পারকিনসন্স ডিজিজের একটি ইন ভিট্রো মডেলে বর্ধিত নির্ভুলতা এবং দক্ষতা সহ নিউরাইট অবক্ষয়ের পরিমাণ পার্ট 2

ফলাফল

PD এর সাথে যুক্ত নিউরাইট অবক্ষয়ের একটি সেল কালচার মডেল প্রতিষ্ঠা করা

PD-এর সেল কালচার মডেলে নিউরাইটের অবক্ষয় তদন্তের জন্য একটি পদ্ধতি বিকাশ করতে, আমরা সংস্কৃতিযুক্ত LUHMES কোষগুলি ব্যবহার করেছি, শর্তসাপেক্ষে অমর, মানব মেসেনসেফালিক কোষগুলির একটি জনসংখ্যা। পার্থক্যের পরে, LUHMES কোষগুলি পোস্টমিটোটিক হয়ে যায়, পরিপক্ক ডোপামিনার্জিক নিউরনের একটি জিন এক্সপ্রেশন প্রোফাইল বৈশিষ্ট্য গ্রহণ করে এবং 500 মিমি দৈর্ঘ্য পর্যন্ত প্রসারিত নিউরাইটগুলির সাথে একটি নিউরোনাল আকারবিদ্যা বিকাশ করে (চিত্র 1A; Lotharius et al., 2005; Scholz et al. , 2011; ক্রেমার এট আল।, 2021)।

নিউরোডিজেনারেশন, এমন একটি অবস্থা যেখানে স্নায়ু কোষগুলি পরিবর্তিত হয় বা মারা যায়, স্মৃতির সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত। কোষ সংস্কৃতির মডেলগুলিতে, আমরা নিউরোডিজেনারেশনের অভিব্যক্তিকে উপশম করতে এবং এইভাবে স্মৃতির কর্মক্ষমতা উন্নত করতে সংস্কৃতির অবস্থা নিয়ন্ত্রণ করতে পারি।

গবেষণায় দেখা গেছে যে স্নায়ু কোষের হোমিওস্ট্যাসিস কোষের বেঁচে থাকা এবং সিস্টেম ফাংশনে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। আমরা সংস্কৃতির মাধ্যমের পুষ্টি এবং বৃদ্ধির কারণগুলি নিয়ন্ত্রণ করে কোষের স্থিতিশীলতা উন্নত করতে পারি। একই সময়ে, পরিবেশের দ্বারা কোষগুলিকে বিরক্ত এবং ক্ষতিগ্রস্ত হওয়া থেকে রক্ষা করার জন্য সংস্কৃতি পরিবেশের পরিচ্ছন্নতা এবং তাপমাত্রা নিয়ন্ত্রণ বজায় রাখার দিকে মনোযোগ দিন।

এছাড়াও, সেল কালচার মডেলে, আমরা নিউরোমোডুলেশনের অভিব্যক্তি কমাতে কোষগুলিতে নির্দিষ্ট যৌগ বা ওষুধও ইনজেকশন করতে পারি, যার ফলে কোষগুলির বেঁচে থাকার হার এবং স্মৃতিশক্তির কার্যকারিতা উন্নত হয়। এই কৌশলটি নিউরোডিজেনারেটিভ রোগের গবেষণায়ও ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়।

সংক্ষেপে, কোষের স্থায়িত্ব এবং সিস্টেমের কার্যকারিতার উপর নিউরোডিজেনারেশন একটি গুরুত্বপূর্ণ প্রভাব ফেলে, এবং কোষ সংস্কৃতি প্রযুক্তি একটি ভাল মডেল গবেষণা পদ্ধতি, যা নিউরোডিজেনারেশন এবং স্মৃতির মধ্যে সম্পর্কের উপর গভীরভাবে অন্বেষণ এবং গবেষণা পরিচালনা করতে পারে। কোষের বেঁচে থাকা এবং স্মৃতিশক্তির কর্মক্ষমতা উন্নত করতে এবং নিউরোডিজেনারেটিভ রোগের অধ্যয়নের জন্য আরও বিস্তৃত ভিত্তি প্রদান করতে পরিবেশগত নিয়ন্ত্রণ, কোষে ওষুধ ইনজেকশন ইত্যাদির মাধ্যমে আমরা নিউরোমোডুলেশন কর্মক্ষমতা হ্রাস করতে পারি। দেখা যায় আমাদের স্মৃতিশক্তি উন্নত করতে হবে। Cistanche উল্লেখযোগ্যভাবে আমাদের স্মৃতিশক্তি উন্নত করতে পারে, কারণ Cistanche নিউরোট্রান্সমিটারের ভারসাম্য নিয়ন্ত্রণ করতে পারে, যেমন অ্যাসিটাইলকোলিনের মাত্রা বৃদ্ধি এবং বৃদ্ধির কারণ, যা স্মৃতি এবং শেখার জন্য খুবই গুরুত্বপূর্ণ। এছাড়াও, মাংস রক্ত ​​​​প্রবাহকে উন্নত করতে পারে এবং অক্সিজেন সরবরাহকে উন্নীত করতে পারে, যা নিশ্চিত করতে পারে যে মস্তিষ্ক যথেষ্ট পুষ্টি এবং শক্তি পায়, যার ফলে মস্তিষ্কের জীবনীশক্তি এবং সহনশীলতা উন্নত হয়।

মেমরি উন্নত করতে সম্পূরকগুলি জানুন ক্লিক করুন

প্লাস্টিকের তুলনায় কাচের উচ্চতর অপটিক্যাল গুণাবলীর কারণে, আটটি মিডিয়া চেম্বার সমন্বিত কাচের স্লাইডে সংস্কৃতিগুলি প্রতিষ্ঠিত হয়েছিল। পূর্ববর্তী প্রতিবেদনের উপর ভিত্তি করে (লোথারিয়াস এট আল।, 2005; স্কোলজ এট আল।, 2011; কুরোভস্কা এট আল।, 2014), আমরা প্রাথমিকভাবে পিএলও এবং ফাইব্রোনেক্টিন দিয়ে প্রলিপ্ত চেম্বার স্লাইডগুলিতে সংস্কৃতি প্রতিষ্ঠা করার চেষ্টা করেছি; যাইহোক, এই জাতীয় সংস্কৃতিগুলি আনুগত্যের ঘাটতি এবং কম কার্যকারিতা প্রদর্শন করে। ফলস্বরূপ, আমরা পরীক্ষা করেছি যে অতিরিক্ত স্তরগুলির সাথে আবরণ কাচের পৃষ্ঠগুলিতে প্রতিষ্ঠিত LUHMES কোষ সংস্কৃতিগুলির কার্যকারিতা উন্নত করবে কিনা।

LUHMES সেল কালচারগুলি স্লাইডগুলিতে প্রতিষ্ঠিত হয়েছিল যেগুলি হয় আনকোটেড বা পিএলও এবং ফাইব্রোনেকটিন, পিডিএল এবং ল্যামিনিন, বা চারটি স্তরের সংমিশ্রণ দ্বারা প্রলিপ্ত ছিল। ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি দ্বারা কার্যকরী নিউক্লিয়াসের বিশ্লেষণ থেকে জানা যায় যে স্লাইড আবরণ সংস্কৃতির কার্যকারিতাকে উল্লেখযোগ্যভাবে প্রভাবিত করেছে [ফ্রাইডম্যান x2 (3)=18, p, 0.0001], পোস্ট হক একাধিক তুলনা বিশ্লেষণের সাথে স্লাইডগুলি প্রকাশ করে উপরে উল্লিখিত চারটি সাবস্ট্রেটের সংমিশ্রণে প্রলিপ্ত হলে শুধুমাত্র পিএলও এবং ফাইব্রোনেক্টিন (p= 0.0437; চিত্র 1B, C) দিয়ে প্রলিপ্ত স্লাইডের সাথে তুলনা করলে কার্যকরী কোষগুলির একটি উল্লেখযোগ্যভাবে উচ্চ হার পাওয়া যায়।

গ্লাস স্লাইডগুলিতে LUHMES কোষগুলিকে সংস্কৃতির জন্য সর্বোত্তম আবরণের স্তরগুলি সনাক্ত করার পরে, আমরা নিউরাইট অবক্ষয় পরিমাপের জন্য সংস্কৃতিগুলির উপযুক্ততার উপর কোষের ঘনত্বের প্রভাবগুলি মূল্যায়ন করেছি। LUHMES কোষগুলি প্রতি কূপ প্রতি 57,500 কোষ, 115,000 কূপ প্রতি কোষ, বা প্রতি কূপ প্রতি 230,000 কোষের প্রলেপ ঘনত্বের সাথে একটি পার্থক্যের মাধ্যমে সংষ্কৃত হয়েছিল এবং তাদের পার্থক্যের পঞ্চম দিনে, কোষগুলি 4% PFA দিয়ে স্থির করা হয়েছিল এবং ফেজ-কনট্রাস্ট মাইক্রোস্কোপি দ্বারা চিত্রিত করা হয়েছিল।

প্রতি ভালভাবে 57,500 কোষের ঘনত্বের ফলে দুর্বল নেটওয়ার্কযুক্ত নিউরাইট এবং অনিয়মিত নিউরাইট অঙ্গসংস্থানের সংস্কৃতি রয়েছে, যখন 230 এর প্রলেপ ঘনত্বের সাথে প্রতিষ্ঠিত সংস্কৃতিগুলি,000 কোষগুলি, যদিও কার্যকর, সঠিক নিউরাইট পরিমাপের জন্য নিউরাইটের ঘনত্ব খুব বেশি। মধ্যবর্তী কোষের ঘনত্ব 115,000 কোষ প্রতি ভালভাবে প্রদান করে উচ্চ কার্যকারিতা এবং ভাল-বিচ্ছিন্ন অ্যাক্সন ট্র্যাক্ট সঠিক নিউরাইট অবক্ষয় পরিমাপের জন্য সহায়ক (চিত্র 1D)।

