অংশ 1: রেনাল Hsa-miR-127-3p এর ডাউনরেগুলেশন লুপাস নেফ্রাইটিসের কিডনিতে টাইপ I ইন্টারফেরন সিগন্যালিং পাথওয়ের অত্যধিক সক্রিয়করণে অবদান রাখে
May 07, 2022
আরও তথ্যের জন্য. যোগাযোগtina.xiang@wecistanche.com
মাইক্রোআরএনএগুলি সিস্টেমিক লুপাস এরিথেমাটোসাস (এসএলই) এর প্যাথোজেনেসিসের সাথে জড়িত এবং এর মধ্যে নিয়ন্ত্রণহীনকিডনিলুপাস নেফ্রাইটিস (এলএন) রোগীদের, কিন্তু এলএন-এ তাদের রোগগত ভূমিকা অনেকাংশে অজানা। Janus Kinase 1 (JAK1) অনেকের ডাউনস্ট্রিম সিগন্যালিং পাথওয়ের সক্রিয়করণের মধ্যস্থতা করেপ্রদাহজনকসাইটোকাইনস, টাইপ I ইন্টারফেরন (IFN-I) সিগন্যালিং পাথওয়ে সহ যা SLE এবং LN এর বিকাশের জন্য গুরুত্বপূর্ণ। এইভাবে, JAK1 এইগুলির জন্য একটি শক্তিশালী থেরাপিউটিক লক্ষ্যঅটোইম্মিউন রোগ. যাইহোক, অটোইমিউন রোগে JAK1 এর অনিয়ন্ত্রণ এবং এর পিছনে আণবিক প্রক্রিয়া প্রদর্শন করে এমন কয়েকটি গবেষণা রয়েছে। এই সংক্ষিপ্ত প্রতিবেদনে, আমরা hsa-miR-127-3p-এর একটি প্রতিরোধমূলক প্রভাব দেখাই, একটি মাইক্রোআরএনএ যা LN রোগীদের রেনাল টিস্যুতে, IFN-I সিগন্যালিং-এর উপর নিয়ন্ত্রিত হয়। আমরা খুঁজে পেয়েছি hsa-miR-127-3p-এর অত্যধিক এক্সপ্রেশন ISRE এবং GAS মধ্যস্থিত জিনের অভিব্যক্তি, STAT1 এবং STAT2-এর ফসফোরিলেশন, এবং IFN-I দ্বারা উদ্দীপিত IFN উদ্দীপিত জিনগুলির (ISGs) আপগ্র্যুলেশনকে বাধা দিতে পারে। যদিও hsa-miR-127-3পি প্রতিপক্ষ প্রাথমিক রেনাল মেসাঞ্জিয়াল কোষে IFN-I সংকেত সক্রিয়করণকে উন্নত করেছে। পরবর্তীকালে, আমরা JAK1-কে hsa-miR-127-3p-এর প্রকৃত লক্ষ্যবস্তু জিন হিসাবে চিহ্নিত করেছি এবং hsa-miR-127-3p লক্ষ্যবস্তু JAK1 কে এর 3'UTR এবং কোডিং অঞ্চলে আবদ্ধ করার মাধ্যমে দেখিয়েছি। ধারাবাহিকভাবে, আমরা দেখতে পেলাম যে Hsa-miR-127-3p-এর নিম্ননিয়ন্ত্রণ LN রোগীদের কিডনি টিস্যুতে JAK1 এবং ISGs-এর আপগ্র্যুলেশনের সাথে যুক্ত। আমাদের ডেটা নির্দেশ করে যে hsa-miR-127-3p এর রেনাল ডাউনরেগুলেশন JAK1-এর অভিব্যক্তি প্রচার করে LN রোগীদের কিডনিতে IFN-I সিগন্যালিং পথের অত্যধিক সক্রিয়করণে অবদান রাখে, hsa-miR-127-3p অনুকরণের পরামর্শ দেয় LN-এ JAK1 এবং IFN-I সিগন্যালিং পাথওয়েকে বাধা দিতে ব্যবহার করা যেতে পারে।
কীওয়ার্ড: microRNA, hsa-miR-127-3p, টাইপ I ইন্টারফেরন, জানুস কিনেস 1, সিস্টেমিক লুপাস এরিথেমাটোসাস, লুপাস নেফ্রাইটিস
সংযুক্ত তথ্য:
একাডেমিয়ায় বিদ্যমান গবেষণার তথ্য অনুসারে, এটি বিবেচনা করা যেতে পারে যে ঐতিহ্যগত চীনা ওষুধের ইমিউনোরেগুলেটরি ফাংশন এবং রেচক ফাংশনসিস্তানচেশরীরের রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা বাড়ানো এবং COVID-19 আক্রান্ত রোগীদের পুনরুদ্ধারের জন্য এর দুর্দান্ত ক্লিনিকাল তাৎপর্য রয়েছে। Cistanche দ্বারা ইমিউন ফাংশনের নিয়ন্ত্রণ প্রধানত নিম্নলিখিত বিষয়গুলির মাধ্যমে হয়:
শরীরের ইমিউন কোষগুলির কার্যকরী কার্যকলাপ বৃদ্ধি করে (ম্যাক্রোফেজ, ডেনড্রাইটিক কোষ, টি কোষ, বি কোষ, প্রাকৃতিক হত্যাকারী (এনকে) কোষ ইত্যাদি);
অ্যান্টিজেন প্রসেসিং, ফাগোসাইটোসিস এবং ইমিউন কোষের হত্যার ফাংশন বাড়ায়; ইমিউন কোষ দ্বারা সাইটোকাইন এবং অ্যান্টিবডির নিঃসরণ নিয়ন্ত্রণ করে;
কিছু পণ্ডিত সিস্তানচে নিয়ে গবেষণা করেছেনপলিস্যাকারাইডএকটি ভ্যাকসিন সহায়ক হিসাবে, এবং দেখা গেছে যে সিস্তানচে পলিস্যাকারাইডগুলি ইনফ্লুয়েঞ্জা ভাইরাস ভ্যাকসিনের হিউমারাল ইমিউন প্রতিক্রিয়ার সেলুলার ইমিউন প্রতিক্রিয়াকে উন্নত করতে পারে, এটি দেখায় যে সিস্তানচে পলিস্যাকারাইডগুলি শরীরের বৃদ্ধি করতে পারে।ইমিউন ফাংশন; বিশেষজ্ঞরা যাচাই করেছেন যে এটি প্রতিরোধ ক্ষমতা নিয়ন্ত্রণে ইতিবাচক প্রভাব ফেলে।
cistanche root এবং extract সম্পর্কে আরও জানতে ক্লিক করুন
ভূমিকা
সিস্টেমিক লুপাস এরিথেমাটোসাস (SLE) এর বিকাশের জন্য গুরুত্বপূর্ণ নির্দিষ্ট প্রদাহজনক সাইটোকাইনেসিসের অনুপযুক্ত এবং অত্যধিক উত্পাদন। এই প্যাথোজেনিক সাইটোকাইনের ডাউনস্ট্রিম সিগন্যালিং পাথওয়ের সক্রিয়করণকে ব্লক করা SLE(1) এর জন্য একটি প্রতিশ্রুতিশীল থেরাপিউটিক কৌশল হতে পারে। এই ধারণা অনুসারে, অ্যান্টিফ্রোলুম্যাব, টাইপ আই ইন্টারফেরন (IFN-I) রিসেপ্টর সাবুনিট 1 (IFNARl) এর মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি, IFN-I সিগন্যালিং পাথওয়ে (2) এর সক্রিয়করণকে ব্লক করে SLE এর চিকিৎসায় প্রতিশ্রুতিশীল বলে প্রমাণিত হয়েছে। , যা SLE এবং লুপাস নেফ্রাইটিস (LN)(3) এর প্যাথোজেনেসিসের জন্য গুরুত্বপূর্ণ।
Janus Kinases (JAKs) হল টাইরোসিন কাইনেস, সাইটোকাইন রিসেপ্টরগুলির অন্তঃকোষীয় ডোমেনের সাথে আবদ্ধ হয় এবং ফসফরিলেটিং সিগন্যাল ট্রান্সডাকশন এবং ট্রান্সক্রিপশন (STAT) ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর (TFs) অ্যাক্টিভেটর দ্বারা সক্রিয়করণ সংকেত প্রেরণ করে। একটি JAK-STAT সিগন্যালিং পথ অনেক সাইটোকাইন দ্বারা ব্যবহৃত হয়, যেমন IFN-I, IL6 এবং IL10, যেগুলি SLE সহ অটোইমিউন রোগের প্যাথোজেনেসিসের সাথে জড়িত। অটোইমিউন রোগের চিকিৎসার জন্য একযোগে একাধিক সাইটোকাইন সিগন্যালিং