একটি loxP-flanked mc1-নিও ক্যাসেট সন্নিবেশ করান। , যথাক্রমে (L3 মানে অ্যালিলের মধ্যে তিনটি loxP সাইট), শর্তসাপেক্ষ জিন মিউটেশন তৈরি করতে। Pkd1L3/L3 ইঁদুর PC1-এর নিম্ন স্তরের (নিয়ন্ত্রণের 20%) উত্পাদন করে, যা আক্রমনাত্মক সিস্টের বৃদ্ধি এবং ক্রমবর্ধমান বয়সের সাথে কিডনির আয়তনের বিস্তারকে প্ররোচিত করে [17]। এছাড়াও, একটি ADPKD সেল মডেল (2L3 সেল লাইন) Pkd1L3/L3 ইঁদুর থেকে প্রাথমিক রেনাল এপিথেলিয়াল কোষগুলির SV40 ভাইরাস ট্রান্সডাকশন দ্বারা অমর কোষ লাইনগুলিকে প্ররোচিত করার জন্য প্রতিষ্ঠিত হয়েছিল [18]।

নিউট্রোফিল জেলটিনেস-সম্পর্কিত লাইপোক্যালিন (এনজিএএল), একটি 22-কেডি নিঃসৃত প্রোটিন, প্রাপ্তবয়স্কদের মধ্যে পিকেডি সহ কিডনির আঘাতের জন্য একটি বায়োমার্কার হিসাবে বিবেচিত হয় [১৯] (কিন্তু শিশুদের মধ্যে নয় [২০]), দীর্ঘস্থায়ী কিডনি রোগ [২১] ], এবং তীব্র কিডনি ইস্কেমিয়া [22]। রোগীর প্রস্রাবে এনজিএএল প্রোটিনের বৃদ্ধির প্রক্রিয়াটি স্পষ্ট নয়, এটি প্রস্তাব করা হয়েছে যে প্রস্রাবে জমে থাকা এনজিএএল আঘাতের ফলে রেনাল এপিথেলিয়াল কোষগুলির হ্রাসের সাথে সম্পর্কিত [২৩]। কিছু গবেষণায় ইঙ্গিত দেওয়া হয়েছে যে এনজিএএল রেনাল ইনজুরির বিরুদ্ধে একটি প্রতিরক্ষামূলক ভূমিকা পালন করে, ইসকেমিয়ার অবস্থান [২৪] এবং সিস্টের অগ্রগতি [২৫] দমন করে, যেখানে কিছু গবেষণায় পরামর্শ দেওয়া হয়েছে যে এনজিএএল সিস্টের অগ্রগতি [২৬] এবং টিউমারের বিকাশ [২৭] এর সাথে জড়িত থাকতে পারে। ]। NGAL রিসেপ্টর (NGAL-R, Slc22a17) রেনাল নেফ্রন সহ একাধিক এপিথেলিয়াল টিস্যুতে প্রকাশ করা হয় [২৮]। এনজিএএল এবং এনজিএএল-আর কাপলিং আন্তঃকোষীয় আয়রনকে আলাদা করতে পারে এবং আরও অ্যাপোপটোসিসকে প্ররোচিত করতে পারে [২৯], যা ব্যাকটেরিয়া সংক্রমণের বিরুদ্ধে সহজাত ইমিউন সিস্টেমের একটি আয়রন-ক্ষরণ কৌশলের সাথে যুক্ত [৩০]।

এক্সোজেনাস এনজিএএল-এর প্রশাসন Pkd1−/− কোষগুলির অ্যাপোপটোসিস বাড়াতে এবং ভিট্রোতে সিস্টের বৃদ্ধি আরও হ্রাস করতে দেখা গেছে [25]। পূর্ববর্তী কাজে, আমরা যথাক্রমে NGAL নকআউট এবং ট্রান্সজেনিক ইঁদুরের সাথে Pkd1L3/L3 ইঁদুরকে আন্তঃক্রস করে Pkd1L3/L3 × NGAL−/− এবং Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg ইঁদুর তৈরি করেছি [31]। আমরা দেখেছি যে একটি ADPKD মাউস মডেলে (Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg ইঁদুর) এনজিএএল-এর অত্যধিক এক্সপ্রেশন সিস্টের অগ্রগতি হ্রাস করেছে এবং Pkd1L3/L3 ইঁদুরের জীবনকালকে দীর্ঘায়িত করেছে, যার সাথে প্রসারণ, অ্যাপোপটোসিস এবং এর সাথে জড়িত আণবিক পথের একটি সিরিজের পরিবর্তন রয়েছে। ফাইব্রোসিস [৩১]। যাইহোক, ADPKD এর অগ্রগতি হ্রাস করার ক্ষেত্রে NGAL এর প্রভাবগুলির অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়াটি রহস্যজনক থেকে যায়।

