আরএনএ সিকোয়েন্সিংয়ের উপর ভিত্তি করে কিডনি বার্ধক্যে LncRNA-এর ভূমিকার ভবিষ্যদ্বাণী করুন Ⅱ

lncRNA Gm43360 এবং এর সম্ভাব্য লক্ষ্য mRNA এর পারস্পরিক সম্পর্ক

LncRNA Gm43360 অধ্যয়নের জন্য নির্বাচিত হয়েছিল কারণ এটি দুটি lncRNA-mRNA কো-এক্সপ্রেশন নেটওয়ার্ক সংযুক্ত করেছে। Adra1a-এর অভিব্যক্তি স্তরটি ইতিবাচকভাবে সম্পর্কযুক্ত ছিল (rho=0.8650, p=0.026) Gm43360 এর সাথে, Csnk1a1 (কেসিন কিনেস 1A1) নেতিবাচকভাবে সম্পর্কযুক্ত ছিল (rho{{12) }}.8084, p=0.0084) (চিত্র 5a)। lncRNA Gm43360 এবং এর সম্ভাব্য লক্ষ্য mRNAs Adra1a এবং Csnk1a1 এর পারস্পরিক সম্পর্ক আরও যাচাই করার জন্য, এই গবেষণায় lncRNA Gm43360 এর একটি ওভার এক্সপ্রেশন প্লাজমিড ডিজাইন করা হয়েছিল। Csnk1a1 এর অভিব্যক্তি প্রত্যাশিত হিসাবে হ্রাস পেয়েছে, এবং Adra1a অভিব্যক্তিও হ্রাস পেয়েছে, তবে উল্লেখযোগ্যভাবে নয়। এরপরে, আমরা siRNA দ্বারা lncRNA Gm43360 ছিটকে দিয়েছি যাতে এটির লক্ষ্য mRNA-এর অভিব্যক্তি প্রভাবিত হয়েছিল কিনা তা সনাক্ত করতে। প্রত্যাশিত হিসাবে, lncRNA Gm43360 নকডাউন কোষগুলিতে siRNA নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর (চিত্র 5b) তুলনায় Csnk1a1 বৃদ্ধি করা হয়েছিল। দশ, আমরা কোষ চক্রে lncRNA Gm43360 এর ভূমিকা সনাক্ত করেছি। সেল কাউন্টিং কিট-8 (CCK-8) ফলাফলগুলি দেখায় যে lncRNA Gm43360 কোষের কার্যকারিতা প্রচার করেছে (চিত্র 5c)৷ ফলাফলগুলি দেখায় যে lncRNA Gm43360 S ফেজ কোষের শতাংশ বৃদ্ধি করেছে এবং নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণের তুলনায় G1 ফেজ কোষের শতাংশ হ্রাস করেছে (চিত্র 5d)। Te p53 এবং p21 প্রোটিনগুলি কোষ চক্রের নিয়ন্ত্রণে জড়িত ছিল এবং এইভাবে কোষের বার্ধক্যের চিহ্ন ছিল। p53 এবং p21 এর এক্সপ্রেশন স্তরগুলি নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর তুলনায় ওভার এক্সপ্রেশন গ্রুপে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে। siRNA কন্ট্রোল গ্রুপ (চিত্র 5e) এর সাপেক্ষে siRNA গ্রুপে p53 এবং p21 এর অভিব্যক্তির মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে। lncRNA Gm43360-এর অত্যধিক এক্সপ্রেশন SA- -গাল-পজিটিভ কোষের সংখ্যা হ্রাস করে এবং ট্রান্সফেক্ট Gm43360 (চিত্র 5f) গ্রুপে -গাল-পজিটিভ কোষ বৃদ্ধি পায়। একসাথে নেওয়া, এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে lncRNA Gm43360 রেনাল টিউবুলার এপিথেলিয়াল কোষগুলির সেন্সেন্সকে বাধা দেয়Csnk1a1 এর অভিব্যক্তিকে বাধা দেয়.

কিডনির কার্যকারিতার জন্য 25% ইচিনাকোসাইড এবং 9% অ্যাকটিওসাইড সহ প্রাকৃতিক জৈব সিস্টানচে নির্যাস পেতে এখানে ক্লিক করুন

আলোচনা

এই গবেষণায়, আমরা তরুণ এবং বৃদ্ধ মাউসের কিডনি থেকে এমআরএনএ এক্সপ্রেশন ডেটা মূল্যায়ন করেছি এবং জৈব-তথ্য বিশ্লেষণ পরিচালনা করেছি যা বিকৃতভাবে প্রকাশিত এমআরএনএগুলির কার্যাবলী প্রকাশ করেছে। আমরা 347টি আপ-রেগুলেটেড এমআরএনএ এবং 355টি ডাউনরেগুলেটেড এমআরএনএ এবং সেইসাথে 130টি আপরেগুলেটেড এলএনসিআরএনএ এবং 91টি ডাউনরেগুলেটেড এলএনসিআরএনএ পর্যবেক্ষণ করেছি।তরুণ ইঁদুরের কিডনির তুলনায় পুরানো মাউসের কিডনি. উপরন্তু, এই mRNAs বার্ধক্য-সম্পর্কিত পথের সাথে জড়িত দেখানো হয়েছে, যেমনঅক্সিডেটিভ phosphorylation, AMPK সিগন্যালিং পাথওয়ে, Wnt সিগন্যালিং পাথওয়ে, Rap1 সিগন্যালিং পাথওয়ে, এবং বয়স-সম্পর্কিত রোগ, যা রেনাল বার্ধক্যজনিত প্যাথোজেনেসিসে ভিন্নভাবে প্রকাশিত mRNA এর কার্যাবলী প্রদর্শন করে।

