অংশ 2: DHHC21 ঘাটতি সেপটিক আঘাতের সময় কিডনির কার্যকারিতা হ্রাস করে
May 10, 2022
যোগাযোগtina.xiang@wecistanche.com
আলোচনা
বর্তমান কাজে, আমরা সেপটিক আঘাতের সময় রেনাল পারফিউশন এবং ফাংশনের একটি অভিনব নিয়ন্ত্রক হিসাবে DHHC21 রিপোর্ট করি। আমাদের নতুন অনুসন্ধানগুলি নির্দেশ করে: (1) Zdhhc21devde? WT ইঁদুরের তুলনায় সেপটিক আঘাতের পরে ইঁদুরের ভাল কিডনি ফাংশন এবং কম কিডনি ক্ষতি প্রদর্শন করে;(2)DHHC21 কার্যকরী ঘাটতি রেনাল টিস্যু পারফিউশন, অক্সিজেন স্যাচুরেশন এবং সেপটিক ইনজুরিতে RBF সংরক্ষণ করে;(3)DHHC21-অনুঘটক অ্যালএআর পামিটোলেশন অ্যালআর সিগন্যালিং পাথওয়ে সক্রিয়করণ এবং রেনাল ধমনীর অ্যালএআর-প্ররোচিত সংকোচনের জন্য প্রয়োজনীয়। এই অধ্যয়নটি সেপটিক আঘাতের সময় রেনাল পারফিউশন এবং ফাংশন নিয়ন্ত্রণে নতুন যান্ত্রিক অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে। আমরা পরামর্শ দিই যে DHHC21 কার্যকরী ঘাটতি প্রতিরক্ষামূলক প্রভাব প্রদান করেকিডনি ফাংশনসেপ্টিক ইনজুরিতে এবং DHHC21-এর সেই বাধা মোকাবিলার জন্য একটি থেরাপিউটিক কৌশল হিসাবে কাজ করতে পারেরেনাল কর্মহীনতাসেপটিক আঘাতের সময়।
cistanche tubulosa নির্যাস উপকারিতা জানতে এখানে ক্লিক করুন
রেনাল টিস্যু হাইপোপারফিউশন/হাইপক্সিয়া সেপটিক ইনজুরির সময় রেনাল ডিসফাংশনের অন্যতম প্রধান কারণ3-5। মোট হিমোগ্লোবিনের দুর্বল MSOT সংকেত তীব্রতা, রেনাল টিস্যুতে অক্সিজেন স্যাচুরেশন হ্রাস এবং সেপটিক আঘাতের পরে RBF হ্রাস দ্বারা প্রমাণিত সিএলপির পরে আমরা ইঁদুরের মধ্যে রেনাল হাইপোপারফিউশন সনাক্ত করেছি। আমাদের অনুসন্ধানের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, কিডনিতে আঘাতপ্রাপ্ত সেপসিস রোগীদের পাশাপাশি সেপটিক ইনজুরি 7,10l1 এর বৃহৎ-প্রাণীর মডেলগুলিতে RBF-এর হ্রাস পরিলক্ষিত হয়েছে। এটি লক্ষণীয় যে বেশ কয়েকটি গবেষণায় দেখা গেছে যে রেনাল ডিসফাংশন অপরিবর্তিত সহ সেপসিস প্রাণীদের মধ্যে বিকাশ হতে পারে। বা এমনকি RBF334 বৃদ্ধি পেয়েছে। এই অসঙ্গত ফলাফলগুলি বিভিন্ন প্রাণীর মডেল এবং রক্ত প্রবাহ পরিমাপ করার জন্য ব্যবহৃত পদ্ধতিগুলির জন্য দায়ী করা যেতে পারে। উদাহরণস্বরূপ, যখন CLP-প্ররোচিত পলিমাইক্রোবিয়াল সেপটিক আঘাত সাধারণত ব্যবহার করা হয়, কিছু গবেষণায় Escherichia coli35 এর একটি শিরায় ইনজেকশন ব্যবহার করা হয়।
প্রোটিন পালমিটোলেশন সম্প্রতি প্রোটিন ফাংশনের একটি অভিনব নিয়ন্ত্রক হিসাবে রিপোর্ট করা হয়েছে, যা অনেক রোগের প্যাথোজেনেসিস এবং অগ্রগতির সাথে জড়িত। এটিকে প্রথমে শ্মিডট এট আল.৩৬৩৭ দ্বারা একটি নতুন ধরনের অনুবাদ-পরবর্তী পরিবর্তন হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছিল। লিপিড মেটাবলিজম সহ অসংখ্য শারীরবৃত্তীয় এবং প্যাথলজিকাল পরিস্থিতিতে পামিটোলেশন এবং পিএটি-এর ভূমিকা রিপোর্ট করা হয়েছে,ক্যান্সার, কার্ডিওভাসকুলার রোগ, এবং স্নায়বিক ব্যাধি23,0,4. যদিও পলিসিস্টিক কিডনি রোগ এবং কিডনি ক্যান্সারে পালমিটোলেশনের জড়িত থাকার কথা পূর্বে রিপোর্ট করা হয়েছে23., সেখানে PAT-এর কার্যকরী ভূমিকা পরীক্ষা করে খুব সীমিত গবেষণা হয়েছে।