পাথওয়েকে বাধা দেওয়ার ক্ষমতা সহ ছোট অণু JAK ইনহিবিটারগুলি তৈরি করা হয়েছে (4)। উল্লেখ্য, প্রথম প্রজন্মের প্যান-জেএকে ইনহিবিটরগুলির সাথে তুলনা করে, সাম্প্রতিক গবেষণাগুলি দেখায় যে উচ্চ নির্বাচনী JAKI ইনহিবিটরগুলি বিভিন্ন অটোইমিউন রোগের জন্যও সন্তোষজনক থেরাপিউটিক কার্যকারিতা অর্জন করতে পারে যার প্রতিকূল প্রভাবের ঝুঁকি কম থাকে (4,5), যা নির্দেশ করে JAK1 এর অপরিহার্য ভূমিকা অটোইমিউন রোগের বিকাশ। যাইহোক, কম গবেষণায় অটোইমিউন রোগের বিকাশের সময় JAK1 নিয়ন্ত্রণের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করা হয়েছে, যেমন SLE বা LN-তে।
MicroRNA(miRNA) হল এক ধরনের ছোট নন-কোডিং RNA। 3'UTR বা লক্ষ্য mRNA-এর কোডিং অঞ্চলের সাথে তাদের বীজ অঞ্চলের পরিপূরক বেস পেয়ারিং দ্বারা, miRNAs তাদের লক্ষ্য জিনের প্রকাশকে চিনতে এবং বাধা দেয় এবং তাই বিভিন্ন জৈবিক ফাংশন নিয়ন্ত্রণ করে(6)। এমআইআরএনএগুলি ইমিউন প্রতিক্রিয়াগুলির সমালোচনামূলক নিয়ন্ত্রক হিসাবে স্বীকৃত হয়েছে, এবং এমআইআরএনএগুলির ডিসরেগুলেশন এসএলই (7) এর প্যাথোজেনেসিসের সাথে জড়িত। আমাদের পূর্ববর্তী রেনাল miRNA প্রোফাইলগুলি LN রোগীদের (8) কিডনি টিস্যুতে অনেকগুলি অনিয়ন্ত্রিত miRNA আবিষ্কার করেছে। যাইহোক, এই অনিয়ন্ত্রিত miRNA এর কাজগুলি মূলত অজানা।
এখানে, আমরা IFN-I সিগন্যালিং পাথওয়েতে তাদের নিয়ন্ত্রক ভূমিকার জন্য LN রোগীদের কিডনিতে 9টি সংরক্ষিত ডাউনরেগুলেটেড miRNA স্ক্রীন করেছি এবং hsa-miR-127-3p কে IFN-I সিগন্যালিং পাথওয়ের নেতিবাচক নিয়ন্ত্রক হিসাবে চিহ্নিত করেছি, এবং রেনাল মেসাঞ্জিয়াল কোষে এই ভূমিকা যাচাই করেছে। আমরা প্রমাণ করেছি যে JAK1 হল hsa-miR-127-3p এর প্রকৃত লক্ষ্য। আমাদের ডেটা পরামর্শ দেয় যে hsa-miR-127-3p-এর নিম্ননিয়ন্ত্রণ LN রোগীদের কিডনি টিস্যুতে IFN-I সিগন্যালিং পথের অত্যধিক সক্রিয়করণে অবদান রাখে, এবং hsa-miR-127-3p অনুকরণ JAKl বিকল্প হিসাবে কাজ করতে পারে LN এর চিকিৎসায় ইনহিবিটার।
উপকরণ এবং পদ্ধতিসমূহ
বিকারক
ইউনিভার্সাল টাইপ I ইন্টারফেরন ছিল R&D সিস্টেম (বিড়াল। 11200-1) থেকে। miRNA অনুকরণ, অনুকরণ নিয়ন্ত্রণ, এবং মিউট্যান্ট hsa-miR-127-3p (5'UgccuagCGUCUGAGCUUGGCU3') জিন- থেকে
Pharma.Hsa-miR-127-3p antagomir ছিল ReboBio থেকে। প্লাজমিডের বিশদ বিবরণ নিম্নরূপ:
পিআইএসআরই- এবং পিজিএএস-লুসিফেরেজ রিপোর্টার প্লাজমিডগুলি ক্লোনটেক ল্যাবরেটরিজ থেকে ছিল। psiCHECK2 এবং pRL-TK ভেক্টরগুলি প্রোমেগা বায়োটেক থেকে ছিল। এবং pcDNA3.1 ভেক্টর ছিল Invitrogen থেকে।