এই গবেষণায়, Pkd1L3/L3 রেনাল এপিথেলিয়াল কোষের (2L3 কোষ) সিস্টের অগ্রগতি পরীক্ষা করার জন্য একটি 3D সেল কালচার প্ল্যাটফর্ম প্রতিষ্ঠিত হয়েছিল যাতে রিকম্বিন্যান্ট মাউস NGAL (mNGAL) প্রোটিন বা ভিট্রোতে ট্রান্সজেনিক NGAL-এর অতিরিক্ত এক্সপ্রেশন যোগ করা হয়। এছাড়াও, প্রসারণ, অ্যাপোপটোসিস এবং অটোফ্যাজি-সম্পর্কিত পথগুলিতে মানসিক প্রভাবগুলি অন্বেষণ করা হয়েছিল। তদ্ব্যতীত, 2L3 কোষে NGAL-এর প্রক্রিয়াটি 2L3 কোষে নিঃসৃত NGAL (pN + LS) এবং nonsecreted NGAL (pN − LS) এর অতিরিক্ত এক্সপ্রেশনের প্রভাবগুলি পরীক্ষা করে ব্যাখ্যা করা হয়েছিল। ADPKD কোষে NGAL প্রোটিনের প্রভাব এবং ধারণাযোগ্য প্রক্রিয়াটি এই গবেষণায় আংশিকভাবে অন্বেষণ করা হয়েছিল।

2. উপকরণ এবং পদ্ধতি

2.1। সেল লাইন

Pkd1L3/L3 (2L3) সেল লাইনটি 2L3 ইঁদুর থেকে প্রাথমিক রেনাল এপিথেলিয়াল কোষগুলির SV40 ভাইরাস ট্রান্সডাকশন দ্বারা প্রতিষ্ঠিত হয়েছিল, একটি ADPKD মাউস মডেল, একটি অমর কোষ লাইন [17,18] প্ররোচিত করতে। প্রাথমিক রেনাল কোষগুলি তাদের দ্বিতীয় উত্তরণে একটি Lenti SV40 ভাইরাস অমরকরণ কিট ব্যবহার করে সংক্রামিত হয়েছিল (ক্যাপিটাল বায়োসায়েন্সেস ইনক।, গেইথার্সবার্গ, এমডি, ইউএসএ)। কোষগুলিকে 37 ◦C তাপমাত্রায় 5% CO2 তে ইনকিউব করা হয়েছিল এবং একটি ছয়-কূপ প্লেটে রাতারাতি পলিব্রিন (8 µg/mL) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। পরের দিন, ভাইরাল সুপারনাট্যান্ট বাতিল করা হয়েছিল, এবং কোষগুলিকে একটি তাজা মাধ্যমে ইনকিউব করা হয়েছিল। সঙ্গমে পৌঁছানোর পর, কোষগুলিকে সংস্কৃতির মাধ্যম সহ একটি 10- সেমি ডিশে উপসংস্কৃতি করা হয়েছিল এবং প্যাসেজ ওয়ান (P1) কোষ হিসাবে বিবেচনা করা হয়েছিল। SV40-রূপান্তরিত ক্লোনগুলি নির্বাচন করা হয়েছিল, এবং ক্লোনিং রিংগুলি ব্যবহার করে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল [17,18]। BCRC (Hsinchu, তাইওয়ান) থেকে কেনা M-1 সেল লাইন (Pkd1+/+) ওয়াইল্ড-টাইপ সেল লাইন হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল৷