কিডনি রোগ, বিশেষত সেপটিক আঘাতের সময় কিডনি কর্মহীনতার ক্ষেত্রে। আমাদের সর্বোত্তম জ্ঞান অনুসারে, আমরাই প্রথম সেপটিক আঘাতে রেনাল ডিসফাংশনে DHHC2l এর ভূমিকা তদন্ত করেছি। আমাদের অনুসন্ধানগুলি ইঙ্গিত দেয় যে DHHC21-এর নিষেধাজ্ঞা কিডনির কার্যকারিতাকে ব্যাপকভাবে উদ্ধার করে এবং সেপটিক আঘাতে কিডনির গঠন সংরক্ষণ করে।
আমাদের গবেষণা Zdhhc21dp/d4 ব্যবহার করে? ইঁদুরগুলি দেখায় যে কিডনির কার্যকারিতার উপর DHHC21 কার্যকরী ঘাটতির উপকারী প্রভাবগুলি সেপটিক আঘাতের সময় রেনাল টিস্যু পারফিউশন উন্নত করার ক্ষমতার জন্য দায়ী। বেসাল অবস্থার অধীনে, Zdhhc21ewaeP ইঁদুরে লবণ/জলের ভারসাম্যহীনতা বা কিডনি কাঠামোগত/কার্যকরী ক্ষতির কোনো লক্ষণ দেখা যায় না। তবুও, DHHC21 লস-অফ-ফাংশন সেপটিক ইনজুরি-প্ররোচিত RBF এর হ্রাস, রেনাল পারফিউশন এবং রেনাল অক্সিজেন স্যাচুরেশনকে দমন করে। অত্যধিক রেনাল ভাসোকনস্ট্রিকশনের কারণে বর্ধিত রেনাল ভাস্কুলার প্রতিরোধকে সেপ্টিক ইনজুরিতে প্রতিবন্ধী রেনাল টিস্যু পারফিউশনের একটি প্রধান কারণ হিসাবে বিবেচনা করা হয় 6.9। আমাদের ফলাফলগুলি সেপটিক আঘাত-প্ররোচিত রেনাল টিস্যু হাইপোপারফিউশনের মধ্যস্থতায় অ্যালআর-এর জড়িত থাকার ইঙ্গিত দেয়, যেমন অ্যালএআর পামিটোলেশন বৃদ্ধি এবং সেপটিক আঘাতে অ্যালআর সংকেত পথের সক্রিয়করণ দ্বারা প্রমাণিত। যাইহোক, DHHC21 কার্যকরী ঘাটতি alARpalmitoylation বাধা দেয় এবং ফলস্বরূপ ALAR এর একটি ভোঁতা ক্ষমতা তার ডাউনস্ট্রিম ইফেক্টরকে সক্রিয় করতে এবং রেনাল ধমনীতে ফেনাইলেফ্রিন-প্ররোচিত ভাসোকনস্ট্রিকশনের মধ্যস্থতা করতে পারে।
"DHHC21 দ্বারা alAR ফাংশনের নিয়ন্ত্রণের অন্তর্নিহিত আণবিক প্রক্রিয়া এখনও সম্পূর্ণরূপে ব্যাখ্যা করা বাকি রয়েছে। DHHC21 ক্ষতি-অফ-ফাংশনের কারণে সৃষ্ট alAR ফাংশনের ত্রুটিকে alAR-এর গঠনগত পরিবর্তনের জন্য দায়ী করা যেতে পারে। অনেক GPCR তাদের উপযুক্ত করার জন্য palmitoylation উপর নির্ভর করে অন্তঃকোষীয় কনফর্মেশন, GPCR-এর সি-টার্মিনাল লেজের সংযুক্ত পালমিটেট চতুর্থ অন্তঃকোষীয় লুপ তৈরি করতে প্লাজমা মেমব্রেনে প্রবেশ করে, যা তাদের অংশীদার প্রোটিনের সাথে GPCR-এর মিথস্ক্রিয়া এবং GPCR সংকেত 17,4 প্রচারের জন্য অপরিহার্য। পূর্ববর্তী একটি গবেষণা ইঙ্গিত দিয়েছে যে অ্যালবারের পালমিটোলেশন তার সি-টার্মিনাল অঞ্চলেও ঘটে 44৷ অতএব, DHHC21-মধ্যস্থ lAR palmitoylation এর অভাব অ্যালারের অন্তঃকোষীয় গঠনকে পরিবর্তন করতে পারে, এইভাবে lAR সংকেতগুলির প্রচারকে অবরুদ্ধ করে৷ এটি সমর্থন করা যেতে পারে৷ আমাদের ফলাফল দ্বারা দেখা যাচ্ছে যে ERK-এর সক্রিয়করণ, alAR অ্যাক্টিভেশনের একটি ডাউনস্ট্রিম সিগন্যালিং ইভেন্ট, Zdhhc21 ডেভিডার ইঁদুরের মধ্যে বাধাপ্রাপ্ত আইসি আঘাত। যাইহোক, এলএআর কার্বক্সিল-টার্মিনালের ডিএইচএইচসি21-নিয়ন্ত্রিত টপোলজিকে এক্স-রে ক্রিস্টালোগ্রাফি ব্যবহার করে আরও নিশ্চিত করতে হবে।