দীর্ঘ ননকোডিং আরএনএ NEAT1 রেনাল টিউবুলার এপিথেলিয়াল কোষগুলিতে কিডনি ফাইব্রোসিসের অগ্রগতির একটি প্রতিরক্ষামূলক ফ্যাক্টর [২১]। কাকতালীয়ভাবে, আমাদের সিকোয়েন্সিং ফলাফলে, lncRNA NEAT1 অল্প বয়সী ইঁদুরের তুলনায় বয়স্ক ইঁদুরের কিডনিতে নিম্ন স্তরে প্রকাশ করা হয়েছিল, যা পূর্ববর্তী অনুসন্ধানের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। LincRNA-Gm4419 NF-kB/NLRP3 দ্বারা প্রদাহ এবং ফাইব্রোসিসকে ত্বরান্বিত করে ডায়াবেটিক নেফ্রোপ্যাথিতে ইনফ্ল্যামাসোম-মিডিয়াটেড মেকানিজম [২২]। আমাদের সিকোয়েন্সিং ফলাফলগুলিতে, আমরা আরও দেখতে পেয়েছি যে তরুণ ইঁদুরের তুলনায় বয়স্ক ইঁদুরের কিডনিতে Gm4419 এর অভিব্যক্তি বেশি ছিল, তবে কোনও উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল না। LncRNA Gm43360 ক্রোমোজোম 5 এ অবস্থিত (Chr5:122494022–122,494,908, 2887 bp)। UCSC জিনোম ব্রাউজার অনুসারে, Gm43360 প্রোটিন-কোডিং জিন Atp2a2-এর অন্তর্মুখে অবস্থিত। যাইহোক, আজ অবধি রোগের সাথে lncRNA Gm43360-এর সম্পৃক্ততা সম্পর্কে কোন রিপোর্ট পাওয়া যায়নি। এই গবেষণায়, lncRNA Gm43360 এর নকডাউন রেনাল টিউবুলার এপিথেলিয়াল সেল সেন্সেন্সকে উন্নীত করেছে। এছাড়াও, আমরা সিকোয়েন্সিং ফলাফলগুলিতে অনেকগুলি পৃথকভাবে প্রকাশিত lncRNA চিহ্নিত করেছি এবং সেগুলি তদন্ত করেছি।

LncRNA গুলিকে lncRNA নিয়ন্ত্রক প্রক্রিয়ার উপর ভিত্তি করে cis-regulation বা ট্রান্স-রেগুলেশনে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়েছিল। Cis-অভিনয় lncRNAs cis-অভিনয় উপাদানগুলির উপর নির্ভর করে প্রতিবেশী জিনের অভিব্যক্তিকে প্রভাবিত করতে পারে, যেমন প্রোমোটার, বর্ধক এবং নিয়ন্ত্রক ক্রম, যা 100 kb এর কম lncRNA এবং mRNA এর মধ্যে দূরত্ব। ট্রান্স-অ্যাক্টিং lncRNAs বলতে lncRNA গুলিকে বোঝায় যা স্থানান্তরের স্থান ত্যাগ করে এবং দূরবর্তী স্থানে কাজ করে (অর্থাৎ, lncRNAs এবং mRNAs এর মধ্যে দূরত্ব 100 kb এর বেশি) [23]। lncRNA MAAT একটি cis-নিয়ন্ত্রক মডিউল [24] এর মাধ্যমে প্রতিবেশী জিন Mbnl1 এর অভিব্যক্তি বাড়ায়। lncRNA Pnky কর্টিকাল বিকাশে একটি ট্রান্স-অ্যাক্টিং নিয়ন্ত্রক হিসাবে ভূমিকা পালন করে [25]। এই গবেষণায়, lncRNA Gm43360 এবং Csnk1a1 এর মধ্যে একটি ট্রান্সরেগুলেটরি সম্পর্ক ছিল। Csnk1a1 হল একটি টিউমার দমনকারী জিন [২৬] যা একটি প্রোটিনকে এনকোড করে যা কোষ চক্র এবং কোষ বিভাজন প্রক্রিয়ায় অংশগ্রহণ করে [২৭]। Csnk1a1 ডাউনরেগুলেশন প্ররোচিত করেসেন্সেন্স-সম্পর্কিত প্রদাহজনককোলোরেক্টাল টিউমারে বৃদ্ধি গ্রেপ্তারের সাথে প্রতিক্রিয়া [26]। যখন Gm43360 আপ-নিয়ন্ত্রিত করা হয়েছিল তখন Csnk1a1কে নিয়ন্ত্রিত করা হয়েছিল; এইভাবে, সম্ভবত lncRNA Gm43360 এতে অংশগ্রহণ করেকিডনি বার্ধক্যদ্বারাCsnk1a1 এক্সপ্রেশন নিয়ন্ত্রণ করা.