2.2। কোষ সংস্কৃতি

কোষ প্রতি তিন দিন পাস করা হয়. ADPKD কোষে mNGAL-এর IC50 পরীক্ষা করার জন্য, 2L3 কোষগুলিকে উপরে বর্ণিত মাধ্যমটির 500 μL দিয়ে 24-ওয়েল প্লেটে (6000 কোষ/কূপ) বীজ দেওয়া হয়েছিল এবং এর জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল 16 ঘন্টা। তারপরে কোষগুলিকে রিকম্বিন্যান্ট mNGAL (0, 20, 40, 80, 160, 320 µg/mL) বা রেপামাইসিন (1 µM, সিগমা, সেন্ট লুইস, MO, USA থেকে) অন্য 0, 8,24, বা 48-এর জন্য চিকিত্সা করা হয়েছিল। h (n=4)।

2.3। লেকটিন স্টেনিং

M{{0}} এবং 2L3 কোষগুলি অনুরূপ উত্সের রেনাল টিউবুল থেকে ছিল কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য, লোটাস টেট্রাগোনোলোবাস লেকটিন (LTL, যা ফ্লুরোসেসিন দ্বারা লেবেলযুক্ত একটি পার্থক্যযুক্ত প্রক্সিমাল টিউবুল মার্কার) এবং ডলিচোস বিফ্লোরাস অ্যাগ্লুটিনিন (ডিবিএ) দিয়ে লেকটিন স্টেনিং। , যা রোডামাইন লেবেলযুক্ত একটি পৃথক সংগ্রহ নালী চিহ্নিতকারী) সঞ্চালিত হয়েছিল। LTL এবং DBA ভেক্টর ল্যাবরেটরিজ (Burlingame, CA, USA) থেকে কেনা হয়েছিল। কোষের পর্যবেক্ষণের জন্য, কভারস্লিপে সংষ্কৃত কোষগুলিকে ফসফেট-বাফারযুক্ত স্যালাইন (পিবিএস) দিয়ে তিনবার 10 মিনিটের জন্য ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং তারপরে 30 মিনিটের জন্য পিবিএস-এ 4% প্যারাফর্মালডিহাইড (পিএফএ) দিয়ে স্থির করা হয়েছিল। 20 মিনিটের জন্য PBS (PBST) তে 0.4% Triton X-100 দিয়ে ব্যাপ্তিকরণের পরে, কোষগুলি 1.5 ঘন্টার জন্য PBST-তে 10% হর্স সিরাম দিয়ে ব্লক করা হয়েছিল। কোষগুলি 37 ◦C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য LTL (20 µg/mL) এবং DBA (20 µg/mL) দিয়ে দাগযুক্ত ছিল। নিউক্লিয়াস 5 মিনিটের জন্য DAPI (1 µg/mL) দিয়ে দাগযুক্ত ছিল। ধাপগুলির মধ্যে 10 মিনিটের জন্য নমুনাগুলি পিবিএসটি দিয়ে তিনবার ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল।

2.4। ডিএনএ লাইসেট এবং জিনোটাইপিং

Pkd1 জিন জিনোটাইপিংয়ের জন্য, পিসিআর ফরোয়ার্ড (50 -TGTGTTGTTCTTTGTGGCAGTCAG-30 ) এবং বিপরীত (50 -ATTCTCAATGACTGACTTGGGCTC-30 ) প্রাইমারগুলি জিনোমিক ডিএনএ সিকোয়েন্সগুলিকে প্রসারিত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল৷ নমুনাগুলি 5 মিনিটের জন্য 94 ◦C তাপমাত্রায় উত্তপ্ত করা হয়েছিল, এবং তারপরে 30টি চক্র (1 মিনিটের জন্য 94 ◦C, 1 মিনিটের জন্য 56 ◦C, 1 মিনিটের জন্য 72 ◦C) এবং 10 মিনিটের জন্য 72 ◦C এবং 25 ◦C দ্বারা অনুসরণ করা হয়েছিল সি 5 মিনিটের জন্য। পিসিআর দ্বারা প্রশস্ত করার পরে, ডিএনএ পণ্যগুলিকে 6× লোডিং ডাইয়ের সাথে মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং 1% অ্যাগারোজ ট্রিস-বোরেট-ইডিটিএ (টিবিই) জেল ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

2.5। পরিমাণগত বিপরীত প্রতিলিপি রিয়েল-টাইম পলিমারেজ চেইন প্রতিক্রিয়া (RT–qPCR)

