পার্ট 1: একটি ক্লোনড কুকুর তৈরি করার জন্য কোষ রক্ষাকারী হিসাবে অ্যাক্টিওসাইডের প্রভাব

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1, Eun Young Kim1, Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1, Kil Woo Han1, Kang-Sun Park1, Kyung-Bon Lee2, Min Kyu Kim1*

প্রাণী ও দুগ্ধ বিজ্ঞানের 1 বিভাগ, কৃষি ও জীবন বিজ্ঞান কলেজ, চুংনাম জাতীয় বিশ্ববিদ্যালয়, ডেজিয়ন, কোরিয়া প্রজাতন্ত্র,

2 জীববিজ্ঞান শিক্ষা বিভাগ, শিক্ষা কলেজ,চোন্নাম ন্যাশনাল ইউনিভার্সিটি, গুয়াংজু, কোরিয়া প্রজাতন্ত্র

যোগাযোগ:joanna.jia@wecistanche.com

অনুগ্রহ করে পার্ট 2-এ এখানে ক্লিক করুন

বিমূর্ত

সোম্যাটিক সেল নিউক্লিয়ার ট্রান্সফার (SCNT) একটি সুপরিচিত পরীক্ষাগার কৌশল। SCNT-এর নীতির মধ্যে একটি প্রাপক oocyte যার নিউক্লিয়াস অপসারণ করা হয়েছে তার মধ্যে একটি সোম্যাটিক কোষ ইনজেকশনের মাধ্যমে একটি সোম্যাটিক নিউক্লিয়াসকে পুনরায় প্রোগ্রাম করা জড়িত। অতএব, নিউক্লিয়াস দাতা কোষগুলিকে SCNT-তে একটি গুরুত্বপূর্ণ ফ্যাক্টর হিসাবে বিবেচনা করা হয়। G0/G1 পর্যায়ে নিউক্লিয়াস দাতা কোষের কোষ চক্র সিঙ্ক্রোনাইজেশন যোগাযোগ বাধা বা সিরাম অনাহার দ্বারা প্ররোচিত হতে পারে। এই গবেষণায়,অ্যাক্টিওসাইড, একটি phenylpropanoid গ্লাইকোসাইড যৌগ, এটি কোষ চক্র সিঙ্ক্রোনাইজেশন, সাইটোপ্রোটেকশন, এবং ক্যানাইন ভ্রূণ ফাইব্রোব্লাস্টে SCNT দক্ষতা উন্নত করার জন্য প্রযোজ্য কিনা তা নির্ধারণ করার জন্য তদন্ত করা হয়েছিল। প্রাথমিক ক্যানাইন ভ্রূণ ফাইব্রোব্লাস্টের সাথে চিকিত্সা করা হয়েছিলঅ্যাক্টিওসাইড(10, 30, 50 μM) বিভিন্ন সময়ের জন্য (24, 48, এবং 72 ঘন্টা)। G0/G1 পর্যায়ে কোষ চক্র সিঙ্ক্রোনাইজেশন আবেশের পদ্ধতির সাথে উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন ছিল না:অ্যাক্টিওসাইডচিকিত্সা, যোগাযোগ বাধা, বা সিরাম অনাহার। যাইহোক, এই তিনটি চিকিত্সার মধ্যে, সিরাম অনাহারের ফলে প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতির (ROS) (99.5 ± 0.3 শতাংশ) এবং অ্যাপোপটোসিসের মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে। ফলাফলেও তা প্রকাশ পেয়েছেঅ্যাক্টিওসাইডক্যানাইন ভ্রূণের ফাইব্রোব্লাস্টে নেক্রোসিস সহ ROS এবং অ্যাপোপটোসিস প্রক্রিয়া হ্রাস এবং কোষের বেঁচে থাকা উন্নত। ক্যানাইন ভ্রূণের ফাইব্রোব্লাস্ট দিয়ে চিকিত্সা করা হয়অ্যাক্টিওসাইডG0/G1 পর্যায়ে সফলভাবে গ্রেফতার করা হয়েছে। তদুপরি, অ্যাক্টিওসাইড দিয়ে চিকিত্সা করা নিউক্লিয়াস দাতা কোষ ব্যবহার করে পুনর্গঠিত ভ্রূণগুলি একটি সুস্থ ক্লোনড কুকুর তৈরি করেছিল, তবে যোগাযোগ বাধাগ্রস্ত নিউক্লিয়াস দাতা কোষ ব্যবহার করে উত্পাদিত ভ্রূণগুলি নয়। উপসংহারে,অ্যাক্টিওসাইডসাইটোপ্রোটেক্টিভ প্রভাবের কারণে ক্যানাইন SCNT-এর কার্যকারিতা উন্নত করার জন্য নিউক্লিয়াস দাতা কোষের প্ররোচিত কোষ চক্র সিঙ্ক্রোনাইজেশন একটি বিকল্প পদ্ধতি হবে।

Cistanche acteoside রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা বাড়াতে পারে

ভূমিকা

SCNT কৌশলটি কৃষি কাজের জন্য এবং জৈব চিকিৎসা সম্পদ হিসাবে জেনেটিক্যালি উন্নত বা চালিত প্রাণী উত্পাদন করতে ব্যবহৃত হয়েছে। রোগের প্রাণীর মডেল, বিলুপ্তির ঝুঁকিতে থাকা প্রাণীদের উদ্ধার, পুনর্জন্মের ওষুধের জন্য স্টেম সেল, অঙ্গ প্রতিস্থাপন ইত্যাদির ক্রমবর্ধমান প্রয়োজনীয়তার সাথে, সাম্প্রতিক সময়ে SCNT ব্যবহার করে প্রাণীদের ক্লোনিং করার আগ্রহ বাড়ছে [1-5]। যদিও ক্লোন করা প্রাণীর উৎপাদন সফল হয়েছে, তবুও SCNT এর কার্যকারিতা এখনও খুবই কম [6]। কম SCNT ভ্রূণ বিকাশগত যোগ্যতার কারণগুলির মধ্যে অনেকগুলি কারণ রয়েছে যা প্রাপক ওসাইটের গুণমান, নিউক্লিয়াস দাতা কোষের গুণমান এবং সারোগেট মায়ের অবস্থা [7-10] এর সাথে সম্পর্কিত।

প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতি (আরওএস) এবং অ্যাপোপটোসিস ভিভো এবং ভিট্রো [১১-১৪] তে ওসাইট বিকাশ সহ মহিলা প্রজনন প্রক্রিয়ায় জড়িত বলে জানা গেছে। ROS সাইটোপ্লাজমিক ঘনীভবন, ডিএনএ ক্ষতি এবং ভ্রূণে অ্যাপোপটোসিস প্ররোচিত করে ভ্রূণের বিকাশে বাধা দেয়। সমর্থক গবেষণায় জানা গেছে যে ROS হ্রাস করা ভিট্রো সংস্কৃতির [15-17] সময় SCNT ভ্রূণ বিকাশের দক্ষতা উন্নত করে। অ্যাপোপটোসিস হল একটি শারীরবৃত্তীয় প্রক্রিয়া যা স্বাভাবিক প্রি-ইমপ্লান্টেশন ভ্রূণের বিকাশের সময় স্বতঃস্ফূর্তভাবে ঘটে যাতে ডিএনএ ক্ষতিগ্রস্ত/অকার্যকর কোষগুলিকে সরিয়ে সেলুলার হোমিওস্ট্যাসিস বজায় থাকে। ROS ডিএনএ ফ্র্যাগমেন্টেশন ঘটায় এবং অ্যাপোপটোটিক ব্লাস্টোমেয়ার বাড়ায় যা ভ্রূণের বিকাশে ব্যাঘাত ঘটায়। আরওএস এবং অ্যাপোপটোসিসের ঘটনাটি ভিট্রো ফার্টিলাইজেশনের [18, 19] পরে এসসিএনটির পরে বেশি পরিলক্ষিত হয়। অনেক গবেষণায় জানা গেছে যে সেলেনিয়াম [২০], ইনসুলিন-ট্রান্সফারিন-সেলেনিয়াম [১৭, ২১], মেলাটোনিন [২২] এবং গ্লুটাথিয়ন [২৩] এর মতো অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট ব্যবহার করে ROS এবং অ্যাপোপটোসিসের মাত্রা হ্রাস করে SCNT ভ্রূণের বিকাশের দক্ষতা উদ্ধার করা হয়।

পূর্ববর্তী গবেষণায় জানা গেছে যে G{{0}}/G1 পর্যায়ে গ্রেফতারকৃত দাতা কোষের ব্যবহার SCNT [7, 9, 24-28] এর কার্যকারিতা উন্নত করেছে। G0/G1 পর্যায়ে দাতা কোষের ক্রোমাটিনকে SCNT ভ্রূণ বিকাশের দক্ষতার জন্য সবচেয়ে কার্যকর বলে মনে করা হয়েছে। দাতা কোষ চক্রকে সিঙ্ক্রোনাইজ করতে, যোগাযোগের বাধা, সিরাম অনাহার এবং রাসায়নিক চিকিত্সাগুলি প্রায়শই ব্যবহার করা হয়েছে [7, 25, 29, 30]। যাইহোক, সিরাম অনাহার কোষের বেঁচে থাকা হ্রাস করে এবং ডিএনএ বিভক্তকরণ বৃদ্ধি করে, যা অ্যাপোপটোসিসের দিকে পরিচালিত করে [31]। রাসায়নিক বাধা হল G0/G1 পর্যায়ে কোষ চক্রকে আটক করার আরেকটি কৌশল যেমন রোস্কোভিটাইন [২৯, ৩২], ডাইমিথাইল সালফোক্সাইড (DMSO) [৩৩] এবং সাইক্লোহেক্সিমাইড (CHX) [৩৪] ব্যবহার করে। সিঙ্ক্রোনাইজেশনের জন্য ব্যবহৃত পদ্ধতির কার্যকারিতা দাতা কোষের প্রকার এবং প্রজাতি দ্বারা প্রভাবিত হয়। সর্বোত্তম দাতা কোষ সিঙ্ক্রোনাইজেশনের জন্য, ব্যবহৃত পদ্ধতির বিভিন্ন দিক সাবধানে মূল্যায়ন করা প্রয়োজন।

অ্যাক্টিওসাইড(ভারবাস্কোসাইড নামেও পরিচিত) [{{0}}(3, 4-ডাইহাইড্রক্সি ফিনাইল ইথাইল)-1-ওএল-রহ্যামনোপাইরানোসিল-(1 / 3)-বিডি-({{13} }O-caffeoyl)-glucopyranoside] সিরিঙ্গা ভালগারিসের বেগুনি ফুল থেকে বিচ্ছিন্ন। অ্যাক্টিওসাইড ধারণকারী গাছগুলিতে অ্যান্টি-মাইক্রোবিয়াল এবং অ্যান্টি-ফাঙ্গাল কার্যকলাপ রয়েছে [৩৫-৩৭] এবং প্রদাহ প্রতিরোধ করে বলে জানা গেছে। প্রকৃতপক্ষে, অ্যাক্টিওসাইড ভিট্রো এবং ভিভোতে বিভিন্ন জৈবিক ক্রিয়াকলাপ প্রদর্শন করে যেমন অ্যান্টি-অক্সিডেটিভ কার্যকলাপ, অ্যান্টি-অ্যাপোপ্টোটিক কার্যকলাপ, বিভিন্ন টিউমার কোষের বিরুদ্ধে সাইটোটক্সিসিটি, এবং সাইক্লিন-নির্ভর হিসাবে G0/G1 পর্যায়ে কোষ চক্র সিঙ্ক্রোনাইজেশন। kinase (CDK) ইনহিবিটর [38]। উদাহরণস্বরূপ লি এট আল [38] রিপোর্ট করা হয়েছে যে অ্যাক্টিওসাইড চিকিত্সা G0/G1 পর্যায়ে কোষ চক্র গ্রেপ্তারকে প্ররোচিত করে মানুষের প্রোমাইলোসাইটিক HL-60 লিউকেমিয়া কোষের বিস্তারকে বাধা দিতে পারে। যাইহোক, ক্যানাইন SCNT এর দক্ষতার উপর অ্যাক্টিওসাইড-চিকিত্সা করা দাতা কোষের প্রভাব এখনও অধ্যয়ন করা হয়নি।

এই গবেষণায়, এর প্রভাবঅ্যাক্টিওসাইডকোষ চক্র সিঙ্ক্রোনাইজেশন, ROS, এবংapoptosisক্যানাইন ভ্রূণের ফাইব্রোব্লাস্টগুলিতে তদন্ত করা হয়েছিল। কোষ চক্র সিঙ্ক্রোনাইজেশন, আরওএস এবং অ্যাপোপটোসিসের বিশ্লেষণ ফ্লুরোসেন্স-অ্যাক্টিভেটেড সেল সর্টিং (এফএসিএস) ব্যবহার করে সম্পাদিত হয়েছিল। অ্যাক্টিওসাইড দিয়ে চিকিত্সা করা দাতা কোষের কার্যকারিতা প্রদর্শনের জন্য, SCNT ভ্রূণগুলিকে একটি প্রাপক কুকুরে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল এবং সফলভাবে একটি সুস্থ ক্লোনড কুকুর তৈরি করা হয়েছিল।

cistancheচিকিৎসা করতে পারেকিডনিরোগের উন্নতিরেনালফাংশন

উপকরণ এবং পদ্ধতিসমূহ

নীতিশাস্ত্র বিবৃতি

এই গবেষণায়, 44টি মহিলা মঙ্গেল কুকুর (1-6 বছর বয়সী) oocyte দাতা এবং ভ্রূণ স্থানান্তর সারোগেট হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল এবং ভ্রূণের ফাইব্রোব্লাস্ট সেল লাইন স্থাপনের জন্য একটি মহিলা বিগল (2 বছর বয়সী) ব্যবহার করা হয়েছিল। সমস্ত প্রাণীর পরীক্ষা-নিরীক্ষা চুংনাম জাতীয় বিশ্ববিদ্যালয়ের ইনস্টিটিউশনাল অ্যানিমাল কেয়ার অ্যান্ড ইউজ কমিটি (IACUC) দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল (অনুমোদন নম্বর: CNU-00487) এবং IACUC দ্বারা প্রকাশিত "দ্যা গাইড ফর দ্য কেয়ার অ্যান্ড ইউজ অব ল্যাবরেটরি অ্যানিমালস" অনুসারে সঞ্চালিত হয়েছিল। চুংনাম জাতীয় বিশ্ববিদ্যালয়ের। কুকুরগুলিকে একটি তাপমাত্রা এবং বায়ুচলাচল নিয়ন্ত্রণ ব্যবস্থা সহ পৃথক খাঁচায় বাড়ির অভ্যন্তরে উত্থাপন করা হয়েছিল। কুকুরকে প্রতিদিন একবার একটি বাণিজ্যিক খাদ্য খাওয়ানো হত এবং জলের অ্যাড লিবিটাম দেওয়া হত। সমস্ত প্রাণী পরীক্ষায়, কুকুরকে প্রাথমিকভাবে 6 মিলিগ্রাম/কেজি কেটামিন এবং জাইলাজিন দিয়ে অ্যানেস্থেটাইজ করা হয়েছিল এবং 2 শতাংশ আইসোফ্লুরেন দিয়ে চেতনানাশক অবস্থায় রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল। অস্ত্রোপচারের শেষে, অ্যান্টিবায়োটিকগুলি (প্রোকেইন পেনিসিলিন জি, বেনজাথিন পেনিসিলিন জি, এবং ডিহাইড্রোস্ট্রেপ্টোমাইসিন সালফেট) কোনও সংক্রমণ প্রতিরোধ করার জন্য দেওয়া হয়েছিল। অস্ত্রোপচারের পরে, কুকুরগুলিকে মিঠা জলের সাথে তাদের নিজস্ব খাঁচায় স্থানান্তর করা হয়েছিল, পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল এবং দায়িত্বে থাকা পশুচিকিত্সকের কাছ থেকে বিশেষ যত্ন প্রদান করা হয়েছিল, যাতে পশুদের প্রয়োজন হলে প্রয়োজনীয় চিকিত্সা পরিচালনা করা যেতে পারে।

রাসায়নিক

সমস্ত রাসায়নিক সিগমা-অলড্রিচ কেমিক্যাল কোং (সেন্ট লুইস, এমও, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) থেকে কেনা হয়েছে যদি না অন্যথায় বলা হয়। অ্যাক্টিওসাইড চীনের চেংডু বায়োপিউরিফাই ফাইটোকেমিক্যালস লিমিটেড থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল।

ক্যানাইন ভ্রূণের ফাইব্রোব্লাস্টের বিচ্ছিন্নতা

ক্যানাইন ভ্রূণের ফাইব্রোব্লাস্টগুলি {{0}} দিন বয়সী ভ্রূণ থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। সংক্ষেপে, একটি মহিলা বিগলকে একটি পুরুষ বিগলের শুক্রাণু দিয়ে কৃত্রিমভাবে প্রজনন করা হয়েছিল। 28 দিন পর, মহিলা বিগলের গর্ভাবস্থা নিশ্চিত করা হয়েছিল এবং সেলিওহিস্টেরেক্টমি দ্বারা 5টি ভ্রূণ পাওয়া গিয়েছিল। ফসফেট-বাফারযুক্ত স্যালাইনে ভ্রূণ তিনবার ধৌত করা হয়েছিল (PBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA)। ভ্রূণের মাথা, অভ্যন্তরীণ অঙ্গ এবং অঙ্গগুলি অস্ত্রোপচারের ব্লেড দিয়ে মুছে ফেলা হয়েছিল এবং শরীরের অবশিষ্ট অংশগুলি পিবিএস-এ কিমা করা হয়েছিল। ভ্রূণের টুকরোগুলিকে 400 × 5 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং ডালবেকোর মডিফাইড ঈগলস মিডিয়াম (DMEM; Gibco) 1 শতাংশ পেনিসিলিন-স্ট্রেপ্টোমাইসিন (পণ্য নং P4458) এবং 20 শতাংশ seibcorum (বোবিএস) দ্বারা পরিপূরক করা হয়েছিল। 5 শতাংশ CO2 এবং 95 শতাংশ বাতাসের আর্দ্র বায়ুমণ্ডলে 39 ডিগ্রিতে। যখন কোষগুলি 5-7 দিন পরে সঙ্গমে পৌঁছেছিল, তখন তাদের 0.25 শতাংশ ট্রিপসিন-ইডিটিএ (জিবকো) দিয়ে 2 মিনিটের জন্য চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং ফসল কাটা হয়েছিল। দুটি ক্যানাইন ভ্রূণ ফাইব্রোব্লাস্ট সেল লাইন দুটি পৃথক ভ্রূণ থেকে প্রতিষ্ঠিত হয়েছিল। কোষগুলিকে FBS-এ 10 শতাংশ DMSO-তে হিমায়িত করা হয়েছিল এবং ব্যবহার না করা পর্যন্ত -196 ডিগ্রিতে তরল নাইট্রোজেনে সংরক্ষণ করা হয়েছিল৷

কোষ চিকিত্সা

৮ পরবর্তী পরীক্ষার জন্য কোষগুলি 4 থেকে 7 বার কাটা হয়েছিল এবং পাস করা হয়েছিল। 60 মিমি সংস্কৃতির খাবারে 106/mL ঘনত্বে কোষগুলি বীজ করা হয়েছিল। কোষগুলিকে (1) DMEM 10 শতাংশ FBS এবং 1 শতাংশ পেনিসিলিন-স্ট্রেপ্টোমাইসিন দিয়ে পাঁচ দিনের জন্য পরিপূরক (যোগাযোগ প্রতিরোধ), (2) DMEM 0.5 শতাংশ FBS এবং 1 শতাংশ পেনিসিলিন-স্ট্রেপ্টোমাইসিন দিয়ে পাঁচ দিনের জন্য পরিপূরক (সিরাম অনাহার) এর মধ্যে সংষ্কৃত করা হয়েছিল। , অথবা (3) DMEM 10 শতাংশ FBS এবং 1 শতাংশ পেনিসিলিন-স্ট্রেপ্টোমাইসিন সহ 10 μM, 30 μM, বা 50 μM 24 h, 48 h, এবং 72 h (অ্যাক্টিওসাইড চিকিত্সা) এ অ্যাক্টিওসাইড ধারণকারী।

প্রবাহ সাইটোমেট্রি দ্বারা কোষ চক্র বিশ্লেষণ

কোষ চক্রের পর্যায়গুলির বিশ্লেষণের জন্য, কোষগুলি {{0}} ব্যবহার করে সংগ্রহ করা হয়েছিল। 25 শতাংশ ট্রিপসিন-ইডিটিএ ব্যবহার করে এবং সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে পিবিএস দিয়ে 3 বার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। শেষ ধোয়ার পরে, সুপারন্যাট্যান্টগুলি বাতিল করা হয়েছিল এবং কোষগুলিকে 0.3 মিলি পিবিএস-এ পুনরায় চালু করা হয়েছিল। ফিক্সেশনের জন্য, {{10}}.7 মিলি ঠান্ডা পরম ইথানল সেল সাসপেনশনে ড্রপ-ওয়াইজ যোগ করা হয়েছিল, মৃদু ঘূর্ণি দ্বারা মিশ্রিত করা হয়েছিল, এবং 4 ডিগ্রিতে রাতারাতি সংরক্ষণ করা হয়েছিল। স্থির কোষগুলিকে সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং ঠান্ডা পিবিএস দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। কোষগুলিকে 0.25 মিলি পিবিএস-এ 5 μL 10 mg/mL RNase এর সাথে সম্পূরক পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল এবং 37 ডিগ্রিতে 1 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল। তারপর, 1 mg/mL প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড (PI) এর 10 μL যোগ করা হয়েছিল। FACS ক্যালিবুর ফ্লো সাইটোমিটার ব্যবহার করে G0/G1 (2n), S (2n এবং 4n এর মধ্যে), এবং G2/M (4n) পর্যায়ে কোষের জনসংখ্যার ডিএনএ বিষয়বস্তুর পরিমাণের দ্বারা কোষ চক্র বিশ্লেষণ করা হয়েছিল (বেক্টন ডিকিনসন, সান জোসে, CA) , আমেরিকা).

প্রবাহ সাইটোমেট্রি দ্বারা ROS সনাক্তকরণ

লাইভ কোষে ROS একটি Image-iT™ লাইভ গ্রীন রিঅ্যাকটিভ অক্সিজেন প্রজাতি সনাক্তকরণ কিট (মলিকুলার প্রোব, ইউজিন, বা, ইউএসএ) ব্যবহার করে মূল্যায়ন করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, সংস্কৃতির মাধ্যমটি অপসারণের পরে কোষগুলি পিবিএস-এ ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং 100 μM tert-butyl hydroperoxide (TBHP) কার্যকরী সমাধানের 2 মিলি যোগ করা হয়েছিল। 1 ঘন্টার জন্য 37 ডিগ্রীতে ইনকিউবেশনের পরে, TBHP কার্যকারী দ্রবণটি সরানো হয়েছিল, এবং কোষগুলিকে উষ্ণ Dulbecco-এর ফসফেট-বাফারযুক্ত স্যালাইনে (DPBS; Gibco) 3 বার আলতোভাবে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। তারপরে কোষগুলিকে 25 μM 5-(এবং-6)-কারবক্সি-2,7–ডিক্লোরোডিহাইড্রো-ফ্লুরোসেসিন ডায়াসেটেট (কারবক্সি-এইচ2ডিসিএফডিএ) 37 ডিগ্রিতে 30 মিনিটের জন্য অন্ধকারে কার্যকরী দ্রবণে ইনকিউব করা হয়েছিল . যখন অক্সিডাইজ করা হয়, কার্বক্সি-H2DCFDA সবুজ প্রতিপ্রভ নির্গত করে, যা প্রবাহ সাইটোমেট্রি দ্বারা ROS-এর মূল্যায়ন সহজতর করে। TBHP, যা ROS উৎপাদনের একটি প্রবর্তক, একটি ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। কোষের নিউক্লিয়াস Hoechst 33342 দিয়ে দাগযুক্ত ছিল। পিবিএস দিয়ে 3 বার ধোয়ার পর, কোষগুলি ট্রিপসিনাইজেশনের মাধ্যমে সংগ্রহ করা হয়েছিল, পিবিএস-এ স্থগিত করা হয়েছিল এবং এফএসিএস ক্যালিবার ফ্লো সাইটোমিটার ব্যবহার করে ROS সনাক্ত করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল (বেক্টন ডিকিনসন, সান জোসে, CA, USA ) ROS গঠনের হার গণনা করা হয়েছিল ROS পজিটিভ কোষের সংখ্যাকে মোট সেল সংখ্যা দ্বারা ভাগ করে এবং মানগুলিকে শতাংশে রূপান্তর করে।

প্রবাহ সাইটোমেট্রি দ্বারা অ্যাপোপটোসিস বিশ্লেষণ

Apoptosis বিশ্লেষণ একটি Vybran1 Apoptosis Assay Kit #2 (মলিকুলার প্রোব, ইউজিন, OR, USA) ব্যবহার করে সম্পাদিত হয়েছিল। সংক্ষেপে, কোষগুলি ট্রিপসিনাইজেশন দ্বারা সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং ঠান্ডা পিবিএস দিয়ে 2 বার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। তারপরে, কোষগুলিতে 1x অ্যানেক্সিন-বাইন্ডিং বাফারের 100 μL, অ্যালেক্সা ফ্লুর 488 অ্যানেক্সিন ভি-এর 5 μL এবং PI-এর 1 μL যোগ করা হয়েছিল। ঘরের তাপমাত্রায় 15 মিনিটের জন্য ইনকিউবেশনের পরে, 1× অ্যানেক্সিন-বাইন্ডিং বাফারের 400 μL যোগ করা হয়েছিল এবং সেল সাসপেনশনটি আলতোভাবে মিশ্রিত হয়েছিল। অ্যানেক্সিন ভি, যা একটি Ca2 প্লাস-নির্ভর ফসফোলিপিড-বাইন্ডিং প্রোটিনের ফসফ্যাটিডিলসারিন (PS) এর জন্য উচ্চ সম্পর্ক রয়েছে। জীবন্ত কোষে, পিএস অভ্যন্তরীণ সাইটোপ্লাজমিক ঝিল্লিতে অবস্থিত এবং অ্যাপোপটোটিক কোষে বাইরের সাইটোপ্লাজমিক ঝিল্লিতে স্থানান্তরিত হয়। অ্যাপোপটোটিক কোষগুলিকে অ্যানেক্সিন ভি লেবেলযুক্ত অ্যালেক্সা ফ্লুর 488 দ্বারা আলাদা করা হয় যা বাইরের ঝিল্লিতে পিএসের সাথে আবদ্ধ হয়। এছাড়াও, PI, যা একটি নিউক্লিক অ্যাসিড বাঁধাই রঞ্জক, লাল প্রতিপ্রভ সহ নেক্রোটিক কোষগুলিকে দাগ দেয়। অতএব, সবুজ ফ্লুরোসেন্স সহ অ্যাপোপটোটিক কোষ, লাল ফ্লুরোসেন্স সহ নেক্রোটিক কোষ এবং কোষে সামান্য বা কোন ফ্লুরোসেন্স নেই এমন জীবন্ত কোষ এফএসিএস ক্যালিবার ফ্লো সাইটোমিটার (বেক্টন ডিকিনসন, সান জোসে, সিএ, ইউএসএ) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। লাইভ, নেক্রোটিক বা অ্যাপোপটোটিক কোষের কোষ সংখ্যাকে মোট কোষ সংখ্যার সাথে ভাগ করে এবং গণনা করা মানগুলিকে শতাংশে রূপান্তর করে হারগুলি গণনা করা হয়েছিল।

ভিভো পরিপক্ক oocytes সংগ্রহ

প্রতিটি কুকুরের ডিম্বস্ফোটন শনাক্ত করার জন্য, সিরাম প্রোজেস্টেরন (P4) ঘনত্ব একটি DSL-3900অ্যাক্টিভ প্রোজেস্টেরন কোটেড-টিউব রেডিওইমিউনোসায় কিট (ডায়াগনস্টিক সিস্টেম ল্যাবরেটরিজ, ইনক., TX, USA) ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল। পূর্বে বর্ণিত [39, 40] হিসাবে, যেদিন P4 ঘনত্ব 4 ng/mL ছাড়িয়ে গিয়েছিল তাকে ডিম্বস্ফোটনের দিন হিসাবে বিবেচনা করা হত। ডিম্বস্ফোটনের 72 ঘন্টা পরে, অ্যাসেপটিক অস্ত্রোপচার পদ্ধতি ব্যবহার করে ল্যাপারোটমি দ্বারা ওসাইটগুলি পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল। ডিম্বনালীর ফিমব্রিয়াটি বার্সাল স্লিটের মাধ্যমে প্রবেশ করা হয়েছিল এবং একটি উল্টানো ফ্ল্যাঞ্জযুক্ত বাল্ব স্টিল সুই (18 গেজ, 7.5 সেমি) ব্যবহার করে ক্যানুলেট করা হয়েছিল। একটি 24 গেজ ইন্ট্রাভেনাস (IV) ক্যাথেটার (Angiocath™ Plus, Becton Dickison Korea Inc., Seoul, Korea) জরায়ুটুবাল জংশনের কাছে ডিম্বনালীর ইসথমাসে ঢোকানো হয়েছিল এবং মাঝারি 199 (Gibco) 1 শতাংশ পেনিসিলিন এবং রেপটোমাইসিন-স্টার্টোমাইসিনের সাথে সম্পূরক ছিল। IV ক্যাথেটারের মাধ্যমে ডিম্বনালীতে 5 শতাংশ FBS প্রবর্তিত হয়েছিল। Oocites অবিলম্বে পরীক্ষাগারে স্থানান্তরিত করা হয়. 31টি কুকুর থেকে মোট 316 টি oocytes সংগ্রহ করা হয়েছিল।

সোমাটিক সেল পারমাণবিক স্থানান্তর এবং ভ্রূণ স্থানান্তর SCNT পূর্বে বর্ণিত হিসাবে সঞ্চালিত হয়েছিল [39]। সংক্ষেপে, ভিভো পরিপক্ক ওসাইট থেকে কিউমুলাস কোষ অপসারণ করতে, কিউমুলাস-ওসাইট-কমপ্লেক্স (সিওসি) পুনরাবৃত্তভাবে 0.1 শতাংশ হায়ালুরোনিডেসে পাইপেট করা হয়েছিল। প্রথম পোলার বডি এবং মেটাফেজ-II ক্রোমোজোমগুলি উচ্চাকাঙ্ক্ষা দ্বারা সরানো হয়েছিল। Hoechst 33342 (bisbenzimide) দিয়ে দাগ দেওয়ার মাধ্যমে Enucleation নিশ্চিত করা হয়েছিল। ক্যানাইন ভ্রূণের ফাইব্রোব্লাস্টগুলিকে 48 ঘন্টার জন্য 30 μM অ্যাক্টিওসাইড দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং তারপরে 0.25 শতাংশ ট্রিপসিন- EDTA দিয়ে কাটা হয়েছিল। একটি একক কোষ, যার একটি মসৃণ কোষের ঝিল্লি রয়েছে, প্রতিটি এনউক্লিয়েটেড ওসাইটের পেরিভিটেলাইন স্পেসে স্থানান্তরিত হয়েছিল। কাপলেটগুলি সুষম আধানের মাধ্যম ছিল, যা 0.26 এম ম্যানিটল মাধ্যম যার মধ্যে 0.1 মিমি হেপস, 0.5 মিমি এমজিএসও4, এবং 0.05 শতাংশ বিএসএ রয়েছে এবং দুটি ডাল দ্বারা মিশ্রিত হয়েছে একটি ইলেক্ট্রো-সেল ফিউশন যন্ত্রপাতি (NEPA জিন কোং, চিবা, জাপান) থেকে সরাসরি কারেন্ট (15 μs এর জন্য 69–75 V)। এই কাপলেটগুলি 1 ঘন্টা 30 মিনিটের জন্য 10 শতাংশ FBS এর সাথে পরিপূরক মাঝারি 199 এ ইনকিউবেট করা হয়েছিল। মিশ্রিত SCNT ভ্রূণগুলি পরীক্ষা করা হয়েছিল এবং তাদের 10 μM ক্যালসিয়াম আয়নোফোর (পণ্য নং C7522, সিগমা) 4 মিনিটের জন্য ইনকিউব করে রাসায়নিক সক্রিয়করণ প্ররোচিত হয়েছিল। SCNT ভ্রূণগুলিকে ধুয়ে তারপর একটি পরিবর্তিত সিন্থেটিক ওভিডাক্টাল ফ্লুইড মিডিয়াম (mSOF) [41] এ 1.9 mM 6-ডাইমেথাইলামিনোপিউরিন (6-DMAP) 3 ঘন্টা 30 মিনিটের জন্য রাখা হয়েছিল। ইঞ্জিনিয়ারড ভ্রূণগুলি SCNT-এর পরে 4 ঘন্টার মধ্যে অস্ট্রাস-সিঙ্ক্রোনাইজড সারোগেটের ডিম্বনালীতে অস্ত্রোপচারের মাধ্যমে স্থানান্তরিত হয়েছিল। ভ্রূণ স্থানান্তরের পর 26 দিনে (প্রথম দিকে) আল্ট্রাসনোগ্রাফির মাধ্যমে গর্ভাবস্থা নিশ্চিত করা হয়েছিল।

সক্রিয় উপাদানঅ্যাক্টিওসাইডভিতরেcistanche

ক্লোন করা ভ্রূণের ভিট্রো সংস্কৃতি

SCNT-এর পরে, ক্লোন করা ভ্রূণগুলি 5 শতাংশ CO2 এবং 95 শতাংশ বায়ুতে 38.5 ডিগ্রিতে খনিজ তেল দিয়ে আবৃত একটি পরিবর্তিত সিন্থেটিক ডিম্বাশয় ফ্লুইড মিডিয়াম (mSOF) (10 ক্লোনড ভ্রূণ প্রতি মাইক্রোড্রপের) 40 μL মাইক্রো ড্রপগুলিতে সংষ্কৃত করা হয়েছিল। SCNT ভ্রূণের বিকাশ 2 দিন থেকে 8 দিন পর্যন্ত পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।

একটি ক্লোনড কুকুরের মাইক্রোস্যাটেলাইট এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ বিশ্লেষণ

মোট ডিএনএ পারমাণবিক দাতা কোষ থেকে বের করা হয়েছে এবং উৎপাদকের নির্দেশিকা অনুসারে জি-স্পিন™ জিনোমিক ডিএনএ এক্সট্রাকশন কিট (আইএনট্রন বায়োটেকনোলজি, সিওংনাম, কোরিয়া) দ্বারা ওসাইট ডোনার কুকুর, সারোগেট কুকুর এবং ক্লোন করা কুকুরের চামড়া, এবং তারপর TE বাফারের 100 μL (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) তে নির্গত হয়েছিল। ডিএনএর পরিমাণ বায়োস্পেক-ন্যানো স্পেকট্রোফটোমিটার (শিমাদজু কর্পোরেশন, জাপান) দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল।

মাইক্রোস্যাটেলাইট জিনোটাইপিংয়ের জন্য, নিম্নলিখিত 7টি নির্দিষ্ট জিন নির্বাচন করা হয়েছিল: PEZ1, PEZ3, PEZ8, PEZ12, FH2010, FH2054, এবং FH2079৷ পিসিআর 95 ডিগ্রিতে 10 মিনিটের জন্য প্রাথমিক বিকৃতকরণের সাথে সঞ্চালিত হয়েছিল, 95 ডিগ্রিতে 30 সেকেন্ডের জন্য 20টি চক্র, 58 ডিগ্রিতে 30 সেকেন্ড অ্যানিলিং (-0.1 ডিগ্রি/সাইকেল), এক্সটেনশনের 1 মিনিট 72 ডিগ্রী, এবং 15 টি আরো চক্রের মধ্যে 95 ডিগ্রীতে 30 সেকেন্ডের জন্য বিকৃতকরণ, 56 ডিগ্রীতে 30 সেকেন্ড অ্যানিলিং, 72 ডিগ্রীতে 1 মিনিট এক্সটেনশন এবং 10 মিনিটের জন্য 72 ডিগ্রীতে চূড়ান্ত এক্সটেনশন রয়েছে।

মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য, ক্যানাইন এমটিডিএনএর সম্পূর্ণ নিউক্লিওটাইড সিকোয়েন্স ব্যবহার করে (জেনব্যাঙ্ক অ্যাসেশন নং: U96639), নিম্নলিখিত অলিগোনিউক্লিওটাইড প্রাইমারগুলি সংশ্লেষিত হয়েছিল: সাইটোক্রোম বি অঞ্চল (L14,252 –L14,631) F:;; সাইটোক্রোম সি অক্সিডেস সাবুনিট II (L7,054—L7,465) F: ATGGCGTACCCATTTCAACT,R: GGATGGTTATTTTCTATTGG; 16S rRNA (L2,033 –L2,472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT,R: AGGACTTTAATCGTTGAAC; ডি-লুপ অঞ্চল (L15,622 - L16,030) F: CATAGGACATTAACTCAATC,R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]। এই বিশ্লেষণের জন্য PCR চক্রের মধ্যে রয়েছে: 5 মিনিটের জন্য 95 ডিগ্রী প্রারম্ভিক বিকৃতকরণ, 95 ডিগ্রিতে 30 সেকেন্ডের জন্য 5 সাইকেল ডিনাচুরেশন, 60 ডিগ্রিতে 40 সেকেন্ড অ্যানিলিং (-1 ডিগ্রি/সাইকেল), এক্সটেনশনের 1 মিনিট 72 ডিগ্রী, এবং পরবর্তী 30 সাইকেল 30 সেকেন্ডের জন্য 95 ডিগ্রীতে, 55 ডিগ্রীতে 40 সেকেন্ড অ্যানিলিং, 72 ডিগ্রীতে 1 মিনিট এক্সটেনশন এবং 10 মিনিটের জন্য 72 ডিগ্রীতে চূড়ান্ত এক্সটেনশন। এবিআই প্রিজম 3100 জেনেটিক অ্যানালাইজার (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেম ইনক।, ইউএসএ) ব্যবহার করে বিভিন্ন পরীক্ষা-নিরীক্ষার পিসিআর টুকরা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। বায়োএডিট সফ্টওয়্যার (v.7.0.5.3) দিয়ে সিকোয়েন্স সমাবেশ, একাধিক প্রান্তিককরণ, এবং নিয়ন্ত্রণ অঞ্চলগুলির জন্য প্রান্তিককরণ ছাঁটাই করা হয়েছিল।

অ্যাক্টিওসাইডভিতরেcistancheরোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা বাড়াতে পারে