ভিট্রোতে পিডি-সম্পর্কিত নিউরাইট অবক্ষয়ের মডেল করার জন্য, আমরা ডিফারেনিয়েটেড LUHMES কোষগুলিকে 6-OHDA-তে প্রকাশ করেছি, একটি বহুল ব্যবহৃত নিউরোটক্সিন যা অক্সিডেটিভ স্ট্রেস এবং ক্যাটেকোলামিনার্জিক নিউরনের অবক্ষয়কে উৎসাহিত করে (Bové এবং Perier, 2012)। বিভেদযুক্ত LUHMES কোষের এক্সপোজার 6-OHDA তে ডোজ-নির্ভর নিউরাইট অবক্ষয়কে উন্নীত করেছে, 5.0 mM 6-OHDA এবং 7.5 mM 6-OHDA যথাক্রমে মাঝারি এবং গুরুতর নিউরাইট অবক্ষয় ঘটায় (চিত্র 2F)। LUHMES কোষের সংস্কৃতিতে নিউরাইটের অবক্ষয় পরিমাপ করার জন্য 6-OHDA-এর সংস্পর্শে, আমরা একটি ব্যাপকভাবে উদ্ধৃত পদ্ধতি ব্যবহার করেছি যেখানে সংস্কৃতির ফেজ-কনট্রাস্ট চিত্রগুলিকে বাইনারি করা হয়, চিত্রগুলির কোষের দেহগুলি ডিজিটালভাবে সরানো হয়, এবং কণা বিশ্লেষক অ্যালগরিদম ইমেজজে নিউরাইট খণ্ডের ক্ষেত্রফল পরিমাপের জন্য প্রয়োগ করা হয়। খণ্ডিত নিউরাইট এলাকাগুলিকে তারপর একটি DI (চিত্র 2A–E; সাসাকি এট আল।, 2009; ক্রেমার এট আল।, 2014; ডি স্টেফানো এট আল।, 2015; হিল এট আল। ., 2018; Geisler et al., 2019)।

প্রত্যাশিত হিসাবে, 6- ওএইচডিএ-তে আলাদা LUHMES কোষের এক্সপোজারের ফলে DI (F(3,24)= 119.8, p=0.0001, R{ ডোজ-নির্ভর বৃদ্ধি পেয়েছে {8}}.9374; চিত্র 2G)। যাইহোক, 6-OHDA-এর সংস্পর্শে আসা কোষগুলির বিশ্লেষণের সময়, আমরা বেশ কিছু সমস্যা লক্ষ্য করেছি যা DI পরিমাপের নির্ভুলতা এবং কার্যকারিতাকে নেতিবাচকভাবে প্রভাবিত করে৷ এইভাবে, আমরা DI পরিমাপ সম্পাদনের জন্য এই সাধারণ পদ্ধতিটিকে অপ্টিমাইজ করার চেষ্টা করেছি, যা আমরা এখন থেকে প্রথাগত DI পদ্ধতি হিসাবে উল্লেখ করি, একটি প্রোটোকল তৈরি করতে যা নিউরাইট ফ্র্যাগমেন্টেশনের আরও কার্যকর পরিমাপকে সহজতর করে।

মাইক্রোগ্রাফ বাইনারাইজেশনের সাথে যুক্ত কৃত্রিম খণ্ডন হ্রাস করা

প্রথাগত DI পদ্ধতি ব্যবহার করার সময়, আমরা প্রায়শই এমন একটি সমস্যা লক্ষ্য করেছি যেখানে ফেজ-কনট্রাস্ট ইমেজে অক্ষত নিউরাইটগুলি তাদের সংশ্লিষ্ট বাইনারাইজড ইমেজে (চিত্র 3A) খণ্ডিত হয়ে দেখা দিয়েছে। এই কৃত্রিম বিভাজন প্রাথমিকভাবে কম প্রাধান্য সহ নিউরাইটগুলিকে প্রভাবিত করে। এইভাবে, আমরা তদন্ত করেছি যে চিত্রের বৈসাদৃশ্য বাড়ায় এমন পদ্ধতির দ্বারা সমস্যাটি হ্রাস করা যেতে পারে কিনা। ইমেজ কন্ট্রাস্ট উন্নত করার জন্য, আমরা প্রথমে ইমেজের উজ্জ্বলতার মাত্রা নির্ধারণ করতে বিভিন্ন আলোর তীব্রতা ব্যবহার করে নিউরাইটের ছবি ধারণ করেছি যা সর্বোত্তম বৈসাদৃশ্য তৈরি করবে।

সর্বোত্তম আলোর তীব্রতার সাথে ক্যাপচার করা চিত্রগুলি যথাক্রমে 90 এবং 205 এর সর্বনিম্ন এবং সর্বাধিক তীব্রতার মান সহ একটি LUT প্রয়োগ করতে ImageJ ব্যবহার করে আরও বৈসাদৃশ্য বর্ধনের শিকার হয়েছিল। এই বৈসাদৃশ্য বর্ধিতকরণগুলির অন্তর্ভুক্তি ফেজ-কনট্রাস্ট ইমেজ (চিত্র 3B) থেকে উত্পন্ন বাইনারিকৃত চিত্রগুলিতে নিউরাইটগুলির একটি পরিমিতভাবে আরও সঠিক উপস্থাপনা প্রদান করে। তবুও, স্বাস্থ্যকর নিউরাইটের বাইনারিকৃত চিত্রের পরিমাণগত বিশ্লেষণ ইঙ্গিত দেয় যে বৈপরীত্য বর্ধনগুলি কৃত্রিম খণ্ডনকে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করেনি (p=0.9999; চিত্র 3D)। এইভাবে, আমরা পরবর্তীতে তদন্ত করেছি যে ইমিউনোফ্লোরোসেন্স ইমেজিংয়ের ব্যবহার উচ্চতর বৈসাদৃশ্য সহ চিত্রগুলি তৈরি করবে এবং এর ফলে কৃত্রিম খণ্ডিতকরণের সাথে আরও নির্ভুল বাইনারাইজড নিউরাইট ইমেজ তৈরির সুবিধা হবে।

চিত্র 2-এ বর্ণিত স্লাইডগুলি, 6- OHDA-এর বিভিন্ন ঘনত্বের সংস্পর্শে থাকা স্থির LUHMES কোষগুলিকে সমন্বিত করে, সাইটোস্কেলেটাল প্রোটিন বি III-টিউবিউলিনের জন্য ইমিউনোস্টেইন করা হয়েছিল, ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি ব্যবহার করে চিত্রিত করা হয়েছিল, এবং একটি অন্ধ তদন্তকারীর দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল 3C)। ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফ এবং সংশ্লিষ্ট ফেজ-কনট্রাস্ট মাইক্রোগ্রাফ থেকে প্রাপ্ত বাইনারিকৃত চিত্রের পরিমাণগত বিশ্লেষণ থেকে জানা গেছে যে কৃত্রিম খণ্ডনের মাত্রা প্রভাবিত মাইক্রোস্কোপির ধরন [ফ্রাইডম্যান x2 (3)=15.44, p, 0.0001] . বিশেষত, ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফগুলি ফেজ-কনট্রাস্ট মাইক্রোগ্রাফের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাসকৃত কৃত্রিম খণ্ডন সহ বাইনারি ছবি তৈরি করে (p=0.0016; চিত্র 3D)।

ফলস্বরূপ, ফেজ-কনট্রাস্ট মাইক্রোগ্রাফ (F(1,8)= 131.4, p=0 এর পরিবর্তে ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফ ব্যবহার করা হলে সুস্থ সংস্কৃতির চিত্রগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে কম ডিআই স্কোর দেয়৷{12} }001, R2=0.1442; চিত্র 3E)। অধিকন্তু, একটি উল্লেখযোগ্য সামগ্রিক প্রবণতা হল যে স্বাস্থ্যকর (যানবাহন-চিকিত্সা করা) সংস্কৃতি এবং নিউরাইট অবক্ষয় (5.0 বা 7.5 মিমি 6-OHDA-চিকিত্সা করা) প্রদর্শনকারী সংস্কৃতির সাথে সম্পর্কিত গড় DI মানগুলির মধ্যে ভাঁজ পরিবর্তন ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফ ব্যবহার করে পরিমাপ করার সময় বেশি ছিল। ফেজ কন্ট্রাস্ট মাইক্রোগ্রাফ (চিত্র 3E) থেকে প্রাপ্ত করার চেয়ে। মাঝারি নিউরাইট অবক্ষয় সহ সংস্কৃতির ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফ (5 মিমি 6-ওএইচডিএ এক্সপোজার দ্বারা প্ররোচিত) কৃত্রিম বিভাজন হ্রাসের কারণে সংশ্লিষ্ট ফেজ চিত্রগুলির তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে কম ডিআই স্কোর থাকা সত্ত্বেও এটি ঘটেছে (p=0.0001 , d=0.6312)।

খণ্ডিত নিউরাইট এবং মোট নিউরাইট সনাক্তকরণের জন্য পরামিতি অপ্টিমাইজ করা
DI পরিমাপ সম্পাদনের ঐতিহ্যগত পদ্ধতিতে নিউরাইট খণ্ড সনাক্ত করতে 20 10,000 পিক্সেলের আকারের প্যারামিটার সহ ImageJ-এর জন্য বিশ্লেষণ কণা প্লাগইন ব্যবহার করা জড়িত। যাইহোক, আমরা লক্ষ্য করেছি যে এই ব্যাপকভাবে উদ্ধৃত পরামিতিগুলি ব্যবহার করার সময় নিউরাইট খণ্ডের একটি বড় অনুপাত কণা বিশ্লেষক দ্বারা সনাক্ত করা যায়নি (শিন এট আল।, 2012; ডি স্টেফানো এট আল।, 2015; সাসাকি এট আল।, 2016; লরেটো এট আল। , 2020; Shin and Cho, 2020) LUHMES কোষের ফেজ-কনট্রাস্ট মাইক্রোগ্রাফে নিউরাইটের অবক্ষয় পরিমাপ করার জন্য 6-OHDA, চিত্র 2-এ বর্ণিত হিসাবে উত্পন্ন।