সেল লাইন থেকে মোট RNA একটি MagQu gDNA নিষ্কাশন কিট (MagQu, নিউ তাইপেই সিটি, তাইওয়ান) ব্যবহার করে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং DNase I চিকিত্সা (Worthington, Lakewood, NJ, USA) এবং −80 ◦C তাপমাত্রায় ddH2O তে সংরক্ষণ করা হয়েছিল। 1% টিবিই অ্যাগারোজ জেল এবং একটি ন্যানোড্রপ স্পেকট্রোফটোমিটার (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে আরএনএর গুণমান এবং ঘনত্ব নির্ধারণ করা হয়েছিল। RNaseOUTTM RNase ইনহিবিটর (G-Biosciences, St. Louis, MO, USA) এর উপস্থিতিতে একটি RevertAid ফার্স্ট স্ট্র্যান্ড cDNA সংশ্লেষণ কিট (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে টেমপ্লেট আরএনএকে cDNA-তে বিপরীত প্রতিলিপি করা হয়েছিল। প্রতিটি প্রতিক্রিয়া মোট RNA (100 ng), Oligo (dT)18 প্রাইমার (1 µL), 5X রিঅ্যাকশন বাফার (4 µL), RiboLock RNase ইনহিবিটর (20 U), dNTP মিক্স (20 U), সহ মোট 20 μL ভলিউমে প্রস্তুত করা হয়েছিল 1 মিমি), রিভার্টএড রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ (200 ইউ), এবং নিউক্লিজ-মুক্ত জল। প্রথম-স্ট্র্যান্ড সিডিএনএ সংশ্লেষণের জন্য, নমুনাগুলিকে 1 ঘন্টার জন্য 42 ◦C তাপমাত্রায় উত্তপ্ত করা হয়েছিল এবং তারপরে 1 মিনিটের জন্য 70 ◦C তাপমাত্রায় উত্তপ্ত করে প্রতিক্রিয়াটি বন্ধ করা হয়েছিল।

জিন এক্সপ্রেশনের পরিমাণ নির্ধারণ একটি StepOne™ রিয়েল-টাইম পিসিআর সিস্টেম (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেম, নরওয়াক, সিটি, ইউএসএ) ব্যবহার করে সম্পাদিত হয়েছিল। জিন-নির্দিষ্ট ফরোয়ার্ড (100 nM), বিপরীত (100 nM) প্রাইমার (সারণী 1), cDNA টেমপ্লেট (100 ng), ORATM SEE qPCR Green ROX H মিক্স (1×) সহ প্রতিটি নমুনা মোট 20 μL ভলিউমে প্রস্তুত করা হয়েছিল , উচ্চ GmbH, Kraichtal, Germany) এবং PCR জল। নমুনাগুলি 2 মিনিটের জন্য 95 ◦C তাপমাত্রায় উত্তপ্ত করা হয়েছিল, তারপরে 40টি চক্র (5 সেকেন্ডের জন্য 95 ◦C, 25 সেকেন্ডের জন্য 65 ◦C) এবং তারপর গলিত বক্ররেখা বিশ্লেষণ (15 সেকেন্ডের জন্য 95 ◦C, 1 মিনিটের জন্য 60 ◦C) , 15 সেকেন্ডের জন্য 95 ◦C) একটি StepOne™ রিয়েল-টাইম PCR সিস্টেম ব্যবহার করে। StepOne™ সফটওয়্যার (v2.3) দিয়ে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছে। Gapdh এর জিন এক্সপ্রেশন স্বাভাবিককরণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।

2.6। কোষের কার্যকারিতা পরীক্ষা

থিয়াজোলিল ব্লু টেট্রাজোলিয়াম ব্রোমাইড (এমটিটি অ্যাস) (সিগমা) ব্যবহার করে কোষের কার্যকারিতা নির্ধারণ করা হয়েছিল। MTT দ্রবণ (0.5 mg/mL) প্রতিটি কূপে যোগ করা হয়েছিল এবং 2 ঘন্টার জন্য 37 ◦C তাপমাত্রায় সেদ্ধ করা হয়েছিল। বেগুনি ফর্মাজান ক্রিস্টালগুলিকে দ্রবীভূত করার জন্য, অপসারণের পরে প্রতিটি কূপে ডাইমিথাইল সালফক্সাইড (DMSO, সিগমা) যোগ করা হয়েছিল। মাঝারি এবং MTT সমাধান। 570 এনএম-এ প্রতিটি নমুনার অপটিক্যাল ঘনত্ব (OD) একটি ELISA রিডার (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল।