PsiCHECK2-JAK1-3'UTR রিপোর্টার প্লাজমিড নির্মাণের জন্য, মানব JAK1 3'UTR-এর খণ্ডটি (পূর্বাভাসিত hsa-miR-127-3p বাইন্ডিং সাইট রয়েছে) ছিল স্ট্যান্ডার্ড পিসিআর কৌশল ব্যবহার করে পরিবর্ধিত (প্রাইমারগুলি সারণি S1 এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে) এবং পরবর্তীতে psiCHECK2 ভেক্টরে ঢোকানো হয়েছে।
PsiCHECK2-JAK1-3'UTR-মিউট্যান্ট রিপোর্টার প্লাজমিড নির্মাণের জন্য, psiCHECK2-জেএকে-তে পূর্বাভাসিত hsa-miR-127-3p বাইন্ডিং সাইট (5'GATCTGA3') 1-3'UTR রিপোর্টার প্লাজমিডকে KOD-Plus-Mutagenesis Kit(TOYOBO) ব্যবহার করে(5'CTAGACT3') রূপান্তরিত করা হয়েছিল (প্রাইমারগুলি সারণি S1 এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে)।
pcDNA3 নির্মাণের জন্য৷{1}}JAKlt প্লাজমিড, মানব JAK1 কোডিং অঞ্চলের খণ্ডটি (পূর্বাভাসিত hsa-miR-127-3p বাইন্ডিং সাইট ধারণ করে) স্ট্যান্ডার্ড PCR কৌশল ব্যবহার করে বিবর্ধিত করা হয়েছিল (প্রাইমারগুলি টেবিলে তালিকাভুক্ত করা হয়েছে) S1) এবং পরবর্তীতে pcDNA3.1( প্লাস )-5'HA ভেক্টরে ঢোকানো হয়।
pcDNA3 নির্মাণের জন্য।{1}}JAKlt-মিউট্যান্ট প্লাজমিড, pcDNA3-তে পূর্বাভাসিত hsa-miR-127-3p বাঁধাই সাইট (5tcgAtcGgaGcctcaaga aggAtcTggt3')। 'tcgTtcCgaCcctcaagaaggTtcAggt3) KOD-Plus-Mutagenesis Kit (TOYOBO) ব্যবহার করে (প্রাইমারগুলি টেবিল S1 এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে)।
সমস্ত প্লাজমিড সিকোয়েন্সিং দ্বারা যাচাই করা হয়েছিল।
সেল সংস্কৃতি
হেলা কোষ, HepG2 কোষ এবং K562 কোষগুলি সেল ব্যাংক, সাংহাই ইনস্টিটিউট ফর বায়োলজিক্যাল সায়েন্সেস, সাংহাই, চীন থেকে ছিল। পরিবর্তিত JAK1(9) সহ U4A কোষগুলি সোচো বিশ্ববিদ্যালয়ের ওয়াই ইউজিন চিনের উপহার ছিল। অনুগত কোষগুলি (হেলা, হেপজি2, এবং ইউ4এ) 10 শতাংশ FBS (Gibco) এবং 100 ug/ml পেনিসিলিন-স্ট্রেপ্টোমাইসিন (Gibco) দিয়ে পরিপূরক DMEM(Gibco) এ সংষ্কৃত হয়েছিল। সাসপেনশন সেল (K562) RPMI 1640（Gibco） 10 শতাংশ FBS（Gibco） এবং 100 ug/ml পেনিসিলিন-স্ট্রেপ্টোমাইসিন (Gibco) এ সংস্কৃত করা হয়েছিল। প্রাইমারি হিউম্যান রেনাল মেসাঞ্জিয়াল সেল (HRMCs)(Cat. 4200, ScienCellTM Research Laboratories) মেসাঞ্জিয়াল সেল মিডিয়াম (Cat.4201, ScienCellTM রিসার্চ ল্যাবরেটরিজ) প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে সংস্কৃত করা হয়েছিল। সমস্ত কোষ 5 শতাংশ CO2 এ 37 ডিগ্রিতে বজায় রাখা হয়েছিল।