উপসংহার

lncRNA-mRNA কো-এক্সপ্রেশন নেটওয়ার্কের আমাদের তদন্তকিডনি বার্ধক্যএকটি lncRNA, lncRNA Gm43360 প্রকাশ করেছে, যা কিডনি বার্ধক্যের ক্ষেত্রে একটি প্রতিরক্ষামূলক ভূমিকা পালন করতে পারে এবং এর সাথে জড়িত প্রক্রিয়াগুলি সম্পর্কে আমাদের বোঝার প্রসারিত করতে পারে।কিডনি বার্ধক্য

উপকরণ এবং পদ্ধতিসমূহ

স্যাম্পল ইয়াং (3-মাস-বয়সী) এবং বৃদ্ধ (24-মাস-বয়সী) পুরুষ C57BL/6J ইঁদুরগুলি Xiamen বিশ্ববিদ্যালয়ের এক্সপেরিমেন্টাল অ্যানিমাল সেন্টার থেকে কেনা হয়েছিল এবং একটি আদর্শ পরিবেশে বড় করা হয়েছিল৷ সমস্ত ইঁদুরের খাবার এবং জল বিনামূল্যে অ্যাক্সেস ছিল। ইঁদুরগুলি বলি দেওয়ার আগে এক মাসের জন্য নতুন সুবিধার সাথে অভ্যস্ত ছিল। নমুনা সংগ্রহের আগে 750 মিলিগ্রাম/কেজি ডোজে ইন্ট্রাপেরিটোনিয়াল ইনজেকশন দ্বারা ইঁদুরগুলিকে ইউরেথেন দিয়ে অ্যানেস্থেটাইজ করা হয়েছিল। একই দিনে তরুণ ও বৃদ্ধ ইঁদুর বলি দেওয়া হয়।অবশিষ্ট মাউস কিডনিপ্রতিটি অ্যাসে সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য টিস্যু ব্যবহার করা হয়েছিল। আরএনএ-সেক এবং হিস্টোপ্যাথলজি সঞ্চালিত হয়েছিলপৃথক কিডনিএকই মাউস থেকে। ইঁদুর থেকে কিডনির টিস্যু সংগ্রহ করা হয়েছিল। একটি কিডনি অবিলম্বে পরবর্তী সেকশন এম্বেডিংয়ের জন্য 10% নিরপেক্ষ বাফারযুক্ত ফরমালিনের মধ্যে নিমজ্জিত করা হয়েছিল, এবং অন্য কিডনিকে কয়েকটি টিস্যুতে বিভক্ত করা হয়েছিল এবং অবিলম্বে তরল নাইট্রোজেনে স্থাপন করা হয়েছিল এবং তারপরে -80 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়েছিল। গবেষণাটি জিয়ান জিয়াওটং ইউনিভার্সিটির (শানসি, চীন) (নং 2018-জি-164) প্রথম অনুমোদিত হাসপাতালের নীতিশাস্ত্র কমিটি দ্বারা সমর্থিত ছিল। সমস্ত পদ্ধতি পশু নৈতিকতা নির্দেশিকা এবং প্রবিধান দ্বারা বাহিত হয়. এই গবেষণাটি ARRIVE নির্দেশিকাগুলির সাথে সম্মতিতে করা হয়েছিল৷

কিডনি হিস্টোপ্যাথলজি

অল্প বয়স্ক এবং বৃদ্ধ ইঁদুরের রেনাল টিস্যুর নমুনাগুলি রাতারাতি 10% প্যারাফর্মালডিহাইড দ্রবণে স্থির করা হয়েছিল। দশটি বিভাগ ডিহাইড্রেটেড, প্যারাফিন-এম্বেডেড এবং 4-µm পুরুত্বে বিভাগ করা হয়েছে। PAS এবং ম্যাসনের ট্রাইক্রোম্যাটিক স্টেনিং স্ট্যান্ডার্ড প্রোটোকল ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল। চিত্রগুলি ক্যামেরা দ্বারা বন্দী করা হয়েছিল এবং স্টেনিং-ইতিবাচক এলাকাটি পরিমাপ করা হয়েছিল। হিস্টোপ্যাথলজি ক্যামেরা চিত্রগুলির জন্য এলাকাটি চিত্র-প্রো প্লাস 6.0 দিয়ে গণনা করা হয়েছিল।

SA-gal staining

প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুযায়ী SA{{0}}গালের কার্যকলাপ একটি SA- -গাল স্টেনিং কিট (সেল সিগন্যালিং প্রযুক্তি #9860) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল৷ ইতিবাচক দাগের ক্ষেত্রটি পরিমাপ করা হয়েছিল, এবং SA- -গাল-পজিটিভ কোষগুলি চিত্র-প্রো প্লাস 6.0 ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল৷