আমাদের অধ্যয়নের আরেকটি অভিনব দিক হল সেপটিক আঘাতের সময় কিডনি পারফিউশন এবং ফাংশন মূল্যায়ন করতে MSOT এর ব্যবহার। MSOT বিভিন্ন অঙ্গের পারফিউশন পরিমাপ করার জন্য একটি লেবেল-মুক্ত পদ্ধতি এবং কিডনির কার্যকারিতা 2832,45 নির্ধারণের জন্য একটি নির্ভরযোগ্য ইমেজিং কৌশল হিসাবে রিপোর্ট করা হয়েছে। ডপলার ফ্লোমিটারের তুলনায় যা মাইক্রোভাস্কুলেচার 45 এর ভিজ্যুয়ালাইজেশনের অনুমতি দেয় না, MSOT 150 um এ উচ্চ স্থানিক রেজোলিউশন সহ চিত্র তৈরি করে যখন কিডনি মাইক্রোভাস্কুলেচারে পারফিউশন অবস্থার একটি পরিমাণগত মূল্যায়ন প্রদান করে। জলে দ্রবণীয় IRDye800CW হল একটি নিরাপদ ট্রেসার যা রেনাল ক্লিয়ারেন্স পরিমাপের জন্য ব্যবহার করা যায় এবং এটি 20 মিলিগ্রাম/কেজির মতো উচ্চ মাত্রায় বিষাক্ততা সৃষ্টি করে না। আমরা পর্যবেক্ষণ করেছি IRDye800CW এর দুই-পর্যায়ের আন্দোলন পূর্বে প্রকাশিত গবেষণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। আমাদের MSOT রেকর্ডিংগুলি সেপসিস কিডনিতে একটি বৃহত্তর Tmax-বিলম্বের ইঙ্গিত দেয়, যা প্রতিবন্ধী রেনাল ক্লিয়ারেন্সের পরামর্শ দেয়। একটি নেফ্রোপ্যাথি গবেষণা দেখায় যে MSOTis দ্বারা সনাক্ত করা প্রতিবন্ধী রেনাল ফাংশন গ্লোমেরুলার হিস্টোলজিক্যাল ক্ষতির সাথে উল্লেখযোগ্যভাবে সম্পর্কযুক্ত। আমাদের ডেটা, পূর্ববর্তী প্রকাশনাগুলির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, পরামর্শ দেয় যে এমএসওটি রেনাল পারফিউশন এবং ফাংশন নিরীক্ষণের জন্য একটি ন্যূনতম-আক্রমণকারী এবং নির্ভরযোগ্য কৌশল।
বর্তমানে, কোনো DHHC21-নির্দিষ্ট ইনহিবিটার উপলব্ধ নেই। সবচেয়ে বেশি ব্যবহৃত PAT ইনহিবিটর হল 2-BP যা একাধিক DHHC-এর উপর ব্যাপক প্রভাব ফেলে এবং ফ্যাটি অ্যাসিড বিপাকের ক্ষেত্রেও হস্তক্ষেপ করে47৷ এইভাবে, বিশেষভাবে DHHC21 কে লক্ষ্য করে এমন ছোট মলিকিউল ইনহিবিটারগুলির বিকাশ একটি আশাব্যঞ্জক দিক হতে পারে৷ এটাও উল্লেখ করার মতো যে alAR DHHC21 এর একমাত্র সাবস্ট্রেট নয়। প্লেটলেট এন্ডোথেলিয়াল সেল অ্যাডেসন মলিকিউল (PFCA M-1), ইস্ট্রোজেন রিসেপ্টর ক্যাভিওলিন-1, এন্ডোথেলিয়াল নাইট্রিক অক্সাইড সিন্থেস (eNOS), Fyn, সুপারঅক্সাইড ডিসম্যুটেজ (SOD{{) সহ আরও কয়েকটি DHHC21 সাবস্ট্রেট সম্প্রতি সনাক্ত করা হয়েছে 8}}), এবং PLCB122,41,4s,49, বর্তমান অধ্যয়নের সুযোগের বাইরে থাকাকালীন, আমরা সেপটিক আঘাতের সময় এই সাবস্ট্রেটগুলি রেনাল ফাংশনকেও প্রভাবিত করতে পারে এমন সম্ভাবনাকে উড়িয়ে দিতে পারি না।
উপসংহারে, বর্তমান অধ্যয়নটি প্রথমবারের মতো দেখায় যে DHHC21 সেপটিক আঘাতের সময় অ্যালএআর পামিটোলেশন এবং অ্যালএআর-মধ্যস্থ ভাসো-সংকোচন জড়িত প্রক্রিয়াগুলির মাধ্যমে রেনাল পারফিউশন নিয়ন্ত্রণে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। অধিকন্তু, DHHC21-এর বাধা সেপটিক আঘাতের সময় রেনাল ফাংশনে প্রতিরক্ষামূলক প্রভাব ফেলে।