ট্রান্সফেকশন এবং স্টিমুলেশন
লুসিফেরেস রিপোর্টার অ্যাসের জন্য, হেলা কোষ বা এইচআরএমসিগুলিকে একটি 96-কূপ প্লেটে বীজ দেওয়া হয়েছিল এবং ISRE-বা GAS-লুসিফেরেস রিপোর্টার (100ng/ওয়েল), pRL-TK প্লাজমিড (10ng/ওয়েল) নির্দেশিত miRNA অনুকরণের সাথে একত্রে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল। Lipofectamine 2000(Invitrogen) ব্যবহার করে (100nM) বা অ্যান্টাগোমিরস (500nM)। 12 ঘন্টা পরে, পরিমাপের আগে 8 ঘন্টার জন্য ইউনিভার্সাল টাইপ I ইন্টারফেরন (1000U/ml) দিয়ে স্থানান্তরিত কোষগুলিকে উদ্দীপিত করা হয়েছিল।
JAK1 mRNA-এর 3'UTR-এ hsa-miR-127-3p-এর টার্গেট সাইটগুলির যাচাইয়ের জন্য, হেলা কোষগুলিকে একটি 96-ওয়েল প্লেটে বীজ করা হয়েছিল এবং psiCHECK2-JAK1-3 দিয়ে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল 'UTR(বা psiCHECK2-JAK1-3'UTR-মিউট্যান্ট বা psiCHECK2) প্লাজমিড (20ng/ওয়েল) একত্রে নির্দেশিত miRNA অনুকরণ (100nM) ব্যবহার করে
Lipofectamine 2000 (Invitrogen)। পরিমাপের আগে 24 ঘন্টার জন্য স্থানান্তরিত কোষগুলিকে সংস্কৃতি করা হয়েছিল।
নির্দেশ অনুসারে লুসিফেরেজ কার্যকলাপ ডুয়াল-লুসিফেরেস রিপোর্টার অ্যাসে সিস্টেম (প্রোমেগা বায়োটেক) দিয়ে পরিমাপ করা হয়েছিল।
JAK1 mRNA-এর কোডিং অঞ্চলে hsa-miR-127-3p-এর টার্গেট সাইটগুলির যাচাইয়ের জন্য, U4A কোষগুলিকে একটি 6-ওয়েল প্লেটে বীজ করা হয়েছিল এবং pcDNA3 দিয়ে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল৷{6}}JAKlt (বা pcDNA3. 1-JAK1t-মিউট্যান্ট) প্লাজমিড (লাগ/ওয়েল) লিপোফেক্টামিন 2000 (ইনভিট্রোজেন) ব্যবহার করে নির্দেশিত miRNA অনুকরণ (100nM) সহ।
অন্যান্য উদ্দেশ্যে, হেলা কোষ বা এইচআরএমসিগুলিকে লাইপোফেক্টামিন আরএনএআইম্যাক্স (ইনভিট্রোজেন) ব্যবহার করে miRNA মিমিকস (100nM) বা অ্যান্টাগোমির (500nM) দ্বারা স্থানান্তরিত করা হয়েছিল। ২৪ ঘণ্টা পরে, স্থানান্তরিত কোষগুলিকে ইউনিভার্সাল টাইপ I ইন্টারফেরন (1000U/ml) দিয়ে উদ্দীপিত করা হয়েছিল ঘন্টার জন্য। (mRNA কোয়ান্টিফিকেশন বা মাইক্রোয়ারের জন্য) অথবা 10 মিনিট বা 15 মিনিটের জন্য (ওয়েস্টার্ন ব্লটের জন্য)।
জিন এক্সপ্রেশনের পরিমাণ
