পার্ট 1: অস্টিওপোরোসিস এবং আল্জ্হেইমার রোগ উভয়ের চিকিৎসার জন্য সিস্তানচে টিউবুলোসার দ্বৈত-প্রতিক্রিয়া উপাদানগুলির তদন্ত করার জন্য ইন্টিগ্রেটেড নেটওয়ার্ক ফার্মাকোলজি এবং জেব্রাফিশ মডেল
Mar 30, 2022
যোগাযোগ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
ইং-কিউ লি 1, ই চেন 1, জিয়া-ই ফাং 1, সি-কিউ জিয়াং 1, পিং লি 1, * এবং ফেই লি 1, 2, *
বিমূর্ত
এথনোফার্মাকোলজিকাল প্রাসঙ্গিকতা:অস্টিওপোরোসিস (OP) এবং আলঝেইমার রোগ (AD) হল সাধারণ জেরিয়াট্রিক সমসাময়িক রোগ, এবং অনেক গবেষণা তাদের প্যাথোজেনেসিসের সংযোগ নির্দেশ করে। Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) একটি বহুল ব্যবহৃত ঐতিহ্যবাহী চীনা ঔষধ এবং যথাক্রমে OP এবং AD এর চিকিৎসার জন্য ব্যাপকভাবে প্রয়োগ করা হয়েছে। যাইহোক, একযোগে এবং অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়া উভয় সমবর্তী রোগের জন্য সক্রিয় উপাদান সীমিত।
গবেষণার উদ্দেশ্য:এই কাজটি সিটিতে দ্বৈত-প্রতিক্রিয়া যৌগগুলি খুঁজে পেতে একটি কার্যকর এবং নির্ভরযোগ্য নেটওয়ার্ক স্ক্রীনিং পদ্ধতি প্রতিষ্ঠার লক্ষ্যে যা AD এবং OP কে একযোগে রক্ষা করতে পারে। এবং এটি আণবিক প্রক্রিয়াগুলিতে OP এবং AD এর মধ্যে লিঙ্কের নতুন দৃষ্টিভঙ্গি সরবরাহ করবে।
উপাদান এবং পদ্ধতি:নেটওয়ার্ক ফার্মাকোলজি স্তরে একাধিক ডাটাবেস এবং বিস্তৃত বিশ্লেষণ সংহত করে সিটির দ্বৈত প্রভাবগুলি পদ্ধতিগতভাবে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। বিভিন্ন ধরনের যৌগের মধ্যে প্রভাবের পার্থক্য প্রকাশ করার জন্য একটি শ্রেণীবদ্ধ ড্রাগ-টার্গেট ইন্টারঅ্যাকশন নেটওয়ার্ক তৈরি করা হয়েছিল। এই নেটওয়ার্কের কার্যকারিতা প্রমাণ করার জন্য, টপোলজিক্যাল প্যারামিটার অনুসারে জেব্রাফিশের প্রাক-প্ররোচিত OP মডেল এবং AlCl3-প্রেরিত AD মডেলে যাচাই করার জন্য কিছু যৌগ নির্বাচন করা হয়েছিল।
কীওয়ার্ড:নেটওয়ার্ক ফার্মাকোলজি; অস্টিওপোরোসিস;আলঝেইমার রোগ; Cistanche tubulosa; জেব্রাফিশ।
Cistanche একটি অ্যান্টি-আলঝাইমার ফাংশন আছে।
1। পরিচিতি
