পার্ট 4 গবেষণায় দেখা গেছে যে অটোফ্যাজি সেলুলার এলডি ডিপোজিশন নিয়ন্ত্রণে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে

অনুগ্রহ করে যোগাযোগ করুনoscar.xiao@wecistanche.comআরও তথ্যের জন্য

2.14। ল্যাকটেট ডিহাইড্রোজেনেস (LDH) অ্যাস

প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে, সেলগুলিকে একটি 96-ওয়েল প্লেটে 5000টি কোষ/কূপে প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল, এবং একটি অ্যাসে কিট (নানজিং জিয়ানচেং বায়োইঞ্জিনিয়ারিং ইনস্টিটিউট) দিয়ে LDH মাত্রা পরিমাপের জন্য একটি সংস্কৃতি মাধ্যম সংগ্রহ করা হয়েছিল। তারপরে মাল্টিস্কান স্পেকট্রাম (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) দ্বারা 450 এনএম-এ নমুনার শোষণ সনাক্ত করা হয়েছিল।

2.15। BODIPY493/503, BODIPY 581/591 C11, এবং MitoTracker গভীর লাল দাগ

লাইভ কোষগুলিকে PBS দিয়ে ধুয়ে 2 ug/ml BOD-IPY 493/503 (InvitrogenTM, Cat D3922) বা BODIPY 581/591 C11 (BD-C11）（2) দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল৷{15}} μM, InvitrogenTM, Cat D3861）PBS-এ 37 ডিগ্রিতে 15 মিনিটের জন্য। MitoTracker ডিপ রেড স্টেনিংয়ের জন্য, লাইভ সেলগুলিকে 0.5 ug/ml MitoTracker ডিপ রেড (InvitrogenTM, Cat M22426) দিয়ে PBS-এ 30 ডিগ্রীতে 37 মিনিটের জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল। পিবিএস-এ দুবার ধোয়া হয় এবং 10 মিনিটের জন্য 3.5 শতাংশ পিএফএতে স্থির করা হয় এবং তারপরে ইমেজিংয়ের জন্য কাচের স্লাইডে ঢেকে রাখার আগে 10 মিনিটের জন্য Hoechst 3342 (সিগমা, ক্যাট B2261) দিয়ে ধোয়া এবং পাল্টা স্টেইনিং করা হয়।কত cistanche নিতেচিত্রগুলি পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল এবং ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি (অলিম্পাস, টোকিও, জাপান) দ্বারা ছবি তোলা হয়েছিল।

আরো জানতে এখানে ক্লিক করুন

2.16. Hoechst এবং PI স্টেনিং

কোষগুলি Hoechst 33,342 দিয়ে দাগযুক্ত ছিল (1 ul 500ul PBS, Sigma, Cat B2261） এবং （or）PI （0.1 ul 500ul PBS, Solarbio,(CA1102 ঘুমের জন্য) তারপর ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি দ্বারা স্থির এবং পর্যবেক্ষণ করা হয় (অলিম্পাস, টোকিও, জাপান)।

2.17.ফ্লো সাইটোমেট্রি

কোষগুলিকে ডি-হ্যাঙ্ক দিয়ে পরিপাক করা হয়েছিল এবং তারপরে অ্যানেক্সিন V-FITC দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল (5 ul 500ul PBS）/PI （0.1 ul 500ul PBS-এ মিশ্রিত করা হয়েছে) অ্যাপোপটোসিস কিট (CA1020, বেইজবিয়ান, চিয়িংবিওন, ) প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুযায়ী। পরে, ফ্লো সাইটোমেট্রি (পেয়ারা ইজিসিটারএম 8, মিলিপুর, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) ব্যবহার করে অ্যাপোপটোটিক কোষগুলি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। মাইটোকন্ড্রিয়াল ROS এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেন সম্ভাব্য পরিমাপ 【12】 প্রকাশিত হিসাবে সম্পাদিত হয়েছিল। SH-SY5Y কোষগুলিকে MitoSOX （2.5 μM, Invitrogen, USA） অথবা JC1 （10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, USA） দিয়ে 37 ডিগ্রিতে 30 মিনিটের জন্য দাগ দেওয়া হয়েছিল। পিবিএস দিয়ে দুবার ধোয়ার পরে, কোষগুলিকে ফ্লো সাইটোমেট্রিক বিশ্লেষণের জন্য 1 শতাংশ এফবিএস ধারণকারী ঠান্ডা পিবিএস-এ পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল। FCS এক্সপ্রেস সফ্টওয়্যার (Guava Easy CyterM8, Millipore, Hayward, CA, USA) দিয়ে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

2.18। সমুদ্রের ঘোড়ার শ্বাস-প্রশ্বাসের পরীক্ষা

লাইভ SH-SY5Y কোষে মাইটোকন্ড্রিয়াল শ্বাসযন্ত্রের ফাংশন অক্সিজেন খরচ হার (OCR) পরিবর্তনের মাধ্যমে Seahorse extracellular flux (XFe96) বিশ্লেষক (Agi-lent, Santa Clara, USA) ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল। 3 × 10³ কোষ/কূপে বীজযুক্ত SH-SY5Y কোষগুলিকে সিহর্স সেল কালচার প্লেটগুলি মেনে চলতে দেওয়া হয়েছিল এবং পরীক্ষার সময় প্রায় 80 শতাংশ সঙ্গমে পৌঁছানোর অনুমতি দেওয়া হয়েছিল। আরও 24 ঘন্টার জন্য MPP*-এর সংস্পর্শে আসা। 1 μM অলিগোমাইসিন, 1 μM FCCP, সেইসাথে 1 μM রোটেনোন এবং অ্যান্টিমাইসিন A-এর অনুক্রমিক সংযোজন দ্বারা বেসাল অবস্থার অধীনে OCR সনাক্ত করা হয়েছিল।