উপকরণ এবং পদ্ধতিসমূহ
বিকারক. সমস্ত রিএজেন্ট পরিপূরক সারণি S1 এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে।
প্রাণী. Zdhhc21depher ইঁদুর এবং তাদের বন্য-টাইপ নিয়ন্ত্রণ ইঁদুর (B6C3Fe) জ্যাকসন ল্যাবরেটরি থেকে কেনা হয়েছিল। Zdhhc21dephe এর জিনোটাইপ? ইঁদুরগুলি সিকোয়েন্সিং দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল (জেনউইজ, ইনক।, এনজে, ইউএসএ)। সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য ব্যবহৃত প্রাইমারগুলি হল: AGCTGACTGAAGGGCACC (ফরোয়ার্ড) এবং AAAACCTGTAACGCATTTCCA (বিপরীত)23। খাবার এবং জলের বিনামূল্যে অ্যাক্সেস সহ 12/12-ঘন্টা আলো/অন্ধকার চক্রের অধীনে প্রাণীদের রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল। এই গবেষণার জন্য উভয় লিঙ্গের ইঁদুর (16-20 সপ্তাহ) ব্যবহার করা হয়েছিল। সমস্ত প্রাণী পরীক্ষা-নিরীক্ষা সাউথ ফ্লোরিডা বিশ্ববিদ্যালয়ের ইনস্টিটিউশনাল অ্যানিমাল কেয়ার অ্যান্ড ইউজ কমিটি দ্বারা অনুমোদিত এবং পরীক্ষাগারের যত্ন ও ব্যবহারের জন্য NIH নির্দেশিকা মেনে চলে
Cecal ligation এবং puncture, Isoflurane (3 শতাংশ আনয়ন এবং 1 শতাংশ রক্ষণাবেক্ষণ) দিয়ে ইঁদুরকে অবেদন দেওয়া হয়েছিল। শেভ করা পেটের অঞ্চলে একটি মধ্যরেখার ছেদ তৈরি করা হয়েছিল, এবং সিকামটি বহির্মুখী করা হয়েছিল, 5 মিমি ইলিওসেকাল ভালভের নীচে শক্তভাবে বন্ধন করা হয়েছিল এবং লাইগেশনের বিন্দুতে একটি 20-গজ সুই দিয়ে দুবার ছিদ্র করা হয়েছিল। প্রতিটি পাংচার গর্ত থেকে এক মিমি মল বের করা হয়েছিল। সিকামটি তখন পুনঃস্থাপিত হয়েছিল এবং পেট দুটি স্তরে বন্ধ ছিল। 37 সি ল্যাকটেড রিঙ্গার দ্রবণটি সেকাম শুকানো থেকে রক্ষা করার জন্য টপিক্যালি প্রয়োগ করা হয়েছিল। তারপরে তরল পুনরুত্থানের জন্য ইঁদুরকে 37 ডিগ্রি 0.9 শতাংশ স্যালাইন দেওয়া হয়েছিল। একটি প্রিঅপারেটিভ 0।{9}}.5 মিগ্রা/কেজি ডোজ বুপ্রেনরফিন সাসটেইন্ড-রিলিজ অ্যানালজেসিয়ার জন্য দেওয়া হয়েছিল। শাম ইঁদুর একই অস্ত্রোপচার পদ্ধতির শিকার হয়েছিল কিন্তু সিকাল লাইগেশন এবং পাংচার 50,51 ছাড়াই।
মাল্টিস্পেকট্রাল অপটোঅ্যাকোস্টিক টমোগ্রাফি. IRDye800CW-এর রেনাল ক্ষরণের মূল্যায়ন। ইঁদুরকে আইসোফ্লুরেন এর মাধ্যমে চেতনানাশক করা হয়েছিল এবং ধড় অঞ্চলের চারপাশে ক্ষয় করা হয়েছিল। একাধিক তরঙ্গদৈর্ঘ্য:700,730,760,775,785, 800,850 nm 10 ফ্রেম/সেকেন্ড হারে Altera মেডিকেল MSOT ইমেজিং সিস্টেম (মিউনিখ, জার্মানি) ব্যবহার করে ইঁদুরগুলিকে চিত্রিত করা হয়েছিল। ইঁদুরগুলিকে একটি ধারকের মধ্যে একটি সুপাইন অবস্থানে রাখা হয়েছিল এবং ফিক্স-অবতল ট্রান্সডুসারের উপরে কিডনিগুলিকে স্থাপন করার জন্য অনুভূমিক রৈখিক স্তর বরাবর সরানো হয়েছিল। বেসলাইন রেকর্ডিংয়ের পরে, 0.9 শতাংশ স্যালাইনে দ্রবীভূত RDve800CW-এর 60 nmol l0 সেকেন্ড সময়ের মধ্যে শিরায় ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। ব্যাক-প্রোজেকশন সূত্র ব্যবহার করে চিত্রগুলি পুনর্গঠন করা হয়েছিল এবং মাল্টিস্পেকট্রাল বিশ্লেষণের সাথে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল। আগ্রহের অঞ্চলগুলি (ROIs) রেনাল কর্টেক্স এবং মেডুলা/পেলভিস অঞ্চলের চারপাশে আঁকা হয়েছিল এবং ROIগুলিতে MSOT সংকেতের সাময়িক পরিবর্তনগুলি চিত্রিত করা হয়েছিল।
Measurement of renal perfusion. Mice were prepared for MSOT imaging utilizing the same procedures mentioned above. Mouse respiration was closely monitored throughout the entire procedure. Images were reconstructed and spectral unmixing was performed. ROIs were drawn around the entire right kidney region. Mean pixel intensities of oxygenated hemoglobin (HbO,) and deoxygenated hemoglobin (Hb) were acquired. Total hemoglobin (HbT=HbO,+ Hb) and oxygen saturation (So=HbO, /HbT) were then calculated>2.
কিডনি হিস্টোপ্যাথলজি. কিডনি স্থির করা হয়েছিল, ধনুকের সমতল বরাবর কাটা হয়েছিল এবং প্যারাফিন এম্বেডিংয়ের জন্য প্রক্রিয়া করা হয়েছিল। বিভাগগুলি (5 μm) ডি-প্যারাফিনাইজড, রিহাইড্রেটেড এবং 8 মিনিটের জন্য কক্ষ তাপমাত্রায় (RT) পর্যায়ক্রমিক অ্যাসিড দিয়ে অক্সিডাইজ করা হয়েছিল, তারপরে 25 মিনিটের জন্য শিফের দ্রবণ দিয়ে ইনকিউবেশন করা হয়েছিল। তারপরে বিভাগগুলিকে হেমাটোক্সিলিন দিয়ে প্রতিস্থাপন করা হয়েছিল। Keyence BZ-X710 (Itasca, IL, USA) ব্যবহার করে ছবিগুলো ধারণ করা হয়েছে। রেনাল স্ট্রাকচারাল ক্ষতি নিম্নলিখিত বৈশিষ্ট্যগুলির উপর ভিত্তি করে মূল্যায়ন করা হয়েছিল: গ্লোমেরুলার অস্বাভাবিকতা, প্রক্সিমাল টিউবুলের ব্রাশ বর্ডার হারানো, ভ্যাকুওলেশন, টিউবুল এপিথেলিয়ামের প্রসারণ, টিউবুলার কোষ বিচ্ছিন্নতা/নেক্রোসিস এবং নিউট্রোফিল অনুপ্রবেশ। প্রতিটি বৈশিষ্ট্য তীব্রতার উপর ভিত্তি করে 0-5 এর স্কেলে গ্রেড করা হয়েছিল।
ক্রিয়েটিনিন এবং রক্তের ইউরিয়া নাইট্রোজেনের পরিমাপ. সেপটিক আঘাতের 24 ঘন্টা পরে কার্ডিয়াক পাংচারের মাধ্যমে মাউসের রক্ত সংগ্রহ করা হয়েছিল। RT-এ 15 মিনিটের জন্য 2500g এ রক্ত সেন্ট্রিফিউজ করে প্লাজমা তৈরি করা হয়েছিল। ক্রিয়েটিনিনের পরিমাপ: একটি 10-kDa স্পিন কলাম ব্যবহার করে প্লাজমা ডিপ্রোটিনাইজ করা হয়েছিল; ফিল্টারে ক্রিয়েটিনিনের মাত্রা তারপর একটি ক্রিয়েটিনাইন অ্যাসে কিট ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়। রক্তের ইউরিয়া নাইট্রোজেনের মাত্রা (BUN) একটি ইউরিয়া নাইট্রোজেন কালোরিমেট্রিক ডিটেকশন কিট ব্যবহার করে প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসরণ করে নির্ধারণ করা হয়েছিল।