জনসংখ্যার বয়স্ক প্রবণতার ফলে বছরের পর বছর ধরে অস্টিওপরোসিস (OP) এবং আল্জ্হেইমার রোগ (AD) এর প্রকোপ বৃদ্ধি পায় (পারনেটি এট আল।, 2019; রিজোলি, 2018)। আজকাল OP এবং AD উভয়ই জনস্বাস্থ্যের জন্য প্রধান হুমকি হিসাবে স্বীকৃত হয়েছে কারণ তারা লক্ষণ ছাড়াই অগ্রগতি করতে পারে এবং বিশাল সামাজিক বোঝা নিয়ে আসতে পারে (Erkkinen et al., 2018; Jonsson et al., 2018)। বয়স-সম্পর্কিত রোগ হিসাবে, তারা প্রায়শই উচ্চ অক্ষমতা এবং মৃত্যুর হার সহ ক্লিনিকাল অনুশীলনে সহ-ঘটতে দেখা যায় (ডেঙ্গলার-ক্রিশ এবং এলিফটেরিউ, 2019)। OP হল একটি সিস্টেমিক কঙ্কালের রোগ যা হাড়ের কম ভর এবং হাড়ের টিস্যুর প্রতিবন্ধী মাইক্রো-আর্কিটেকচার দ্বারা চিহ্নিত করা হয়, যার সাথে হাড়ের ভঙ্গুরতা এবং ফ্র্যাকচারের ঝুঁকি বেড়ে যায় (Rizzoli, 2018)। AD হল সবচেয়ে সাধারণ মস্তিষ্কের অবক্ষয় যা স্মৃতিশক্তির প্রগতিশীল ক্ষতি এবং অন্যান্য জ্ঞানীয় ফাংশন দ্বারা চিহ্নিত করা হয় (Bondi et al., 2017)। এখন অবধি, তাদের জটিল ইটিওলজি এবং প্যাথোজেনেসিসের দুটি রোগ প্রতিরোধ বা নিরাময়ের জন্য এখনও পর্যাপ্ত শক্তিশালী বিকল্প নেই। এবং সবচেয়ে খারাপ বিষয় হল রোগীর প্রায়ই পার্শ্বপ্রতিক্রিয়া হয় (Brown, 2017; Huang and Mucke, 2012)।
সিন্ড্রোম ডিফারেনসিয়েশনের তাত্ত্বিক ভিত্তিতে (সুচার, 2013), প্রথাগত চীনা ওষুধ (TCMs) একাধিক উপাদানের সাথে একাধিক প্যাথোফিজিওলজিকাল মেকানিজমকে লক্ষ্য করে কিছু পরিচিত জটিল রোগের চিকিৎসায় একটি অনন্য শ্রেষ্ঠত্ব রয়েছে। একটি কিডনি টনিক ভেষজ হিসাবে, Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) ঐতিহ্যগত চীনা চিকিত্সকদের দ্বারা স্মৃতিশক্তি হ্রাস এবং হাড়ের অ্যাট্রোফিক দুর্বলতার বিরুদ্ধে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয় (ফু এট আল।, 2018)। এর ঐতিহ্যগত কার্যকারিতা ছাড়াও, যথেষ্ট গবেষণায় দেখা গেছে যে এটির বিভিন্ন ফার্মাকোলজিকাল কার্যকলাপ রয়েছে, যেমন জ্ঞানীয় এবং আচরণগত ঘাটতি কমানো (Wu et al., 2014), প্রদাহ বিরোধী (Fu et al., 2018), হাড় গঠনের প্রচার করা এবং হাড়কে দমন করা। রিসোর্পশন (Li et al., 2013; Li et al., 2012), সেইসাথে অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট কার্যকলাপ (Zhang et al.,2016)। কিন্তু এর সক্রিয় উপাদান এবং বিপাকীয় প্রক্রিয়ার জটিলতা মানুষের টিস্যুতে লক্ষ্যবস্তু অন্বেষণ এবং কর্মের প্রক্রিয়া ব্যাখ্যা করতে উভয় ক্ষেত্রেই অসুবিধা সৃষ্টি করে।
সর্বোপরি, OP/AD এর থেরাপিউটিক লক্ষ্যগুলির একটি নির্ভরযোগ্য আলোচনা প্রয়োজন। বিশেষ করে টিসিএম-এ "বিভিন্ন রোগের জন্য একই চিকিত্সা" এবং "মাল্টি-কম্পোনেন্ট থেরাপিউটিকস, বায়োলজিক্যাল নেটওয়ার্ক" ইন-নেটওয়ার্ক ফার্মাকোলজির পদ্ধতির উপর ভিত্তি করে, উভয় রোগের মধ্যে উল্লেখযোগ্য সাধারণ লক্ষ্যগুলি অনুসন্ধান করার প্রচেষ্টাগুলি বিশেষভাবে ব্যবহারিক হতে পারে। OP এবং AD প্রতিরোধ এবং নিয়ন্ত্রণের জন্য নির্দেশিকা প্রদানের অর্থ। জেব্রাফিশের স্তন্যপায়ী প্রাণীর সাথে তাদের কঙ্কালের শারীরবৃত্তিতে এবং মানুষের সাথে অত্যন্ত সমজাতীয় জিনের মিল রয়েছে। এটি OP এবং AD গবেষণার জন্য ভিভোতে একটি উপলব্ধ এবং আকর্ষণীয় প্রাণী মডেল (বার্গেন এট আল।, 2019; নিউম্যান এট আল।, 2014)। এইভাবে, এই নেটওয়ার্ক ফার্মাকোলজি গবেষণার লক্ষ্য ছিল সিটির দ্বৈত-প্রতিক্রিয়া সক্রিয় উপাদানগুলি স্ক্রীনিং করা, OP এবং AD-এর সাধারণ সম্ভাব্য লক্ষ্যগুলি অন্বেষণ করা, পাশাপাশি দুটি রোগের একই সাথে চিকিত্সার জন্য CT ব্যবহার করার সম্ভাবনা উন্মোচন করা। এই গবেষণায়, একটি ইন্টারেক্টিভ নেটওয়ার্ক স্থাপনের জন্য CT সক্রিয় উপাদান, জিনোম এবং OP এবং AD-এর প্রোটিওমিক্স তথ্যের লক্ষ্যমাত্রার তথ্য যথাক্রমে বিভিন্ন ডাটাবেস থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল, এবং OP এবং AD-এর চিকিত্সার জন্য CT-এর সিনারজিস্টিক মেকানিজম আবিষ্কারের জন্য সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণ তৈরি করা হয়েছিল। . তদ্ব্যতীত, আমরা যথাক্রমে ওপি এবং এডি জেব্রাফিশ মডেলগুলিকে প্ররোচিত করেছি এবং দুটি রোগের জন্য তাদের কার্যকারিতা এবং লক্ষ্যগুলি যাচাই করতে নেটওয়ার্কের মূল যৌগগুলিকে ক্যাপচার করেছি।
সিস্টানচে স্ক্লেরোটিনের বৃদ্ধি বাড়ায়।
2। সামগ্রী ও পদ্ধতি
2.1 বিকারক
জেনিস্টিন (জিই), কোয়ারসেটিন (কিউইউ), অ্যাবিটিক অ্যাসিড (এএ), -সিটোস্টেরল (বিএসএস) (বিশুদ্ধতা 98 শতাংশের চেয়ে বেশি বা সমান) এর রাসায়নিক মানগুলি ক্রোমা বায়োটেকনোলজি কোং লিমিটেড (চেংদু, চীন) থেকে কেনা হয়েছিল। Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. (Wuxi, China) থেকে কালচার প্লেট প্রাপ্ত করা হয়েছে। Prednisolone (Pre), Etidronate Disodium (Ed), Donepezil HCL (DPZ), AlCl3·6H2O আলাদিন রিএজেন্ট ইনকর্পোরেটেডের কাছ থেকে কেনা হয়েছিল। জেব্রাফিশ অ্যালকালাইন ফসফেটেস (ALP), টার্টরেট-প্রতিরোধী অ্যাসিড ফসফেটেস (TRAP), অ্যাসিটাইলকোলিনস্টেরেস (ACHE), এবং acetyltransferase (CHAT) এনজাইম-লিঙ্কড ইমিউনোসর্বেন্ট অ্যাসে (ELISA) কিট সাংহাই এনজাইম-লিঙ্কড বায়োটেকনোলজি কোং, লিমিটেড (সাংহাই, চীন) দ্বারা সরবরাহ করা হয়েছিল। Trizol নানজিং KeyGen বায়োটেক থেকে প্রাপ্ত করা হয়েছিল. কোং, লিমিটেড (নানজিং, চীন)। ট্রান্সটার টপ গ্রীন কিউপিসিআর সুপারমিক্স ট্রান্সজেন বায়োটেক থেকে কেনা হয়েছিল। কোং, লিমিটেড (বেইজিং, চীন)।