আরএনএ নিষ্কাশন গ্রন্থাগার নির্মাণ এবং সিকোয়েন্সিং

Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7৷{1}} একটি সিকোয়েন্সিং লাইব্রেরি তৈরি করতে ব্যবহৃত হয়েছিল৷ মোট আরএনএ নিষ্কাশনের পর, এমআরএনএকে মোট আরএনএ (5ug) থেকে ডিনাবেডস অলিগো (ডিটি) (থার্মো ফিশার, সিএ, ইউএসএ) ব্যবহার করে দুই রাউন্ড পরিশোধনের মাধ্যমে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। বিশুদ্ধকরণের পর, উচ্চ তাপমাত্রায় (ম্যাগনেসিয়াম আরএনএ ফ্র্যাগমেন্টেশন মডিউল (NEB, cat. e6150, USA) 94 ডিগ্রি 5-7 মিনিটের নিচে) ডিভালেন্ট ক্যাটেশন ব্যবহার করে mRNA ছোট খণ্ডে বিভক্ত হয়েছিল। তারপরে ক্লিভড RNA খণ্ডগুলোকে সুপারস্ক্রিপ্ট™ II রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেস (ইনভিট্রোজেন, বিড়াল। 1,896,649, ইউএসএ) দ্বারা সিডিএনএ পাওয়ার জন্য বিপরীত-প্রতিলিপি করা হয়েছিল, যেগুলি পরবর্তীতে E. coli DNA পলিমারেজ I (এর সাথে U-লেবেলযুক্ত সেকেন্ড-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএগুলিকে সংশ্লেষণ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল) NEB, cat.m0209, USA), RNase H (NEB, cat.m0297, USA) এবং dUTP সলিউশন (Termo Fisher, cat.R0133, USA)। তারপরে প্রতিটি স্ট্র্যান্ডের ভোঁতা প্রান্তে একটি A-বেস যুক্ত করা হয়েছিল, সূচীকৃত অ্যাডাপ্টারের সাথে বন্ধনের জন্য তাদের প্রস্তুত করে। প্রতিটি অ্যাডাপ্টারে একটি টি-বেস ওভারহ্যাং থাকে যাতে অ্যাডাপ্টারটিকে A-টেইলড ফ্র্যাগমেন্টেড ডিএনএ-তে লাগানো যায়। ডুয়াল-ইনডেক্স অ্যাডাপ্টারগুলি টুকরোগুলির সাথে সংযুক্ত ছিল এবং AMPureXP জপমালা দিয়ে আকার নির্বাচন করা হয়েছিল। হিট-লেবাইল UDG এনজাইম (NEB, cat.m0280, USA) U-লেবেলযুক্ত সেকেন্ড-স্ট্র্যান্ডেড ডিএনএগুলির চিকিত্সার পরে, বন্ধনযুক্ত পণ্যগুলিকে নিম্নলিখিত শর্তগুলির দ্বারা পিসিআর দিয়ে প্রশস্ত করা হয়েছিল: 3 মিনিটের জন্য 95 ডিগ্রিতে প্রাথমিক বিকৃতকরণ; 15 সেকেন্ডের জন্য 98 ডিগ্রিতে বিকৃতকরণের 8টি চক্র, 15 সেকেন্ডের জন্য 60 ডিগ্রিতে অ্যানিলিং এবং 30 সেকেন্ডের জন্য 72 ডিগ্রিতে এক্সটেনশন; এবং তারপর 5 মিনিটের জন্য 72 ডিগ্রিতে চূড়ান্ত এক্সটেনশন। চূড়ান্ত cDNA লাইব্রেরির জন্য গড় সন্নিবেশ দৈর্ঘ্য ছিল 300±50 bp। অবশেষে, আমরা প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল [২৮] অনুসারে একটি ইলুমিনা নোভাসেক™ 6000 (এলসি-বায়ো টেকনোলজি কো., লিমিটেড, হ্যাংঝো, চীন) 2x150 bp পেয়ারড-এন্ড সিকোয়েন্সিং (PE150) সম্পাদন করেছি।

বায়োইনফরমেটিক্স বিশ্লেষণ সিকোয়েন্স এবং ক্লিন রিডের ফিল্টারিং

থেকে পুল করা আরএনএ থেকে প্রযুক্তি দ্বারা নির্মিত একটি সিডিএনএ লাইব্রেরিকিডনির নমুনাইঁদুরের সিকোয়েন্স করা হয়েছিল এবং Illumina NovaseqTM 6000 সিকোয়েন্স প্ল্যাটফর্মের সাথে চালানো হয়েছিল। ইলুমিনা পেয়ারড-এন্ড RNA-seq পদ্ধতি ব্যবহার করে, আমরা ট্রান্সক্রিপ্টোম সিকোয়েন্স করেছি, যা মোট মিল 2×150 bp পেয়ারড-এন্ড রিড তৈরি করে। সিকোয়েন্সিং মেশিন থেকে প্রাপ্ত রিডগুলির মধ্যে অ্যাডাপ্টার বা নিম্ন-মানের বেস ধারণকারী কাঁচা পাঠ অন্তর্ভুক্ত যা নিম্নলিখিত সমাবেশ এবং বিশ্লেষণকে প্রভাবিত করবে। এইভাবে, উচ্চ-মানের ক্লিন রিড পেতে, রিডগুলিকে Cutadapt [29] (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/, version:cutadapt-1.9) দ্বারা আরও ফিল্টার করা হয়েছিল। পরামিতিগুলি নিম্নরূপ ছিল:

1) অ্যাডাপ্টার ধারণকারী রিড অপসারণ;

2) পলিএ এবং পলি ধারণকারী রিড অপসারণ;

3) 5% এর বেশি অজানা নিউক্লিওটাইড (N) ধারণকারী রিড অপসারণ করা;

4) নিম্ন-মানের 20%-এর বেশি নিম্ন-মানের (Q-মান 20-এর থেকে কম বা সমান) বেস ধারণকারী নিম্ন-মানের পাঠগুলি সরিয়ে ফেলা।

FastQC [30] (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/ fastqc/, 0.11.9) ব্যবহার করে দশটি সিকোয়েন্সের গুণমান যাচাই করা হয়েছে। ক্লিন ডেটার Q20, Q30 এবং GC বিষয়বস্তু সহ। এর পরে, মোট G bp পরিষ্কার করা, পেয়ারড-এন্ড রিড তৈরি করা হয়েছিল। কাঁচা ক্রম ডেটা NCBI জিন এক্সপ্রেশন অমনিবাস (GEO) ডেটাসেটে যোগদান নম্বর GSE154223 সহ জমা দেওয়া হয়েছে৷

রেফারেন্স জিনোম/টীকা ছিল Mus_musculus.GRCm38. বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহৃত জিন টীকাটির উৎস এবং সংস্করণটি ছিল Ensembl_v88.

প্রতিলিপি সমাবেশ

প্রথমত, Cutadapt [29] অ্যাডাপ্টার দূষণ, নিম্ন-মানের ঘাঁটি এবং অনির্ধারিত ঘাঁটিগুলি ধারণকারী রিডগুলিকে অপসারণ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। FastQC (http://www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/) ব্যবহার করে দশটি সিকোয়েন্সের গুণমান খুব খাওয়ানো হয়েছিল। আমরা বোটি 2 [31] এবং হিসাট 2 [32] ব্যবহার করেছি মাউসের জিনোমের রিড ম্যাপ করতে। প্রতিটি নমুনার ম্যাপড রিডগুলি স্ট্রিংটাই [৩৩] ব্যবহার করে একত্রিত করা হয়েছিল। দশ, থেকে সব প্রতিলিপিকিডনির নমুনাপার্ল স্ক্রিপ্ট ব্যবহার করে একটি ব্যাপক ট্রান্সক্রিপ্টোম পুনর্গঠনের জন্য একত্রিত করা হয়েছিল। চূড়ান্ত ট্রান্সক্রিপ্টোম তৈরি হওয়ার পরে, স্ট্রিংটাই [৩৩] এবং এজআর [৩৪] সমস্ত প্রতিলিপিগুলির অভিব্যক্তির মাত্রা অনুমান করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।

LncRNA সনাক্তকরণ

প্রথমত, পরিচিত mRNA এবং 200 bp-এর চেয়ে ছোট ট্রান্সক্রিপ্টগুলির সাথে ওভারল্যাপ করা ট্রান্সক্রিপ্টগুলি বাতিল করা হয়েছিল৷ তারপরে আমরা কোডিং সম্ভাবনা সহ প্রতিলিপিগুলির পূর্বাভাস দিতে CPC [35] এবং CNCI [36] ব্যবহার করেছি। CPC স্কোর সহ সমস্ত প্রতিলিপি<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.

ভিন্নভাবে প্রকাশ করা বিশ্লেষণ জিন (DGEs) বিশ্লেষণ

StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>2 আলাদাভাবে প্রকাশিত জিন হিসাবে বিবেচিত হয়েছিল।

লক্ষ্য জিন পূর্বাভাস এবং lncRNAs এর কার্যকরী বিশ্লেষণ

lncRNAs-এর কার্যকারিতা অন্বেষণ করতে, আমরা lncRNAs-এর cis-টার্গেট জিনগুলির পূর্বাভাস দিয়েছি। LncRNAs প্রতিবেশী টার্গেট জিনের উপর কাজ করার ক্ষেত্রে একটি cis ভূমিকা পালন করতে পারে। এই গবেষণায়, পার্ল স্ক্রিপ্ট দ্বারা 100,000 আপস্ট্রিম এবং ডাউনস্ট্রীমের কোডিং জিন নির্বাচন করা হয়েছিল। তারপরে, আমরা BLAST2GO [৩৯] স্ক্রিপ্টগুলি ব্যবহার করে lncRNA-এর লক্ষ্য জিনের একটি কার্যকরী বিশ্লেষণ দেখিয়েছি। পাবলিক ডোমেনের সম্পূর্ণ কমান্ড লিঙ্ক ছিল Jie-Li/README.md প্রধান · dandan-li/Jie-Li (github.com) এ।

জিন অন্টোলজি (জিও) বিভাগ এবং জিন এবং জিনোমের কিয়োটো এনসাইক্লোপিডিয়া (কেইজিজি) বিশ্লেষণ