মোট আরএনএ টিআরআইজল বিকারক (ইনভিট্রোজেন) দিয়ে বের করা হয়েছিল। প্রাইমস্ক্রিপ্ট আরটি রিএজেন্ট কিট (টাকারা) ব্যবহার করে সিডিএনএ সংশ্লেষিত হয়েছিল। জিন এক্সপ্রেশনটি এসওয়াইবিআর প্রিমিক্স এক্সটাক কিট (টাকারা) ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল। RPL13a এমআরএনএ পরিমাণ নির্ধারণের জন্য একটি রেফারেন্স জিন হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। hsa-miR-127-3p এর অভিব্যক্তিটি TaqMan মাইক্রোআরএনএ অ্যাসে কিট (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেম) ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল। RNU48 miRNA পরিমাণ নির্ধারণের জন্য একটি রেফারেন্স জিন হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। একটি ABI vii7 রিয়েল-টাইম পিসিআর সিস্টেম (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেমস) এ পরিবর্ধন করা হয়েছিল। আপেক্ষিক অভিব্যক্তি একটি 2- পদ্ধতি ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল। আনস্টিমিউলেটেড কন্ট্রোল নমুনার একই জিনের আপেক্ষিক অভিব্যক্তি দ্বারা পরীক্ষামূলক গোষ্ঠীতে একটি নমুনার একটি জিনের আপেক্ষিক অভিব্যক্তি (miRNA অনুকরণ বা IFN-I উদ্দীপনা সহ অ্যান্টাগোমির ট্রান্সফেকশন গ্রুপ) ভাগ করে ইন্ডাকশন ভাঁজ গণনা করা হয়েছিল (কোনও ট্রান্সফেকশন নেই) IFN-I উদ্দীপনা)। প্রাইমারগুলি সারণি S2 এ তালিকাভুক্ত করা হয়েছে।
পশ্চিম ফোঁটার
পুরো-কোষ লাইসেট ব্যবহার করা হয়েছিল। প্রোটিনগুলি 10 শতাংশ SDS-PAGE দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল, বৈদ্যুতিকভাবে PVDF মেমব্রেনে (EMD মিলিপুর) স্থানান্তরিত হয়েছিল এবং নির্দেশিত অ্যান্টিবডিগুলির সাথে পরীক্ষা করা হয়েছিল। ব্যান্ডগুলিকে পিয়ার্স ইসিএল ওয়েস্টার্ন ব্লটিং সাবস্ট্রেট (থার্মো সায়েন্টিফিকটিএম) দিয়ে কল্পনা করা হয়েছিল। অ্যান্টিবডি তথ্য টেবিল S3 এ ছিল।
মাইক্রোয়ারে
ফলাফল বিভাগে নির্দেশিত নমুনাগুলি থেকে TRIzol রিএজেন্ট (ইনভিট্রোজেন) দিয়ে মোট আরএনএ বের করা হয়েছিল এবং মাইক্রোয়ারে বিশ্লেষণের শিকার হয়েছিল। সাংহাই বায়োটেকনোলজি কর্পোরেশন দ্বারা অ্যাফিমেট্রিক্স U133 প্লাস 2৷{2}} অ্যারে ব্যবহার করে সমস্ত মাইক্রোয়ারে পরীক্ষা করা হয়েছিল৷ সংক্ষেপে, একটি Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, US) দ্বারা RNA অখণ্ডতা পরিদর্শনের জন্য একটি RIN নম্বরের জন্য মোট RNA পরীক্ষা করা হয়েছিল। RNeasy মাইক্রো কিট (Cat#74004, QIAGEN, GmBH, Germany) এবং RNase-মুক্ত DNase সেট (Cat#79254, QIAGEN, GmBH, জার্মানি) দ্বারা যোগ্য মোট RNA আরও শুদ্ধ করা হয়েছিল। তারপরে, বায়োটিন-লেবেলযুক্ত cRNA পাওয়ার জন্য প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসরণ করে RNA নমুনাগুলিকে GeneChip 3'IVT Express Kit(Cat#901229, Affymetrix, Santa Clara, CA, US) দ্বারা পরিবর্ধিত, লেবেলযুক্ত এবং বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। অ্যারে হাইব্রিডাইজেশন এবং ওয়াশ করা হয়েছিল GeneChip①Hybridization, Wash and Stain Kit (Cat#900720, Affymetrix, Santa Clara, CA, US) ব্যবহার করে হাইব্রিডাইজেশনে
Oven 645(Cat#00-0331-220V,Affymetrix, Santa Clara, CA,US)এবং Fluidics Station 450(Cat#00-0079, Affymetrix, Santa Clara, CA, US) অনুসরণ করেছে প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী। স্লাইডগুলি GeneChipScanner 3000(Cat#00-00212, Affymetrix, Santa Clara, CA, US) এবং Command Console Software 3.1 (Affymetrix, Santa Clara, CA, US) দ্বারা ডিফল্ট সেটিংস সহ স্ক্যান করা হয়েছে৷ কাঁচা ডেটা MAS5.0 অ্যালগরিদম দ্বারা স্বাভাবিক করা হয়েছিল এবং জিন স্প্রিং সফ্টওয়্যার 11.0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, US) এ আমদানি করা হয়েছিল৷ বেঞ্জামিনি-হচবার্গ সংশোধনের সাথে জোড়াবিহীন-পরীক্ষা বিশ্লেষণটি একটি সামঞ্জস্যপূর্ণ পি-মান সহ ভিন্নভাবে প্রকাশিত জিনগুলি পেতে ব্যবহার করা হয়েছিল<0.05. overlapping="" differentially="" expressed="" genes="" in="" ifn-α="" treated="" hela="" cells(upregulated="" or="" downregulated="" by="" 1.5-fold)="" between="" different="" comparison="" pairs="" (hsa-mir-127-3p="" mimics="" vs="" mock,="" hsa-mir-127-3p="" mimics="" vs="" negative="" control="" mimics,="" and="" hsa-mir-127-3p="" mimics="" vs="" hsa-mir-127-3p="" mutant="" mimics)="" were="" calculated.="" all="" the="" hsa-mir-127-3p="" inhibited="" genes="" were="" retrieved="" and="" subjected="" to="" the="" enrichment="" analysis="" of="" the="" cis-regulatory="" motifs="" at="" the="" upstream="" of="" these="" genes="" using="" the="" iregulon="" plugin="" on="" the="" cytoscape="" platform(10).="" the="" effect="" of="" hsa-mir-127-3p="" on="" the="" induction="" of="" the="" interferon-stimulated="" genes="" (isgs)from="" a21-gene="" ifnsignature="" (8)by="" ifn-α="" in="" hela="" cells="" was="" also="">
Ago2 বাইন্ডিং RNA ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন হেলা কোষগুলি একটি 10 সেমি থালায় বীজ করা হয়েছিল এবং 100nM ঘনত্বে hsa-miR-127-3p বা hsa-miR-127-3p মিউট্যান্ট দিয়ে স্থানান্তরিত হয়েছিল। স্থানান্তরিত কোষগুলিকে রাতারাতি সংষ্কৃত করা হয়েছিল। তারপর কোষগুলি ঠান্ডা পিবিএসে ধুয়ে স্ক্র্যাপ করা হয়েছিল। ইমিউনোপ্রিসিপিটেশন প্রক্রিয়া করা হয়েছিল EZ-Magna RIPRNA-বাইন্ডিং প্রোটিন ইমিউনোপ্রেসিপিটেশন কিট(Cat.17-701, Millipore) এবং RIPAb প্লাস Ago2(Cat. 03-110, Millipore) ব্যবহার করে। মোট লাইসেটের 10 শতাংশ ব্যবহার করা হয়েছিল ইনপুট এবং বাকি 90 শতাংশ মোট লাইসেট ইমিউনোপ্রিসিপিটেশনের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল। প্রাইমস্ক্রিপ্ট আরটি রিএজেন্ট কিট (টাকারা) দিয়ে পরিপূরক ডিএনএ সংশ্লেষ করতে প্রতিটি গ্রুপের আরএনএ নমুনা ব্যবহার করা হয়েছিল। SYBR প্রিমিক্স এক্সট্যাগ কিট (টাকারা) ব্যবহার করে JAK1-এর অভিব্যক্তিটি পরিমাপ করা হয়েছিল। hsa-miR-127-3p-এর অভিব্যক্তিটি TaqMan MicroRNA অ্যাসে কিট (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেম) ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল। একটি ABI vii7 রিয়েল-টাইম পিসিআর সিস্টেম (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেমস) এ পরিবর্ধন করা হয়েছিল। প্রাইমার সিকোয়েন্সগুলি সারণি S2 এ রয়েছে।
কিডনির নমুনা
কিডনি বায়োপসি(n=14) সাংহাই রেন জি হাসপাতালের বায়োব্যাঙ্ক থেকে প্রাপ্ত করা হয়েছিল৷ লিখিত ওয়াকিবহাল সম্মতি সব রোগীদের থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল. গবেষণাটি সাংহাই রেন জি হাসপাতালের গবেষণা নীতি বোর্ড দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল। সমস্ত LN রোগী (শ্রেণী IV-V) LN(11) এর জন্য আমেরিকান কলেজ অফ রিউমাটোলজি মানদণ্ড পূরণ করেছে। সাধারণ কন্ট্রোল গ্রুপের (n=11) নমুনাগুলি কিডনি ক্যান্সারের রোগীদের (পর্যায় I-II) সাধারণ প্যারা-কার্সিনোমা রেনাল টিস্যু থেকে ছিল যাদের অটোইমিউন রোগের কোনো ইতিহাস ছিল না। সমস্ত বিষয়ে ক্লিনিকাল তথ্য আমাদের পূর্ববর্তী কাগজে বর্ণনা করা হয়েছিল (8)।
পরিসংখ্যান
গ্রাফপ্যাড প্রিজম (সংস্করণ 6৷{5}}2) দিয়ে ডেটা বিশ্লেষণ এবং প্লট করা হয়েছিল৷ মান-হুইটনি ইউ-টেস্ট এবং ভিন্নতার একমুখী বিশ্লেষণ (ANOVA) দুই বা ততোধিক স্বাধীন গোষ্ঠীর তুলনার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। স্পিয়ারম্যানের পারস্পরিক সম্পর্ক পরীক্ষাটি পারস্পরিক সম্পর্ক গবেষণার জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল। 0.05 এর কম P মানগুলি পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল।