2.7। কোষ বিস্তার পরীক্ষা

M-1 এবং 2L3 কোষের বিস্তার বিশ্লেষণের জন্য ব্রোমোডিঅক্সিউরিডিন (BrdU) কোষের বিস্তার পরীক্ষা (মিলিপুর, বার্লিংটন, এমএ, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) করা হয়েছিল। M-1 এবং 2L3 কোষের প্রসারণ ক্ষমতার তুলনা করার জন্য, কোষগুলিকে 24 ঘন্টার জন্য 96-ওয়েল প্লেটে (5 × 103 কোষ/কূপ) সংষ্কৃত করা হয়েছিল। ইনকিউবেশন পিরিয়ড শেষ হওয়ার 2 ঘন্টা আগে BrdU মাঝারিতে যুক্ত করা হয়েছিল। 2L3 কোষের বিস্তারের উপর mNGAL-এর প্রভাব অন্বেষণ করতে, 2L3 কোষগুলিকে প্রথমে 96-ওয়েল প্লেটে (2 × 103 কোষ/কূপ) 16 ঘণ্টার জন্য সংষ্কৃত করা হয়েছিল এবং তারপরে আরও 8, 24 এবং 48 ঘণ্টার জন্য mNGAL চিকিত্সা করা হয়েছিল। খাবারের ইনকিউবেশন পিরিয়ড শেষ হওয়ার 2 ঘন্টা আগে BrdU মাঝারিতে যুক্ত করা হয়েছিল। তারপরে কোষগুলিকে 37 ◦C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য ফিক্সিং দ্রবণ (200 µL/ওয়েল) দিয়ে স্থির করা হয়েছিল, তারপরে BrdU সনাক্তকরণ অ্যান্টিবডি (100 μL/ওয়েল) দিয়ে 37 ◦C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেশন এবং পারক্সিডেস-কনজুগেটেড গোট অ্যান্টি-মাউস অ্যান্টিবডি। (100 μL/ভাল) 37 ◦C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য। কোষগুলি ওয়াশ বাফার দিয়ে তিনবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং উপরে বর্ণিত ধাপগুলির মধ্যে কাগজের তোয়ালে শুকিয়ে গেছে।

অন্ধকারে 30 মিনিটের জন্য 37 ◦C তাপমাত্রায় TMB পারক্সিডেস সাবস্ট্রেট (100 μL/ওয়েল) দিয়ে ইনকিউবেশন করার পরে, স্টপ সলিউশন (100 μL/ওয়েল) দিয়ে প্রতিক্রিয়া বন্ধ করা হয়েছিল। অবশেষে, প্রতিটি নমুনার OD450 একটি ELISA রিডার (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল।

2.8। অ্যাপোপটোসিস অ্যাস

ফ্লো সাইটোমেট্রি ব্যবহার করে অ্যাপোপটোসিস বিশ্লেষণের জন্য, 2L3 কোষগুলিকে 2 মিলি মাঝারি দিয়ে 6-ওয়েল প্লেটে (1.8 × 105 কোষ/কূপ) বীজ দেওয়া হয়েছিল এবং 16 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল। এরপর কোষগুলিকে mNGAL (0, 600, 1200 µg/mL) দিয়ে আরও 0, 4, বা 12 ঘন্টার জন্য চিকিত্সা করা হয়েছিল, Annexin V-FITC এবং PI (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) দিয়ে সংগ্রহ ও দাগ দেওয়া হয়েছিল ) যথাক্রমে 4 এবং 12 ঘন্টা এ প্রবাহ সাইটোমেট্রি দ্বারা বিশ্লেষণের জন্য (n=3, নিয়ন্ত্রণ এবং mNGAL)। বিশ্লেষণের আগে ক্ষতিপূরণ এবং চতুর্ভুজ স্থাপন করতে, দাগহীন কোষ, শুধুমাত্র অ্যানেক্সিন V-FITC দিয়ে দাগযুক্ত কোষ এবং শুধুমাত্র PI দিয়ে দাগযুক্ত কোষগুলি ব্যবহার করা হয়েছিল।