এইভাবে, আমরা নিউরাইট খণ্ডগুলির সনাক্তকরণের জন্য সর্বোত্তম পরামিতি নির্ধারণ করতে কণা সনাক্তকরণের জন্য বিভিন্ন ন্যূনতম আকারের সীমা ব্যবহার করে সেই ডেটাসেট থেকে চিত্রগুলি পুনরায় বিশ্লেষণ করেছি। ফেজ-কনট্রাস্ট মাইক্রোগ্রাফ থেকে উত্পন্ন বাইনারিকৃত চিত্রগুলির গুণগত মূল্যায়ন থেকে, 5-10 এর আকারের প্যারামিটার,000 পিক্সেল নিউরাইট খণ্ডগুলির সনাক্তকরণকে উন্নত করেছে, তবে পটভূমির শব্দ, চিত্র শিল্পকর্ম, বা অন্যান্য ছোট ছোট শনাক্তকরণের সাথেও যুক্ত ছিল নিউরাইট খণ্ড হিসাবে অ-নিউরাইট উপাদান। 20-10,000 পিক্সেলের ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত প্যারামিটারের তুলনায়, তবে, 10-10,000 পিক্সেলের প্যারামিটারগুলি মিথ্যা ইতিবাচকের লক্ষণীয়ভাবে বড় বৃদ্ধি ছাড়াই নিউরাইট খণ্ডগুলির সনাক্তকরণকে উন্নত করেছে (চিত্র 4A) , বাম)।

অনুরূপ বিশ্লেষণগুলি বি III-টিউবুলিনের জন্য ইমিউনোলেবেলযুক্ত LUHMES কোষগুলির ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফ থেকে প্রাপ্ত বাইনারাইজড চিত্রগুলির সাথেও সঞ্চালিত হয়েছিল। 5-10,000 পিক্সেলের কণা বিশ্লেষক আকারের প্যারামিটারগুলি নিউরাইট খণ্ডগুলির সবচেয়ে সংবেদনশীল সনাক্তকরণকে সহজতর করেছে এবং যেহেতু ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফগুলিতে কম ছোট ধ্বংসাবশেষ বৈশিষ্ট্যযুক্ত, এই ধরনের পরামিতিগুলি নিউরাইট খণ্ড হিসাবে অ-নিউরাইট উপাদানের ভুল সনাক্তকরণকে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি করেনি। (চিত্র 4A, ডান)।

DI পরিমাপ সম্পাদনের ঐতিহ্যগত পদ্ধতি, 20-10,000 পিক্সেলের কণা বিশ্লেষক আকারের প্যারামিটার ব্যবহার করে, নিউরাইট খণ্ডের পরিমাপ থেকে 20 পিক্সেলের চেয়ে ছোট বস্তু বাদ দেয়।

যাইহোক, এই ধরনের ছোট বস্তুগুলি সাধারণত ভুলভাবে মোট নিউরাইট এলাকা পরিমাপের মধ্যে অন্তর্ভুক্ত করা হয়, যেহেতু ঐতিহ্যগত DI পরিমাপ পদ্ধতিতে বাইনারিকৃত চিত্রগুলিতে সমস্ত কালো পিক্সেল যোগ করে মোট নিউরাইট এলাকা গণনা করা জড়িত। এই সমস্যাটি কাটিয়ে ওঠার জন্য, আমরা বাইনারি করা ছবিগুলি থেকে ছোট, অ-নিউরাইট বস্তুগুলিকে সরাতে ImageJ বিকাশকারী ওয়েন রাসব্যান্ডের লেখা ImageJ-এর জন্য কণা রিমুভার প্লাগইন ব্যবহার করেছি। LUHMES কোষের ফেজ-কন্ট্রাস্ট মাইক্রোগ্রাফ ব্যবহার করে ডিআই পরিমাপ করার সময় এই প্লাগইনটির প্রয়োগ 6- OHDA-তে উন্মুক্ত, চিত্র 2-তে বর্ণিত হিসাবে উত্পন্ন, ফলে নিউরোটক্সিন এক্সপোজারের সমস্ত ঘনত্ব জুড়ে DI পরিমাপ উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি পেয়েছে (F(1) ,8)=83.43, পি=0.0001, আর2=0.0416)।
তদ্ব্যতীত, একটি উল্লেখযোগ্য মিথস্ক্রিয়া নির্দেশ করে যে কণা রিমুভার ব্যবহারের ফলে সৃষ্ট DI বৃদ্ধি উচ্চ ঘনত্বে শক্তিশালী হয়ে ওঠে (F(1.881,15.05)=59.97, p=0.0001, R{ {8}}.0094; চিত্র 4বি, সি)। আমরা ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি দ্বারা কোষগুলির একই স্লাইডগুলিও চিত্রিত করেছি এবং ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফগুলি থেকে প্রাপ্ত ডিআই পরিমাপের উপর ছোট কণা অপসারণের প্রভাবগুলি মূল্যায়ন করেছি। যদিও ছোট কণা অপসারণ ডিআই মানগুলি প্রদান করে যা তাত্ত্বিকভাবে আরও নির্ভুল, এই ধরনের মানগুলি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফ (F(1,8)=2 ব্যবহার করে পরিমাপ করার সময় কণা রিমুভার প্লাগইন ব্যবহার না করে প্রাপ্ত মানগুলির থেকে উল্লেখযোগ্যভাবে আলাদা ছিল না। 613, পি=0.1446, আর2=0.0013; চিত্র 4D)।

ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফ থেকে ডিআই পরিমাপের অটোমেশন

প্রথাগত পদ্ধতি ব্যবহার করে ডিআই পরিমাপের পারফরম্যান্সের জন্য ক্লান্তিকর এবং সময়-সাপেক্ষ ইমেজ প্রসেসিং প্রয়োজন, প্রতিটি ইমেজ থেকে পৃথক কোষ বডিকে ডিজিটালভাবে অপসারণ করতে ফ্রিহ্যান্ড টুলের ব্যবহার এবং খণ্ডিত নিউরাইট এবং মোট নিউরাইট এলাকার পরিমাপ। এইভাবে, আমরা একটি ম্যাক্রো লিখে পদ্ধতির দক্ষতা বাড়ানোর চেষ্টা করেছি যা সম্পূর্ণরূপে DI বিশ্লেষণকে স্বয়ংক্রিয় করে। সোমা অপসারণ স্বয়ংক্রিয় করতে, ম্যাক্রো, ANDI শিরোনাম, কোষের নিউক্লিয়াসের চিত্রগুলির বাইনারাইজেশন সম্পাদন করে, নিউক্লিয়ার স্টেন DAPI এর মাধ্যমে লেবেল করা হয়, তারপরে বাইনারাইজড ইমেজটির পরিবর্তন করা হয় যাতে থ্রেশহোল্ড পারমাণবিক অঞ্চলগুলি সোমার সমগ্র অঞ্চলকে ঘিরে ফেলা হয়। বাইনারাইজড এবং বর্ধিত নিউক্লিয়াস সহ এই ধরনের চিত্রগুলিকে বি III-টিউবুলিনের জন্য ইমিউনোলেবেলযুক্ত নিউরনের অনুরূপ ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফ থেকে বিয়োগ করা হয়, যা একচেটিয়াভাবে নিউরাইট বৈশিষ্ট্যযুক্ত একটি চিত্র তৈরি করে (চিত্র 5A, B)।

নিউরোডিজেনারেশনের সাথে যুক্ত পারমাণবিক সংকোচন বা খণ্ডনের কারণে সৃষ্ট পরিবর্তনশীল পারমাণবিক আকারের জন্য সামঞ্জস্য করতে, নিউক্লিয়াসের বাইনারাইজড চিত্রগুলি প্রসারণ এবং ক্ষয়গুলির সংমিশ্রণের মাধ্যমে বড় করা হয় যা পারমাণবিক টুকরোগুলিকে একত্রিত করে এবং বাইনারিকৃত অঞ্চলগুলিকে প্রসারিত করে যাতে বিভেদযুক্ত কোষগুলির সোমাসের চেয়ে বড় একটি এলাকা দখল করে। . একচেটিয়াভাবে নিউরাইট ধারণকারী চিত্রগুলি তারপর বাইনারি করা হয় এবং স্বয়ংক্রিয় ফাংশনগুলির একটি সিরিজের মাধ্যমে ডিআই বিশ্লেষণের শিকার হয় (চিত্র 5C, D)। চিত্রগুলি থেকে সোমা অপসারণের সাথে সম্পর্কিত ম্যাক্রো অপারেশনগুলির যথার্থতা মূল্যায়ন করার জন্য, আমরা ইমেজজে (আগে চিত্র 4D তে চিত্রিত) এর ফ্রিহ্যান্ড টুল ব্যবহার করে ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফগুলি থেকে সেল বডিগুলিকে ম্যানুয়াল অপসারণের পরে প্রাপ্ত ডিআই স্কোরগুলিকে ডিআই স্কোরের সাথে তুলনা করেছি। ANDI ম্যাক্রোতে বৈশিষ্ট্যযুক্ত সোমা অপসারণ ক্রিয়াকলাপগুলি ব্যবহার করে স্বয়ংক্রিয় কোষের দেহ অপসারণের পরে অভিন্ন চিত্রগুলির বিশ্লেষণ থেকে তৈরি করা হয়েছে৷ আমাদের বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে স্বয়ংক্রিয় সেল বডি রিমুভাল ব্যবহার করে গণনা করা DI স্কোরগুলি ম্যানুয়াল সোমা রিমুভাল (r(34)=0.980, p, 0.0001; চিত্র থেকে প্রাপ্ত চিত্রগুলি থেকে প্রাপ্ত DI পরিমাপের সাথে প্রায় অভিন্নভাবে সম্পর্কিত। 5ই)।

বিশ্লেষণের নির্ভুলতা বাড়ানোর জন্য, আমরা পূর্বে বর্ণিত বেশ কয়েকটি সমন্বয় অন্তর্ভুক্ত করেছি যা DI পরিমাপকে ANDI-তে উন্নত করে। ম্যাক্রো বৈশিষ্ট্যগুলি বৈপরীত্য বর্ধিতকরণ ক্রিয়াকলাপ, কণা রিমুভার প্লাগইন ব্যবহার করে নিউরাইট ইমেজ থেকে নন-নিউরাইট ম্যাটার এবং নিউক্লিয়ার ইমেজ থেকে নন-পারমাণবিক ম্যাটার এবং 5-10 সাইজের প্যারামিটার ব্যবহার করে নিউরাইট টুকরো সনাক্তকরণ,000 বিশ্লেষণ কণা প্লাগইন জন্য.