Cistanche রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা উন্নত করতে পারে

2.19। পরিসংখ্যান সংক্রান্ত বিশ্লেষণ

ডেটা গড় ± SEM হিসাবে উপস্থাপিত হয়েছিল। পার্থক্যের তাত্পর্য নির্ধারণ করা হয়েছিল ছাত্রদের টি-টেস্ট, দ্বি-মুখী বিশ্লেষন অফ ভ্যারিয়েন্স, বা একমুখী বিশ্লেষন অফ ভ্যারিয়েন্স (ANOVA) এর পরে Tukey এর পোস্ট-হক টেস্ট দ্বারা। পার্থক্যটি P এ তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল<>

3। ফলাফল

ফলাফল 1. Ka মোটর কর্মহীনতা পুনরুদ্ধার করে এবং MPTP/p PD মডেল ইঁদুরের স্ট্রাইটামে ডোপামিনের মাত্রা বাড়ায়

কাওন পিডি প্যাথোজেনেসিসের নিউরোপ্রোটেক্টিভ প্রভাবের তদন্ত করার জন্য, 4-মাস বয়সী পুরুষ C57BL/6 ইঁদুরকে MPTP/p PD মডেল স্থাপনের জন্য নিউরোটক্সিন MPTP দিয়ে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল এবং Ka (Fig. la) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। মডেল আনয়নের পরে, রোটারড পরীক্ষা এবং মেরু পরীক্ষাটি বিভিন্ন গ্রুপে ইঁদুরের মোটর এবং আচরণগত কর্মক্ষমতা মূল্যায়ন করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। যেমন দেখানো হয়েছে, এমপিটিপি-চিকিত্সা করা ইঁদুরগুলিতে রোটারড কার্যক্ষমতার সময় উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে এবং এই প্রভাবটি Ka (Fig.1b) দ্বারা প্রতিরোধ করা হয়েছিল। (cistanche tubulosa বেনিফিট) Ka MPTP দ্বারা প্ররোচিত আচরণগত ঘাটতিও পুনরুদ্ধার করেছে, যেমনটি ইঁদুরের শরীরের ওজনকে প্রভাবিত না করে (চিত্র 1c এবং d) মেরু পরীক্ষায় বাঁক নেওয়ার সময় এবং মোট সময় হ্রাস দ্বারা নির্দেশিত হয়েছে (চিত্র। le)। অধিকন্তু, এইচপিএলসি বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে MPTP/p-চ্যালেঞ্জড ইঁদুরের মধ্যে স্ট্রাইটামে ডোপামিনের মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে এবং এই স্তরটি Ka ট্রিটমেন্ট (চিত্র 1f) দ্বারা পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল। ডাইহাইড্রক্সি-ফিনাইল অ্যাসিটিক অ্যাসিড (DOPAC, ডোপামিনের একটি বিপাক) স্তরে p-প্ররোচিত হ্রাসসুপারম্যান ভেষজ cistancheএই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে Ka মোটর কর্মহীনতা পুনরুদ্ধার করে এবং MPTP-প্ররোচিত PD ইঁদুরের স্ট্রাইটামে ডোপামিনের মাত্রা বাড়ায়।

ফলাফল 2. Ka MPTP/p PD মডেল ইঁদুরের SNpc-এ DA নিউরনের ক্ষতি কমিয়ে দেয়

এরপরে, কাওন এমপিটিপি/পি-প্ররোচিত ডিএ নিউরোনাল বৈকল্যের নিউরোপ্রোটেক্টিভ প্রভাবকে আরও মূল্যায়ন করার জন্য, আমরা ইমিউনোস্টেইনিংয়ের মাধ্যমে মুরিন এসএনপিসিতে টাইরোসিন হাইড্রোক্সিলেস (টিএইচ) নিউরনগুলি পরীক্ষা করেছি। Fig.2a এবং b-তে দেখানো হয়েছে, MPTP/p টিএইচ নিউরনের সংখ্যায় উল্লেখযোগ্য হ্রাস ঘটায়, যা Ka চিকিত্সার দ্বারা প্রশমিত হয়েছিল। তদ্ব্যতীত, SNpc-এ মোট নিউরনের স্টেরিওলজিক্যাল গণনা, যেমন Nissl দ্বারা সংজ্ঞায়িত করা হয়েছে

আকার 1. Ka চিকিত্সা মোটর কর্মহীনতা দূর করে এবং MPTP/p PD মডেল ইঁদুরের স্ট্রাইটামে ডোপামিনের মাত্রা বাড়ায়।

(a) পরীক্ষামূলক নকশার পরিকল্পিত চিত্র। (cistanche tubulosa reddit) (b) রডের সময় পরপর তিন দিনে রোটারড পরীক্ষার জন্য পরিমাপ করা হয়েছিল। (cd) একটি খুঁটি ঘুরে (বাঁকানোর সময়) এবং নামার জন্য সময় নেওয়া হয় (আরোহণের সময়) মেরু পরীক্ষার জন্য রেকর্ড করা হয়েছিল। (ই) অধ্যয়নের শেষে মাউসের শরীরের ওজন পরিমাপ করা হয়েছিল। (fg) স্ট্রিয়াটামে ডোপামিন (ডিএ) এবং ডাইহাইড্রক্সি-ফিনাইল অ্যাসিটিক অ্যাসিড (ডোপ্যাক) উচ্চ-কার্যকারিতা তরল ক্রোমাটোগ্রাফি দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। (b,c,d);n=6-8 প্রতিটি গোষ্ঠীর জন্য (f,g.ns) মধ্যে প্রতিটি গোষ্ঠীর জন্য ডেটা গড় ±SEM.n=9-10 হিসাবে প্রকাশ করা হয়, উল্লেখযোগ্য নয়,* পৃ<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,kaempferol.="" staining,="" verified="" that="" the="" loss="" of="" th+="" cells="" reflected="" cellular="" death="" but="" not="" the="" downregulation="" of="" th="" expression="" and="" showed="" that="" ka="" treatment="" restored="" the="" decrease="" in="" the="" number="" of="" nissl-positive="" neurons="" in="" the="" snpc="" of="" mptp-treated="" mice="" from="" 43.3%="" to="" 25.4%="" (fig.="" 2c="" and="" d).in="" addition,="">bioflavonoids সুবিধাKa উল্লেখযোগ্যভাবে TH এবং DAT প্রোটিন এক্সপ্রেশনে MPTP-প্ররোচিত হ্রাসকে উন্নত করেছে, যেমনটি ওয়েস্টার্ন ব্লটিং (Fig.2e-g) দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছে। এই প্রমাণটি পিডি মাউস মডেলে কাওনের নিউরোপ্রোটেক্টিভ প্রভাব নিশ্চিত করে।

ফলাফল 3. Ka MPTP/p-চিকিত্সা করা ইঁদুরের SNpc-এ LD ভ্যাকুওল এবং অক্সিডেটিভ স্ট্রেসের জমে থাকা কমায়

ক্রমবর্ধমান প্রমাণ এনডিডি-তে এলডি-র সম্পৃক্ততা দেখিয়েছে [১০], ধারাবাহিকভাবে, আমাদের পূর্ববর্তী কাজ MPTP-প্ররোচিত PD ইঁদুরের SNpc-এ LDs বৃদ্ধি চিহ্নিত করেছে নিরাকার বিষয়বস্তু [২৮]। সাধারণত, জমে থাকা এড়াতে LDs অটোফ্যাজির মাধ্যমে অবনমিত হতে পারে [২৯]।cistanche কিনুনKa PD-তে LDs নিয়ন্ত্রণ করতে পারে কিনা তা তদন্ত করার জন্য, LDs-এর জমে SNpc অফ কন্ট্রোলে, MPTP/p এবং MPTP/p ＋ Ka ইঁদুরে ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি (TEM) দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। আমাদের পূর্ববর্তী কাজ [12] এ দেখানো হয়েছে, এলডিগুলির সংখ্যা এবং আকার ছিল

স্যালাইন-ট্রিটেড কন্ট্রোল (চিত্র 3a এবং b) এর তুলনায় MPTP/p ইঁদুরে বৃদ্ধি পেয়েছে এবং Ka-চিকিত্সা করা ইঁদুরগুলিতে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে (চিত্র 3c-e)। অধিকন্তু, কা-চিকিত্সা করা ইঁদুরগুলিতে, এলডিগুলি প্রায়শই কাছাকাছি পরিলক্ষিত হয়, অটোলাইসোসোম দ্বারা আবদ্ধ বা অবনমিত হয়, যেগুলিকে ইলেকট্রন-ঘন লিপোফুসিন দানা হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল। BODIPY এর সাথে TH নিউরনের আরও হিস্টোলজিকাল স্টেনিং, একটি রঞ্জক যা বিশেষভাবে নিরপেক্ষ লিপিড লেবেল করে এবং সাধারণত LDs সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয় [30], দেখায় যে SNpc-এ BODIPY প্লাস LDs-এর সংখ্যা এবং আকার উভয়ই নিয়ন্ত্রণের তুলনায় PD ইঁদুরে বেশি ছিল, এবং উল্লেখযোগ্যভাবে Ka চিকিত্সা দ্বারা হ্রাস পেয়েছে (Fig.3f-h)।

যদি LDs সময়মতো অবনমিত না করা যায়, তাহলে জমে থাকা LDs পারক্সিডেশনের মধ্য দিয়ে যেতে পারে এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ROS-মধ্যস্থ চাপে অবদান রাখতে পারে [4],দূরত্বযা নিউরোটক্সিসিটি এবং রোগের অগ্রগতি বাড়ায়। তাই, আমরা ফ্রি এফএ টক্সিসিটি (Gpx8), অক্সিডেটিভ প্রজাতি নিরপেক্ষকরণ, সুপারঅক্সাইড র‌্যাডিকেল (Sod3) এবং হাইড্রোজেন পারক্সাইড (Cat), এবং FA বিপাক (Acsbg1 এবং Dbi) এর বিরুদ্ধে সুরক্ষার সাথে যুক্ত জিনের এক্সপ্রেশন প্রোফাইলগুলি আরও পরীক্ষা করেছি [৩১] , যার সবকটিই নিয়ন্ত্রণের তুলনায় MPTP-চিকিত্সা করা ইঁদুরের SNpc-তে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে এবং এই প্রভাবগুলি Ka-চিকিত্সা করা PD ইঁদুরগুলিতে (চিত্র 3i) উন্নত করা হয়েছিল। একইভাবে, MPTP/p এছাড়াও mRNA এক্সপ্রেশন মাত্রা বৃদ্ধি করেছে

চিত্র 2। Ka MPTP/p PD মডেল ইঁদুরের SNpc-এ DA নিউরনের ক্ষতি কমিয়ে দেয়।

(ab) টাইরোসিন হাইড্রোক্সিলেস(TH)-পজিটিভ নিউরন (a) এর মাইক্রোফটোগ্রাফ এবং নিগ্রা পার্স কমপ্যাক্টা (SNpc) (b) এ TH-পজিটিভ নিউরনের স্টেরিওলজিক্যাল কাউন্ট। স্কেল বার নির্দেশিত হিসাবে হয়. (cd) ক্রিসিল ভায়োলেট-পজিটিভ কোষের মাইক্রোফটোগ্রাফ (c) এবং SNpc (d) তে ক্রিসিল ভায়োলেট-পজিটিভ কোষের স্টেরিওলজিক্যাল কাউন্ট। স্কেল বার, 120 um. (যেমন) SNpc (e) এবং পরিমাণগত বিশ্লেষণে (f,g) TH এবং DAT প্রোটিন এক্সপ্রেশনের ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ। পরিমাপকৃত ডেটা স্যালাইন কন্ট্রোল গ্রুপে স্বাভাবিক করা হয়। ডেটা গড় হিসাবে প্রকাশ করা হয় ± SEM।*P<><0.01, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.n="4-5" for="" each="" group.="" ve,="" vehicle,="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydroloyridine..="" (for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="" article.="" of="" nadph="" oxidase="" subunits="" such="" as="" nox1,="" nox2,="" and="" nox4="" in="" the="" snpc="" of="" mptp/p="" mice,="" which="" were="" further="" blunted="" by="" ka="" treatment="" (fig.="" 3j).="" taken="" together,="" these="" data="" suggest="" that="" ka="" alleviates="" mptp/p-induced="" ld="" accumulation,="" peroxidation,="" and="" ros-mediated="">

ফলাফল 4. Ka SH-SY5Y কোষকে MPP প্লাস-প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিস থেকে রক্ষা করে

MPP, MPTP এর সক্রিয় বিপাক, মাইটোকন্ড্রিয়াল কম-প্লেক্স এনজাইমগুলিকে বাধা দেয় এবং কোষের মৃত্যু ঘটায় যা সরাসরি PD [32] এর সাথে যুক্ত। আমরা পরবর্তীতে তদন্ত করেছি যে Ka ভিট্রোতে MPPt-প্ররোচিত নিউরোনাল অ্যাপোপটোসিস প্রতিরোধ করতে পারে কিনা। চিত্র 4a এবং b-তে দেখানো হয়েছে, MPPt(40 uM, 24h) SH-SY5Y কোষ থেকে LDH-এর মুক্তিকে প্ররোচিত করেছে, এবং Ka(30 এবং 60 uM) কোষের বেঁচে থাকাকে প্রভাবিত না করে উল্লেখযোগ্যভাবে LDH রিলিজ করেছে (চিত্র 4a)। যেহেতু Ka 30 μM এর ঘনত্বে একটি যথেষ্ট প্রতিরক্ষামূলক প্রভাব তৈরি করেছে （চিত্র। 4 বি), আমরা পরবর্তী পরীক্ষাগুলিতে এই ঘনত্ব ব্যবহার করেছি। Hoechst/PI স্টেনিং ফলাফলগুলি আরও দেখিয়েছে যে Ka উল্লেখযোগ্যভাবে MPPt-প্ররোচিত ক্রোমাটিন ঘনীভবন (চিত্র 4c এবং d) এবং সেলুলার অ্যাপোপটোসিস সহ কোষের শতাংশ হ্রাস করেছে, যেমনটি বর্ধিত Hoechst ফ্লুরোসেন্স তীব্রতা (চিত্র 4c) এবং এর শতাংশ দ্বারা প্রমাণিত। Hoechst/PI-দাগযুক্ত কোষ (Hoechst প্লাস /PI')(চিত্র 4e)। এছাড়াও, ফ্লো সাইটোমেট্রি দ্বারা শনাক্ত করা হয়েছে, MPP প্লাস ইনডিউসড সেল অ্যাপোপটোসিস, অ্যানেক্সিন ভি-দাগযুক্ত কোষের (AV /PI এবং AV প্লাস /PI প্লাস) বর্ধিত শতাংশ দ্বারা প্রমাণিত Ka (চিত্র 4f এবং g) দ্বারা সুরক্ষিত ছিল। উপরন্তু, Ka উল্লেখযোগ্যভাবে বিপরীত MPP-প্রেরিত পরিবর্তনগুলি অ্যাপোপটোসিস-সম্পর্কিত প্রোটিন অভিব্যক্তিতে, যেমন Bcl-2-এর আপগ্রিগুলেশন, Bax-এর নিম্ননিয়ন্ত্রণ (চিত্র 4hi-j), এবং ক্যাসপেসের বিভাজন হ্রাস দ্বারা প্রমাণিত হয়েছে-3 (চিত্র 4 ঘন্টা, কে)। এই তথ্যগুলি পরামর্শ দেয় যে Ka কোষের বেঁচে থাকার উপর MPPt-এর ক্ষতিকর প্রভাবগুলি বাতিল করতে পারে।

ফলাফল 5. Ka MPPt-প্ররোচিত LD সঞ্চয়ন এবং লিপিড পারক্সিডেশনকে দমন করে, যা SH-SY5Y কোষে মাইটোকন্ড্রিয়াল ক্ষতির মধ্যস্থতা করে

সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে অপ্রত্যাশিত এলডি জমা হওয়ার ফলে লিপিড পারক্সিডেশন-মধ্যস্থ চাপ বৃদ্ধি পেতে পারে এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতাকে ত্বরান্বিত করতে পারে, যা নিউরোডিজেনারেশনকে [10] প্রচার করে। আমাদের পূর্ববর্তী কাজটিও দেখিয়েছিল যে এসএনপিসিতে বর্ধিত এলডিগুলি ইঁদুরের পিডি প্যাথলজির সাথে যুক্ত ছিল [12]। Ka-এর প্রতিরক্ষামূলক প্রভাব ভিট্রোতে এলডি জমার সাথে সম্পর্কিত ছিল কিনা তা তদন্ত করার জন্য, আমরা প্রথমে BODIPY 493/503 ব্যবহার করে SH-SY5Y কোষগুলিতে LD-নির্দিষ্ট স্টেনিং করেছি এবং LD-এর বর্ধিত জমা (নিরপেক্ষ লিপিডের বর্ধিত মাত্রা) পর্যবেক্ষণ করেছি।

ফলাফল 6. Ka অটোফ্যাজিকে উৎসাহিত করে এবং MPP প্লাস-চিকিত্সা করা SH-SY5Y কোষে mtROS উৎপাদন হ্রাস করে

সাধারণত, এলডিগুলি অটোফ্যাজির মাধ্যমে লাইসোসোমে সরবরাহ করা হয় এবং পারক্সিডেশন এড়াতে এফএ-তে বিভক্ত করা যেতে পারে। যাইহোক, প্রমাণ ইঙ্গিত দেয় যে অটোফ্যাজি প্রতিবন্ধী, যা PD [2] তে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। যখন অটোফ্যাজি লাইসোসোমে (চিত্র 6a) ভাঙ্গার জন্য LDs-কে ভাগ করা জড়িত থাকে, তখন প্রক্রিয়াটিকে বিশেষভাবে লাইপোফ্যাগি [2] বলা হয়। অটোফ্যাজি Ka এর নিউরোপ্রোটেক্টিভ প্রভাবের সাথে জড়িত কিনা তা তদন্ত করতে, আমরা অটোফ্যাজি-সম্পর্কিত প্রোটিনের স্তরগুলি পরীক্ষা করেছি। চিত্র 6b-d-এ যেমন দেখানো হয়েছে, সংস্কৃত SH-SY5Y কোষে, মাইক্রোটিউবুল-সম্পর্কিত প্রোটিন লাইট চেইন 3 (LC3)-II-এর স্তর উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে, যেখানে MPP প্লাস-ট্রিটেড কোষগুলিতে p62-এর অভিব্যক্তি উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে, যেমন ইমিউনোব্লটিং দ্বারা পরিমাপ করা হয়, এবং এই প্রভাবটি উল্লেখযোগ্যভাবে Ka দ্বারা বিপরীত হয়েছিল। আমরা এলসি 3 এর জন্য ইমিউনোস্টেইন করে অটোফ্যাজির পরিবর্তনগুলি আরও পরীক্ষা করেছি। কোষের মধ্যে অটোফ্যাগোসোমগুলিকে জমা করার অনুমতি দেওয়ার জন্য, লাইসোসোমের সাথে অটোফ্যাগোসোম ফিউশন প্রতিরোধ করতে ব্যাফিলোমাইসিন যুক্ত করা হয়েছিল। যেমন দেখানো হয়েছে, MPP*-চিকিত্সা করা কোষগুলিতে LC3b পাঙ্কটার বর্ধিত সংখ্যা সনাক্ত করা হয়েছিল, যা প্রতিবন্ধী অটোফেজিক অবক্ষয় নির্দেশ করে এবং এই প্রভাবটিও Ka (চিত্র 6e এবং f) দ্বারা বিপরীত হয়েছিল। এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে SH-SY5Y কোষে LDs অটোফ্যাজি দ্বারা চূড়ান্ত অপসারণের জন্য সচল করা হয় এবং Ka অক্সিডাইজড লিপিড জমা কমাতে অটোফ্যাজিকে উন্নীত করতে পারে। বর্ধিত লিপিড পারক্সিডেশন মাইটোকন্ড্রিয়াল অক্সিডেটিভ স্ট্রেস বাড়িয়ে মাইটোকন্ড্রিয়াল ক্ষতিকে বাড়িয়ে তুলতে পারে [৪]। উপরন্তু, Ka চিকিত্সা উল্লেখযোগ্যভাবে মজবুত mtROS প্রজন্মকে হ্রাস করেছে, যেমন MitoSOX স্টেনিং (চিত্র 6g এবং h) দ্বারা নির্ধারিত, এবং অকার্যকর মাইটোকন্ড্রিয়ার সংখ্যা হ্রাস করেছে, যেমন মাইটোকন্ড্রিয়া-নির্দিষ্ট লেবেল দ্বারা শ্বাস-প্রশ্বাসের পার্থক্য (MitoTracker গভীর লাল) এবং মোট MitoTracker সবুজ) মাইটোকন্ড্রিয়া (চিত্র 6i এবং j)। উপরন্তু, মাইটোকন্ড্রিয়াল পরিবর্তনের প্রত্যক্ষ দৃষ্টিভঙ্গি পেতে, আমরা সিহরস এক্সএফ বিশ্লেষক দ্বারা অক্সিজেন খরচ হার (ওসিআর) সনাক্ত করেছি। চিত্র 6k-এ যেমন দেখানো হয়েছে, MPPt-চিকিত্সা করা কোষগুলিতে মাইটোকন্ড্রিয়া শ্বসন হ্রাস পেয়েছে, যখন Ka চিকিত্সা স্পষ্টতই MPP প্লাস (চিত্র 6k) দ্বারা সৃষ্ট এই ক্ষতিকে বিপরীত করে।

ফলাফল7. অটোফ্যাজি ইনহিবিশন কাওন এলডি জমা, মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিসফাংশন এবং ভিট্রোতে ডিএ নিউরোনাল ইনজুরির দমনমূলক প্রভাবকে বিপরীত করে

অটোফ্যাজি একটি প্রধান প্রক্রিয়া যা দ্বারা Ka DA নিউরোপ্রোটেকশনের মধ্যস্থতা করে কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য, অটোফ্যাজি ইনহিবিটর 3-MA ব্যবহার করা হয়েছিল। আমরা দেখতে পেয়েছি যে MPP#-প্ররোচিত আঘাতের উপর Ka-এর প্রতিরোধমূলক প্রভাব, যার মধ্যে LD সঞ্চয় হ্রাস (চিত্র 7a এবং b), mtROS উৎপাদন হ্রাস (চিত্র 7c এবং d), এবং উপশম মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা (Fig.7e এবং f) সহ SH-SY5Y কোষগুলি, উল্লেখযোগ্যভাবে 3-MA দ্বারা অবরুদ্ধ ছিল৷ যেহেতু এলডি অক্সিডেশন এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা ডিএ নিউরোনাল মৃত্যুর সাথে ঘনিষ্ঠভাবে জড়িত, আমরা পরবর্তীতে প্রাথমিক সংস্কৃতিযুক্ত ডিএ নিউরনগুলি পরীক্ষা করেছি। আমরা Ka এবং/অথবা MPPf দিয়ে কালচারড মেসেনসেফালন টিএইচ প্লাস নিউরনকে চিকিত্সা করেছি এবং ইমিউনোস্টেইনিংয়ের মাধ্যমে টিএইচ প্লাস নিউরোনাল প্রক্রিয়াগুলির সংখ্যা এবং দৈর্ঘ্য পরিমাপ করেছি। রূপতাত্ত্বিক বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে MPP প্লাস দ্বারা নিউরোনাল প্রক্রিয়ার সংখ্যা এবং দৈর্ঘ্য উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে এবং Ka দ্বারা সুরক্ষিত হয়েছে, এবং এই সুরক্ষা আরও 3-MA (Fig.7g-i) দ্বারা বিপরীত হয়েছে। এই তথ্যগুলি নির্দেশ করে যে Ka অটোফ্যাজি প্রচার করে DA নিউরোনাল ক্ষতি হ্রাস করে।

ফলাফল 8. নীরব Atg5 ভিভোতে নিউরোনাল ক্ষতির Ka-মধ্যস্থতা প্রতিরোধকে বাতিল করেছে

আরও নিশ্চিত করার জন্য যে Ka একটি অটোফ্যাজি-নির্ভর পদ্ধতিতে MPTP/p-প্ররোচিত TH প্লাস নিউরোনাল ক্ষতির বিরুদ্ধে রক্ষা করে, আমরা একটি অ্যাডেনো-সম্পর্কিত ভাইরাস (AAV) মাইক্রোইনজেক্ট করে Atg5-কে চুপ করে দিয়েছি - এটিজি 5-এর বিরুদ্ধে পূর্বের বৈশিষ্ট্যযুক্ত shRNA দ্বিপাক্ষিক মেসেনসেফালনে (চিত্র) প্রকাশ করে। .8a) পূর্বে বর্ণিত [25]। প্রাথমিক পরীক্ষা-নিরীক্ষায় আমরা লক্ষ্য করেছি যে 2 সপ্তাহের জন্য Atg5 shRNA ট্রান্সফেকশন TH প্লাস নিউরনে পর্যাপ্ত GFP অভিব্যক্তি অর্জন করেছে (চিত্র 8b) এবং ইনজেকশন করা ইঁদুরের SNpc-এ ATG5 অভিব্যক্তিকে বাধা দিয়েছে (চিত্র। 8 গ)। আমরা দেখতে পেয়েছি যে Atg5-নকডাউন Ka-এর নিউরোপ্রোটেক্টিভ প্রভাবকে বিপরীত করেছে, যেমনটি TH (চিত্র 8d এবং e) এর আপগ্রিগুলেটেড প্রোটিন এক্সপ্রেশন এবং TH প্লাস নিউরনের সংখ্যা বৃদ্ধি (চিত্র 8f এবং g) দ্বারা প্রমাণিত। এই ডেটাগুলি পিডি ইঁদুরগুলিতে Ka এর প্রতিরক্ষামূলক প্রভাবে অটোফ্যাজির অবদানকে আরও সমর্থন করে। উপসংহারে, আমরা নিশ্চিত করেছি যে Ka অটোফ্যাজি প্রচার করে এলডি অক্সিডেশন এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিসফাংশন হ্রাস করে MPTP/p-প্ররোচিত আঘাত থেকে রক্ষা করে।

4। আলোচনা

বর্তমান গবেষণায় দেখা গেছে যে প্রাকৃতিক ছোট অণু Ka একটি মূল কারণ যার দ্বারা অটোফ্যাজিক সিগন্যালিং লিপিড অক্সিডেটিভ বিষাক্ততাকে বাধা দিতে পারে। আমাদের ফলাফলগুলি প্রমাণ করেছে যে অটোফ্যাজি পাথওয়ে হল একটি মূল নিয়ন্ত্রক লুপ যার মাধ্যমে Ka LD পারক্সিডেশন এবং পরবর্তী মাইটোকন্ড্রিয়াল ক্ষতি কমিয়ে দেয় এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ক্ষতি কমাতে অটোফ্যাজি-নিয়ন্ত্রিত এলডি বিষাক্ততার ভূমিকার উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করে যখন অত্যধিক চাপের কারণে নিউরোডিজেনারেশন প্রি-ভেন্টিং করে। 9)।

এলডি হ'ল নিরপেক্ষ লিপিড স্টোরেজের অন্তঃকোষীয় স্থান [৫]এবং লিপিড বিপাক এবং শক্তি হোমিওস্টেসিসের জন্য গুরুত্বপূর্ণ, যখন এলডি কর্মহীনতা অনেক রোগের সাথে যুক্ত হয়েছে [১৬]। জমে থাকা প্রমাণগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে জীববিজ্ঞান এবং প্যাথলজিতে LDs যে ভূমিকা পালন করে তা পূর্বের চিন্তার তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বিস্তৃত। সিএনএস-এ, প্রমাণ দেখা গেছে যে নিউরন এবং গ্লিয়ার বর্ধিত এলডি নিউরোডিজেনারেটিভ প্যাথলজিতে জড়িত [১০,৩৬]। বিস্তারিতভাবে, ভিট্রো [৩৭] তে সংষ্কৃত অ্যাপ্লিসিয়া নিউরনের অ্যাক্সন এবং মস্তিষ্কের অংশে উভয় ক্ষেত্রেই এলডি সনাক্ত করা হয়েছে। হান্টিংটনের রোগের মডেলগুলি [৩৮]। উপরন্তু, এটি দেখানো হয়েছিল যে নিউরনগুলি লিপিড বিষাক্ততার প্রতি বিশেষভাবে সংবেদনশীল, এবং এলডিগুলির জমে যা সময়মত অপসারণ করা যায় না তা ত্বরান্বিত এলডি পারক্সিডেশনের দিকে পরিচালিত করে এবং নিউরোডিজেনারেশনের জন্ম দিতে পারে [17]।

হাইপারঅ্যাকটিভ নিউরনে লিপিড জমা হওয়া শুধুমাত্র এই লিপিডগুলির পারক্সিডেশনের জন্য সংবেদনশীলতার কারণেই বিষাক্ত নয়। অধিকন্তু, অতিরিক্ত এলডি-র বিষয়বস্তু নন-অক্সিডেটিভ বিপাকীয় পথগুলিতে প্রবেশ করতে পারে, যা সিরামাইডের অত্যধিক উত্পাদনকে ট্রিগার করে, যা কোষের জন্য বিষাক্ত [39]। সাম্প্রতিক গবেষণায় আরও দেখানো হয়েছে যে এলডি-ত্রুটিপূর্ণ কোষে, এফএগুলি অ্যাসিলকার্নিটাইনে রূপান্তরিত হতে পারে, যা পরে মাইটোকন্ড্রিয়াল কর্মহীনতা এবং ROS উত্পাদন [৪০] করে। হাইপারঅ্যাকটিভ নিউরনে এই প্রক্রিয়াগুলির সুনির্দিষ্ট এবং গভীর পরিণতি হওয়ার সম্ভাবনা রয়েছে কারণ অকার্যকর মাইটোকন্ড্রিয়া এফএ ব্যবহারের ক্ষমতাকে আপস করে এবং এমটিআরওএস উত্পাদন ঝিল্লির লিপিড পারক্সিডেশনের আরও কারণ করে।

এইভাবে, এলডি হোমিওস্ট্যাসিস নিউরনে ভালভাবে নিয়ন্ত্রণ করা উচিত, যা বিষাক্ততা এড়াতে এবং শেষ পর্যন্ত মস্তিষ্কের স্বাস্থ্য বজায় রাখার জন্য গুরুত্বপূর্ণ। বর্তমান সমীক্ষায়, আমরা দেখেছি যে ছোট প্রাকৃতিক অণু Ka নিউরোনাল LD বিষাক্ততাকে বাধা দেয় যা MPP#-অপমানিত SH-SY5Y কোষে LD সঞ্চয়, উচ্চতর লিপিড পারক্সিডেশন এবং আপ-রেগুলেটেড লিপিড বিষাক্ততা-সম্পর্কিত জিনের অভিব্যক্তি হিসাবে প্রকাশিত হয়। আরও গুরুত্বপূর্ণ, আমরা এটাও দেখিয়েছি যে Ka চিকিৎসা 45] হ্রাস করে কোষে জমা LC3B puncta এর বর্ধিত সংখ্যা। আহত SH-SY5Y কোষে ত্রুটিপূর্ণ লাইপোফ্যাজি Ka-এর সাথে চিকিত্সার দ্বারা বিপরীত হয়েছিল। ফলস্বরূপ, Ka MPP#-চিকিত্সা করা SH-SY5Y কোষে অক্সিডাইজড এলডি, ক্ষতিগ্রস্থ মাইটোকন্ড্রিয়া এবং এমটিআরওএস জেনারেশনের পরিমাণ হ্রাস করে। গুরুত্বপূর্ণভাবে, 3-MA দ্বারা অটোফ্যাজির বাধা অক্সিডাইজড এলডি এবং ক্ষতিগ্রস্থ মাইটোকন্ড্রিয়া এবং ভিট্রোতে DA নিউরন ইনজুরির উপশম কা-মধ্যস্থতা বিলুপ্ত করে। তদুপরি, ভিভোতে Atg5 নকডাউন দ্বারা অটোফ্যাজির বাধা MPTP-প্ররোচিত PD মাউস মডেলে কাওন ডিএ নিউরোনাল অবক্ষয়ের প্রতিরক্ষামূলক প্রভাবগুলিকে বিপরীত করেছে। সম্মিলিতভাবে, এই অনুসন্ধানগুলি ইঙ্গিত দেয় যে কা একটি পরীক্ষামূলক পিডি মডেলে অটোফ্যাজি প্রচার করে এলডি বিষাক্ততা-সম্পর্কিত মাইটোকন্ড্রিয়াল ক্ষতিকে বাধা দেয়।

জমা হওয়া প্রমাণগুলি ইঙ্গিত করে যে mtROS প্রজন্মের বৃদ্ধি উচ্চ-ক্রিয়াকলাপ নিউরনের একটি প্রাথমিক বৈশিষ্ট্য এবং PD [46] সহ অনেক NDD-তে পরিলক্ষিত হয়েছে। ROS একটি কারণ বা এলডি গঠনের পরিণতি কিনা সে সম্পর্কে প্রতিবেদনগুলি পরস্পর বিরোধী [47,48]। মজার বিষয় হল, আমাদের ইন-ভিট্রো ফলাফলগুলি দেখিয়েছে যে ও-টোকোফেরলের সাথে এলডি পারক্সিডেশনের ফার্মাকোলজিকাল বাধা mtROS জেনারেশন এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেনের সম্ভাব্য অস্বাভাবিকতা রোধ করে এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল হ্রাসকে উপশম করে, যেমন SH-SY5Y কোষের মধ্যে Tomm20 স্টেনিং দ্বারা প্রমাণিত হয়, যা LD-SY5Y কোষকে সমর্থন করে। এমপিপি-প্ররোচিত মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিসফাংশন এবং এমটিআরওএস প্রজন্মের কার্যকারণ ভূমিকা। যাইহোক, এটা সম্ভব যে উন্নত ROS প্রাথমিকভাবে LD গঠনকে ত্বরান্বিত করে, এবং পরবর্তীকালে, LDs আরও ROS প্রজন্মকে প্ররোচিত করে এবং আন্তঃকোষীয় এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ROS স্তরগুলিকে বাড়িয়ে দেয়।

বর্তমান সমীক্ষায়, আমরা দেখিয়েছি যে এমপিটিপি-প্ররোচিত পিডি সহ ইঁদুরের উচ্চ মাত্রার এলডি জমে ছিল, যা ডিএ নিউরনের বর্ধিত ক্ষতি, ত্বরান্বিত ROS- মধ্যস্থতামূলক চাপ এবং আচরণগত ঘাটতিগুলির সাথে ছিল। কা চিকিত্সা ভিট্রোতে এলডি বিষাক্ততা প্রতিরোধ করে এবং পিডি মাউস মডেলে ডিএ নিউরোনাল ক্ষতি এবং আচরণগত ঘাটতিগুলিকে উন্নত করে এবং এই প্রভাবগুলি অটোফ্যাজি-নির্ভর ছিল। অতএব, এটি উপসংহারে আসা যুক্তিসঙ্গত যে Ka অটোফ্যাজিকে উৎসাহিত করে, এবং এই উন্নত অটোফ্যাজি অক্সিডাইজড এলডি সঞ্চয়নকে হ্রাস করে, এমটিআরওএস প্রো-ডাকশন হ্রাস করে এবং ডিএ নিউরনের মাইটোকন্ড্রিয়াল ক্ষতি হ্রাস করে, যা এলডি বিষাক্ততা প্রতিরোধে অবদান রাখে, যার ফলে পিএফডিজি (পিডিএফ) রোগবিদ্যা হ্রাস করে। 9)।

অর্থায়ন

এই গবেষণাটি চীনের ন্যাশনাল ন্যাচারাল সায়েন্স ফাউন্ডেশন (নং 81903587), চায়না পোস্টডক্টরাল সায়েন্স ফাউন্ডেশন (No.2019M661807), জিয়াংসু প্রদেশের ন্যাচারাল সায়েন্স ফাউন্ডেশন (নং BK20190120) দ্বারা অর্থায়িত প্রকল্পের অনুদান দ্বারা সমর্থিত ছিল। চীনা মেডিসিনের নানজিং ইউনিভার্সিটির চীনা মেটেরিয়া মেডিকা ফার্স্ট-ক্লাস ডিসিপ্লিনের উন্মুক্ত প্রকল্প (নং 2020YLXK006), এবং ড্রাগ ইনোভেশন মেজর প্রজেক্ট (No.2018ZX09711001-003-007)।

এই নিবন্ধটি Redox Biology 41 (2021) 101911 থেকে নেওয়া হয়েছে