2.9। ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ

কোষগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং প্রোটেজ ইনহিবিটর ককটেল (1:100) এবং ফসফেটেস (1:100) এর সাথে RIPA সম্পূরক দিয়ে লাইজ করা হয়েছিল। 4 ◦C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য ইনকিউবেশনের পরে, সেল লাইসেটগুলিকে 15 মিনিটের জন্য 13,400 × g (Eppendorf 5415R, Hamburg, Germany) 4 ◦C তাপমাত্রায় সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। বিসিএ অ্যাস ব্যবহার করে প্রোটিনের ঘনত্ব পরিমাপ করা হয়েছিল। সমান পরিমাণে প্রোটিন (1:2 লোডিং ডাই/ওয়েল সহ 25 µg প্রোটিন) ইলেক্ট্রোফোরেটিক্যালি SDS-PAGE (10%) দ্বারা আলাদা করা হয়েছিল এবং 1 ঘন্টার জন্য PVDF মেমব্রেনে স্থানান্তরিত হয়েছিল। তারপর ঘরের তাপমাত্রায় 2 ঘন্টার জন্য 0.1% টুইন-20 (TBST) সহ ট্রিস-বাফার স্যালাইনে 5% স্কিমড মিল্ক দিয়ে মেমব্রেনগুলিকে ব্লক করা হয়েছিল। 10 মিনিটের জন্য তিনবার TBST দিয়ে ধোয়ার পর, ঝিল্লিগুলিকে প্রাথমিক অ্যান্টিবডি (টেবিল 2) দিয়ে রাতারাতি 4 ◦C তাপমাত্রায় ইনকিউবেশন করা হয়েছিল, তারপরে HRP-সংযোজিত সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলির সাথে একটি 1-ঘন্টা ইনকিউবেশন (টেবিল 3)।

2.10। ত্রিমাত্রিক কোষ সংস্কৃতি (3D সংস্কৃতি)

সিস্ট গঠনের মূল্যায়ন করতে ম্যাট্রিজেল ম্যাট্রিক্স (কর্নিং, এনওয়াই, ইউএসএ) ব্যবহার করে 3D সংস্কৃতি সম্পাদিত হয়েছিল। 2L3 কোষগুলিকে 96-কূপ প্লেটে (1000 কোষ/কূপ) প্রিফর্মড ম্যাট্রিজেল (মাঝারিভাবে 40%) বীজ দেওয়া হয়েছিল। কোষগুলি জেলের সাথে সংযুক্ত হওয়ার পরে, স্যান্ডউইচের মতো প্যাটার্ন তৈরি করতে কোষগুলিতে আরও ম্যাট্রিজেল যুক্ত করা হয়েছিল (চিত্র 6)। কোষগুলি 3D সংস্কৃতিতে 37 ◦C এবং 5% CO2 বজায় রাখা হয়েছিল। সিস্ট গঠনকে প্ররোচিত করার জন্য 1 দিন থেকে 3 দিন পর্যন্ত ফোরস্কোলিন (20 মিমি, সিগমা) দিয়ে কোষগুলিকে চিকিত্সা করা হয়েছিল। ফোরস্কোলিনের সাহায্যে সিস্ট গঠনের প্রবর্তনের পরে, কোষগুলিকে mNGAL (2 mg/mL) দিয়ে বা ছাড়াই 4 থেকে 8 দিন পর্যন্ত চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং মাধ্যমটি প্রতিদিন পরিবর্তন করা হয়েছিল। সিস্ট গঠন প্রতিদিন একটি মাইক্রোস্কোপের নীচে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল এবং সিস্টের ব্যাস, এলাকা এবং সংখ্যা ইমেজজে দিয়ে পরিমাপ করা হয়েছিল। ইমিউনোসাইটোকেমিস্ট্রি (আইসিসি) প্লেট বা কভারস্লিপে 8 তম দিনে সঞ্চালিত হয়েছিল। কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি (ZEISS, Oberkochen, Germany) দ্বারা সিস্টের পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।

2.11। ইমিউনোসাইটোকেমিস্ট্রি (আইসিসি)