আমরা অনুমান করেছি যে, সম্মিলিতভাবে, ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির ব্যবহার, বৈপরীত্য বর্ধিতকরণ ক্রিয়াকলাপ, কণা রিমুভারের সাহায্যে ছোট বস্তু অপসারণ এবং কণা সনাক্তকরণের জন্য অপ্টিমাইজ করা পরামিতিগুলি নিউরাইট অবক্ষয়ের আরও সঠিক পরিমাপে অবদান রাখবে। এই অনুমান পরীক্ষা করার জন্য, চিত্র 2-এ বর্ণিত হিসাবে উত্পন্ন 6- OHDA-এর বিভিন্ন ঘনত্বের সংস্পর্শে আসা LUHMES কোষগুলির ফেজ-কনট্রাস্ট চিত্রগুলিকে 0-এর মধ্যে একটি মান পরিসর ব্যবহার করে অন্ধ এবং বিষয়গত স্কোরিং দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল৷ 0 এবং 1.0, মানগুলি খণ্ডিত নিউরাইট এলাকার আপাত অনুপাতের প্রতিনিধিত্ব করে। আমরা তারপরে ঐতিহ্যগত পদ্ধতির মাধ্যমে প্রাপ্ত বিষয়গত স্কোর এবং DI পরিমাপের মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্ক মূল্যায়ন করেছি, সেইসাথে ANDI ম্যাক্রো ব্যবহার করে প্রাপ্ত বিষয়গত স্কোর এবং DI পরিমাপের মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্ক।

যদিও ঐতিহ্যগত পদ্ধতি ব্যবহার করে প্রাপ্ত ডিআই পরিমাপগুলি বিষয়গত স্কোরের সাথে সম্পর্কিত (r {{0}}.7850, p,0.0001; চিত্র 5F), ANDI ম্যাক্রো ফলন করেছে পরিমাপ যা বিষয়গত রেটিংগুলির সাথে অনেক বেশি দৃঢ়ভাবে সম্পর্কযুক্ত (r 2=0.978, p, 0.0001; চিত্র 5G)। প্রত্যক্ষ পরিসংখ্যানগত তুলনা প্রকাশ করে যে ANDI ম্যাক্রোর মাধ্যমে প্রাপ্ত স্কোরগুলি ঐতিহ্যগত পদ্ধতির (z=6.626, p, 0.0001; চিত্র 5F, G) এর মাধ্যমে প্রাপ্ত স্কোরের তুলনায় বিষয়গত রেটিংগুলির সাথে উল্লেখযোগ্যভাবে শক্তিশালী সম্পর্কযুক্ত। আরও বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে ম্যাক্রো সময় দক্ষতায় শক্তিশালী এবং উল্লেখযোগ্য উন্নতি সহ DI পরিমাপের কার্যকারিতাকে সহজতর করে। ANDI ম্যাক্রো ব্যবহার করে সম্পাদিত DI বিশ্লেষণের জন্য প্রতি চিত্র বিশ্লেষণের জন্য গড়ে 12.75 সেকেন্ড সময় প্রয়োজন, যা ঐতিহ্যগত পদ্ধতির মাধ্যমে বিশ্লেষণ করা প্রতি চিত্র প্রতি 5.27 মিনিটের গড় সময়ের তুলনায় [ফ্রাইডম্যান x2 (1)=9, p {{22} }.0027]। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত করে যে ANDI DI পরিমাপের দ্রুত প্রজন্মের ফলন করে যা, ঐতিহ্যগত পদ্ধতির মাধ্যমে প্রাপ্ত স্কোরের সাথে তুলনা করে, তদন্তকারীরা নিউরাইট চিত্রগুলির গুণগত বিশ্লেষণ থেকে যে অধঃপতনটি অনুধাবন করে তার আরও কাছাকাছি।

6-OHDA-এর সংস্পর্শে থাকা ভিন্ন LUHMES কোষে নিউরাইট অবক্ষয় পরিমাপের জন্য ANDI ম্যাক্রোর যথার্থতা এবং কার্যকারিতা নির্ধারণ করার পরে, আমরা অন্যান্য কোষ সংস্কৃতি মডেলের সাথে জড়িত পরীক্ষার জন্য ম্যাক্রোর উপযুক্ততা মূল্যায়ন করেছি। বি III-টিউবুলিন এবং DAPI-এর জন্য প্রাথমিক সহানুভূতিশীল সংস্কৃতির ইমিউনোলেবেলযুক্ত মাইক্রোগ্রাফ ব্যবহার করে DI পরিমাপ সম্পাদনে ANDI-এর যথার্থতা মূল্যায়ন করার জন্য প্রথমে একটি পাইলট গবেষণা করা হয়েছিল। মজার বিষয় হল, তবে, সহানুভূতিশীল নিউরনের কোষের দেহগুলি আলাদা LUHMES কোষগুলির তুলনায় বড়, এবং এইভাবে স্বয়ংক্রিয় সোমা অপসারণের সাথে সম্পর্কিত ANDI-তে ক্রিয়াকলাপগুলি সোমার সম্পূর্ণতাকে সরিয়ে দেয়নি (ডেটা দেখানো হয়নি)।

এই সমস্যাটি কাটিয়ে ওঠার জন্য, আমরা ANDI সংশোধন করেছি একটি ডায়ালগ বক্সের বৈশিষ্ট্য যাতে ব্যবহারকারীদের নিউক্লিয়াসের বাইনারিাইজড মাইক্রোগ্রাফগুলি প্রসারিত হওয়ার সংখ্যা নিয়ন্ত্রণ করে সোমা অপসারণের আকার চয়ন করতে সক্ষম করে৷ ANDI-এর এই সংস্করণ, সংস্করণ 1.1, তখন মাইক্রোগ্রাফ থেকে DI পরিমাপ করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল যা স্বাস্থ্যকর, গাড়ি-চিকিত্সা সহানুভূতিশীল নিউরন বা হাইড্রোজেন পারক্সাইডের সংস্পর্শে আসা সহানুভূতিশীল নিউরনগুলিকে চিত্রিত করে। হাইড্রোজেন পারক্সাইডের সংস্পর্শে আসা নিউরনগুলির চিত্রগুলি গাড়ি-চিকিত্সা করা নিউরনের চিত্রগুলির তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে উচ্চতর DI স্কোর অর্জন করেছে (F(1,3)=71.2, p=0.0035, R{10}} .9301; চিত্র 6A, C)। তদুপরি, আমরা ইমেজজে-এর ফ্রিহ্যান্ড টুল ব্যবহার করে ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফগুলি থেকে সেল বডিগুলিকে ম্যানুয়াল অপসারণের পরে একই ইমেজ সেট থেকে প্রাপ্ত ANDI থেকে DI পরিমাপ ব্যবহার করে প্রাপ্ত এই DI স্কোরগুলির তুলনা করেছি। ANDI (F(1,3)=0.1082, p=0.7639, R2=0 ব্যবহার করে প্রাপ্ত স্কোরের তুলনায় ম্যানুয়াল সোমা অপসারণের পরে গণনা করা DI স্কোরের কোনও উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল না। 0000; চিত্র 6A-C)। পোস্ট-হক পরীক্ষাগুলিও নিশ্চিত করেছে যে ANDI ব্যবহার করে প্রাপ্ত ডিআই স্কোরগুলি চিকিত্সা না করা নিউরনের ক্ষেত্রে (p=0.0972) এবং হাইড্রোজেন পারক্সাইডের সংস্পর্শে আসা নিউরনের ক্ষেত্রে (p=0) উভয় ক্ষেত্রেই উল্লেখযোগ্যভাবে আলাদা ছিল না। 9986)।

অধিকন্তু, ANDI থেকে উত্পাদিত DI স্কোরগুলি সংশ্লিষ্ট মাইক্রোগ্রাফ (r(34)=0.991, p, 0.0001) থেকে সেল বডিগুলিকে ম্যানুয়াল অপসারণের পরে প্রাপ্ত DI স্কোরের সাথে প্রায় অভিন্নভাবে সম্পর্কযুক্ত। এই তথ্যগুলি দেখায় যে ANDI প্রাথমিক নিউরনের সংস্কৃতিতে নিউরাইটের অবক্ষয় পরিমাপের জন্য উপযুক্ত, সোমা অপসারণ ক্রিয়াকলাপগুলির সাথে যা ব্যবহারকারী বিভিন্ন নিউরনের প্রকারের সাথে মেলে কাস্টমাইজ করতে পারে। উপরন্তু, হাইড্রোজেন পারক্সাইডের সংস্পর্শে আসা সংস্কৃতিতে নিউরাইট খণ্ডের সনাক্তকরণ 6-OHDA ব্যতীত অন্যান্য উত্স দ্বারা প্ররোচিত নিউরাইট অবক্ষয় জড়িত পরীক্ষায় ব্যবহারের জন্য ম্যাক্রোর প্রযোজ্যতা প্রদর্শন করে। বিভিন্ন কারণের সাথে যুক্ত নিউরাইট অবক্ষয় সনাক্তকরণে ANDI-এর ব্যবহার আরও যাচাই করার জন্য, আমরা স্বাস্থ্যকর সহানুভূতিশীল সংস্কৃতি বা এনজিএফ প্রত্যাহারের শিকার সংস্কৃতির মাইক্রোগ্রাফগুলিতে নিউরাইট অবক্ষয় পরিমাপ করতে ম্যাক্রো ব্যবহার করেছি। প্রত্যাশিত হিসাবে, এনজিএফ প্রত্যাহার করা সংস্কৃতির চিত্রগুলি স্বাস্থ্যকর সংস্কৃতির চিত্রগুলির তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে উচ্চতর ডিআই মান অর্জন করেছে (F(1,2)= 287, p= 0.0035, R2=0৷ 958; চিত্র 6D, E)। সম্মিলিতভাবে, এই ফলাফলগুলি দেখায় যে ANDI বিভিন্ন জৈবিক প্রসঙ্গের সাথে যুক্ত নিউরাইট অবক্ষয় সনাক্ত করতে ব্যবহার করা যেতে পারে।