RBF এবং MAP এর পরিমাপ. আইসোফ্লুরেন ব্যবহার করে ইঁদুরকে অবেদন দেওয়া হয়েছিল। রক্তচাপ ট্রান্সডুসার ক্যারোটিড ধমনীতে ক্যানুলেট করা হয়েছিল। পেটের অঞ্চলে একটি মধ্যরেখার ছেদ তৈরি করা হয়েছিল এবং তারপরে রেনাল ধমনীটি উন্মুক্ত করার জন্য একটি বাম ট্রান্সভার্স ছেদ করা হয়েছিল। RBF একটি আল্ট্রাসাউন্ড ট্রানজিট-টাইম ফ্লোমিটার (TS-420; Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA) ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল। উন্মুক্ত রেনাল ধমনীর চারপাশে ফ্লো প্রোব রাখার পরে, ইঁদুরগুলিকে কমপক্ষে 30 মিনিটের জন্য স্থিতিশীল হতে দেওয়া হয়েছিল। RBF এবং MAP একই সাথে PowerLab (AD Instruments, Colorado Springs, CO, USA) ব্যবহার করে রেকর্ড করা হয়েছিল। ল্যাবচার্ট প্রো সংস্করণ 7 সফ্টওয়্যার 4,55 ব্যবহার করে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল
রজন-সহায়তা ক্যাপচার. রেনাল ধমনীগুলি লাইসিস বাফারে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং লাইসিস করা হয়েছিল (100 মিমি HEPES.25 মিমি NaCl, 1 মিমি ইডিটিএ, 10 μM পালমোস্ট্যাটিন বি, প্রোটেজ ইনহিবিটরস, pH 7.4）22, 56. টিস্যু লাইসেটগুলিকে ব্লকিং বাফার (100 mM HEPES.1 mM EDTA, 2.5 শতাংশ SDS, 6 ul/ml MMTS, pH 7.4) 50 ডিগ্রি সেন্টিগ্রেডে 30 মিনিটের জন্য ধ্রুবক ঘূর্ণি সহকারে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। ঠান্ডা অ্যাসিটোন দিয়ে প্রস্রাব করার পরে, প্রোটিন ছিল 30 মিনিটের জন্য 5000g এ সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে পেলট করা হয় এবং 70 শতাংশ কোল্ড অ্যাসিটোন দিয়ে পাঁচবার ধুয়ে ফেলা হয়। প্রোটিন পেলেটগুলিকে বাইন্ডিং বাফারে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল (100 মিমি HEPES, 1.0 শতাংশ SDS, 1 মিমি ইডিটিএ, pH 7.4)। প্রোটিনের ঘনত্ব এবং স্বাভাবিক গোষ্ঠীর মধ্যে নির্ধারণ করা হয়েছিল। প্রতিটি প্রোটিন নমুনা দুটি সমান অংশে বিভক্ত ছিল প্রত্যেকে সমান পরিমাণে আইসোপ্রোপাইল সেফারোজ 6B পুঁতি, হাইড্রক্সভ্যামিন (0.2 M, pH 7.4), এবং NaCl (0.2 M) যথাক্রমে প্রতিটি অংশে যোগ করা হয়েছিল। RT এ ইনকিউবেশনের 4 ঘন্টা পরে ধ্রুবক ঘূর্ণন সহ, 1×নমুনা বাফারে 50 মিমি ডিটিটি দিয়ে পামিটোয়েলেটেড প্রোটিনগুলিকে নির্গত করা হয়েছিল এবং SDS-পৃষ্ঠার জন্য সংগ্রহ করা হয়েছিল।
পশ্চিমা শোষক. palmitoylated lAR পরিমাপ. RAC থেকে সংগৃহীত নমুনাগুলি একটি 4-20 শতাংশ Tris-Glycine জেলে লোড করা হয়েছিল এবং ইলেক্ট্রোফোরসিসের পরে একটি নাইট্রোসেলুলোজ ঝিল্লিতে স্থানান্তরিত হয়েছিল৷ RT-এ 1 ঘন্টা ব্লক করার পরে, 4 ডিগ্রীতে রাতারাতি খরগোশের অ্যান্টি-এলআর প্রাথমিক অ্যান্টিবডি (1:500) দিয়ে alAR পরীক্ষা করা হয়েছিল। TBST দিয়ে তিনবার ধোয়ার পর, ঝিল্লিটি RT-এ 45 মিনিটের জন্য IRDye800CW গাধা অ্যান্টি-রবিট সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (1:20,{11}}) দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল।