সিস্টের পর্যবেক্ষণের জন্য, কূপে বা কভারস্লিপে ম্যাট্রিজেল দিয়ে কালচার করা সিস্টগুলিকে পিবিএস দিয়ে 10 মিনিটের জন্য তিনবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং তারপর 30 মিনিটের জন্য পিবিএস-এ 4% প্যারাফর্মালডিহাইড (পিএফএ) দিয়ে স্থির করা হয়েছিল। 20 মিনিটের জন্য 0.4% পিবিএসটি সহ ব্যাপ্তিকরণের পরে, সিস্টগুলি 2 ঘন্টার জন্য পিবিএসটি-তে 10% ঘোড়ার সিরাম দিয়ে ব্লক করা হয়েছিল। সিস্টগুলিকে ই-ক্যাডেরিন (1:500; সেল সিগন্যালিং টেকনোলজি, ড্যানভার্স, এমএ, ইউএসএ) এবং অ্যাক্টিন (1:1000; মিলিপুর) এর বিরুদ্ধে রাতারাতি 4 ◦C তাপমাত্রায় প্রাথমিক অ্যান্টিবডি দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল এবং তারপরে ফ্লুরোসেন্ট সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল (টেবিল 3) ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য অন্ধকারে। নিউক্লিয়াস 5 মিনিটের জন্য DAPI (1 µg/mL) দিয়ে দাগযুক্ত ছিল। ধাপগুলির মধ্যে 10 মিনিটের জন্য নমুনাগুলি পিবিএসটি দিয়ে তিনবার ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল।

2.12। কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি

3D সংস্কৃতিতে পরিলক্ষিত গোলাকার নির্মাণগুলি সিস্ট ছিল তা নিশ্চিত করার জন্য, 3D সংস্কৃতির কভারস্লিপগুলি ফ্লুরোমাউন্ট-জি মাউন্টিং মাধ্যম (সাউদার্ন বায়োটেক, বার্মিংহাম, AL, USA) সহ স্লাইডে মাউন্ট করা হয়েছিল এবং একটি কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে চিত্রিত করা হয়েছিল। কনফোকাল ইমেজিং একটি 63× তেল নিমজ্জন উদ্দেশ্য সহ সঞ্চালিত হয়েছিল। ZEISS ZEN মাইক্রোস্কোপ সফ্টওয়্যার (Oberkochen, Germany) এ Z-স্ট্যাক মডিউল ব্যবহার করে 3D সংস্কৃতিতে একটি 2L3 সিস্টের বিভিন্ন অপটিক্যাল জেড-সেকশন প্রাপ্ত করা হয়েছিল। ZEISS ZEN মাইক্রোস্কোপ সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে সিস্টের অপটিক্যাল বিভাগগুলি Z-স্ট্যাক বা 3D ভিডিওতে পুনর্গঠন করা হয়েছিল।

2.13। প্লাজমিড নির্মাণ এবং ভাইরাস সংক্রমণ

মাউস NGAL সিকোয়েন্স (534 bp) pSecTag2B ভেক্টর (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) মধ্যে ঢোকানো হয়েছিল একটি মুরিন Igκ-চেইন লিডার সিকোয়েন্সের ফ্রেমে এবং ডাউনস্ট্রিমে লুকানো এনজিএএল প্রোটিনকে অতিরিক্তভাবে প্রকাশ করার জন্য। বিপরীতভাবে, উপরে বর্ণিত প্লাজমিডে মুরিন Igκ চেইন লিডার সিকোয়েন্সটি অপসারিত এনজিএএল প্রোটিনকে অত্যধিক এক্সপ্রেস করতে সরানো হয়েছিল। pSecTag2B-NGAL লিডার সিকোয়েন্স সহ বা ছাড়া (যথাক্রমে pN + LS বা pN − LS) NGAL এবং NGAL রিসেপ্টরের মধ্যে সম্পর্ক অধ্যয়ন করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছিল। কনস্ট্রাক্টের সঠিক সন্নিবেশ নিশ্চিত করার জন্য, NheI এবং NotI ব্যবহার করা হয়েছিল pN + LS বা pN −LS এর সাথে NEBuffer 2 (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) 37 ◦C তাপমাত্রায় 2 ঘন্টার জন্য এবং তারপরে 1% ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল টিবিই জেল।

স্থিতিশীল ক্লোন তৈরি করতে, 2L3 কোষগুলিকে DMEM/F12 মাঝারি (300 µL/ওয়েল) 10% তাপ-নিষ্ক্রিয় FBS, 1% P/S, পলিব্রেন (8 µg/mL), এবং লেন্টিভাইরাস (200 µL) এর সাথে পরিপূরক করা হয়েছিল। 24 ঘন্টার জন্য 37 ◦C তাপমাত্রায় একটি 6-ওয়েল প্লেট। তারপরে ভাইরাস সুপারন্যাট্যান্টটি বাতিল করা হয় এবং কোষগুলিকে পিবিএস দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয় এবং সংক্রামিত কোষ নির্বাচনের জন্য ব্লাস্টিসিডিন (4 µg/mL)যুক্ত তাজা মাধ্যম দিয়ে ইনকিউব করা হয়। নির্বাচন মাধ্যম প্রতি 3 দিন পরিবর্তন করা হয়. এমএনজিএএল এক্সপ্রেশনের স্তর বিশ্লেষণ করতে ওয়েস্টার্ন ব্লটিং এবং আরটি-কিউপিসিআর-এর জন্য ব্লাস্টিসিডিন নির্বাচনের এক সপ্তাহ পরে সংক্রামিত কোষগুলি কাটা হয়েছিল।

2.14। এনজাইম-লিঙ্কড ইমিউনোসরবেন্ট অ্যাস (ELISA)

কোষ দ্বারা নিঃসৃত NGAL-এর পরিমাপ একটি মাউস লাইপোক্যালিন{{0}} (Lcn2) সলিড-ফেজ স্যান্ডউইচ ELISA কিট (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল। কোষের সুপারনাট্যান্ট মাধ্যম সংগ্রহ করা হয়েছিল, কোষের ধ্বংসাবশেষ অপসারণের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং −80 ◦C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল। স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখার জন্য, স্ট্যান্ডার্ড মাউস এনজিএএল প্রোটিনের 8× সিরিজ ডিলিউশন প্রস্তুত করা হয়েছিল (0, 0.024, 0.195, 1.563, 12.5, 100 ng/mL)। স্ট্যান্ডার্ড (100 µL/ওয়েল) এবং নমুনাগুলি (সেল লাইসেট বা নন-ডাইলুটেড সুপারনাট্যান্ট থেকে 10 µg মোট প্রোটিনের 100 µL/ওয়েল) কূপ প্লেটে যোগ করা হয়েছিল এবং 2.5 ঘন্টার জন্য 37 ◦C তাপমাত্রায় ইনকিউব করা হয়েছিল। প্রতিটি কূপ বায়োটিন (100 µL/ওয়েল) কনজুগেট দিয়ে 37 ◦C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য এবং তারপরে স্ট্রেপ্টাভিডিন–এইচপিআর দ্রবণ (100 μL/ওয়েল) 37 ◦C তাপমাত্রায় 45 মিনিটের জন্য মৃদু ঝাঁকুনি দিয়ে সিদ্ধ করা হয়েছিল। দ্রবণটি ফেলে দেওয়া হয়েছিল এবং কূপটি ধুয়ে ফেলা হয়েছিল

অন্ধকারে 30 মিনিটের জন্য 37 ◦C তাপমাত্রায় TMB সাবস্ট্রেট (100 μL/ওয়েল) দিয়ে ইনকিউবেশনের পরে, স্টপ সলিউশন (50 μL/ওয়েল) যোগ করে প্রতিক্রিয়া বন্ধ করা হয়েছিল। অবশেষে, প্রতিটি নমুনার OD450 একটি ELISA রিডার (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল।

2.15। পরিসংখ্যান বিশ্লেষণ

সমস্ত ডেটা গড় ± স্ট্যান্ডার্ড বিচ্যুতি (SD) হিসাবে দেখানো হয়। একাধিক গড় তুলনার জন্য, R স্টুডিওতে Tukey-এর পোস্ট-হক পরীক্ষার সাথে ছাত্রদের টি-টেস্ট এবং ভ্যারিয়েন্সের একমুখী বিশ্লেষণ (ANOVA) ব্যবহার করে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। পার্থক্যগুলি পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ হিসাবে বিবেচিত হয়েছিল যখন p মান < 0.05।