cistanche নির্যাস
2.2 প্রাণী
প্রাপ্তবয়স্ক জেব্রাফিশ (এবি স্ট্রেন, 4 মাস বয়সী) মিঠা পানির বিনিময়ে সরবরাহ করা অ্যাকোয়ারিয়ামে 14/10 ঘন্টা আলো/অন্ধকার চক্রের অধীনে 28 ডিগ্রিতে বজায় রাখা হয়েছিল। তাদের প্রতিদিন দুইবার সদ্য হ্যাচড ব্রাইন চিংড়ির খাদ্যের সাথে রাখা হত (চেন এট আল।, 2018)। সাধারণত নিষিক্ত ভ্রূণগুলিকে একটি হালকা বৃদ্ধির ইনকিউবেটরে 3 দিনের পোস্ট-ফর্টিলাইজেশন (ডিপিএফ) পর্যন্ত নির্বাচন করা হয় এবং সংস্কৃতি করা হয়। সমস্ত প্রাণী পরীক্ষা পশু পরীক্ষার জন্য প্রতিষ্ঠান এবং সরকারের নির্দেশিকা অনুসারে ছিল।
2.3 নেটওয়ার্ক ফার্মাকোলজিকাল প্রক্রিয়া
2.3.1 রাসায়নিক স্থান গণনা এবং প্রার্থী যৌগ স্ক্রীনিং
CT এর সমস্ত রাসায়নিক উপাদান ডেটা ঐতিহ্যগত চাইনিজ মেডিসিন সিস্টেম ফার্মাকোলজি ডেটাবেস এবং বিশ্লেষণ প্ল্যাটফর্ম থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল। TCMSP হল চীনা ভেষজ ওষুধের একটি সিস্টেম ফার্মাকোলজি প্ল্যাটফর্ম যা ওষুধ, লক্ষ্য এবং রোগের মধ্যে সম্পর্ক ক্যাপচার করে (Ru et al., 2014)। ইতিমধ্যে, TCMSP-তে চারটি অপরিহার্য ফার্মাকোলজি-সম্পর্কিত প্যারামিটারগুলি প্রধান উপাদান বিশ্লেষণের (PCA) জন্য অর্জিত হয়েছিল, যার মধ্যে রয়েছে আণবিক ওজন (MW), অক্টানল এবং জলের মধ্যে পার্টিশন সহগ (AlogP), হাইড্রোজেন দাতা গণনা (Hdon), এবং হাইড্রোজেন গ্রহণকারী গণনা (Hdon) হ্যাক)। সিটির রাসায়নিক বিতরণ SIMCA সফ্টওয়্যার (সংস্করণ 14.1, Umetrics) ব্যবহার করে উপরের পরামিতিগুলির সাথে তৈরি করা হয়েছিল। এবং ড্রাগব্যাঙ্ক থেকে AD/OP-এর জন্য অনুমোদিত ছোট অণু ওষুধ একই কোর্সে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল। সিটি থেকে উপাদানগুলি ড্রাগ-সদৃশ (ডিএল) দ্বারা ফিল্টার করা হয়েছিল। DL হল একটি গুণগত ধারণা যেটি ড্রাগ ডিজাইনে ব্যবহৃত একটি সম্ভাব্য যৌগ কতটা "ড্রাগের মতো" তা অনুমান করার জন্য। এই অত্যাবশ্যক সম্পত্তিটি ঐতিহ্যগত চীনা ভেষজ উদ্ভিদের "মাদক-সদৃশ" যৌগের জন্য নির্বাচনের মানদণ্ড হিসাবে ব্যবহৃত হয় এবং এটি ফার্মাকোকিনেটিক্স এবং ফার্মাসিউটিক্যাল বৈশিষ্ট্যগুলিকে অপ্টিমাইজ করতে সাহায্য করে (টাও এট আল।