ERK ফসফোরিলেশন পরিমাপ. রেনাল ধমনীগুলি প্রোটেজ এবং ফসফেটেস ইনহিবিটর ধারণকারী 1×RIPA তে লাইজ করা হয়েছিল। খরগোশের অ্যান্টি-ইআরকে (1:1000) এবং মাউস অ্যান্টি-ফসফরিলেটেড ERK (1:1000) অ্যান্টিবডি দিয়ে মেমব্রেনটি পরীক্ষা করা হয়েছিল। IRDye800CW গাধা অ্যান্টি-মাউস এবং IRDye680RD গাধা অ্যান্টি-রবিট অ্যান্টিবডি সেকেন্ডারি ইনকিউবেশনের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল (1:20,000)। Li-COR Odyssey CLx ব্যবহার করে ঝিল্লিগুলি চিত্রিত এবং বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
তারের মায়োগ্রাফের মাধ্যমে ভাসোরেক্টিভিটির মূল্যায়ন। মাউস রেনাল ধমনী। রেনাল ধমনী ({{0}} μm ব্যাস) WTand Zdhhc21dp/de ইঁদুর থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং বরফ-ঠান্ডা অক্সিজেনযুক্ত (95 শতাংশ O,/5 শতাংশ CO.) শারীরবৃত্তীয় লবণাক্ত দ্রবণে নিমজ্জিত হয়েছিল (PSS,13{ {47}} mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.18 mM KH,PO, 1.17 mM MgSO.7H,O, 14.9 mM NaHCO, 5.5 mM গ্লুকোজ, 0.026 mM EDTA, এবং 1.6 mM CaCl, pH 7.4 ~ (সেটমেন্ট)। 2 মিমি লম্বা) তারের মায়োগ্রাফ চেম্বারে (লিভিং সিস্টেম ইন্সট্রুমেন্টেশন, ভিটি, ইউএসএ) দুটি টাংস্টেন তারের মধ্যে (30 um ব্যাস) মাউন্ট করা হয়েছিল। LabScribe v4 iWorks সফ্টওয়্যারের সাথে মিলিত লিভিং সিস্টেম সিগন্যাল কন্ডিশনার (MYO-SC-1) ব্যবহার করে আইসোমেট্রিক টেনশন রেকর্ড করা হয়েছিল। 37 ডিগ্রী Cin PSS-এ 30 মিনিটের জন্য ভারসাম্য করার পরে, সর্বোত্তম অভ্যন্তরীণ পরিধি L,=0.9×L(Lo=অভ্যন্তরীণ পরিধি যা 100 mmHg এর ট্রান্সমুরাল চাপের সাথে মিলে যায়) নির্ধারণের জন্য স্বাভাবিককরণ প্রক্রিয়াটি সম্পাদিত হয়েছিল। . এরপরে, জাহাজের কার্যক্ষমতা 60 mMKPSS (74.7 mM NaCl, 60 mM KCl, 1.18 mM KH, PO.1.17 mM MgSO.7H, O, 14.9 mM NaHCO, 5.5 mM গ্লুকোজ, 0.026 mM EDMH, Ca. 7.4) যে ধমনীগুলি কেপিএসএসে সাড়া দেয়নি তাদের কার্ড বাতিল করা হয়েছিল। ফেনাইলেফ্রিন (10 nM-30 μM）) এর ক্রমবর্ধমান ঘনত্বের সাথে ধমনীগুলি চিকিত্সা করা হয়েছিল। এন্ডোথেলিয়াল অখণ্ডতা তখন অ্যাসিটাইলকোলিন (10 μM) ব্যবহার করে মূল্যায়ন করা হয়েছিল। ঘনত্ব-প্রতিক্রিয়া বক্ররেখা নির্মিত হয়েছিল।
মানুষের কিডনি থেকে ছোট ধমনী. ছোট ধমনী (~1000 um ব্যাস) অক্ষত কার্যকর মানব কিডনি থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল যেগুলি ট্রান্সপ্লান্ট সার্জারির জন্য প্রত্যাখ্যান করা হয়েছিল। ভেসেল সেগমেন্টগুলি (~2 মিমি লম্বা) তারের মায়োগ্রাফ চেম্বারের আই-বারগুলিতে (250 um ব্যাস) মাউন্ট করা হয়েছিল। মানব ধমনীতে অনুরূপ ভারসাম্য এবং স্বাভাবিকীকরণ পদ্ধতি সম্পাদিত হয়েছিল। এরপরে, ধমনীগুলি 1 ঘন্টার জন্য যানবাহন নিয়ন্ত্রণ (পিএসএস-এ 0.02 শতাংশ ডিএমএসও) দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। তারপরে জাহাজগুলিকে 60 মিমি কেপিএসএস দিয়ে কার্যক্ষমতার জন্য পরীক্ষা করা হয়েছিল এবং ফেনাইলেফ্রিন (10 nM-30 uM) এর ক্রমবর্ধমান ঘনত্বের সাথে চিকিত্সা করা হয়েছিল। ধোয়ার পর, পাত্রগুলিকে 1 ঘণ্টার জন্য 2-BP(100 uM) দিয়ে ইনকিউব করা হয়; তারপরে জাহাজের কার্যক্ষমতা আবার 60 মিমি KPSS এর সাথে 100 uM 2-BP দিয়ে পরীক্ষা করা হয়েছিল। কেপিএসএস-এ কোন বা কম প্রতিক্রিয়া সহ ছোট ধমনীগুলি বাতিল করা হয়েছিল। তারপরে ধমনীগুলিকে ফেনাইলেফ্রিনের একই ঘনত্বের সাথে চ্যালেঞ্জ করা হয়েছিল যার পরে অ্যাসিটাইলকোলিন (10 ইউএম)। যানবাহন নিয়ন্ত্রণ-বা 2-বিপি-চিকিত্সা ধমনীগুলির ঘনত্ব-প্রতিক্রিয়া বক্ররেখা তৈরি এবং তুলনা করা হয়েছিল।
ইমিউনোফ্লোরেসেন্স. মানুষের রেনাল ধমনী 10 শতাংশ ফরমালিন 48 ঘন্টার জন্য স্থির করা হয়েছিল, প্যারাফিন-এম্বেডেড, এবং বিভাগযুক্ত। তারপরে স্লাইডগুলিকে ডিপ্যারাফিনাইজড, রিহাইড্রেটেড এবং 0.05 শতাংশ ট্রাইটন এক্স-1002 ধারণকারী পিবিএসের মাধ্যমে ব্যাপ্ত করা হয়েছিল। ব্লক করার পরে, স্লাইডগুলিকে খরগোশ-বিরোধী DHHC21 এবং ছাগল-বিরোধী অ্যান্টিবডি (1:100) রাতারাতি 4 ডিগ্রি সেলসিয়াসে লেবেল করা হয়েছিল। ধোয়ার পরে, গাধা অ্যান্টি-র্যাবিট আলেক্সা ফ্লুর 488 এবং গাধা অ্যান্টি-গোট অ্যালেক্সা দিয়ে সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি ইনকিউবেশন করা হয়েছিল। ফ্লোর 568(1:500)। ডিএপিআই-এর সাথে প্রোলং ডায়মন্ড মাউন্টিং মিডিয়ামের সাথে মাউন্ট করার পরে, স্লাইডগুলিকে লেইকা SP8 স্পেকট্রাল ইনভার্টেড লেজার স্ক্যানিং কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ দিয়ে চিত্রিত করা হয়েছিল।
পরিসংখ্যান সংক্রান্ত বিশ্লেষণ. প্রতিটি পরিসংখ্যানগত পরীক্ষার জন্য বিশদ তথ্য (যেমন, পরীক্ষার নাম, পোস্ট-হক পরীক্ষা, n মান, আলফা স্তর, পি-মান) পরিপূরক সারণি S2 এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। সমস্ত ডেটা স্বাভাবিক বিতরণ অনুমান পূরণ করে। 0.05 এ আলফা স্তর সেট সহ শাপিরো-উইল্ক টেস্ট ব্যবহার করে স্বাভাবিকতা পরীক্ষা করা হয়েছিল। ছাত্রদের টি-টেস্ট (টু-টেইলড) ব্যবহার করে দুটি গ্রুপের মধ্যে তুলনা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল, এবং তিনটি গ্রুপ বা তার বেশিকে টুকি পোস্ট-হক বিশ্লেষণের সাথে ওয়ান-ওয়ে আনোভা-এর মাধ্যমে তুলনা করা হয়েছিল। তারের মায়োগ্রাফ কার্ভের তুলনা দ্বি-মুখী ANOVA.p ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল<0.05 was="" used="" for="" statistical="" significance.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0d="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" the="" actual="" values="" for="" all="" quantification="" results="" are="" listed="" in="" supplementary="" table="">