আরএনএ সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য বায়োইনফরমেটিক্স বিশ্লেষণ OmicStudio টুলস (http://www.omicsudio. cn/tool) ব্যবহার করে সম্পাদিত হয়েছিল। জিন অন্টোলজি (জিও) কার্যকরী সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণ এবং জিন এবং জিনোমের কিয়োটো এনসাইক্লোপিডিয়া (কেইজিজি) [৩৭-৩৯] সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণ ভবিষ্যদ্বাণীকৃত লক্ষ্য জিনের জৈবিক কার্যাবলী বিশ্লেষণ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। GO বিশ্লেষণ তিনটি দিক দিয়ে প্রধান জৈবিক প্রক্রিয়াগুলিকে স্পষ্ট করে: কোষের গঠন, আণবিক ফাংশন এবং জৈবিক প্রক্রিয়া (http://www.geneontology. org/)। বিশ্লেষণ frst সমস্ত ভিন্নভাবে প্রকাশিত জিন এবং পটভূমি জিনগুলিকে GO ডাটাবেসে রাখে। প্রতিটি আইটেম ম্যাপ করা হয়, প্রতিটি আইটেমের জিনের সংখ্যা গণনা করা হয়, এবং হাইপারজিওমেট্রিক ডিস্ট্রিবিউশনটি সমৃদ্ধকরণ ফলাফলের P মান পেতে হাইপোথিসিস পরীক্ষা করতে ব্যবহৃত হয়। P মান যত কম হবে, সমৃদ্ধকরণের ফলাফল তত বেশি তাৎপর্যপূর্ণ। কেইজিজি হল একটি ডাটাবেস সংস্থান যা লক্ষ্য জিনের সাথে সম্পর্কিত গুরুত্বপূর্ণ পথগুলি (https://www.genome.jp/kegg/) অন্বেষণ করতে জেনেটিক জীববিজ্ঞানের দ্বারা পৃথকভাবে প্রকাশিত mRNA গুলিকে বিশ্লেষণ করে। ফলাফল p-মান দ্বারা প্রকাশ করা হয়; পি-মান যত কম হবে, সমৃদ্ধকরণের ফলাফল তত বেশি তাৎপর্যপূর্ণ।

qRT-PCR

GAPDH অন্তঃসত্ত্বা নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। তারপরে, অজানা জিনের আপেক্ষিক অভিব্যক্তি স্তরগুলি গণনা করা হয়েছিল। সমস্ত প্রাইমারগুলি এই পরীক্ষার জন্য বিশেষভাবে ডিজাইন এবং সংশ্লেষিত হয়েছিল। GAPDH-এর জন্য প্রাইমার বাণিজ্যিকীকরণ করা হয়েছে। Adra1a এবং Csnk1a1 প্রাইমারগুলির নির্দিষ্টতা গলিত বক্ররেখার একক শিখর দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল।

mRNA-lncRNA কো-এক্সপ্রেশন নেটওয়ার্ক তৈরি করুন

ট্রান্সরেগুলেশন গবেষণার উপর ভিত্তি করে ছিল, এবং তারপর ট্রান্স শক্তি গণনা করা হয়েছিল। ট্রান্স শক্তি যত কম ছিল, বাঁধার সম্ভাবনা তত বেশি। তারপর, mRNA-lncRNA এর পারস্পরিক সম্পর্ক সহগও গণনা করা হয়েছিল। mRNA-lncRNA নেটওয়ার্কটি 0.9 অতিক্রমকারী একটি স্পিয়ারম্যান পারস্পরিক সম্পর্ক সহগ বেছে নিয়ে তৈরি করা হয়েছিল। mRNA-lncRNA কো-এক্সপ্রেশন নেটওয়ার্ক সাইটোস্কেপ সফ্টওয়্যার (v3.7.1) ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল।

সেল সংস্কৃতি

মাউস রেনাল প্রক্সিমাল টিউবুলার এপিথেলিয়াল কোষ (MRPT-EpiCs) এপিথেলিয়াল কোষ মাঝারি-প্রাণী (EpiCM-a, Cat. #4131) 2% ভ্রূণের বোভাইন সিরাম (FBS, Cat. #0010) এবং এপিথেলিয়াল সেল গ্রোথ সাপ্লিমেন্ট-এ সংস্কৃত করা হয়েছিল। (EpiCGS-a, Cat. #4182) 37 ডিগ্রী এবং 5% CO2 এ আর্দ্র ইনকিউবেটরে অ্যান্টিবায়োটিক ছাড়াই। প্রতি 2-3 দিনে সংস্কৃতির মাধ্যম পরিবর্তন করা হয়। লগারিদমিক বৃদ্ধি পর্বের কোষগুলি উপ-সংস্কৃতি করা হয়েছিল যখন বৃদ্ধি 90% এ পৌঁছেছিল। ট্রিপসিন দ্বারা পরিপাককৃত কোষ সাসপেনশনটি প্রতিটি কূপে 2*104 -5*104টি কোষ সহ 6-কূপ প্লেটে বীজ করা হয়েছিল। স্থানান্তরের জন্য ব্যবহৃত কোষগুলি 2 থেকে 5 প্রজন্মের মধ্যে ছিল।