, 2013)। সাহিত্য এবং TCMSP-তে পরামর্শের উপর ভিত্তি করে, আমরা ফিল্টার শর্ত হিসাবে 0.18 এর চেয়ে বড় বা সমান DL নির্বাচন করেছি। অবস্থার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ উপাদানগুলি পরবর্তী বিশ্লেষণের জন্য রপ্তানি করা হয়েছিল। তাদের 2-মাত্রিক (2D) এবং 3D কাঠামো ChemDraw Professional 16.0 সফ্টওয়্যার দ্বারা আঁকা হয়েছে। এবং 3D কাঠামোগুলি Chem3D 16.0-এ শক্তি হ্রাস করার ফাংশন দ্বারা অপ্টিমাইজ করা হয়েছিল।
2.3.2 OP এবং AD সংশ্লিষ্ট লক্ষ্য সংগ্রহ
OP এবং AD এর জন্য সমস্ত জিন অ্যাসোসিয়েশন স্বাধীনভাবে DisGeNET এবং GeneCards থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল। DisGeNET ডাটাবেস হ'ল মানব রোগের সাথে যুক্ত জিন এবং রূপগুলির সর্বজনীনভাবে উপলব্ধ আবিষ্কারের প্ল্যাটফর্মগুলির মধ্যে একটি (Pinero et al., 2017)। GeneCards হল মানব জিনের একটি সমন্বিত ডাটাবেস যার মধ্যে রয়েছে জিনোমিক, ট্রান্সক্রিপ্টমিক, প্রোটিওমিক, জেনেটিক, ক্লিনিক্যাল এবং কার্যকরী তথ্য (Safran et al., 2010)।
2.3.3 যৌগিক লক্ষ্য সংগ্রহ এবং বিপরীত ডকিং পূর্বাভাস
জিনকার্ডস ডাটাবেস এবং সুইস টার্গেট প্রেডিকশন ডাটাবেসকে সিটিতে সক্রিয় উপাদানগুলির প্রাসঙ্গিক লক্ষ্যগুলির পূর্বাভাস দেওয়ার জন্য একত্রিত করা হয়েছিল। GeneCards যৌগগুলির পরিচিত সক্রিয় লক্ষ্যগুলি নির্দেশ করে, যেখানে সুইস টার্গেট প্রেডিকশন ডাটাবেস ছোট অণুর সবচেয়ে সম্ভাব্য ম্যাক্রোমোলিকুলার লক্ষ্যগুলি অনুমান করতে পারে (ডাইনা এট আল।, 2019)। ভবিষ্যদ্বাণী করার আগে, ওপেন ব্যাবেল (সংস্করণ 2.4.1) ব্যবহার করে প্রার্থীর অণুগুলির গঠনগুলি mol2 ফরম্যাট থেকে SMILES ফর্ম্যাটে রূপান্তরিত হয়েছিল।
2.3.4 প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া বিশ্লেষণ
CT-OP-AD শেয়ার করা লক্ষ্যগুলির একটি গ্রুপের মধ্যে মিথস্ক্রিয়া আবিষ্কার করতে STRING ডাটাবেস প্রয়োগ করা হয়েছিল। "হোমো সেপিয়েন্স" এর প্যাটার্নের অধীনে অনুসন্ধান করার পর, সাইটোস্কেপ (সংস্করণ 3.7.2) সফ্টওয়্যার দ্বারা প্রোটিন-প্রোটিন মিথস্ক্রিয়া (PPI) নেটওয়ার্কটি কল্পনা করা হয়েছিল। STRING হল পরিচিত এবং ভবিষ্যদ্বাণীকৃত PPI-এর একটি ডাটাবেস, যা জিনোমিক প্রেক্ষাপটের পূর্বাভাস, উচ্চ-থ্রুপুট ল্যাব পরীক্ষা, (সংরক্ষিত) সহ-অভিব্যক্তি, স্বয়ংক্রিয় পাঠ্য মাইনিং এবং ডেটাবেসে পূর্ববর্তী জ্ঞান (Szklarczyk et al., 2017) থেকে প্রাপ্ত।
আলঝাইমার রোগের জন্য সিস্টানচে ভালো।
2.3.5 GO এবং KEGG পাথওয়ে সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণ
জিন অন্টোলজি (জিও) সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণ ফানরিচ সফ্টওয়্যারে সম্পাদিত হয়েছিল। ফানরিচ (সংস্করণ 3.1.3) হল একটি কার্যকরী সফ্টওয়্যার যা প্রধানত জিন এবং প্রোটিন সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহৃত হয় (পাঠান এট আল।, 2015)। ConsensusPathDB-মানুষ ডাটাবেস পাথওয়ে সমৃদ্ধি বিশ্লেষণ পরিচালনা করার জন্য নিযুক্ত করা হয়েছিল। প্রাপ্ত জিন তালিকা 0.01 হিসাবে "p-মান কাটঅফ" সেটিং সহ ডাটাবেসে জমা দেওয়া হয়েছিল। ফলাফল পাওয়ার পর, শুধুমাত্র OP এবং/অথবা AD সম্পর্কিত এই পথগুলিকে বেছে নেওয়া হয়েছিল এবং কেইজিজি ফাংশন বিভাগ অনুসারে গ্রুপে বিভক্ত করা হয়েছিল। CPDB হল বাইনারি এবং জটিল প্রোটিন-প্রোটিন, জেনেটিক, বিপাকীয়, সিগন্যালিং, জিন নিয়ন্ত্রক, এবং ড্রাগ-টার্গেট মিথস্ক্রিয়া, সেইসাথে হোমো সেপিয়েন্সের জৈব রাসায়নিক পথ (কাম্বুরভ এট আল।, 2013) ধারণকারী একটি বিরামবিহীন মিথস্ক্রিয়া নেটওয়ার্ক।
2.4 ওপি জেব্রাফিশ মডেলের জন্য পরীক্ষামূলক পদ্ধতি
2.4.1 মডেল গ্রুপিং
জেব্রাফিশ লার্ভাকে কয়েকটি গ্রুপে ভাগ করা হয়েছিল: কন্ট্রোল গ্রুপ, মডেল গ্রুপ, মডেল প্লাস ইডি গ্রুপ, মডেল প্লাস যৌগ গ্রুপ, যার প্রতিটিতে 30 লার্ভা রয়েছে। কন্ট্রোল গ্রুপটি 0.2 শতাংশ DMSO সহ মিডিয়ামে বজায় রাখা হয়েছিল। মডেল গ্রুপটিকে 3 ডিপিএফ থেকে 8 ডিপিএফ পর্যন্ত প্রি (25 µM) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। মডেল প্লাস এড গ্রুপকে প্রি এবং এড (30 µg/mL) এর সাথে সহ-চিকিৎসা করা হয়েছিল।
2.4.2 আলিজারিন লাল দাগ
বিভিন্ন যৌগ সহ 5 দিন সংস্কৃতির পরে, লার্ভাকে চেতনানাশক, স্থির এবং পালাক্রমে ব্লিচ করা হয়েছিল। আলিজারিন লাল জেব্রাফিশের মাথার হাড়গুলিতে দাগ দেওয়ার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। অতিরিক্ত অপসারণের জন্য যথাক্রমে 1 শতাংশ KOH এবং গ্লিসারল (3:1, 1:1 এবং 1:3 অনুপাত) প্রয়োগ করা হয়েছিল। অবশেষে, একটি স্টেরিওমাইক্রোস্কোপ (অলিম্পাস এসজেডএক্স 16) প্রবণ অবস্থানের নীচে জেব্রাফিশের স্টেনিং চিত্রগুলি ক্যাপচার করার জন্য নিযুক্ত করা হয়েছিল। ইমেজ-প্রো প্লাস 6 দ্বারা স্টেনিং এরিয়া এবং ইন্টিগ্রেটেড অপটিক্যাল ডেনসিটি (IOD) গণনা করা হয়েছিল৷{11}}৷
2.4.3 ALP এবং TRAP কার্যকলাপ নির্ধারণ
3 dpf-এর জেব্রাফিশ লার্ভাগুলিকে 6-কূপ প্লেটে উপসংস্কৃতি করা হয়েছিল এবং 5 দিনের জন্য যৌগের উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিতে প্রি-এর সাথে ইনকিউব করা হয়েছিল৷ তারপর ALP কার্যকলাপ পরিমাপের জন্য তাদের সংগ্রহ করা হয়েছিল। নির্মাতার প্রোটোকলের উপর ভিত্তি করে জেব্রাফিশ ALP ELISA কিট ব্যবহার করে ALP কার্যকলাপ নির্ধারণ করা হয়েছিল। TRAP কার্যকলাপ মূল্যায়ন করার পদ্ধতি ALP এর মতই ছিল।
2.5 এডি জেব্রাফিশ মডেলের জন্য পরীক্ষামূলক পদ্ধতি
2.5.1 মডেল গ্রুপিং
জেব্রাফিশ লার্ভাকে কয়েকটি গ্রুপে বিভক্ত করা হয়েছিল: কন্ট্রোল গ্রুপ, মডেল গ্রুপ, মডেল প্লাস ডিপিজেড গ্রুপ, মডেল প্লাস যৌগ গ্রুপ, যার প্রতিটিতে 30 লার্ভা রয়েছে। কন্ট্রোল গ্রুপটি 0.2 শতাংশ DMSO সহ মিডিয়ামে বজায় রাখা হয়েছিল। মডেল গ্রুপটিকে AlCl3 (150 µM, pH 5.8) দিয়ে 3 dpf থেকে 6 dpf পর্যন্ত চিকিত্সা করা হয়েছিল। মডেল প্লাস DPZ গ্রুপ AlCl3 এবং DPZ (8 µM) এর সাথে সহ-চিকিৎসা করা হয়েছিল।
2.5.2 আচরণগত বিশ্লেষণ
ওষুধ সরবরাহের 3 দিন পর, ভিউপয়েন্ট আচরণ বিশ্লেষক (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) দ্বারা লার্ভা চলাচল রেকর্ড করা হয়েছিল। সমস্ত পরীক্ষা-নিরীক্ষা 28˚C তাপমাত্রায় 60 মিনিটে সম্পন্ন হয়েছিল, যার মধ্যে আলো/অন্ধকার পর্বের 3টি চক্র রয়েছে (আলো এবং অন্ধকারের জন্য প্রতিটি 10 মিনিট)। পূর্ববর্তী প্রতিবেদনের পদ্ধতি অনুসারে, গড় গতি (AS), গতি পরিবর্তন (∆S), dyskinesia রিকভারি রেট (DRR, সমীকরণ a), এবং প্রতিক্রিয়া দক্ষতা (RE, সমীকরণ b) এডি-বিরোধী ওষুধের কার্যকারিতা হিসাবে নির্বাচিত হয়েছে। এই মডেলে মূল্যায়ন সূচক (Pan et al., 2019; Wenhai et al., 2016)।
AS (mm/sec)=D / T, DRR ( শতাংশ )=100 × (ASDrug - ASModel) / (ASControl - ASModel), a
যেখানে D হল 60 মিনিটের সময় জেব্রাফিশের চলাচলের দূরত্ব, T হল পরীক্ষামূলক সময়।
RE ( শতাংশ )=100 × (∆SDrug - ∆SModel) / (∆SCcontrol - ∆SModel), b
যেখানে ∆S হল আলো/অন্ধকার চক্রে জেব্রাফিশের গতি পরিবর্তন।
2.5.3 ACHE এবং চ্যাট কার্যকলাপ পরিমাপ
3 ডিপিএফ-এ জেব্রাফিশ লার্ভাগুলিকে 6-কূপ প্লেটে উপসংস্কৃতি করা হয়েছিল এবং 3 দিনের জন্য যৌগের উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিতে AlCl3 দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। তারপর তারা ACHE কার্যকলাপের জন্য সংগ্রহ করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের প্রোটোকলের উপর ভিত্তি করে জেব্রাফিশ ACHE ELISA কিট ব্যবহার করে AChE কার্যকলাপ সনাক্ত করা হয়েছিল। চ্যাট কার্যকলাপ মূল্যায়ন করার পদ্ধতি AChE এর মতই ছিল।
2.6 পরিমাণগত রিয়েল-টাইম পিসিআর বিশ্লেষণ
জেব্রাফিশ লার্ভা ওপি এবং এডি গ্রুপে বিভক্ত ছিল। OP গোষ্ঠীগুলি 3 dpf থেকে 8 dpf পর্যন্ত সংস্কৃত কন্ট্রোল গ্রুপ, প্রি গ্রুপ এবং প্রি প্লাস কম্পাউন্ড গ্রুপ নিয়ে গঠিত। AD গ্রুপের মধ্যে কন্ট্রোল গ্রুপ, AlCl3 গ্রুপ এবং AlCl3 প্লাস যৌগ গ্রুপ অন্তর্ভুক্ত ছিল, 3 dpf থেকে 5 dpf পর্যন্ত সংস্কৃত। প্রতিটি গ্রুপে 30টি লার্ভা থাকে। মোট আরএনএ যথাক্রমে ট্রিজল দ্বারা এই জেব্রাফিশ লার্ভা নমুনা থেকে বের করা হয়েছিল। সিডিএনএ কিটের প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে আরএনএ নমুনাগুলি সিডিএনএ-তে বিপরীত প্রতিলিপি করা হয়েছিল। mRNA এক্সপ্রেশন স্তরটি রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্ট পরিমাণগত পিসিআর (Roche LightCycler96) দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল। ফলাফলগুলিকে -অ্যাক্টিন এক্সপ্রেশনে স্বাভাবিক করা হয়েছিল এবং তুলনামূলক (2−∆∆Ct) পদ্ধতি দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল। ব্যবহৃত ফরোয়ার্ড এবং রিভার্স প্রাইমারগুলি সানগন বায়োটেক (সাংহাই, চীন) দ্বারা সংশ্লেষিত হয়েছিল এবং পরিপূরক সারণী S1 এ তালিকাভুক্ত হয়েছিল।
cistanche এবং Tongkat ali পাউডারঅনাক্রম্যতা উন্নত করতে সাহায্য করে।
আরো তথ্যের জন্য, এখানে ক্লিক করুন।
2.7 পরিসংখ্যান বিশ্লেষণ
গ্রাফপ্যাড প্রিজম সংস্করণ 8৷{1}} বর্ণনামূলক পরিসংখ্যান বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল৷ ডেটাকে গড় ± SD হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছিল এবং P 0.05 এর কম বা সমান তাৎপর্যপূর্ণ হিসাবে বিবেচনা করে প্রতিটি ট্রায়ালের মধ্যে পরিবর্তনশীলতা পরীক্ষা করার জন্য ANOVA পদ্ধতি দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।