যেহেতু TH-এর জন্য স্টেনিং সাধারণত ক্যাটেকোলামিনার্জিক নিউরনগুলি কল্পনা করতে ব্যবহৃত হয়, তাই আমরা ANDI ব্যবহার করে নিউরাইট অবক্ষয় পরিমাপের জন্য TH স্টেনিং চিত্রিত মাইক্রোগ্রাফগুলির উপযুক্ততাও মূল্যায়ন করেছি। হাইড্রোজেন পারক্সাইডের সংস্পর্শে আসা গাড়ির দ্রবণ বা অবক্ষয়কারী সহানুভূতিশীল নিউরনগুলির সাথে চিকিত্সা করা স্বাস্থ্যকর সহানুভূতিশীল নিউরনগুলির সংস্কৃতিগুলিকে স্থির করা হয়েছিল এবং TH এবং b III-টিউবুলিনের জন্য ইমিউনোফ্লুরোসেন্স লেবেলিং, সেইসাথে DAPI-এর জন্য কাউন্টারস্টেইনিংয়ের শিকার হয়েছিল। TH বা b III-টিউবুলিনের জন্য স্টেনিং চিত্রিত নিউরাইট চিত্র, এবং DAPI লেবেলিং সমন্বিত নিউক্লিয়াসের অনুরূপ চিত্রগুলি, তারপরে একই ক্ষেত্রগুলিতে ধারণ করা হয়েছিল। ANDI কার্যকর করা হয়েছিল, এবং TH স্টেনিং বা b III-টিউবুলিন স্টেনিং সমন্বিত চিত্রগুলিকে নিউরাইট চিত্র হিসাবে নির্বাচিত করা হয়েছিল। আমাদের বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে টিএইচ স্টেনিংয়ের চিত্রগুলি ব্যবহার করে প্রাপ্ত ডিআই স্কোরগুলি বি III-টিউবুলিন স্টেনিং (r(28)= 0.962, p, 0.0001; চিত্র থেকে প্রাপ্ত স্কোরের সাথে খুব দৃঢ়ভাবে সম্পর্কযুক্ত। 6এফ, জি)। এই তথ্যগুলি নির্দেশ করে যে সঠিক DI পরিমাপ ANDI দ্বারা বিকল্প স্টেনিং পদ্ধতি ব্যবহার করে প্রাপ্ত করা যেতে পারে যা সম্পূর্ণরূপে নিউরাইট লেবেল করে, যেমন TH-এর জন্য ইমিউনোলেবেলিং।

একটি বৈজ্ঞানিক পরীক্ষায় DI পরিমাপ সম্পাদনের জন্য উন্নত পদ্ধতির উপযোগিতা প্রদর্শনের জন্য, আমরা মানব মেসেনসেফালিক কোষে অক্সিডেটিভ স্ট্রেস-প্ররোচিত নিউরাইট অবক্ষয়ের ক্ষেত্রে JNK-এর ভূমিকা মূল্যায়ন করার জন্য নতুন পদ্ধতি ব্যবহার করেছি। জেএনকে ইনহিবিটর SP600125 বা যানবাহনের সমাধান দিয়ে 1 ঘন্টার জন্য ডিফারেনসিয়েটেড LUHMES কোষগুলি প্রিট্রিট করা হয়েছিল। অক্সিডেটিভ স্ট্রেস বা গাড়ির দ্রবণ প্ররোচিত করার জন্য কোষগুলিকে 24 ঘন্টার জন্য 6- OHDA দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। স্থির কোষগুলি বি III-টিউবুলিন এবং DAPI স্টেনিংয়ের জন্য ইমিউনোলেবেলিং এর শিকার হয়েছিল এবং ANDI ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফ থেকে DI পরিমাপ পেতে ব্যবহৃত হয়েছিল। যদিও JNK ইনহিবিটরের সাথে প্রিট্রিটমেন্টের অভাবের সংস্কৃতিগুলি 6-OHDA-এর সংস্পর্শে আসার পরে নিউরাইটের অবক্ষয় দেখায়, JNK নিষেধাজ্ঞার ফলে 6- OHDA-প্ররোচিত নিউরাইট অবক্ষয় (p= 0.0001) একটি চিহ্নিত এবং উল্লেখযোগ্য হ্রাস পায় , d= 2.0209; চিত্র 7)। এই ফলাফলগুলি মানব মেসেনসেফালিক কোষে অক্সিডেটিভ স্ট্রেস দ্বারা প্ররোচিত নিউরাইট অবক্ষয়ের জন্য JNK সংকেতকে একটি মূল ভূমিকা সমর্থন করে এবং গুরুত্বপূর্ণভাবে, নিউরাইট অবক্ষয়ের দ্রুত এবং সঠিক পরিমাপকে সহজতর করে বৈজ্ঞানিক আবিষ্কার তৈরির জন্য আমাদের নতুন পদ্ধতির উপযোগিতা প্রদর্শন করে।

আলোচনা

নিউরাইটের অবক্ষয় বিভিন্ন ধরণের নিউরোপ্যাথলজিকাল অবস্থার সাথে যুক্ত, তবুও নিউরাইটের অবক্ষয়ের অন্তর্নিহিত আণবিক প্রক্রিয়াগুলি অসম্পূর্ণভাবে বোঝা যায়। এই গুরুত্বপূর্ণ সেলুলার ইভেন্টকে নিয়ন্ত্রণকারী অভিনব কারণগুলির সফল সনাক্তকরণের জন্য নিউরাইট অবক্ষয়ের সঠিক এবং দক্ষ বিশ্লেষণের পদ্ধতিগুলি অপরিহার্য। বর্তমান গবেষণায়, আমরা নিউরাইট অবক্ষয় পরিমাপ করার জন্য একটি সাধারণভাবে ব্যবহৃত পদ্ধতির সাথে যুক্ত ত্রুটির একাধিক উত্স প্রকাশ করি। আমরা পরীক্ষামূলক ডেটা রিপোর্ট করি যা পদ্ধতিগত পরিবর্তনগুলিকে সমর্থন করে যা DI বিশ্লেষণ ত্রুটি কমাতে প্রয়োগ করা যেতে পারে এবং এই ধরনের পরিবর্তনগুলিকে একটি নতুন ImageJ ম্যাক্রোতে অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছে যাতে ওপেন-সোর্স এবং বিনামূল্যে সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে দ্রুত, নির্ভুল এবং উদ্দেশ্যমূলক DI বিশ্লেষণের জন্য একটি টুল প্রদান করা হয়। অধিকন্তু, আমরা প্রদর্শন করি কিভাবে PD-এর সেল কালচার মডেলে নিউরাইট অবক্ষয় পরিমাপ করার জন্য উন্নত পদ্ধতি প্রয়োগ করা যেতে পারে, এমন একটি ব্যাধি যেখানে ডোপামিনার্জিক নিউরনে অ্যাক্সোনাল ফ্র্যাগমেন্টেশন একটি প্রাথমিক পর্যায়ের ঘটনা যা শেষপর্যন্ত নিউরোনাল ক্ষতির আগে ঘটে (ট্যাগ্লিয়াফেরো এবং বার্ক, 2016) .

বর্তমান সমীক্ষায়, আমরা 6-OHDA-এর সংস্পর্শে থাকা ভিন্ন ভিন্ন LUHMES কোষ নিয়ে গঠিত PD-এর সেল কালচার মডেলে নিউরাইটের অবক্ষয় পরিমাপের ক্ষেত্রে ANDI ম্যাক্রোর উপযোগিতা প্রদর্শন করি।

আমরা পরীক্ষামূলক ফলাফলগুলি রিপোর্ট করি যা সর্বোত্তম সাবস্ট্রেটগুলিকে সমর্থন করে যার উপর সংস্কৃতিগুলি স্থাপন করা উচিত, সেইসাথে প্লেটিং ঘনত্ব প্রদর্শন করি যা নিউরাইট অবক্ষয় বিশ্লেষণের জন্য সবচেয়ে উপযুক্ত। নিউরাইট ডিজেনারেশন অধ্যয়ন করার জন্য এই মডেল সিস্টেমের ব্যবহারে বেশ কিছু সুবিধা রয়েছে। কোষগুলি ভাল-নেটওয়ার্কযুক্ত এবং সাধারণত .500 মিমি দৈর্ঘ্যের নিউরাইটগুলি বিকাশ করে এবং সংস্কৃতিগুলি PD-এর ক্লাসিক, নিউরোটক্সিন মডেল যেমন 6-OHDA, 1-মিথাইল{{4 দ্বারা প্ররোচিত নিউরোডিজেনারেশনের জন্য সংবেদনশীল। }}ফেনাইলপাইরিডিনিয়াম আয়ন (MPP1), এবং রোটেনোন (লোথারিয়াস এট আল।, 2005; ঝাং এট আল।, 2014; স্মিরনোভা এট আল।, 2016; ক্রেমার এট আল।, 2021)। তদ্ব্যতীত, LUHMES কোষের মানব উৎপত্তি মডেলের সাথে সম্পর্কিত অনুসন্ধানের অনুবাদযোগ্যতা বাড়ায় এবং শর্তসাপেক্ষ অমরকরণ সংস্কৃতির দ্রুত প্রজন্ম এবং প্রচারের সুবিধা দেয় (Scholz et al., 2011)। এইভাবে, ANDI ব্যবহার করে সম্পাদিত স্বয়ংক্রিয় বিশ্লেষণের সাথে মিলিত, LUHMES কোষগুলি PD-সম্পর্কিত নিউরাইট অবক্ষয়ের সাথে সম্পর্কিত অভিনব আবিষ্কার করতে ব্যবহার করা যেতে পারে যখন প্রাথমিক নিউরোনাল সংস্কৃতির সাথে সঞ্চালিত ননঅটোমেটেড বিশ্লেষণের তুলনায় যথেষ্ট উচ্চতর থ্রুপুটকে সহজতর করে।

নিউরাইটের অবক্ষয় নিয়ন্ত্রণ করে এমন কারণগুলির অন্তর্দৃষ্টি পেতে ফেজ-কনট্রাস্ট ইমেজ ব্যবহার করে অসংখ্য গবেষণা গোষ্ঠী ডিআই বিশ্লেষণ করেছে (প্রেস এবং মিলব্র্যান্ড, 20{{10}}9; ক্রেমার এট আল।, 2014 ; Di Stefano et al., 2015; Hill et al., 2018; Geisler et al., 2019)। এখানে, আমরা নিউরাইট অবক্ষয় পরিমাপের জন্য এই বহুল ব্যবহৃত পদ্ধতির সাথে যুক্ত একটি গুরুত্বপূর্ণ ত্রুটির প্রতিবেদন করি: ফেজ-কনট্রাস্ট চিত্রগুলির বাইনারিকরণের ফলে অক্ষত নিউরাইটগুলির একটি উল্লেখযোগ্য অনুপাত খণ্ডিত প্রদর্শিত হয়। যদিও মাইক্রোগ্রাফ ক্যাপচার করার সময় বৈসাদৃশ্যের মাত্রা তদন্তকারীদের কাছে উপলব্ধ মাইক্রোস্কোপ সিস্টেমের উপর নির্ভর করে পরিবর্তিত হয়, এই সমস্যাটি বিভিন্ন গবেষণা গোষ্ঠীর মধ্যে বিস্তৃত, কারণ 0.2 এর একটি DI সাধারণত একটি থ্রেশহোল্ড হিসাবে গৃহীত হয় যার উপরে সংস্কৃতির অবক্ষয় বলে মনে করা হয়। অ্যাক্সন, এবং ফেজ-কনট্রাস্ট মাইক্রোগ্রাফ থেকে ডিআই পরিমাপ সমন্বিত বেশিরভাগ বৈজ্ঞানিক রিপোর্টে 0.1 এবং 0.3 এর মধ্যে সুস্থ নিউরনের জন্য ডিআই স্কোর রিপোর্ট করা হয়েছে (সাসাকি এট আল।, 2009, 2016; ডি স্টেফানো এট আল।, 2015; হিল এট আল।, 2018; Loreto et al., 2020)। ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফ থেকে প্রাপ্ত আমাদের ডিআই বিশ্লেষণ, সেইসাথে অন্ধ তদন্তকারীদের কাছ থেকে বিষয়গত স্কোরগুলি ইঙ্গিত করে যে সুস্থ নিউরন সংস্কৃতিতে 10-20% নিউরাইট ফ্র্যাগমেন্টেশন সাধারণ নয়। বরং, এই জাতীয় সংস্কৃতি গড়ে মাত্র 2.5% নিউরাইট ফ্র্যাগমেন্টেশন প্রদর্শন করে। এইভাবে, আমাদের অনুসন্ধানগুলি পরিমাপের ত্রুটির এই সাধারণ এবং উল্লেখযোগ্য উত্স হ্রাস করে নিউরাইট অবক্ষয় বিশ্লেষণের নির্ভুলতা উন্নত করে এমন পদ্ধতিগুলির প্রয়োজনীয়তার উপর আন্ডারস্কোর করে।

যদিও ডিআই পরিমাপের সাথে জড়িত বেশিরভাগ গবেষণায় নিউরাইট ডিজেনারেশন বিশ্লেষণ করার জন্য ফেজ-কনট্রাস্ট ইমেজ ব্যবহার করা হয়েছে, কিছু গবেষণা গোষ্ঠী সম্প্রতি সাইটোস্কেলেটাল ফিলামেন্ট যেমন নিউরোফিলামেন্ট মিডিয়াম পলিপেপটাইড বা বি-বি-টিউবুলিন (ওয়াকাতসুকি) এর মতো নিউরনের ইমিউনোলেবেলযুক্ত নিউরনের ছবি ব্যবহার করে ডিআই পরিমাপ করেছে। et al., 2011; Li et al., 2017; Pease-Raissi et al., 2017; Hernandez et al., 2018; Sundaramoorthy et al., 2020)। যাইহোক, নিউরাইট অবক্ষয় পরিমাপের জন্য মাইক্রোস্কোপির কোন ফর্মটি সবচেয়ে উপযুক্ত তা এখনও অস্পষ্ট রয়ে গেছে, কারণ নিউরাইট অবক্ষয়ের সময় এই সাইটোস্কেলেটাল প্রোটিনের স্থানীয়করণে পরিবর্তনগুলি যথাযথভাবে নিউরাইট অঙ্গপ্রত্যঙ্গের মোট পরিবর্তনগুলিকে মডেল করে কিনা তা বোঝার জন্য তদন্তের প্রয়োজন হয়েছে, সেইসাথে মূল্যায়ন করার জন্য ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফের সাথে প্রাপ্ত ডিআই পরিমাপগুলি ফেজ-কনট্রাস্ট মাইক্রোগ্রাফ থেকে প্রাপ্ত অনুরূপ পরিমাপের সাথে সম্পর্কযুক্ত। এখানে, আমরা দেখাই যে বি III-টিউবুলিন স্টেনিং চিত্রিত ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফগুলি কেবল নিউরাইট ফ্র্যাগমেন্টেশনকে সঠিকভাবে উপস্থাপন করে না, তবে তাদের উচ্চতর বৈসাদৃশ্য এবং বাইনারিকরণে কৃত্রিম খণ্ডনের প্রতি সংবেদনশীলতা হ্রাসের কারণে আরও সঠিক ডিআই পরিমাপের সুবিধা দেয়। সুতরাং, আমাদের ফলাফলগুলি নিউরাইট অবক্ষয় পরিমাপ করতে b III-টিউবুলিন স্টেনিং ব্যবহার করার উপযোগিতা তুলে ধরে।

নিউরাইট অবক্ষয় পরিমাপ করার জন্য ডিআই বিশ্লেষণের সাথে জড়িত প্রকাশিত গবেষণাগুলির মধ্যে, নিউরাইট খণ্ডগুলি সনাক্ত করতে ব্যবহৃত রিপোর্ট করা আকার এবং বৃত্তাকার পরামিতিগুলি যথেষ্ট পরিবর্তিত হয়েছে। উদাহরণ স্বরূপ, একটি সাম্প্রতিক সমীক্ষা যেখানে সংস্কৃত হিপ্পোক্যাম্পাল নিউরনে নিউরাইট অবক্ষয়ের মূল্যায়ন করা হয়েছে 4–900 পিক্সেলের আকারের প্যারামিটার ব্যবহার করেছে (লি এট আল।, 2017), যেখানে সংস্কৃতিযুক্ত DRG নিউরনগুলির সনাক্তকরণ প্যারামিটার ব্যবহার করা হয়েছে 0–10,000 পিক্সেল (ওয়াকাটসুকি এট আল।, 2011)। এই ধরনের পরিবর্তনের একটি সম্ভাব্য কারণ হল নিউরাইট খণ্ড সনাক্তকরণে কণা বিশ্লেষণের আকারের পরামিতিগুলির কার্যকারিতা চিত্রের রেজোলিউশনের উপর নির্ভর করে যেহেতু কণা সনাক্তকরণের আকারের পরামিতিগুলি পিক্সেল ইউনিটগুলির সাথে যুক্ত। দুর্ভাগ্যবশত, ডিআই বিশ্লেষণের সাথে জড়িত বেশিরভাগ প্রকাশিত গবেষণায় বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহৃত ইমেজ রেজোলিউশনের বর্ণনা অন্তর্ভুক্ত করা হয় না। এইভাবে, একটি প্রোটোকলের মাধ্যমে স্ট্যান্ডার্ড বিশ্লেষণ পরামিতি প্রতিষ্ঠা করা যা গুরুত্বপূর্ণ বিবরণ যেমন প্রস্তাবিত চিত্র রেজোলিউশনকে সম্পূর্ণরূপে প্রকাশ করে। এখানে, আমরা রিপোর্ট করি যে নিউরাইট ফ্র্যাগমেন্ট সনাক্তকরণের জন্য সর্বাধিক উদ্ধৃত প্যারামিটার, 20– 10,000 পিক্সেল (শিন এট আল।, 2012; ডি স্টেফানো এট আল।, 2015; সাসাকি এট আল।, 2016; লরেটো এবং al., 2020; Shin and Cho, 2020), ফলে নিউরন খণ্ডের বড় অনুপাত শনাক্ত করা যায়নি। নিউরাইট ফ্র্যাগমেন্ট সনাক্তকরণের জন্য ন্যূনতম আকারের মানদণ্ড হ্রাস করা টুকরো সনাক্তকরণের সংবেদনশীলতা বাড়ায়, একই সাথে নিউরাইট খণ্ড হিসাবে মিথ্যাভাবে সনাক্ত করা ইমেজ আর্টিফ্যাক্ট এবং নন-নিউরাইট ধ্বংসাবশেষের সংখ্যা বৃদ্ধি করে। সনাক্তকরণের সংবেদনশীলতা এবং মিথ্যা-ইতিবাচকতার হারের মধ্যে সর্বোত্তম ভারসাম্য বজায় রাখতে পারে এমন প্যারামিটারগুলির অনুসন্ধানে, আমরা ফেজ-কনট্রাস্ট মাইক্রোগ্রাফ থেকে প্রাপ্ত বাইনারাইজড চিত্রগুলিতে নিউরাইট খণ্ডগুলির সবচেয়ে সঠিক সনাক্তকরণ প্রদান হিসাবে 10-10,{19}} বিশ্লেষণের পরামিতি চিহ্নিত করেছি, যখন 5– 10,000 প্যারামিটারগুলি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফ থেকে প্রাপ্ত বাইনারিকৃত চিত্রগুলিতে নিউরাইট খণ্ডগুলির সবচেয়ে সঠিক সনাক্তকরণের সুবিধা দেয়৷ যদিও এই নির্ণয়গুলি 1280 1024 এর একটি ইমেজ রেজোলিউশন ব্যবহার করে করা হয়েছিল, এই ধরনের প্যারামিটারগুলিকে 1024 পিক্সেলের উল্লম্ব আকারের বৈশিষ্ট্যযুক্ত অন্যান্য রেজোলিউশনে ক্যাপচার করা ছবিতে সঠিক নিউরাইট ফ্র্যাগমেন্ট সনাক্তকরণ সক্ষম করা উচিত, যেমন {{ এর সাধারণ পূর্ণ-স্ক্রীন রেজোলিউশন 27}}, যেহেতু এই জাতীয় চিত্রগুলিতে চিত্রিত নিউরনগুলি অনুরূপ পিক্সেল আকারের হবে।

নিউরাইট ফ্র্যাগমেন্ট পরিমাপে অন্তর্ভুক্ত হওয়া থেকে ছোট, অ-নিউরাইট ধ্বংসাবশেষ এড়াতে কণা বিশ্লেষণের পরামিতিগুলি কনফিগার করার সময় অসংখ্য গবেষণা গোষ্ঠী একটি ন্যূনতম আকারের মানদণ্ড ব্যবহার করেছে (শিন এট আল।, 2012; কসকার এট আল।, 2013; ডি স্টেফানো এট আল।, 2015; সাসাকি এট আল।, 2016; লি এট আল।, 2017; লরেটো এট আল।, 2020; শিন এবং চো, 2020; সুন্দরমূর্তি এট আল।, 2020)। যাইহোক, এই ধরনের অধ্যয়নগুলি ভুলভাবে মোট নিউরাইট এলাকার পরিমাপের মধ্যে ছোট, অ-খণ্ডিত পদার্থকে অন্তর্ভুক্ত করেছে, যেহেতু এই ধরনের পরিমাপগুলি চিত্রের সমস্ত কালো পিক্সেলের ক্ষেত্রফল যোগ করে প্রাপ্ত করা হয়। এখানে, আমরা ডিআই বিশ্লেষণের আগে চিত্র থেকে ছোট, অ-খণ্ডিত ধ্বংসাবশেষ অপসারণ করতে পার্টিকেল রিমুভার প্লাগইনটির উপযোগিতা প্রদর্শন করি। প্লাগইনটির ব্যবহার ফেজ-কনট্রাস্ট ইমেজ থেকে প্রাপ্ত নিউরাইট ডিজেনারেশন পরিমাপের সংবেদনশীলতা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি করেছে। এইভাবে, আমাদের ফলাফলগুলি ফেজ-কনট্রাস্ট মাইক্রোগ্রাফ ব্যবহার করে ডিআই বিশ্লেষণ সম্পাদনকারী তদন্তকারীদের জন্য কণা রিমুভার প্লাগইনের মান হাইলাইট করে। মজার বিষয় হল, ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফগুলিতে কম ছোট, অ-নিউরাইট ধ্বংসাবশেষ বৈশিষ্ট্যযুক্ত, এবং এইভাবে, খণ্ড সনাক্তকরণের জন্য পাঁচ পিক্সেলের একটি নিম্ন আকারের মানদণ্ড ব্যবহার করা যেতে পারে। যদিও পাঁচ পিক্সেলের কম আকারের নন-নিউরাইট ধ্বংসাবশেষের কণা অপসারণ ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফ থেকে প্রাপ্ত ডিআই পরিমাপকে উল্লেখযোগ্যভাবে প্রভাবিত করেনি, এই ধরনের ক্রিয়াকলাপগুলি এমন মান প্রদান করে যা তাত্ত্বিকভাবে আরও সঠিক এবং তাই ANDI-তে অন্তর্ভুক্ত ছিল।

যেহেতু ডিআই বিশ্লেষণগুলি কেবলমাত্র নিউরাইট বৈশিষ্ট্যযুক্ত চিত্রগুলি ব্যবহার করে সঞ্চালিত হওয়া উচিত, বিশ্লেষণ পদ্ধতির প্রয়োগ প্রাথমিকভাবে কোষের দেহগুলি অপসারণের জন্য উপযুক্ত সংস্কৃতি ব্যবস্থার সাথে ব্যবহার করার মধ্যে সীমাবদ্ধ ছিল, যেমন এক্সপ্লান্ট সংস্কৃতি যেখানে কোষের দেহগুলিকে শারীরিকভাবে নির্মূল করা যেতে পারে (ক্যাটেনাসিও এট আল। , 2017; শিন এবং চো, 2020) বা সোমা এবং অ্যাক্সন কম্পার্টমেন্টের পৃথকীকরণের সুবিধা প্রদানকারী মাইক্রোফ্লুইডিক ডিভাইসে সংস্কৃতি (কসকার এট আল।, 2013; পিস-রাইসি এট আল।, 2017; ট্যান এট আল।, 2018)। বৈকল্পিকভাবে বিচ্ছিন্ন সংস্কৃতির সাথে ডিআই বিশ্লেষণগুলি সম্পাদন করা ক্লান্তিকর এবং সময়সাপেক্ষ শ্রমের মাধ্যমে অর্জন করা যেতে পারে মাইক্রোগ্রাফ থেকে কোষের দেহগুলিকে ডিজিটাল অপসারণের সাথে যুক্ত (Kraemer et al., 2014)। বর্তমান সমীক্ষায়, আমরা প্রকাশ করেছি যে ANDI মাইক্রোগ্রাফ থেকে DI পরিমাপের কার্যকারিতা সক্ষম করে যেগুলি LUHMES কোষগুলিকে সমন্বিত করে যা একটি 2D সংস্কৃতি সিস্টেম জুড়ে বিচ্ছিন্ন এবং মোজাইকভাবে বিতরণ করা হয়। আমাদের অনুসন্ধানগুলি আরও দেখায় যে ANDI বিশ্লেষণগুলি সম্পাদন করার জন্য প্রয়োজনীয় সময়ের 24-গুণ হ্রাসের সুবিধা দেয় এবং ANDI-তে ক্রিয়াকলাপগুলি সোমা অপসারণ ফলন DI বিশ্লেষণের ফলাফল দেয় যা ম্যানুয়াল সোমা অপসারণের পরে সম্পাদিত অনুরূপ বিশ্লেষণগুলির সাথে 98% সম্পর্কযুক্ত ImageJ এর ফ্রিহ্যান্ড টুল। এইভাবে, ম্যাক্রো এমন একটি প্রক্রিয়ার মাধ্যমে স্বয়ংক্রিয় সোমা অপসারণের মাধ্যমে বিশ্লেষণের কার্যকারিতাকে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি করে যা নির্ভুলতা বিসর্জন দেয় না এবং এই ধরনের ক্রিয়াকলাপগুলি মোজাইকভাবে বিতরণ করা কোষের দেহগুলির সাথে বিচ্ছিন্ন সংস্কৃতি বিশ্লেষণ করার পদ্ধতির উপযুক্ততাকে প্রসারিত করে।

ইমেজ থেকে স্বয়ংক্রিয় কোষ বডি অপসারণ সহজতর করার পাশাপাশি, ANDI DI বিশ্লেষণ সম্পাদনের জন্য প্রথাগত পদ্ধতিতে বেশ কিছু সংশোধন করে, যার মধ্যে রয়েছে ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফ ব্যবহার, সংশোধিত কণা বিশ্লেষণ পরামিতি, এবং ছোট, অ-নিউরাইট ধ্বংসাবশেষ অপসারণের জন্য কণা রিমুভারের ব্যবহার। ছবি থেকে। আমাদের অনুসন্ধানগুলি ইঙ্গিত দেয় যে এই অপ্টিমাইজেশনগুলি সম্মিলিতভাবে DI মানগুলি দেয় যা অন্ধ এবং সাবজেক্টেড স্কোরিংয়ের মাধ্যমে প্রাপ্ত আরও ঘনিষ্ঠ আনুমানিক মানগুলি। এইভাবে, বিশ্লেষণগুলি সম্পাদন করার জন্য প্রয়োজনীয় সময়কে যথেষ্ট পরিমাণে হ্রাস করার পাশাপাশি, ANDI DI পরিমাপের সুবিধা দেয় যা, ঐতিহ্যগত পদ্ধতির তুলনায়, আরও সঠিকভাবে নিউরাইট অবক্ষয়কে প্রতিফলিত করে যা তদন্তকারীরা গুণগত চিত্র বিশ্লেষণ থেকে পর্যবেক্ষণ করে।

DI বিশ্লেষণ সম্পাদনের জন্য ঐতিহ্যগত পদ্ধতির একটি ত্রুটি হল যে এই ধরনের বিশ্লেষণের জন্য ইমেজজে ব্যবহারে প্রশিক্ষণের প্রয়োজন হয় যাতে ব্যবহারকারী ইমেজজে অপারেশনগুলির একটি ক্লান্তিকর সেটের সাথে পরিচিত হয়। তদুপরি, বিশ্লেষণগুলি দক্ষতার সাথে সম্পাদন করার জন্য, ব্যবহারকারীকে ব্যাচ বিশ্লেষণগুলি সম্পাদন করতে বা নির্দিষ্ট পদক্ষেপগুলি সম্পাদনকে আধা-স্বয়ংক্রিয় করতে স্ক্রিপ্ট লেখার জন্য আরও প্রশিক্ষণের প্রয়োজন। বিশ্লেষণকে সম্পূর্ণরূপে স্বয়ংক্রিয় করার মাধ্যমে, ANDI ম্যাক্রো ডাউনলোড এবং কার্যকর করার সাথে সম্পর্কিত মাত্র কয়েকটি ধাপে DI পরিমাপকে সহজতর করে। ব্যবহারকারী-বন্ধুত্ব বাড়ানোর জন্য, ম্যাক্রোতে বিশ্লেষণ করার জন্য চিত্র ধারণকারী ডিরেক্টরি নির্বাচন করার জন্য একটি ইন্টারফেস প্রদান করার জন্য কোড অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছে, সেইসাথে ব্যবহারকারীর পছন্দের একটি ডিরেক্টরিতে ফলাফলের চিত্র এবং ডেটা টেবিলের আউটপুটকে সহজতর করার জন্য। অধিকন্তু, স্ক্রিপ্টে পরিমাপের ভুল বা ব্যবহারকারীর ভুল রোধ করার জন্য ডিজাইন করা অসংখ্য বৈশিষ্ট্য রয়েছে, যার মধ্যে পূর্ববর্তী ImageJ ফলাফলের স্বয়ংক্রিয় ক্লিয়ারিং সহ; পিক্সেল ইউনিট ব্যবহার করে পরিমাপ সঠিকভাবে করা হয় তা নিশ্চিত করার জন্য চিত্র স্কেল তথ্য অপসারণ; ImageJ রঙ সেটিংস, পরিমাপ সেটিংস, এবং কণা বিশ্লেষক পরামিতিগুলির উপযুক্ত কনফিগারেশন; ত্রুটি বার্তা উপস্থাপনা যদি ব্যবহারকারীরা ভুলভাবে b III-টিউবিউলিন স্টেনিং এবং DAPI স্টেনিং চিত্রিত অসম সংখ্যক ছবি ধারণকারী ডিরেক্টরি নির্বাচন করেন; লগ বিবরণ বিশ্লেষণ অগ্রগতি নির্দেশ করে; এবং উইন্ডোজ 10 দ্বারা স্বয়ংক্রিয় .ini ফাইল তৈরির সাথে যুক্ত বাগগুলি প্রতিরোধ করার জন্য কোডিং। সব মিলিয়ে, এই বৈশিষ্ট্যগুলি ডিআই বিশ্লেষণগুলিকে আরও ব্যবহারকারী-বান্ধব করে তোলে, যা নিউরাইট অবক্ষয় সম্পর্কিত গবেষণায় আগ্রহ বাড়াতে পারে।

একটি পরীক্ষায় এর উপযোগিতা প্রদর্শনের জন্য, আমরা 6-OHDA-এর সংস্পর্শে থাকা LUHMES কোষ সংস্কৃতিতে নিউরাইট অবক্ষয়ের জন্য JNK-এর অবদান মূল্যায়ন করতে ANDI ব্যবহার করেছি। JNK হল একটি স্ট্রেস-অ্যাক্টিভেটেড কিনেস যা অপ্রাইমেট অরিজিনের পেরিফেরাল নিউরনে নিউরাইট ডিজেনারেশনের চাবিকাঠি হিসাবে রিপোর্ট করা হয়েছে (শিন এট আল।, 2012), কিন্তু মেসেনসেফালিক মানব কোষে নিউরাইট ডিজেনারেশনে কাইনেসের ভূমিকা বোঝার জন্য আরও অধ্যয়ন প্রয়োজন। . এখানে, আমরা প্রদর্শন করি যে JNK-এর বাধা অক্সিডেটিভ স্ট্রেসের সাথে যুক্ত নিউরাইট অবক্ষয় থেকে মানুষের মেসেনসেফালিক কোষগুলিকে উল্লেখযোগ্যভাবে রক্ষা করে। এই ধরনের অনুসন্ধানগুলি শুধুমাত্র মানব রোগের একটি মডেলের সাথে যুক্ত নিউরাইট অবক্ষয়ের ক্ষেত্রে JNK-এর জন্য একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা প্রকাশ করে না বরং নতুন বৈজ্ঞানিক আবিষ্কারগুলি করার জন্য স্বয়ংক্রিয় এবং উদ্দেশ্যমূলক চিত্র বিশ্লেষণ করার জন্য ANDI-এর উপযোগিতার উদাহরণও দেয়।

যদিও ANDI প্রাথমিকভাবে 6-OHDA-এর সংস্পর্শে আসা ভিন্ন ভিন্ন LUHMES কোষের সংস্কৃতিতে নিউরাইট অবক্ষয়ের দ্রুত এবং সঠিক পরিমাপের সুবিধার্থে ডিজাইন করা হয়েছিল, আমাদের অনুসন্ধানগুলি ইঙ্গিত দেয় যে ম্যাক্রো অন্যান্য কারণ দ্বারা প্ররোচিত নিউরাইট অবক্ষয় সনাক্ত করতে ব্যবহার করা যেতে পারে, যেমন হাইড্রোজেন পারক্সাইড বা নিউরোট্রফিন প্রত্যাহারের এক্সপোজার। অতিরিক্তভাবে, ম্যাক্রোর সংস্করণ 1.1-এ একটি ডায়ালগ বক্স রয়েছে যা তদন্তকারীদের নির্দিষ্ট আকারের নিউরনের জন্য সোমা অপসারণ ক্রিয়াকলাপগুলি কাস্টমাইজ করতে সক্ষম করে। আমাদের ডেটাও সমর্থন করে যে বি III-টিউবুলিনের জন্য ইমিউনোলেবেলিং ব্যতীত অন্যান্য স্টেনিং পদ্ধতিগুলি নিউরাইট অবক্ষয়ের সঠিক পরিমাপের জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে। যদিও আমরা DI পরিমাপের যথার্থতা যাচাই করার জন্য পাইলট অধ্যয়ন ব্যবহারের পরামর্শ দিই যখন ANDI ব্যবহার করে কোষের ধরন বা স্টেনিং পদ্ধতি যা আগে পরীক্ষা করা হয়নি, এই ফলাফলগুলি সমর্থন করে যে ম্যাক্রো সংস্কৃতিযুক্ত নিউরনে নিউরাইট অবক্ষয় পরিমাপের জন্য একটি বহুমুখী হাতিয়ার। যেহেতু ANDI টিস্যুতে নিউরাইট অবক্ষয় পরিমাপের জন্য অপ্টিমাইজ করা হয়নি, তাই আমরা বর্তমানে শুধুমাত্র সংস্কৃতিযুক্ত কোষগুলির সাথে যুক্ত নিউরাইট অবক্ষয় বিশ্লেষণের জন্য এটির ব্যবহারের সুপারিশ করি। যাইহোক, ANDI-এর জন্য কোডটি সর্বজনীনভাবে উপলব্ধ এবং এইভাবে ভিভো স্টাডিজ বা অন্যান্য অ্যাপ্লিকেশনের জন্য স্ক্রিপ্টটি পরিবর্তন করতে আগ্রহী তদন্তকারীদের জন্যও কার্যকর হতে পারে।

উপসংহারে, এই নিবন্ধটি নিউরাইট অবক্ষয় পরিমাপ করার জন্য একটি বহুল ব্যবহৃত পদ্ধতির সাথে সম্পর্কিত ত্রুটির সাধারণ উত্সগুলি প্রকাশ করে এমন ডেটা উপস্থাপন করে। পদ্ধতিটি উন্নত করার জন্য পরীক্ষামূলক পদ্ধতি ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং এই ধরনের বর্ধনগুলি একটি মুক্ত এবং ওপেন-সোর্স ইমেজজে ম্যাক্রোতে অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল যা নিউরাইট অবক্ষয়ের জন্য ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোগ্রাফের দ্রুত, সঠিক এবং উদ্দেশ্যমূলক বিশ্লেষণ করতে ব্যবহার করা যেতে পারে। আমাদের অনুসন্ধানগুলি পিডি-র সেল কালচার মডেলকে চিত্রিত মাইক্রোগ্রাফগুলিতে নিউরাইট অবক্ষয়ের পরিমাণ নির্ধারণের জন্য ANDI-এর কার্যকারিতা প্রকাশ করে, সেইসাথে এই নীতির প্রমাণ দেয় যে ম্যাক্রো অন্যান্য জৈবিক প্রসঙ্গের সাথে যুক্ত নিউরাইট অবক্ষয় সনাক্ত করতে পারে। ব্যবহারকারী-বান্ধব ম্যাক্রো নিউরাইট অবক্ষয়ের অন্তর্নিহিত কারণগুলির মূল্যায়নকারী অধ্যয়নের থ্রুপুট এবং নির্ভুলতা বাড়ানোর সময় তদন্তকারীদের নিউরাইট ফ্র্যাগমেন্টেশনের পরিমাণ নির্ধারণ করতে শেখার জন্য প্রয়োজনীয় সময় কমিয়ে দেবে। ANDI ম্যাক্রো নিম্নলিখিত URL এ উপলব্ধ: https:// github.com/kraemerb/kraemerlab.

তথ্যসূত্র

1. Aarsland D, Creese B, Politis M, Chaudhuri KR, Ffytche DH, Weintraub D, Ballard C (2017) পারকিনসন রোগে জ্ঞানীয় হ্রাস। ন্যাট রেভ নিউরোল 13:217-231।

2. অ্যাডালবার্ট আর, কোলম্যান এমপি (2013) পর্যালোচনা: বয়স-সম্পর্কিত নিউরোডিজেনারেটিভ ডিসঅর্ডারে অ্যাক্সন প্যাথলজি। নিউরোপ্যাথল অ্যাপল নিউরোবিওল 39:90-108।

3. বোভে জে, পেরিয়ার সি (2012) পারকিনসন রোগের নিউরোটক্সিন-ভিত্তিক মডেল। নিউরোসায়েন্স 211:51-76।

4. Catenaccio A, Llavero Hurtado M, Diaz P, Lamont DJ, Wishart TM, Court FA (2017) অ্যাক্সোন ডিজেনারেশনের অ্যাক্সোনাল-ইনট্রিনসিক এবং গ্লিয়াল-সম্পর্কিত সহ-নিয়ন্ত্রণের আণবিক বিশ্লেষণ। সেল ডেথ ডিস 8: e3166।

5. Cosker KE, Pazyra-Murphy MF, Fenstermacher SJ, Segal RA (2013) টার্গেট-ডিরাইভড নিউরোট্রফিন কোঅর্ডিনেট ট্রান্সক্রিপশন।

6. Di Stefano M, Nascimento-Ferreira I, Orsomando G, Mori V, Gilley J, Brown R, Janeckova L, Vargas ME, Worrell LA, Loreto A, Tickle J, Patrick J, Webster JRM, Marangoni M, Carpi FM, Pucciarelli S, Rossi F, Meng W, Sagasti A, Ribchester RR, et al. (2015) আঘাতের পরে এনএডি অগ্রদূত নিকোটিনামাইড মনোনিউক্লিওটাইড (এনএমএন) বৃদ্ধি অ্যাক্সন অবক্ষয়কে উত্সাহ দেয়। কোষের মৃত্যুর পার্থক্য 22:731-742।

7. ফুকুই কে (2016) প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতি কোষের মৃত্যুর আগে নিউরাইটের অবক্ষয় ঘটায়। জে ক্লিন বায়োকেম নিউট্র 59:155-159।

8. গেডেন এমজে, দেশমুখ এম (2016) অ্যাক্সন ডিজেনারেশন: প্রসঙ্গ স্বতন্ত্র পথগুলিকে সংজ্ঞায়িত করে। কার ওপিন নিউরোবিওল 39:108-115।

9. Geisler S, Doan RA, Cheng GC, Cetinkaya-Fisgin A, Huang SX, Höke A, Milbrandt J, DiAntonio A (2019) Vincristine এবং bortezomib একটি সাধারণ SARM1-নির্ভর অ্যাক্সন ডিজেনকে সক্রিয় করতে স্বতন্ত্র আপস্ট্রিম মেকানিজম ব্যবহার করে কার্যক্রম. JCI অন্তর্দৃষ্টি 4:e129920।

10. Hernandez DE, Salvadores NA, Moya-Alvarado G, Catalan RJ, Bronfman FC, Court FA (2018) গ্লুটামেট এক্সিটোটক্সিসিটি দ্বারা প্ররোচিত অ্যাক্সোনাল অবক্ষয় নেক্রোপ্টোসিস দ্বারা মধ্যস্থতা করে। J Cell Sci 131:jcs214684.

For more information:1950477648nn@gmail.com