প্লাজমিড নির্মাণ এবং কোষ স্থানান্তর

lncRNA Gm43360 ওভার এক্সপ্রেশন প্লাজমিড GeneChem (সাংহাই, চীন) দ্বারা নির্মিত হয়েছিল। প্লাজমিড ব্যাকবোন ছিল GV658, এবং CMV প্রোমোটার lncRNA এক্সপ্রেশন চালায়। ক্লোন নিউক্লিওটাইড ক্রম পরিপূরক উপাদানে প্রদান করা হয়। lncRNA Gm43360 নকডাউনের জন্য, তিনটি lncRNA ENS অবশ্যই siRNAs00000197656-লক্ষ্যিত করতে হবে (lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3'; lncRNA Gm',}9CCACCUCAU2{9} UGAAGUUTT-3'; এবং lncRNA Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAAUAACUCAAUGGGTT-3') GeneFharma (সাংহাই, চীন) এ ডিজাইন ও সংশ্লেষিত করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে, কোষগুলি প্রতি কূপে 2500 ng প্লাজমিড বা 100 pmol siRNA দিয়ে 6 μl Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent (Invitrogen, USA) দিয়ে স্থানান্তরিত হয়েছিল। আরএনএ এবং প্রোটিন এক্সপ্রেশন স্তরগুলি স্থানান্তরের পরে 48 ঘন্টায় সনাক্ত করা হয়েছিল এবং প্রতিটি পরীক্ষা কমপক্ষে তিনবার পুনরাবৃত্তি হয়েছিল। lncRNA Gm43360 ওভার এক্সপ্রেশন এবং নকডাউনের দক্ষতা যাচাই করতে রিয়েল-টাইম পরিমাণগত পিসিআর ব্যবহার করা হয়েছিল।

ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ

সংস্কৃত কোষগুলিকে বরফ-ঠান্ডা পিবিএস দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল, 120 μl RIPA বাফার (হার্ট, চীন) যোগ করা হয়েছিল এবং বরফের উপর 30 মিনিটের জন্য প্রোটেস ইনহিবিটর এবং পিএমএসএফ (হার্ট, চীন) যুক্ত করা হয়েছিল। বিভিন্ন মাইক্রোসেন্ট্রিফিউজ টিউবে কোষ সংগ্রহ করার পরে, প্রোটিনের ঘনত্ব পরিমাপ করা হয়েছিল। লোডিং বাফার প্রতিটি নমুনায় যোগ করা হয়েছিল এবং তারপরে 7 মিনিটের জন্য সিদ্ধ করা হয়েছিল। নমুনার ত্রিশ মাইক্রোগ্রাম 12% SDS-PAGE (Beyotime, China) দ্বারা আলাদা করা হয়েছিল এবং PVDF ঝিল্লিতে (থার্মো ফিশার, USA) ইলেক্ট্রোট্রান্সফার করা হয়েছিল। তারপর, ঝিল্লি 5% দুধ দিয়ে ব্লক করা হয়েছিল। মেমব্রেনগুলি নির্দিষ্ট প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলির সাথে ইনকিউবেট করা হয়েছিল: অ্যান্টি-p21 (1:1000, Abcam, ab109199), অ্যান্টি-p53 (1:1000, প্রোটিনটেক, 10442-1-AP), এবং অ্যান্টি-GAPDH (1:3000, Profintech , 60004-1-Ig) সারারাত 4 ডিগ্রীতে। টিবিএসটি দিয়ে ধোয়ার পরে, ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য ঝিল্লিগুলি একটি সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। কেমিলুমিনেসেন্স কিট (মিলিপুর, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) ব্যবহার করে প্রোটিন ব্যান্ডগুলি পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। GAPDH এর অভিব্যক্তিটি প্রোটিনের মাত্রা স্বাভাবিক করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।

কোষের বিস্তার পরীক্ষা

কোষের বিস্তারের ক্ষমতা সেল কাউন্টিং কিট-8 (CCK-8) অ্যাস দ্বারা নির্ধারিত হয়েছিল। ট্রান্সফেকশনের আটচল্লিশ ঘণ্টা পর, প্রতিটি কূপে 90 μl নতুন মাধ্যম এবং 10 μl CCK-8 দ্রবণ যোগ করা হয়েছিল (Beyotime, C0042)। কোষগুলি 5% CO2-তে 37 ডিগ্রিতে 1-4 ঘন্টার জন্য ধূসরিত হয়েছিল এবং একটি সর্বজনীন মাইক্রোপ্লেট রিডার (বায়ো-টেক, ইউএসএ) দ্বারা 450 এনএম পরিমাপ করা হয়েছিল।

ফ্লো সাইটোমেট্রিক বিশ্লেষণ

কোষগুলি স্থানান্তরের আগের দিন 6-ওয়েল প্লেটে প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল৷ ট্রান্সফেকশনের আটচল্লিশ ঘন্টা পরে, কোষগুলিকে ট্রাইপসিনাইজ করা হয়েছিল এবং 5 মিনিটের জন্য 1000 আরপিএম-এ সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। তারপরে, কোষগুলি কমপক্ষে 4 ঘন্টার জন্য 4 ডিগ্রিতে 70% ইথানলে স্থির করা হয়েছিল। সেন্ট্রিফিউগেশনের পরে, RNase A এবং প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড (PI) স্টেনিং দ্রবণ কোষগুলিতে যোগ করা হয়েছিল এবং কোষগুলিকে অন্ধকারে ঘরের তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল। টি-দাগযুক্ত কোষগুলি একটি ACEA NovoCyte (বায়োসায়েন্সেস, USA) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

পরিসংখ্যান সংক্রান্ত বিশ্লেষণ

স্বাভাবিক বন্টন দ্বারা পরিমাপ ডেটা গড় ± SD হিসাবে উপস্থাপিত হয়। দুটি ভিন্ন গোষ্ঠীর মধ্যে পার্থক্য দুই-টেইলড আনপেয়ারড স্টুডেন্টস টি-টেস্ট ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল, এবং একটি p-মান < 0.05 পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল। সমস্ত গণনা গ্রাফপ্যাড প্রিজম 8 (গ্রাফপ্যাড সফ্টওয়্যার, ইনক।, ইউএসএ) ব্যবহার করে করা হয়েছিল।

তথ্যসূত্র

1. Docherty MH, O'Sullivan ED, Bonventre JV, Ferenbach DA। কিডনিতে সেলুলার সেন্সেন্স। জে এম সোক নেফ্রোল। 2019;30(5):726–36।

2. প্যাট্রিজ এল, ডিলেন জে, স্ল্যাগবুম পিই। বার্ধক্যের বৈশ্বিক চ্যালেঞ্জ মোকাবেলা করা। প্রকৃতি। 2018;561(7721):45–56।

3. প্যান জেএক্স। LncRNA H19 MAPK এবং NF-kB সংকেত পথ নিয়ন্ত্রণ করে এথেরোস্ক্লেরোসিস প্রচার করে। Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2017;21(2):322–8।

4. Wasson CW, Abignano G, Hermes H, Malaab M, Ross RL, Jimenez SA, Chang HY, Feghali-Bostwick CA, Del Galdo F. দীর্ঘ নন-কোডিং RNA HOTAIR সিস্টেমিক ক্ষেত্রে EZH2-নির্ভর মায়োফাইব্রোব্লাস্ট সক্রিয়তা চালায় নচের miRNA 34a-নির্ভর সক্রিয়করণের মাধ্যমে স্ক্লেরোসিস। অ্যান রিউমেটিক ডিস। 2020;79(4):507–17।

5. Luo J, Wang K, Yeh S, Sun Y, Liang L, Xiao Y, Xu W, Niu Y, Cheng L, Maity SN, et al. LncRNA-p21 এন্টিএন্ড্রোজেন এনজালুটামাইড-প্ররোচিত প্রোস্টেট ক্যান্সার নিউরোএন্ডোক্রাইন ডিফারেন্সিয়েশনকে EZH2/ STAT3 সিগন্যালিং মড্যুলেট করার মাধ্যমে পরিবর্তন করে। ন্যাট কমুন। 2019;10(1):2571।

6. Wang Y, Yang L, Chen T, Liu X, Guo Y, Zhu Q, Tong X, Yang W, Xu Q, Huang D, et al. একটি উপন্যাস lncRNA MCM3AP-AS1 miR-194-5p/FOXA1 অক্ষকে লক্ষ্য করে হেপাটোসেলুলার কার্সিনোমা বৃদ্ধির প্রচার করে। মোল ক্যান্সার। 2019;18(1):28।

7. Wu YY, Kuo HC। নিউরোডিজেনারেটিভ রোগের প্যাথোজেনেসিসে নন-কোডিং RNA-এর কার্যকরী ভূমিকা এবং নেটওয়ার্ক। জে বায়োমেড বিজ্ঞান। 2020;27(1):49।

8. লি জেড, ওয়াং জেড। বার্ধক্যজনিত কিডনি এবং বার্ধক্যজনিত রোগ। অ্যাডভ এক্সপেরিমেন্ট মেড বায়োল। 2018;1086:169–87।

9. Wang X, Vrtiska TJ, Avula RT, Walters LR, Chakkera HA, Kremers WK, Lerman LO, Rule AD. বয়স, কিডনির কার্যকারিতা এবং ঝুঁকির কারণগুলি কিডনির কর্টিকাল এবং মেডুলারি ভলিউমের সাথে ভিন্নভাবে যুক্ত। কিডনি Int. 2014;85(3):677–85।

10. Lin Q, Hou S, Dai Y, Jiang N, Lin Y. LncRNA HOTAIR RAB3IP এর মাধ্যমে পারকিনসন রোগের অগ্রগতি প্রচার করতে miR-126-5p কে লক্ষ্য করে। বায়োল কেম। 2019;400(9):1217–28।

সাপোর্টিভ সার্ভিস অফ ওয়েসিস্তানচে- চীনের বৃহত্তম সিস্টানচে রপ্তানিকারক:

ইমেল:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/টেল:+86 15292862950

আরও স্পেসিফিকেশন বিশদ বিবরণের জন্য কেনাকাটা করুন:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop