ISG15-সেন্সর MDA5 এর নির্ভরশীল অ্যাক্টিভেশন হোস্ট ইননেট ইমিউনিটি এড়াতে SARS-CoV-2 Papain-এর মতো প্রোটিজ দ্বারা বিরোধী

RIG-I-এর মতো রিসেপ্টর, retinoic-অ্যাসিড ইন্ডুসিবল জিন I (RIG-I), এবং মেলানোমা ডিফারেন্সিয়েশন-সম্পর্কিত প্রোটিন 5 (MDA5) সক্রিয়করণ ইন্টারফেরন (IFN)-উত্তেজক জিন (ISGs) আপগ্রেগুলেট করে একটি অ্যান্টিভাইরাল অবস্থা প্রতিষ্ঠা করে। এর মধ্যে রয়েছে ISG15, যার যান্ত্রিক ভূমিকা সহজাত অনাক্রম্যতা এখনও রহস্যজনক। বর্তমান গবেষণায়, আমরা রিপোর্ট করি যে ভাইরাল আরএনএ সেন্সর MDA5 দ্বারা মধ্যস্থতা করা অ্যান্টিভাইরাল IFN প্রতিক্রিয়াগুলির জন্য ISG15 সংযোজন অপরিহার্য। MDA5-এর ক্যাসপেস অ্যাক্টিভেশন এবং রিক্রুটমেন্ট ডোমেনগুলির ISGylation এর অলিগোমারাইজেশনকে উৎসাহিত করে এবং এর ফলে করোনাভাইরাস, ফ্ল্যাভিভাইরাস এবং পিকোর্নাভাইরাস সহ বিভিন্ন ভাইরাসের বিরুদ্ধে সহজাত অনাক্রম্যতা সক্রিয় করে। MDA5-এর ISG15-নির্ভরশীল সক্রিয়তা SARS-CoV-2, একটি সম্প্রতি উদ্ভূত করোনাভাইরাস যা কোভিড-19 মহামারী সৃষ্টি করেছে এর প্যাপেইন-সদৃশ প্রোটিস দ্বারা মধ্যস্থতা করে সরাসরি ডি-আইএসজিলেশনের মাধ্যমে বিরোধিতা করা হয় . আমাদের কাজ MDA5-মধ্যস্থতামূলক অ্যান্টিভাইরাল প্রতিক্রিয়াতে ISG15-এর জন্য একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা প্রদর্শন করে এবং SARS-CoV-2-এর একটি প্রধান প্রতিরোধ ক্ষমতা ফাঁকি দেওয়ার প্রক্রিয়াও চিহ্নিত করে, যা নতুন অ্যান্টিভাইরাল এবং ভ্যাকসিনগুলির বিকাশের জন্য লক্ষ্য করা যেতে পারে কোভিডের বিরুদ্ধে লড়াই করুন-19।

cistanche tubulosa- ইমিউন সিস্টেম উন্নত

Cistanche Enhance Immunity পণ্য দেখতে এখানে ক্লিক করুন

【আরো জন্য জিজ্ঞাসা করুন】 ইমেল:cindy.xue@wecistanche.com / Whats অ্যাপ: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

হোস্ট ইমিউন হোমিওস্টেসিসের ভাইরাল বিপর্যয় সহজাত ইমিউন সিস্টেম দ্বারা পর্যবেক্ষণ করা হয়, যা রিসেপ্টরগুলির উপর নির্ভর করে যা বিপদ- বা প্যাথোজেন-সম্পর্কিত আণবিক প্যাটার্ন (PAMPs)1-3 অনুভব করে। RIG-I-এর মতো রিসেপ্টর (RLRs) RIG-I এবং MDA5 ভাইরাল বা হোস্ট-ডিরাইভড ইমিউনোস্টিমুলেটরি RNAs4-এর জন্য সাইটোপ্লাজম জরিপ করে ভাইরাস সনাক্তকরণের জন্য গুরুত্বপূর্ণ। C-টার্মিনাল ডোমেইন (CTD) এবং RIG-I এবং MDA5-এর হেলিকেসের সাথে RNA-এর আবদ্ধতা তাদের সিগন্যালিং-প্রাইমড কনফর্মেশনের দিকে নিয়ে যায় যা বেশ কয়েকটি এনজাইম নিয়োগের অনুমতি দেয়। এই এনজাইমগুলি একাধিক ডোমেন এবং সাইটে RLR-কে সংশোধন করে এবং পোস্ট-ট্রান্সলেশনাল পরিবর্তনগুলি (PTMs) বিশেষ করে ক্যাসপেস অ্যাক্টিভেশন এবং রিক্রুটমেন্ট ডোমেন (CARD), সিগন্যালিং মডিউলগুলির জন্য ভালভাবে অধ্যয়ন করা হয়। প্রোটিন ফসফেটেস 1 (PP1) / RIG-I এবং MDA5 CARDs6 কে ডিফসফোরিলেট করে। RIG-I-এর ক্ষেত্রে, dephosphorylation TRIM25 (25 সমন্বিত ত্রিপক্ষীয় মোটিফ) এবং অন্যান্য E3 ligases7,8 দ্বারা কার্ডগুলির Lys63-লিঙ্কযুক্ত পলিউবিকিউটিনেশনকে উৎসাহিত করে, যা RIG-I-এর অলিগোমেরিক ফর্মকে স্থিতিশীল করে, যার ফলে অ্যান্টিভাইরালকোন্ড্রি সক্রিয় করে। -সিগন্যালিং প্রোটিন (MAVS) বাঁধাই। RIG-I এর সাথে তুলনা করে, MDA5 অ্যাক্টিভেশনের পৃথক পদক্ষেপ এবং জড়িত সমালোচনামূলক PTMগুলি কম বোঝা যায়। RLR অ্যাক্টিভেশন টাইপ I এবং III IFN-এর উত্পাদনকে প্ররোচিত করে, যা ঘুরে, ISGs9,10 আপ-রেগুলেট করে অ্যান্টিভাইরাল সংকেত প্রচার করে। এর মধ্যে রয়েছে ISG15, একটি ubiquitin-এর মতো প্রোটিন যা টার্গেট প্রোটিনের লাইসিন অবশিষ্টাংশের সাথে সংযোজিত হতে পারে, একটি PTM প্রক্রিয়া যার নাম ISGylation11। যদিও ISG15 কনজুগেশন ব্যাপকভাবে অ্যান্টিভাইরাল 12 কাজ করার জন্য স্বীকৃত হয়েছে, হোস্ট প্রোটিন ISGylation এর প্রক্রিয়া যা ISG15 এর বিস্তৃত অ্যান্টিভাইরাল সীমাবদ্ধতা কার্যকলাপ ব্যাখ্যা করতে পারে তা বর্তমানে অজানা। চলমান COVID-19 মহামারীর কার্যকারক এজেন্ট, গুরুতর তীব্র শ্বাসযন্ত্রের সিন্ড্রোম করোনভাইরাস 2 (SCoV2), করোনাভাইরিডে পরিবারের অন্তর্গত যার মধ্যে বেশ কিছু অন্যান্য মানব প্যাথোজেন রয়েছে। করোনাভাইরাসগুলির IFN-মধ্যস্থিত অ্যান্টিভাইরাল প্রতিক্রিয়াগুলিকে দমন করার একটি ব্যতিক্রমী ক্ষমতা রয়েছে এবং গুরুতর রোগের সাথে সম্পর্কিত SCoV2-সংক্রমিত রোগীদের মধ্যে কম IFN উৎপাদন ১৩৷ করোনাভাইরাল IFN বিরোধীদের মধ্যে রয়েছে প্যাপেইন-লাইক প্রোটিজ (PLpro) যার ডিউবিকিউটিনেটিং এবং ডি-আইএসজিলেটিং কার্যক্রম রয়েছে 14,15। বর্তমান গবেষণায়, আমরা MDA5 অ্যাক্টিভেশনে ISGylation-এর জন্য একটি অপরিহার্য ভূমিকা চিহ্নিত করি। আমরা আরও দেখাই যে SCoV2 PLpro MDA5 এর সাথে মিথস্ক্রিয়া করে এবং সক্রিয় ডি-ISGylation এর মাধ্যমে ISG15-নির্ভর MDA5 অ্যাক্টিভেশনের বিরোধিতা করে, উন্মোচন করে যে SCoV2 ইতিমধ্যে MDA5 দ্বারা প্রতিরোধী নজরদারি এড়াতে বিকশিত হয়েছে।

ফলাফল

MDA5, কিন্তু RIG-I নয়, সিগন্যালিং এর জন্য ISG15 প্রয়োজন।

MDA5 অ্যাক্টিভেশন নিয়ন্ত্রণ করতে পারে এমন MDA5 কার্ডগুলির PTM শনাক্ত করার জন্য, আমরা অ্যাফিনিটি-পিউরিফাইড MDA5–2CARD-কে গ্লুটাথিয়ন-এস-ট্রান্সফারেজ (GST–MDA5–2CARD) বা GST-এর সাথে মিশ্রিত তরল ক্রোমাটোগ্রাফি এবং টেন্ডেম ভর স্পেকট্রোমেট্রি (এলসি) এর সাথে সংযুক্ত করেছি। –MS/MS), এবং দেখা গেছে যে, বিশেষ করে, GST-MDA5–2CARD ISG15-এর সাথে সহ-বিশুদ্ধ করা হয়েছে, যা দুটি ব্যান্ড হিসাবে আবির্ভূত হয়েছে যেগুলি অপরিবর্তিত GST-MDA5–2CARD (বর্ধিত ডেটা) থেকে ধীরে ধীরে (~15 এবং 30 kDa দ্বারা) স্থানান্তরিত হয়েছে। চিত্র 1a)। ইমিউনোব্লটিং (IB) নিশ্চিত করেছে যে GST–MDA5–2CARD ISG15 (বর্ধিত ডেটা চিত্র 1b) দ্বারা পরিবর্তিত হয়েছে৷ আমরা পরবর্তীতে MDA5-প্ররোচিত সিগন্যালিংয়ের জন্য ISG15 এর প্রাসঙ্গিকতা নির্ধারণ করেছি। যেখানে ওয়াইল্ড-টাইপ (WT) মাউস ভ্রূণীয় ফাইব্রোব্লাস্ট (MEFs)-এ FLAG-MDA5 এক্সপ্রেশন IFN- মেসেঞ্জার RNA এবং প্রোটিনের পাশাপাশি Ccl5 ট্রান্সক্রিপ্টকে ডোজ-নির্ভর করে, Isg15−/− MEFs-এ FLAG-MDA5 এক্সপ্রেশনের ফলে অ্যান্টিভাইরাল জিন এবং প্রোটিন এক্সপ্রেশন (চিত্র 1a এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র 1c)। একইভাবে, আইএসজি 15 নকআউট (কেও) হেলা (মানুষ) কোষে অ্যান্টিভাইরাল জিন আবেশ দৃঢ়ভাবে হ্রাস পেয়েছে, ডব্লিউটি কন্ট্রোল সেল (চিত্র 1 বি এবং এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র 1 ডি), একটি প্রজাতি-নির্দিষ্ট প্রভাব বাতিল করে। বিপরীতে, FLAG-RIG-I তুলনীয় পরিমাণে নিঃসৃত IFN- প্রোটিনের পাশাপাশি Ifnb1 এবং Ccl5 প্রতিলিপিগুলি Isg15−/− এবং WT MEFs (চিত্র 1a এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র 1c) তে প্ররোচিত করেছে। IFNB1 এবং CCL5 ট্রান্সক্রিপ্টের পাশাপাশি FLAG-RIG-I দ্বারা IFN- প্রোটিন উৎপাদন WT কোষের তুলনায় ISG15 KO HeLa কোষে অনুরূপ বা সামান্য বর্ধিত ছিল (চিত্র 1b এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র 1d), পূর্ববর্তী রিপোর্টগুলির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যে ISGylation নেতিবাচক RIG-I সংকেত 16,17 প্রভাবিত করে

চিত্র 1|MDA5 এর জন্য ISGylation প্রয়োজন, কিন্তু RIG-I, সংকেত নয়। a,b, IFN-এর ELISA- MEFs (WT বা Isg15−/−) (a) এবং HeLa কোষ (WT বা ISG15 KO) (b) ফ্ল্যাগ-ট্যাগযুক্ত MDA5 বা RIG-I এর ক্রমবর্ধমান পরিমাণে ক্ষণস্থায়ীভাবে স্থানান্তরিত ৪0 ঘণ্টা। হোল-সেল লাইসেট (ডব্লিউসিএল) আইবি দ্বারা অ্যান্টি-আইএসজি 15, অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ এবং অ্যান্টি-অ্যাক্টিন (লোডিং নিয়ন্ত্রণ) দিয়ে তদন্ত করা হয়েছিল। c, IFN-এর ELISA- WT বা Isg15−/− MEF-এর সুপারন্যাট্যান্ট থেকে যেগুলি EMCV RNA (0.1 বা 0.4 µg ml−1 ), HMW-পলি দিয়ে উপহাসিত বা স্থানান্তরিত হয়েছিল (I: C) (0.5 µg ml−1 ) বা RABVLe (1 pmol ml−1 ), অথবা SeV (10 haemagglutination ইউনিট (HAU) ml−1 ) দ্বারা সংক্রমিত 24 জ. d, WT-এ Ifnb1, Ccl5, এবং Tnf mRNA-এর RT–qPCR বিশ্লেষণ এবং গ-এর মতো উদ্দীপিত MEFs। e, NHLF-এর WCL-তে IRF3 ফসফোরিলেশন যা 30 ঘন্টার জন্য নির্দেশিত siRNAs দ্বারা স্থানান্তরিত হয়েছিল এবং তারপর 6 ঘন্টার জন্য ইএমসিভি আরএনএ (0.4 µg ml−1 ) বা RABVLe (1 pmol ml−1 ) দ্বারা উপহাসিত বা স্থানান্তরিত হয়েছিল। অ্যান্টি-pSer396-IRF3 এবং অ্যান্টি-IRF3 সহ IB। f, IFN-এর ELISA- NHLF-এর সুপারন্যাট্যান্টদের থেকে যেগুলি 30 ঘন্টার জন্য নির্দেশিত siRNAs দ্বারা স্থানান্তরিত হয়েছিল এবং তারপরে EMCV RNA (0.4 µg ml−1 ) বা RABVLe (1 pmol ml−1 ) দ্বারা উপহাসিত বা স্থানান্তরিত হয়েছিল, বা SeV দ্বারা সংক্রমিত হয়েছিল (10 HAU ml−1 ) 16 ঘন্টার জন্য। g, IFN-এর ELISA- PBMC-এর সুপারন্যাট্যান্ট থেকে যেগুলিকে 40 ঘন্টার জন্য নির্দেশিত shRNA লেন্টিভাইরাল কণার সাথে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল এবং তারপর 8 ঘন্টার জন্য mutEMCV (MOI=10) বা SeV (200 HAU ml−1 ) দ্বারা সংক্রমিত হয়েছিল৷ h, পিবিএমসি-তে IFNA2 এবং IL-6 mRNA-এর RT–qPCR বিশ্লেষণ যেগুলি g-এর মতো ট্রান্সডুসড এবং সংক্রামিত হয়েছিল। ডেটা অনুরূপ ফলাফল সহ কমপক্ষে দুটি স্বাধীন পরীক্ষার প্রতিনিধিত্ব করে (a–d এবং f-এ n= 3 জৈবিক প্রতিলিপির ± sd, এবং g এবং h-তে n= 2 জৈবিক প্রতিলিপিগুলির গড়)। *পি< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test). ND, not detected; NS, not significant.

আমরা পরবর্তীতে তাদের নিজ নিজ লিগ্যান্ড দ্বারা অন্তঃসত্ত্বা MDA5 এবং RIG-I সক্রিয়করণের উপর ISG15 জিন মুছে ফেলার প্রভাব পরীক্ষা করেছি। IFN- উৎপাদনের পাশাপাশি IFNB1, CCL5, এবং TNF জিনের অভিব্যক্তি এনসেফালোমায়োকার্ডাইটিস ভাইরাস (EMCV) RNA বা উচ্চ-আণবিক-ওজন (HMW)-পলি(I: C), উভয়ই প্রধানত MDA5 দ্বারা অনুভূত হয়। তাদের নিজ নিজ কন্ট্রোল সেলের তুলনায় Isg15−/− MEF, ISG15 KO HeLa এবং ISG15 KO HAP-1 কোষগুলিতে গভীরভাবে ক্ষয় করা হয়েছে (চিত্র 1c,d এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র 1e–g)। গুরুত্বপূর্ণভাবে, ISG15 KO কোষে EMCV RNA বা HMW-poly(I:C) দ্বারা অ্যান্টিভাইরাল জিন ইন্ডাকশন বাতিল করা MDA5 জিনের অভিব্যক্তির কারণে হয়নি; বিপরীতে, MDA5 mRNA এক্সপ্রেশন WT কোষের তুলনায় ISG15 KO কোষে উন্নত করা হয়েছিল (বর্ধিত ডেটা চিত্র 1f,g)। MDA5 অ্যাগোনিস্টের সাথে উদ্দীপনার বিপরীতে, রেবিস ভাইরাস লিডার RNA (RABVLe) ট্রান্সফেকশন বা সেন্ডাই ভাইরাস (SeV) সংক্রমণ দ্বারা Isg15−/− MEFs এবং ISG15 KO HeLa কোষের উদ্দীপনা, যা RIG-I উদ্দীপনা, IFN- উৎপাদনের দিকে পরিচালিত করে। অ্যান্টিভাইরাল জিন এক্সপ্রেশন WT কোষের সাথে তুলনীয় (চিত্র 1c,d এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র 1e)। ISG15 জিন-মুছে ফেলা কোষগুলির সাথে যুক্ত হতে পারে এমন সম্ভাব্য ক্লোনাল প্রভাবগুলিকে বাতিল করার জন্য, আমরা প্রাথমিক স্বাভাবিক মানব ফুসফুসের ফাইব্রোব্লাস্ট (NHLFs) এ ক্ষণস্থায়ী জিন-নিরবতা পরীক্ষা করেছি। ISG15 নীরবতা, MDA5 নকডাউনের অনুরূপ, IFN-নিয়ন্ত্রক ফ্যাক্টর 3 (IRF3)-এর ফসফোরিলেশনের প্রায়-সম্পূর্ণ ক্ষতির দিকে পরিচালিত করে—আরএলআর-সিগন্যাল অ্যাক্টিভেশনের একটি হলমার্ক—ইএমসিভি আরএনএ-এর সাথে উদ্দীপনা অনুসরণ করে কিন্তু RABVL IFN- উৎপাদনে বাধা দেয়নি। এনএইচএলএফ-এ অ্যান্টিভাইরাল ট্রান্সক্রিপ্ট এক্সপ্রেশন EMCV RNA দিয়ে ট্রান্সফেক্ট হয়েছে, কিন্তু RABVLe বা SeV দিয়ে উদ্দীপিত কোষে নয় (চিত্র 1f এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র। 1h)। প্রাথমিক মানব পেরিফেরাল ব্লাড মনোনিউক্লিয়ার কোষে (PBMCs) ISG15 বা MDA5-এর ছোট হেয়ারপিন (sh)RNA-মধ্যস্থিত সাইলেন্সিংও যথেষ্ট পরিমাণে অ্যান্টিভাইরাল প্রোটিন এবং ট্রান্সক্রিপ্ট এক্সপ্রেশন কমিয়ে দেয় একটি রিকম্বিন্যান্ট মিউট্যান্ট EMCV (mutEMCV) এর সাথে সংক্রমণের পরে MDA5 প্রতিপক্ষের ঘাটতি, 1918 এর সাথে। সংক্রামিত PBMCগুলি অ-টার্গেটিং নিয়ন্ত্রণ shRNA (চিত্র 1g,h এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র 1i) দ্বারা পরিবর্তিত হয়েছে। বিপরীতে, ISG15 বা MDA5 হ্রাস SeV সংক্রমণের পরে PBMC-তে সাইটোকাইন প্রতিক্রিয়াগুলিকে প্রভাবিত করেনি (চিত্র 1g,h এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র 1i)। এই ফলাফলগুলি দেখায় যে MDA5 দ্বারা ইমিউন সিগন্যালিংয়ের জন্য ISG15 অপরিহার্য, কিন্তু RIG-I নয়। MDA5 কার্ডগুলি Lys23 এবং Lys43 এ আইএসজিলেটেড।

পুরুষদের জন্য cistanche উপকারিতা-প্রতিরোধ ক্ষমতা শক্তিশালী করে

MDA5–2CARD ISGylation চিহ্নিত করা আমাদের MS বিশ্লেষণকে সমর্থন করার জন্য, আমরা প্রথমে পরীক্ষা করেছি যে অন্তঃসত্ত্বা MDA5ও ISG15 দ্বারা পরিবর্তিত হয়েছে কিনা। HMW-poly(I:C) দ্বারা স্থানান্তরিত কোষে অন্তঃসত্ত্বা MDA5 দৃঢ়ভাবে ISGylated ছিল, অথবা ডেঙ্গু (DENV) বা Zika (ZIKV) ভাইরাস দ্বারা সংক্রামিত হয়েছিল যা MDA5 (রেফ. 5) (চিত্র 2a) দ্বারা সংবেদিত হয়। উল্লেখযোগ্যভাবে, অন্তঃসত্ত্বা MDA5ও অসংক্রমিত কোষে ISGylated ছিল, যদিও খুব কম মাত্রায় (Extended Data Fig. 2a), যা পূর্ববর্তী অনুসন্ধানের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যে অনেক হোস্ট প্রোটিনও স্বাভাবিক (অসংক্রমিত) অবস্থায় নিম্ন স্তরে ISGylated হয়। IFNAR-সিগন্যালিং-মিডিয়াটেড ISG আপগ্র্যুলেশনকে ব্লক করতে অ্যান্টি-IFNAR2 দিয়ে চিকিত্সা করা কোষগুলিতে, ISG15 বা MDA5 সাইলেন্সিং মিউটইএমসিভি সংক্রমণের পরে IFNB1 জিনের অভিব্যক্তির তুলনামূলক হ্রাসের দিকে পরিচালিত করে (এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র 2b), নির্দেশ করে যে ISG15-নির্ভর MDA5 সিগন্যালিং এমনকি IFNAR সিগন্যালিংয়ের অনুপস্থিতিতেও ঘটে।

t MDA5Δ2CARD (হেলিকেস এবং CTD সমন্বিত), হল MDA5 ISGylation-এর প্রাথমিক সাইট যা ISGylated 2CARD (চিত্র 2b) এর জন্য দুটি বিশিষ্ট ব্যান্ড দেখাচ্ছে। WT ISG15 এর সাথে ISG15 KO HeLa কোষের পুনর্গঠন, অথবা একটি আন-সংযোজনযোগ্য ISG15 মিউট্যান্ট যেখানে কনজুগেশনের জন্য প্রয়োজনীয় দুটি গ্লাইসিনকে অ্যালানাইন (ISG15-AA)21 দিয়ে প্রতিস্থাপিত করা হয়েছিল, সমযোজী ISG15 কনজুগেশন (চিত্র 2c) প্রদর্শন করেছে। . GST-MDA5–2CARD-এ পৃথক লাইসিন অবশিষ্টাংশের মিউটেশন থেকে আরজিনিনে প্রকাশ করা হয়েছে যে Lys23 এবং Lys43-এর একক-সাইট মিউটেশন লক্ষণীয়ভাবে ISGylation (এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র 2c) হ্রাস করেছে, যেখানে তাদের সম্মিলিত মিউটেশন (Lys23Arg/Lys43Arg) প্রায় ISGylation (Lys23Arg/Lys43Arg). ) পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের FLAG-MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg এছাড়াও উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাসকৃত ISGylation (চিত্র 2e এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র 2d) দেখিয়েছে; FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg-এ দেখা অবশিষ্ট ISGylation সম্ভবত 2CARD এবং/অথবা Δ2CARD-এর অতিরিক্ত ছোটখাট সাইটগুলির কারণে। লক্ষণীয়, Lys23Arg/Lys43Arg মিউটেশন MDA5–2CARD SUMOylation5 (বর্ধিত ডেটা চিত্র 2e) প্রভাবিত করেনি। তদ্ব্যতীত, যেখানে RIG-I–2CARD দৃঢ়ভাবে সর্বব্যাপী ছিল (যা সমযোজী Lys63-লিঙ্কযুক্ত ubiquitination7 কে প্রতিনিধিত্ব করে), MDA5–2CARD WT বা Lys23Arg/Lys43Arg মিউট্যান্ট উভয়ই সর্বব্যাপী সনাক্তকরণযোগ্য মাত্রা দেখায়নি (এফএক্সটেন)। সম্মিলিতভাবে, এই ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে MDA5 কার্ডগুলি দুটি প্রধান সাইট, Lys23 এবং Lys43-এ ISGylation হয়।

MDA5 সক্রিয়করণের জন্য কার্ড আইএসজিলেশন প্রয়োজন।

তাদের সিগন্যাল-ট্রান্সডুসিং ক্ষমতার তুলনা করার সময়, MDA5-2CARD Lys23Arg এবং Lys43Arg একক-সাইট মিউট্যান্টগুলি WT MDA5-2CARD-এর তুলনায় আংশিকভাবে IFN- প্রমোটার অ্যাক্টিভেশন কমিয়ে দেখিয়েছিল, যেখানে Lys23Arg/Lys43Arg মিউট্যান্টের একটি গভীরভাবে ছিল, যা প্রায় শক্তিশালী সংকেত হিসাবে হ্রাস পেয়েছিল। সিগন্যালিং-ত্রুটিপূর্ণ মিউট্যান্টের মতো Ser88Glu এবং Ser88Asp6 (বর্ধিত ডেটা চিত্র 2g)। বিপরীতে, একটি মিউট্যান্ট যেখানে Lys68, যা Lys43 এবং Lys23-এর সবচেয়ে কাছাকাছি লাইসিন অবশিষ্টাংশ, তাকে আরজিনাইন (Lys68Arg) দিয়ে প্রতিস্থাপিত করা হয়েছিল, WT 2CARD (বর্ধিত ডেটা, চিত্র 2) এর সাথে তুলনীয় ISG15 কনজুগেশন এবং সিগন্যালিং দক্ষতা দেখিয়েছে। MDA5–2CARD Lys23Arg/Lys43Arg, WT MDA5–2CARD এর বিপরীতে, এছাড়াও IRF3 ডাইমারাইজেশন প্ররোচিত করতে ব্যর্থ হয়েছে (বর্ধিত ডেটা চিত্র 2h)। FLAG-MDA5 Lys23Arg, Lys43Arg বা Lys23Arg/Lys43Arg এছাড়াও FLAG-MDA5 WT (চিত্র 2f) এর তুলনায় IFN- প্রমোটার-অ্যাক্টিভেটিং ক্ষমতা হ্রাস পেয়েছে বা প্রায় বিলুপ্ত করেছে। MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg উচ্চ পরিমাণে প্রকাশ করার পরেও একটি গভীর সংকেত ত্রুটি দেখিয়েছে, যেখানে WT MDA5 ডোজ-নির্ভর পদ্ধতিতে অ্যান্টিভাইরাল ট্রান্সক্রিপ্টগুলিকে প্ররোচিত করেছে (চিত্র 2g)। চুক্তিতে, STAT1 ফসফোরিলেশন, IFNAR সিগন্যালিং এর একটি হলমার্ক, সেইসাথে ISG প্রোটিন এক্সপ্রেশন MDA5 WT দ্বারা অত্যন্ত প্ররোচিত হয়েছিল, কিন্তু Lys23Arg/Lys43Arg (চিত্র 2h) নয়। MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg বা Ser88Glu-এর সাথে MDA5-জিন-সম্পাদিত হিউম্যান অ্যাস্ট্রোসাইট (SVGAs) এর পরিপূরক WT MDA5 (চিত্র 2i) এবং এক্সপ্রেসিং কোষের তুলনায় IFNB1, CCL5 এবং ISG ট্রান্সক্রিপ্টগুলিকে ব্যাপকভাবে হ্রাস করেছে। . এই ফলাফলগুলি দেখায় যে MDA5-মধ্যস্থ সাইটোকাইন প্রতিক্রিয়াগুলির জন্য Lys23 এবং Lys43-এ ISGylation অপরিহার্য।

পুরুষদের জন্য cistanche উপকারিতা-প্রতিরোধ ক্ষমতা শক্তিশালী করে

PP1 দ্বারা Dephosphorylation MDA5 ISGylation নিয়ন্ত্রণ করে।

RIG-I এর মতো, MDA5 অসংক্রামিত কোষে কার্ডের মধ্যে ফসফরিলেটেড, যা স্বয়ংক্রিয়তা প্রতিরোধ করে; PP1 দ্বারা RIG-I এবং MDA5-এর dephosphorylation/ তাদের সংকেত-দমন অবস্থা থেকে RLR-গুলিকে মুক্ত করার জন্য অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ 6,22-24৷ RIG-I-এর ডিফোসফোরিলেশন Lys63-কার্ডগুলির লিঙ্কযুক্ত সর্বব্যাপী হওয়ার অনুমতি দেয়, যা RIG-I মাল্টিমারাইজেশন এবং সিগন্যালিংকে প্রচার করে। কিভাবে CARD ডিফসফোরিলেশন (Ser88-এ) MDA5 অ্যাক্টিভেশনকে ট্রিগার করে তার বিশদ বিবরণ অধরা থেকে গেছে, এবং তাই আমরা পরীক্ষা করেছি যে ডিফসফোরিলেশন MDA5 ISGylation নিয়ন্ত্রণ করে কিনা। PP1 এর নীরবতা / শক্তিশালীভাবে হ্রাস MDA5-2CARD আইএসজিলেশন (বর্ধিত ডেটা চিত্র 3a)। তদ্ব্যতীত, ফসফোমিমেটিক Ser88Glu এবং Ser88Asp মিউট্যান্টগুলি আইএসজিলেশন হ্রাস করেছিল, যেখানে ফসফো-নাল Ser88 আলা মিউট্যান্ট WT MDA5–2CARD (বর্ধিত ডেটা চিত্র 3b) এর চেয়ে শক্তিশালী আইএসজিলেশন দেখিয়েছিল। বিপরীতভাবে, MDA5 WT এবং Lys23Arg/Lys43Arg তুলনীয় Ser88 ফসফোরিলেশন ছিল (বর্ধিত ডেটা চিত্র 3c)। একসাথে, এই তথ্যগুলি পরামর্শ দেয় যে Ser88 এ MDA5 ডিফসফোরিলেশন কার্ড আইএসজিলেশনের আগে। আমরা পরবর্তীতে হামের ভাইরাস V প্রোটিন (MeV-V) ব্যবহার করেছি, যা PP1 / বিরোধীতা25 এর মাধ্যমে MDA5 Ser88 ডিফসফোরিলেশনের প্রতিপক্ষ। MeV-V এক্সপ্রেশন GST-MDA5–2CARD বা FLAG-MDA5-এর Ser88 ফসফোরিলেশন (অ্যাবলেটেড ডিফসফোরিলেশনের নির্দেশক) বৃদ্ধি করেছে ডোজ-নির্ভর পদ্ধতিতে, যেমনটি পূর্বে দেখানো হয়েছে25। MeV-V দ্বারা বর্ধিত ফসফোরিলেশন আইএসজিলেশনের হ্রাসের সাথে সম্পর্কযুক্ত (বর্ধিত ডেটা চিত্র 3d,e)। WT MeV-V এর বিপরীতে, একটি মিউট্যান্ট MeV-V যা PP1-বাইন্ডিং এবং MDA5-ডিফসফোরিলেশন বিরোধীতা (MeV-VΔtail)25 বাতিল করেছে, MDA5–2CARD ISGylation (বর্ধিত ডেটা) এর উপর সামান্য প্রভাব প্রদর্শন করেছে চিত্র 3f), আইএসজিলেশনের বাধাকে শক্তিশালী করা প্রাথমিকভাবে PP1 নিষেধের কারণে, এবং অন্যান্য বিরোধী প্রভাব নয়, MeV-V দ্বারা। নিপাহ এবং হেন্দ্রা ভাইরাস (NiV-V এবং HeV-V) থেকে V প্রোটিনগুলিও MDA5 Ser88 ফসফোরিলেশন বাড়িয়েছে এবং অনুরূপভাবে, MDA5 ISGylation (বর্ধিত ডেটা চিত্র 3g,h) স্যাঁতসেঁতে করেছে, পরামর্শ দেয় যে বেশ কয়েকটি প্যারামিক্সোভাইরাল V প্রোটিন MDA5 ম্যানিপুলেশনের মাধ্যমে বাধা দেয়। Ser88 ফসফোরিলেশন, যদিও পৃথক ভি প্রোটিনের সুনির্দিষ্ট প্রক্রিয়া নির্ধারণ করা বাকি আছে। একসাথে নেওয়া, এই তথ্যগুলি পরামর্শ দেয় যে MDA5 কার্ড আইএসজিলেশন Ser88 এ ডিফসফোরিলেশনের উপর নির্ভরশীল।

ISGylation উচ্চ-ক্রম MDA5 সমাবেশ প্রচার করে।

RLR অ্যাক্টিভেশনের জন্য RNA বাইন্ডিং, RLR অলিগোমারাইজেশন এবং MAVS5 এর সাথে মিথস্ক্রিয়া করার জন্য সাইটোসল থেকে মাইটোকন্ড্রিয়াতে তাদের স্থানান্তর প্রয়োজন। ISGylation MDA5 কার্যকলাপকে প্রভাবিত করে এমন প্রক্রিয়াটি ব্যাখ্যা করার জন্য, আমরা প্রথমে ISGylation RNA বাইন্ডিংকে প্রভাবিত করে কিনা তা পরীক্ষা করেছিলাম। এন্ডোজেনাস MDA5 WT বা Isg15−/− MEFs থেকে বিশুদ্ধ HMW-poly(I:C) ইন ভিট্রোর সাথে সমানভাবে ভালোভাবে ইন্টারঅ্যাক্ট করেছে (এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র 4a)। MDA5 WT এবং Lys23Arg/Lys43Arg HMW-poly(I: C) এর সাথে তুলনীয় বাঁধাই দেখিয়েছে, যা নির্দেশ করে যে ISGylation MDA5 এর RNA- বাঁধাই করার ক্ষমতাকে প্রভাবিত করে না (বর্ধিত ডেটা চিত্র 4b)। যখন আমরা EMCV আরএনএ উদ্দীপনা অনুসরণ করে সাইটোসল থেকে মাইটোকন্ড্রিয়ায় MDA5-এর স্থানান্তর পর্যবেক্ষণ করেছি, তখন আমরা দেখতে পেয়েছি যে ISG15 নীরবতা, কিন্তু তাই না। বিপরীতে, RABVLe ট্রান্সফেকশনের পরে RIG-I ট্রান্সলোকেশন ISG15-ক্ষয়প্রাপ্ত এবং si উভয় ক্ষেত্রেই কার্যকর ছিল। C- স্থানান্তরিত কোষ (চিত্র 3b)। এই তথ্যগুলি নির্দেশ করে যে ISGylation MDA5 ট্রান্সলোকেশন বা এটির একটি ধাপ আপস্ট্রিম নিয়ন্ত্রণ করে। যেহেতু MDA5-এর সাইটোসল-টু-মাইটোকন্ড্রিয়া ট্রান্সলোকেশনের জন্য 14-3-3η26-এর সাথে মিথস্ক্রিয়া প্রয়োজন, আমরা WT এবং মিউট্যান্ট MDA5-এর সাথে 14-3-3η বাইন্ডিং তুলনা করেছি। MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg-এর 14-3-3η আবদ্ধ করার ক্ষমতা WT MDA5 বা Lys68Arg মিউট্যান্ট (বর্ধিত ডেটা চিত্র 4c) এর মতো ছিল। যাইহোক, যেখানে EMCV RNA উদ্দীপনা কার্যকরভাবে WT MEFs-এ MDA5 অলিগোমারাইজেশনকে প্ররোচিত করেছে, সেখানে MDA5 অলিগোমারের গঠন ISG15-ঘাটতিপূর্ণ MEFs (চিত্র 3c)-এ বন্ধ করা হয়েছিল। 293T কোষে ISG15 নকডাউন এছাড়াও FLAG–MDA5–2CARD (চিত্র 3d) এর অলিগোমারাইজেশন বাতিল করেছে। বিপরীতভাবে, ISGylation যন্ত্রপাতি উপাদানগুলির সহ-অভিব্যক্তি, Ube1L এবং UbcH8, দৃঢ়ভাবে MDA5-2CARD অলিগোমারাইজেশনকে si-এ উন্নত করেছে। C- স্থানান্তরিত কোষ, কিন্তু ISG15-শূন্য কোষে নয় (চিত্র 3d), নির্দেশ করে যে MDA5 অলিগোমার গঠনের জন্য ISGylation প্রয়োজন। এই ধারণার সমর্থনে, FLAG–MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg প্রায় বিলুপ্ত অলিগোমারাইজেশন দেখিয়েছে, যেখানে WT MDA5 দক্ষতার সাথে অলিগোমারাইজেশন করেছে (চিত্র 3e)। আমরা Lys23 Arg/Lys43Arg মিউটেশনের প্রভাবকে অলিগোমারাইজেশন-বিঘ্নিত মিউটেশনের সাথে তুলনা করেছি যা হয় MDA5 মনোমারের মধ্যে ইন্টারফেসে স্থানীয়করণ করে এবং RNA-বাইন্ডিং-মিডিয়াটেড MDA5 ফিলামেন্টেশনকে বাধা দেয় (Ile841Arg/Glu842Arg এবং Aspla248,Aspla248) অথবা কার্ডগুলিতে (Gly74Ala/Trp75Ala) এবং 2CARD অলিগোমারাইজেশন ব্যাহত করে। WT MDA5 এর বিপরীতে, Lys23Arg/Lys43Arg মিউট্যান্ট, MDA5 Gly74Ala/Trp75Ala অনুরূপ, ঘাটতি অলিগোমারাইজেশন দেখিয়েছে এবং এর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, IFN- প্রমোটার-অ্যাক্টিভেটিং ক্ষমতা বিলুপ্ত করেছে (চিত্র 3f,g)। Ile841Arg/Glu842Arg বা Asp848Ala/Phe849Ala ব্যাকগ্রাউন্ডে Lys23Arg/Lys43Arg-এর প্রবর্তন, যার মধ্যে যেকোনো একটি নিজেই MDA5 অলিগোমারাইজেশন এবং সংকেত হ্রাস করেছে, এছাড়াও MDA5 অলিগোমার গঠন এবং IFN- আনয়ন (Fig3) বিলুপ্ত করেছে। যেহেতু এলজিপি 2 ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড আরএনএ-তে MDA5 নিউক্লিয়েশনের সুবিধা দেয় এবং এর ফলে MDA5 অলিগোমারাইজেশন 29,30, আমরা MDA5 WT এবং Lys23Arg/Lys43Arg-এর LGP2 বাইন্ডিং তুলনা করেছি। MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg LGP2 এর সাথে WT MDA5 (বর্ধিত ডেটা চিত্র 4d) এর মতো দক্ষতার সাথে যোগাযোগ করেছে, এই প্রস্তাবটিকে শক্তিশালী করে যে CARD ISGylation RNA-বাইন্ডিং-মিডিয়াটেড ফিলামেন্টেশন থেকে স্বাধীনভাবে MDA5 অলিগোমারাইজেশনকে উন্নীত করে। সমষ্টিগতভাবে, এই ফলাফলগুলি প্রতিষ্ঠিত করে যে ISGylation কার্ড অলিগোমারাইজেশন এবং উচ্চ-ক্রম MDA5 সমাবেশগুলিকে সহজতর করে।

চিত্র 2|MDA5 সক্রিয়করণের জন্য Lys23 এবং Lys43-এ ISGylation প্রয়োজন। NHLF-তে একটি এন্ডোজেনাস MDA5 ISGylation যা উপহাস করা হয়েছিল, HMW-poly(I: C) (0.1 µg ml−1 ) দিয়ে 40 h (বামে) বা DENV বা ZIKV (MOI {{) দ্বারা সংক্রামিত হয়েছিল 10}} প্রতিটির জন্য) 48 ঘন্টার জন্য (ডানদিকে), অ্যান্টি-MDA5 (বা একটি IgG আইসোটাইপ নিয়ন্ত্রণ) সহ IP এবং অ্যান্টি-ISG15 সহ IB দ্বারা নির্ধারিত। b, ফ্ল্যাগ-ট্যাগযুক্ত MDA5–2CARD এবং MDA5Δ2CARD-এর ISGylation ক্ষণস্থায়ীভাবে স্থানান্তরিত HEK293T কোষে যা V5–ISG15, HA–Ube1L এবং FLAG–UbcH8 প্রকাশ করে, 40 ঘন্টা-পরবর্তী সময়ে ফ্ল্যাগ PD এবং IB-এর দ্বারা অ্যান্টি-V5-এর সাথে মূল্যায়ন করা হয়েছে৷ গ, ISG15 KO HeLa কোষে অন্তঃসত্ত্বা MDA5 ISGylation স্থিরভাবে ভেক্টর, WT ISG15 বা ISG15-AA দিয়ে পুনর্গঠিত হয় এবং IFN- চিকিৎসার পরে HA–Ube1L এবং FLAG–UbcH8 এর সাথে সহ-স্থানান্তরিত হয় (1,000 U ml−1 ) 24 ঘন্টার জন্য, অ্যান্টি-MDA5 সহ IP এবং অ্যান্টি-ISG15 সহ IB দ্বারা নির্ধারিত। d, HEK293T কোষে GST–MDA5–2CARD WT এবং Lys23Arg/ Lys43Arg-এর ISGylation যেগুলি V5–ISG15, HA–Ube1L এবং FLAG–UbcH8-এর সাথে 24 ঘন্টার জন্য সহ-স্থানান্তরিত হয়েছিল, GST PD এবং IB-এর দ্বারা অ্যান্টি-V5 সহ নির্ধারিত৷ e, HEK293T কোষে FLAG–MDA5 WT এবং Lys23Arg/Lys43Arg-এর ISGylation যেগুলি V5–ISG15, HA–Ube1L এবং FLAG–UbcH8-এর সাথে সহ-স্থানান্তরিত হয়েছিল, অ্যান্টি-V5 সহ FLAG PD এবং IB দ্বারা নির্ধারিত৷ f, HEK293T কোষে IFN- luciferase রিপোর্টার কার্যকলাপ যা ভেক্টর, FLAG-MDA5 WT বা মিউট্যান্টের সাথে 40 ঘন্টার জন্য স্থানান্তরিত হয়েছিল। লুসিফেরেজ মানগুলি ভেক্টর-ট্রান্সফেক্টেড কোষের মানের তুলনায় ভাঁজ আবেশ হিসাবে উপস্থাপিত হয়, 1 এ সেট করা হয়। WCL গুলি আইবি দ্বারা অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ এবং অ্যান্টি-অ্যাক্টিন দ্বারা পরীক্ষা করা হয়েছিল। g, HEK293T কোষে IFNB1 এবং CCL5 mRNA-এর RT–qPCR বিশ্লেষণ যা ক্ষণস্থায়ীভাবে ভেক্টর বা FLAG–MDA5 WT বা Lys23Arg/Lys43Arg-এর ক্রমবর্ধমান পরিমাণে স্থানান্তরিত হয়েছিল। h, STAT1 ফসফোরিলেশন এবং আইএসজি (IFIT1 এবং -2) HEK293T কোষের WCL-তে প্রোটিনের প্রাচুর্য যা ক্ষণস্থায়ীভাবে ভেক্টর বা FLAG–MDA5 WT বা Lys23Arg/Lys43Arg, IB দ্বারা নির্ধারিত হয়েছিল। I, MDA5 KO SVGA-তে নির্দেশিত অ্যান্টিভাইরাল জিনগুলির RT–qPCR বিশ্লেষণ যা ক্ষণস্থায়ীভাবে খালি ভেক্টর বা FLAG-ট্যাগযুক্ত MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg বা Ser88Glu দিয়ে পুনর্গঠন করা হয়েছিল। ডেটা অনুরূপ ফলাফল সহ কমপক্ষে দুটি স্বাধীন পরীক্ষার প্রতিনিধিত্ব করে (মানে f, g, এবং i-এ n= 3 জৈবিক প্রতিলিপির ± sd)। *পি< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

চিত্র 3|কার্ড ISGylation উচ্চ-ক্রম MDA5 সমাবেশ গঠনের প্রচার করে। a,b, NHLF থেকে WCL-এর সাইটোসোল-মাইটোকন্ড্রিয়া ভগ্নাংশ যা 30 ঘণ্টার জন্য অ-লক্ষ্যবিহীন নিয়ন্ত্রণ siRNA (si. C) বা ISG15-নির্দিষ্ট siRNA (si.ISG15) সহ স্থানান্তরিত হয়েছিল, এবং তারপর 16 ঘন্টার জন্য EMCV RNA (0.4 µg ml−1 ) (a) বা RABVLe (1 pmol ml−1 ) (b) দিয়ে মক-ট্রিটেড বা স্থানান্তরিত করা হয়। আইবি অ্যান্টি-এমডিএ 5 (এ), অ্যান্টি-আরআইজি-আই (বি), অ্যান্টি-আইএসজি 15 এবং অ্যান্টি-অ্যাক্টিন (এ এবং বি) দিয়ে সঞ্চালিত হয়েছিল। - টিউবুলিন এবং MAVS যথাক্রমে সাইটোসোলিক এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল ভগ্নাংশের জন্য বিশুদ্ধতা চিহ্নিতকারী হিসাবে কাজ করে (a এবং b)। c, WT এবং Isg15−/− MEF-তে এন্ডোজেনাস MDA5 অলিগোমেরাইজেশন যেগুলি 16 ঘন্টার জন্য EMCV RNA (0.5 µg ml−1 ) দিয়ে স্থানান্তরিত হয়েছিল, এবং SDD–AGE এবং IB দ্বারা অ্যান্টি-MDA5 সহ মূল্যায়ন করা হয়েছিল। ডাব্লুসিএলগুলি আরও SDS-PAGE দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং অ্যান্টি-এমডিএ 5 এবং অ্যান্টি-অ্যাক্টিন দিয়ে আইবি দ্বারা তদন্ত করা হয়েছিল। d, HEK293T কোষে FLAG–MDA5–2CARD-এর অলিগোমেরাইজেশন যেগুলি নির্দেশিত siRNA গুলি দ্বারা স্থানান্তরিত হয়েছিল, HA–Ube1L এবং FLAG–UbcH8 সহ বা ছাড়াই 48 ঘন্টার জন্য, NativePAGE এবং IB দ্বারা অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ সহ নির্ধারিত৷ ডাব্লুসিএলগুলি SDS-PAGE দ্বারা আরও বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং আইবি দ্বারা অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ, অ্যান্টি-এইচএ, অ্যান্টি-আইএসজি15 এবং অ্যান্টি-অ্যাক্টিন দিয়ে তদন্ত করা হয়েছিল। e, FLAG–MDA5 WT এবং Lys23Arg/Lys43Arg-এর অলিগোমারাইজেশন ক্ষণস্থায়ীভাবে স্থানান্তরিত MDA5 KO HEK293 কোষে, SDD–AGE এবং IB দ্বারা অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ দিয়ে মূল্যায়ন করা হয়েছে। ডাব্লুসিএলগুলিকে আরও বিশ্লেষণ করা হয়েছিল SDS-PAGE এবং IB দ্বারা অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ এবং অ্যান্টি-অ্যাক্টিন সহ। f, ফ্ল্যাগ-ট্যাগযুক্ত MDA5 WT এবং ক্ষণস্থায়ীভাবে স্থানান্তরিত MDA5 KO HEK293 কোষে মিউট্যান্টের অলিগোমারাইজেশন, NativePAGE এবং IB দ্বারা অ্যান্টি-MDA5 দিয়ে মূল্যায়ন করা হয়েছে। ডাব্লুসিএলগুলি আরও SDS-PAGE দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং অ্যান্টি-এমডিএ 5 এবং অ্যান্টি-অ্যাক্টিন দিয়ে আইবি দ্বারা তদন্ত করা হয়েছিল। g, MDA5 KO HEK293 কোষে IFN- luciferase রিপোর্টার কার্যকলাপ যা 24 ঘন্টার জন্য হয় খালি ভেক্টর, বা FLAG- ট্যাগযুক্ত MDA5 WT বা মিউট্যান্টের সাথে স্থানান্তরিত হয়েছিল। লুসিফেরেজ কার্যকলাপকে ভেক্টর-ট্রান্সফেক্টেড কোষের মানগুলির সাপেক্ষে ভাঁজ আনয়ন হিসাবে উপস্থাপিত করা হয়, 1 এ সেট করা হয়। ডেটা অনুরূপ ফলাফলের সাথে কমপক্ষে দুটি স্বাধীন পরীক্ষার প্রতিনিধিত্ব করে (মানে g তে n= 3 জৈবিক প্রতিলিপিগুলির ± sd)। *** পি< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

ISGylation-নির্ভর MDA5 সিগন্যালিং ভাইরাসের প্রতিলিপিকে সীমাবদ্ধ করে।

ভাইরাস প্রতিলিপি সীমাবদ্ধ করার ক্ষমতার জন্য MDA5 এর ISGylation প্রয়োজন কিনা তা আমরা পরবর্তীতে মূল্যায়ন করেছি। FLAG–MDA5 WT, কিন্তু Lys23Arg/Lys43Arg নয়, সম্ভাব্য (~2log দ্বারা) EMCV প্রতিলিপিকে বাধা দেয় (চিত্র 4a)। একইভাবে, MDA5 KO HEK293 কোষগুলি WT MDA5 এর সাথে পুনর্গঠিত হয়েছে, কিন্তু কোষগুলি Lys23Arg/ Lys43Arg মিউট্যান্টের সাথে পরিপূরক নয়, কার্যকরভাবে সীমাবদ্ধ DENV প্রতিলিপি (চিত্র 4b)। আমরা MDA5 KO অ্যাস্ট্রোসাইট SVGAs পুনর্গঠন করেছি, ZIKV সংক্রমণের জন্য একটি শারীরবৃত্তীয়ভাবে প্রাসঙ্গিক কোষের ধরন, হয় ভেক্টর সহ, অথবা MDA5 WT বা Lys23Arg/Lys43Arg, এবং তারপর একটি 40- ঘন্টা সময় কোর্সে ZIKV প্রতিলিপি মূল্যায়ন করেছি৷ ZIKV প্রতিলিপি ভেক্টর-প্রকাশকারী কোষের তুলনায় WT MDA5 এর সাথে পুনর্গঠিত কোষগুলিতে ~100-ভাঁজ দ্বারা হ্রাস করা হয়েছিল। বিপরীতে, MDA5 Lys23Arg/Lys43Arg এর সাথে পরিপূরক কোষগুলি ZIKV সীমাবদ্ধ করেনি, MDA5 Ser88Glu (চিত্র 4c) প্রকাশকারী কোষের মতো। WT MDA5, কিন্তু Lys23Arg/Lys43Arg নয়, SCoV2 প্রতিলিপিকেও সীমাবদ্ধ করে, যদিও পরীক্ষিত অন্যান্য ভাইরাসের তুলনায় কম পরিমাণে দেখা যায় (চিত্র 4d)।

চিত্র 4|MDA5 দ্বারা ভাইরাল সীমাবদ্ধতার জন্য ISGylation প্রয়োজন। HEK293T কোষের সুপারনাট্যান্টে EMCV টাইটার যেগুলি 40 ঘন্টার জন্য ভেক্টর, অথবা FLAG–MDA5 WT বা Lys23Arg/Lys43Arg দ্বারা স্থানান্তরিত হয়েছিল, এবং তারপর 24-এর জন্য EMCV (MOI=0.001) দ্বারা সংক্রমিত হয়েছিল h, TCID50 অ্যাস দ্বারা নির্ধারিত। b, DENV-সংক্রমিত MDA5 KO HEK293 কোষের শতাংশ যা 24 ঘন্টার জন্য ভেক্টর, অথবা FLAG–MDA5 WT বা Lys23Arg/Lys43Arg দ্বারা স্থানান্তরিত হয়েছিল, এবং তারপর 48 ঘন্টার জন্য DENV (MOI=5) দ্বারা উপহাস বা সংক্রামিত হয়েছিল , অ্যান্টি-ফ্ল্যাভিভাইরাস E (4G2) ব্যবহার করে FACS দ্বারা মূল্যায়ন করা হয়েছে। এস.এস.সি, সাইড স্ক্যাটার। c, MDA5 KO SVGA-এর সুপারনাট্যান্টের ZIKV টাইটার যা ভেক্টর বা FLAG-ট্যাগযুক্ত MDA5 WT, Lys23Arg/Lys43Arg বা Ser88Glu দিয়ে 30 ঘন্টার জন্য স্থানান্তরিত হয়েছিল এবং তারপর নির্দেশিত সময়ের জন্য ZIKV (MOI=0.1) দ্বারা সংক্রমিত হয়েছিল। , প্লেক অ্যাস দ্বারা নির্ধারিত। pfu, ফলক গঠনকারী ইউনিট; hpi, ঘন্টা পরে সংক্রমণ. d, HEK293T–hACE2 কোষের সুপারনাট্যান্টে SCoV2 টাইটার যা 24 ঘন্টার জন্য খালি ভেক্টর, অথবা FLAG–MDA5 WT বা Lys23Arg/Lys43Arg দিয়ে ট্রান্সফেক্ট হয়েছিল এবং তারপর 24-এর জন্য SCoV2 (MOI=0.5) দ্বারা সংক্রমিত হয়েছিল। h, প্লেক অ্যাস দ্বারা নির্ধারিত। ই, IFNAR সিগন্যালিংকে ম্লান করার ক্ষেত্রে এর ভূমিকা থেকে MDA5-মধ্যস্থ IFN ইনডাকশনে ISG15-এর ভূমিকাকে 'দ্বিগুণ' করার জন্য পরীক্ষামূলক পদ্ধতির পরিকল্পিত। Sup., supernatant. f, NHLF 'দাতা' কোষগুলি 40 ঘন্টার জন্য নির্দেশিত siRNA দিয়ে স্থানান্তরিত হয়েছিল এবং তারপর 16 ঘন্টার জন্য mutEMCV (MOI=0.1) দ্বারা সংক্রমিত হয়েছিল৷ সেল সুপারনাট্যান্টগুলি UV- নিষ্ক্রিয় ছিল এবং ভেরো 'প্রাপক' কোষগুলিতে স্থানান্তরিত হয়েছিল। 24 ঘন্টা পরে, কোষগুলি 72 ঘন্টার জন্য ZIKV (MOI=0.002–2) দ্বারা সংক্রামিত হয়েছিল, এবং ZIKV-পজিটিভ কোষগুলি অ্যান্টি-ফ্ল্যাভিভাইরাস E (4G2) এবং TrueBlue peroxidase সাবস্ট্রেটের সাথে ইমিউনোস্টেইনিং দ্বারা নির্ধারিত হয়েছিল। g, RIG-I KO HEK293 'দাতা' কোষগুলি si দিয়ে স্থানান্তরিত হয়েছিল। C বা si.ISG15 একসাথে ভেক্টর বা FLAG–MDA5 WT বা Lys23Arg/Lys43Arg, 24 ঘন্টার জন্য, তারপরে 16 ঘন্টার জন্য EMCV সংক্রমণ (MOI=0.001)। UV- নিষ্ক্রিয় কোষ সুপারন্যাট্যান্টগুলিকে ভেরো 'প্রাপক' কোষে 24 ঘন্টার জন্য স্থানান্তরিত করা হয়েছিল, তারপরে 40 ঘন্টার জন্য EMCV (MOI=0.001–0.1) এর সংক্রমণ হয়েছিল। ইএমসিভি-প্ররোচিত সাইটোপ্যাথিক প্রভাবগুলি কুমাসি ব্লু স্টেনিং দ্বারা কল্পনা করা হয়েছিল। ডেটা অনুরূপ ফলাফল সহ কমপক্ষে দুটি স্বাধীন পরীক্ষার প্রতিনিধিত্ব করে (মানে a–d-এ n= 3 জৈবিক প্রতিলিপির ± sd)। *পি< 0.05, **P< 0.01 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

আমরা পরবর্তীতে ভাইরাসের প্রতিলিপিকে বাধা দেওয়ার MDA5 এর ক্ষমতার উপর ISG15 নীরবতার প্রভাব নির্ধারণ করেছি। যদিও MDA5 Lys23Arg/ Lys43Arg ISG15 সাইলেন্সিং নির্বিশেষে EMCV প্রতিলিপিকে দমন করতে ব্যর্থ হয়েছে, WT MDA5 কার্যকরভাবে si তে EMCV প্রতিলিপিকে সীমাবদ্ধ করেছে। C- স্থানান্তরিত কোষ এবং, অপ্রত্যাশিতভাবে, ISG15-ক্ষয়প্রাপ্ত কোষেও (বর্ধিত ডেটা চিত্র 5a)। এই অপ্রত্যাশিত ফলাফলগুলির অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়ার অন্বেষণে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে WT MDA5 প্রকাশ করা EMCV-সংক্রমিত কোষগুলি WT MDA5 এবং si দ্বারা স্থানান্তরিত সংক্রামিত কোষগুলির তুলনায় ISG15 নীরব করার সময় ISG প্রোটিনের অভিব্যক্তির মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নত করেছিল। C (বর্ধিত ডেটা চিত্র 5 বি)। একইভাবে, IFN- ইন্ডাকশন (বর্ধিত ডেটা চিত্র 5c,d) বাতিল হওয়া সত্ত্বেও, EMCV RNA দ্বারা স্থানান্তরিত বা mutEMCV দ্বারা সংক্রমিত ISG15- ঘাটতি কোষগুলিতে উন্নত ISG ট্রান্সক্রিপ্ট এবং প্রোটিন এক্সপ্রেশন পরিলক্ষিত হয়েছিল৷ বিপরীতে, MDA5 নকডাউন প্রত্যাশিত হিসাবে IFN- এবং ISG প্রোটিন অভিব্যক্তি উভয়ই বাতিল করেছে (বর্ধিত ডেটা চিত্র 5d)। আমরা লক্ষ্য করেছি যে ইউএসপি18 এর প্রোটিনের প্রাচুর্য, একটি ডিউবিকুইটিনেটিং এনজাইম যা নেতিবাচকভাবে IFNAR সিগন্যালিং31কে নিয়ন্ত্রণ করে, si দিয়ে স্থানান্তরিত সংক্রামিত কোষগুলির তুলনায় EMCV সংক্রমণের পরে ISG15-ক্ষয়প্রাপ্ত কোষগুলিতে ব্যাপকভাবে হ্রাস পেয়েছে। C বা MDA5-নির্দিষ্ট siRNA (এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র 5b,d), যা USP18 অবক্ষয় রোধে ISG15 এর রিপোর্ট করা ভূমিকার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। একত্রে, এই ডেটাগুলি পরামর্শ দেয় যে ISG15-জিন টার্গেটিং এর পরীক্ষামূলক সেটিংসে (অর্থাৎ, সাইলেন্সিং বা KO) MDA5 ISGylation-এর অ্যান্টিভাইরাল প্রভাব IFNAR সিগন্যালিং-এর উপর ISG15-এর নিরোধক প্রভাবের বিলুপ্তির কারণে বিভ্রান্তিকর ISG আপগ্র্যুলেশন দ্বারা মুখোশিত।

চিত্র 5|SCoV2 PLpro MDA5–2CARD-এর সাথে আবদ্ধ এবং ডি-ISGylates. SCoV2 PLpro এর স্ফটিক কাঠামোর একটি রিবন উপস্থাপনা: ISG15 কমপ্লেক্স (প্রোটিন ডেটা ব্যাঙ্ক, অ্যাক্সিশন নং 6YVA)। PLpro-তে সাইট 1 ইন্টারঅ্যাকশন (Asn156 এবং Arg166/Glu167) বা সাইট 2 ইন্টারঅ্যাকশন (Phe69) মধ্যস্থতাকারী মূল অবশিষ্টাংশগুলি, সেইসাথে এটির অনুঘটকভাবে সক্রিয় সাইট (Cys111) নির্দেশিত হয়। b, HEK293T কোষে GST–MDA5–2CARD-এর ISGylation যা 20 ঘন্টার জন্য ভেক্টর বা V5-ট্যাগযুক্ত SCoV2 PLpro WT বা মিউট্যান্টের সাথে FLAG–ISG15, HA–Ube1L এবং FLAG–UbcH8 সহ ট্রান্সফেক্ট করা হয়েছিল, অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ এবং অ্যান্টি-জিএসটি সহ GST PD এবং IB দ্বারা নির্ধারিত। ডব্লিউসিএলগুলি আইবি দ্বারা অ্যান্টি-ভি 5, অ্যান্টি-এইচএ, অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ এবং অ্যান্টি-অ্যাক্টিন দিয়ে তদন্ত করা হয়েছিল। গ, এইচএ-ট্যাগযুক্ত MDA5 বা RIG-I থেকে V5-ট্যাগযুক্ত SCoV2– PLpro বা ফ্ল্যাগ-ট্যাগযুক্ত MeV-V (পজিটিভ কন্ট্রোল) ক্ষণস্থায়ীভাবে স্থানান্তরিত HEK293T কোষে বাঁধাই, অ্যান্টি-V5 সহ HA PD এবং IB দ্বারা নির্ধারিত বা অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ, এবং অ্যান্টি-এইচএ। ডব্লিউসিএলগুলি আইবি দ্বারা অ্যান্টি-ভি5 এবং অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ দিয়ে তদন্ত করা হয়েছিল। d, HEK293T কোষে FLAG–MDA5–2CARD-এর অলিগোমারাইজেশন যেগুলি ভেক্টরের সাথে সহ-ট্রান্সফেক্ট করা হয়েছিল, অথবা V5-ট্যাগযুক্ত SCoV2 PLpro WT বা Cys111Ala 24 ঘন্টার জন্য, NativePAGE এবং IB দ্বারা অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ দিয়ে মূল্যায়ন করা হয়েছে৷ ডাব্লুসিএলগুলি আরও SDS- পৃষ্ঠা দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং আইবি দ্বারা অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ, অ্যান্টি-ভি 5 এবং অ্যান্টি-অ্যাক্টিন দিয়ে তদন্ত করা হয়েছিল। e, HEK293T কোষে GST–MDA5–2CARD-এর ISGylation যা FLAG–ISG15, HA–Ube1L, এবং FLAG–UbcH8ও প্রকাশ করে এবং ভেক্টর বা নির্দেশিত V5-ট্যাগযুক্ত করোনাভাইরাল PLpro দিয়ে 40 ঘণ্টার জন্য সহ-স্থানান্তরিত হয়েছিল প্রোটিন, অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ, অ্যান্টি-V5 এবং অ্যান্টি-জিএসটি সহ GST PD এবং IB দ্বারা নির্ধারিত। ডেটা অনুরূপ ফলাফল সহ কমপক্ষে দুটি স্বাধীন পরীক্ষার প্রতিনিধিত্ব করে।

আমরা পরবর্তীতে একটি ভাইরাস সুরক্ষা অ্যাস নিযুক্ত করেছি যা পরীক্ষামূলকভাবে একই কোষে ডাউনস্ট্রিম IFNAR সিগন্যালিং থেকে ভাইরাস-সংক্রমিত কোষগুলিতে MDA5 সিগন্যালিং ডিকপল করে (চিত্র 4e)। মিউটইএমসিভি-সংক্রমিত 'দাতা' কোষ থেকে সুপারন্যাট্যান্টস যা হয় si ছিল। C স্থানান্তরিত, বা ISG15 বা MDA5 এর ক্ষয়প্রাপ্ত, অতিবেগুনী (UV) নিষ্ক্রিয় করা হয়েছিল এবং তারপরে অসংক্রমিত 'প্রাপক' কোষে স্থানান্তরিত হয়েছিল। দাতা কোষ দ্বারা MDA5-মধ্যস্থ IFN উৎপাদনের অ্যান্টিভাইরাল প্রভাব সরাসরি নিরীক্ষণ করতে 'প্রাইমড' প্রাপক কোষগুলি তখন ZIKV দ্বারা সংক্রমিত হয়েছিল। যেখানে si থেকে supernatants. C-স্থানান্তরিত 'দাতা' কোষগুলি ZIKV প্রতিলিপিকে শক্তিশালীভাবে বাধা দেয় এবং ISG15 বা MDA5 নকডাউন কোষের সুপারনাট্যান্টগুলি ZIKV সংক্রমণকে ন্যূনতমভাবে সীমাবদ্ধ করে (চিত্র 4f)। একইভাবে, EMCV- সংক্রামিত দাতা কোষ থেকে কালচার সুপারন্যাট্যান্টগুলি si-এর সাথে WT MDA5-এর মাধ্যমে স্থানান্তরিত হয়েছে। ডাব্লুটি এমডিএ5 প্রকাশকারী কোষের তুলনায় এবং আইএসজি 15 (চিত্র 4জি) ক্ষয়কারী কোষগুলির তুলনায় সি ভাইরাল চ্যালেঞ্জ থেকে প্রাপক কোষের অধিক সুরক্ষার দিকে পরিচালিত করে। সমষ্টিগতভাবে, এই ডেটাগুলি দেখায় যে ISGylation RNA ভাইরাসের একটি পরিসরের MDA{16}মধ্যস্থতা সীমাবদ্ধতার জন্য গুরুত্বপূর্ণ।

চিত্র 6|SCoV2 PLpro এর ডি-ISGylase কার্যকলাপের মাধ্যমে ISG15-মধ্যস্থিত MDA5 সংকেতকে বাধা দেয়। ক, IFNB1, IFNL1, ISG15, MDA5, এবং RIG-I ট্রান্সক্রিপ্টগুলির RT–qPCR বিশ্লেষণ NHLFগুলিতে যেগুলি নির্দেশিত siRNAs দিয়ে 40 ঘন্টার জন্য স্থানান্তরিত হয়েছিল এবং তারপরে মক RNA বা SCoV2 RNA (0.4 μg) দিয়ে স্থানান্তরিত হয়েছিল −1 ) 24 ঘন্টার জন্য। b, A549–hACE2 কোষে SCoV2 Nsp3-এর সাথে এন্ডোজেনাস MDA5-এর আবদ্ধতা যা 24 ঘন্টার জন্য SCoV2 (MOI=0.5) দ্বারা সংক্রামিত হয়েছিল, যা আইপি দ্বারা অ্যান্টি-MDA5 (বা একটি IgG আইসোটাইপ নিয়ন্ত্রণ) দ্বারা নির্ধারিত হয়। অ্যান্টি-এনএসপি 3 এবং অ্যান্টি-এমডিএ5 সহ। ডাব্লুসিএলগুলি আইবি দ্বারা অ্যান্টি-এনএসপি 3 এবং অ্যান্টি-অ্যাক্টিন দিয়ে তদন্ত করা হয়েছিল। c, A549–hACE2 কোষে অন্তঃসত্ত্বা MDA5 ISGylation যেগুলি PLpro ইনহিবিটর (GRL-0617; 50 µM) বা গাড়ির উপস্থিতিতে 40 ঘন্টা ধরে SCoV2 (MOI=0.5) দ্বারা উপহাস বা সংক্রামিত হয়েছিল নিয়ন্ত্রণ (ডাইমেথাইলসালফক্সাইড), আইপি দ্বারা অ্যান্টি-এমডিএ5 (বা একটি আইজিজি আইসোটাইপ কন্ট্রোল) দ্বারা নির্ধারিত, তারপরে আইবি-এর সাথে অ্যান্টি-আইএসজি15 এবং অ্যান্টি-এমডিএ5। ডব্লিউসিএল-এ IFIT1, RSAD2, ISG15 এবং অ্যাক্টিন-এর প্রোটিনের প্রাচুর্য IB দ্বারা তদন্ত করা হয়েছিল। কার্যকর ভাইরাস প্রতিলিপি আইবি দ্বারা অ্যান্টি-এনএসপি 3 এবং অ্যান্টি-স্পাইক (এস) দ্বারা যাচাই করা হয়েছিল। d, IFNB1, CCL5, এবং IFIT1 ট্রান্সক্রিপ্টের RT–qPCR বিশ্লেষণ, এবং EMCV জিনোমিক RNA (gRNA), HeLa কোষে যা 24 ঘন্টার জন্য ভেক্টর, বা V5–SCoV2 PLpro WT বা মিউট্যান্টের সাথে ক্ষণস্থায়ীভাবে স্থানান্তরিত হয়েছিল, এবং তারপর mutEMVC দ্বারা সংক্রমিত হয়েছিল। (MOI=0.5) 12 ঘন্টার জন্য। e, RIG-I KO HEK293 কোষের সুপারনাট্যান্টে EMCV টাইটার যা 24 ঘন্টার জন্য ভেক্টর বা FLAG–MDA5 দিয়ে ক্ষণস্থায়ীভাবে স্থানান্তরিত হয়েছিল, V5- ট্যাগযুক্ত SCoV2 PLpro WT, Cys111Ala বা Arg166Ser/Glu167Arg এবং তারপরে সংক্রমিত হয়েছিল, 16 ঘন্টার জন্য EMCV (MOI=0.001) সহ, প্লেক অ্যাস দ্বারা নির্ধারিত। f, ই-তে পরীক্ষা থেকে WCL-তে নির্দেশিত ISG-এর প্রোটিনের প্রাচুর্য, নির্দেশিত অ্যান্টিবডিগুলির সাথে IB দ্বারা নির্ধারিত। ডেটা অনুরূপ ফলাফল সহ কমপক্ষে দুটি স্বাধীন পরীক্ষার প্রতিনিধিত্ব করে (মানে a, d, এবং e তে n= 3 জৈবিক প্রতিলিপির ± sd)। *পি< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 (two-tailed, unpaired Student's t-test).

SCoV2 PLpro ডি-আইএসজিলেশনের জন্য MDA5 লক্ষ্য করে।

করোনাভাইরাস যেমন SARS-CoV (SCoV), MERS-CoV এবং সম্প্রতি আবির্ভূত SCoV2 একটি PLpro এনকোড করে যা ভাইরাল পলিপ্রোটিন ক্লিভেজ33 মধ্যস্থতা করে। এছাড়াও, পিএলপ্রোর ডিউবিকিউটিনেটিং এবং ডি-আইএসজিলেটিং কার্যক্রম রয়েছে। SCoV2 PLpro সম্প্রতি তার ডি-আইএসজিলেজ কার্যকলাপের মাধ্যমে প্রাথমিকভাবে অ্যান্টিভাইরাল প্রতিক্রিয়াগুলিকে সংশোধন করতে দেখানো হয়েছে। যেহেতু MDA5 করোনাভাইরাস 34,35 শনাক্ত করার জন্য একটি প্রধান সেন্সর হিসাবে পরিচিত, এবং যেহেতু আমাদের ডেটা দেখিয়েছে যে MDA{10}}মধ্যস্থিত ভাইরাস সীমাবদ্ধতার জন্য ISGylation প্রয়োজন, তাই আমরা পরীক্ষা করেছি যে SCoV2 PLpro এনজাইম্যাটিকভাবে MDA5 ISGylation অপসারণ করে সহজাত অনাক্রম্যতা বিরোধী। SCoV2 PLpro WT, কিন্তু এর অনুঘটকভাবে নিষ্ক্রিয় মিউট্যান্ট নয় (PLpro Cys111Ala)15, GST-MDA5–2CARD এবং FLAG-MDA5 (চিত্র 5a,b এবং বর্ধিত ডেটা চিত্র 6a) এর ISGylation বাতিল করেছে। PLpro Asn156Glu এবং Arg166Ser/Glu167Arg মিউট্যান্ট, যা 'সাইট 1' ইন্টারফেসে যথাক্রমে 14,36-এ ISG15 বাইন্ডিংয়ে প্রান্তিকভাবে এবং গুরুতরভাবে প্রতিবন্ধী, আইএসজিলেশনকে কিছুটা প্রভাবিত করেছে বা না করেছে। বিপরীতে, PLpro Phe69Ala, যেখানে 'সাইট 2' ইন্টারফেস যা অগ্রাধিকারমূলকভাবে ubiquitin-এর সাথে বাঁধাই নির্ধারণ করে, কিন্তু ISG15 নয়, ব্যাহত হয়েছে 14,36, WT PLpro (চিত্র 5a, b এবং বর্ধিত Fig. Data6) এর মতো শক্তিশালী MDA5 ISGylation হ্রাস পেয়েছে ) SCoV2 PLpro, তবে, RIG-I–2CARD সর্বব্যাপীকরণকে দমন করেনি (বর্ধিত ডেটা চিত্র 6b)। আমরা দেখতে পেলাম যে PLpro বিশেষভাবে MDA5 এর সাথে ইন্টারঅ্যাক্ট করেছে, কিন্তু RIG-I নয়, যেমন MeV-V করেছে যা MDA5 কে আবদ্ধ করে এবং একটি কন্ট্রোল 37 (চিত্র 5c) হিসাবে কাজ করে। কম পরিমাণে PLpro MDA5 দ্বারা সংকেতকে বাধা দেয়, কিন্তু RIG-I নয়, যেখানে বেশি পরিমাণে PLpro উভয় RLR দ্বারা অ্যান্টিভাইরাল সংকেতকে দমন করে (বর্ধিত ডেটা চিত্র 6c)। এটি PLpro-এর সরাসরি লক্ষ্য হিসাবে MDA5 কে শক্তিশালী করে। IRF3 এর ডি-আইএসজিলেশন সম্ভবত PLpro এর উচ্চ মাত্রায় RLR সিগন্যালিং 15,38-এ প্রতিরোধক প্রভাবের জন্য দায়ী। MDA5–2CARD অলিগোমারাইজেশনের উপর PLpro-এর প্রভাব পরীক্ষা করার সময়, PLpro WT কিন্তু Cys111Ala দক্ষতার সাথে MDA5–2CARD অলিগোমারাইজেশন (চিত্র 5d) অবরুদ্ধ করেছে, ইঙ্গিত করে যে SCoV2 PLpro তার এনজিলেশন-নির্ভর MDA5 অলিগোমার ক্রিয়াকলাপকে বাধা দেয়। সম্পর্কিত -করোনাভাইরাস, SCoV, MERS-CoV এবং মুরিন হেপাটাইটিস ভাইরাস (MHV) এর PLpro এনজাইমগুলি, সেইসাথে -করোনাভাইরাস HCoV-NL63 (NL63) এর সাথেও আবদ্ধ এবং দক্ষতার সাথে MDA5–2CARD ISGylation (চিত্র 5e) , পরামর্শ দিচ্ছে যে PLpro দ্বারা MDA5 বিরোধিতা করোনাভাইরাসগুলির মধ্যে ব্যাপকভাবে সংরক্ষিত হতে পারে।

cistanche উদ্ভিদ-বৃদ্ধি প্রতিরোধ ক্ষমতা

SCoV2 PLpro ISG15-নির্ভর MDA5 সিগন্যালিংয়ের বিরোধিতা করে।

আমরা পরবর্তীতে SCoV2 দ্বারা উদ্ভূত অ্যান্টিভাইরাল সাইটোকাইন ইনডাকশনের জন্য ISG15-নির্ভর MDA5 সংকেতের প্রাসঙ্গিকতা নির্ধারণ করেছি। যেহেতু কার্যকর ভাইরাল বিরোধীতার কারণে SCoV2 সংক্রমণ ন্যূনতমভাবে টাইপ I IFNগুলিকে প্ররোচিত করতে পরিচিত, তাই আমরা SCoV2- সংক্রমিত কোষ থেকে মোট RNA বিচ্ছিন্ন করেছি এবং তারপর সহজাত ইমিউন সিগন্যালিংকে উদ্দীপিত করার জন্য কোষে পুনরায় স্থানান্তরিত করেছি। SCoV2 RNA, কিন্তু মক-ট্রিটেড সেল থেকে RNA নয়, দৃঢ়ভাবে প্ররোচিত IFN ট্রান্সক্রিপ্ট; যাইহোক, যখন ISG15 বা MDA5 নীরব করা হয়েছিল তখন এই আনয়নটি উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছিল (চিত্র 6a)। RIG-I নকডাউন SCoV2 RNA দ্বারা উদ্ভূত অ্যান্টিভাইরাল জিনের অভিব্যক্তিকে বিরূপভাবে প্রভাবিত করেনি, যা নির্দেশ করে যে SCoV2 RNA–PAMPs প্রাথমিকভাবে ISG15–MDA5 অক্ষ (চিত্র 6a) দ্বারা অনুভূত হয়।

আমরা দেখেছি যে SCoV2 নন-স্ট্রাকচারাল প্রোটিন 3 (Nsp3), যার মধ্যে PLpro রয়েছে, প্রামাণিক SCoV2 সংক্রমণের (চিত্র 6b) সময় অন্তঃসত্ত্বা MDA5 এর সাথে সহজেই যোগাযোগ করে। অন্তঃসত্ত্বা MDA5 ISGylation SCoV2-সংক্রমিত কোষে সনাক্ত করা যায় না, যদিও ভাইরাসটি ISG15 প্রকাশকে ট্রিগার করেছিল; যাইহোক, একটি নির্দিষ্ট PLpro ইনহিবিটর 15 দিয়ে চিকিত্সা করা সংক্রামিত কোষগুলিতে, MDA5 ISGylation এবং downstream ISG আনয়ন দৃঢ়ভাবে উন্নত করা হয়েছিল (চিত্র 6c), এই প্রস্তাবটিকে সমর্থন করে যে PLpro কার্যকরভাবে MDA5 ISGylation এবং লাইভ SCoV2 সংক্রমণের সময় সংকেত দমন করে। আমরা পরবর্তীতে mutEMCV সংক্রমণের সময় এন্ডোজেনাস MDA5 সক্রিয়করণের উপর WT এবং মিউট্যান্ট PLpro এর প্রভাব পরীক্ষা করেছি। MDA5 ISGylation (চিত্র 5b এবং এক্সটেন্ডেড ডেটা চিত্র 6a), SCoV2 PLpro WT এবং Phe69Ala অ্যান্টিভাইরাল ট্রান্সক্রিপ্ট ইনডাকশনের উপর তাদের প্রভাবের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, যেখানে MDA5 Arg166Ser/ Glu167Arg, Cys111Ala অ্যান্টিভাইরালকে প্রভাবিত করেনি। 6d)। এর সাথে একমত, PLpro WT বা Phe69Ala প্রকাশকারী কোষগুলিতে mutEMCV প্রতিলিপি উন্নত করা হয়েছিল, কিন্তু PLpro Cys111Ala বা Arg166Ser/Glu167Arg (চিত্র 6d) প্রকাশকারী কোষগুলিতে নয়। একইভাবে, WT PLpro, কিন্তু Arg166Ser/Glu167Arg বা Cys111Ala মিউট্যান্ট নয়, FLAG–MDA5 (চিত্র 6e) দ্বারা অবরুদ্ধ EMCV সীমাবদ্ধতা; ভাইরাস প্রতিলিপির উপর প্রভাব প্ররোচিত আইএসজি প্রোটিনের সাথে সম্পর্কযুক্ত (চিত্র 6f)। সম্মিলিতভাবে, এটি SCoV2 PLpro কে একটি IFN বিরোধী হিসাবে প্রতিষ্ঠিত করে যা সক্রিয়ভাবে MDA5 ডি-ISGylates করে।

আলোচনা

ISG15 সংমিশ্রণ অনেকগুলি ভাইরাসকে অ্যান্টিভাইরাল কার্যকলাপ প্রদানের জন্য পরিচিত; যাইহোক, মাত্র কয়েকটি প্রকৃত সাবস্ট্রেট সনাক্ত করা হয়েছে12। অন্যদিকে, আইএসজি15 তার অসংলগ্ন আকারে ইউএসপি18-মিডিয়াটেড IFNAR-সংকেত নিষেধ31,32,40 কে শক্তিশালী করার মাধ্যমে প্রোভাইরালি কাজ করে। বর্তমান অধ্যয়নটি MDA5-মধ্যস্থ IFN আনয়নে ISGylation-এর জন্য একটি মূল ভূমিকা চিহ্নিত করে৷ আমাদের কাজটি পরীক্ষামূলক ডিজাইনের গুরুত্বের উপরও জোর দেয় যেখানে MDA5 অ্যাক্টিভেশনে ISG15 এর ভূমিকাকে ডিকপল করা থেকে IFNAR সিগন্যালিংকে স্যাঁতসেঁতে করা ISG15 এর শক্তিশালী অ্যান্টিভাইরাল কার্যকলাপ প্রকাশ করার জন্য অপরিহার্য। একটি সংক্রামিত জীবের মধ্যে, এটি সম্ভবত একাধিক ISGylation ইভেন্টের সমষ্টি (হোস্ট এবং ভাইরাল প্রোটিন উভয়কেই প্রভাবিত করে) যা সংক্রমণ এবং প্যাথোজেনেসিসের ফলাফল নির্ধারণ করে, যা প্রসঙ্গ-নির্ভর হতে পারে12।

cistanche tubulosa এর উপকারিতা- ইমিউন সিস্টেমকে শক্তিশালী করা

আমাদের অনুসন্ধানগুলি ইঙ্গিত দেয় যে MDA5-এর ISGylation RIG-I5-এর Lys63-লিঙ্কযুক্ত সর্বব্যাপীকরণের সাথে সাদৃশ্যপূর্ণভাবে কাজ করে: উভয় PTM (1) PP1-প্রেরিত ডিফসফোরিলেশন দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয় এবং (2) কার্ড অলিগোমারাইজেশন এবং RLR উচ্চতর প্রচার করে - অর্ডার সমাবেশ। যাইহোক, যেখানে uninfected এবং সংক্রামিত উভয় কোষে ubiquitin প্রচুর পরিমাণে, ISG15 অভিব্যক্তি IFN উদ্দীপনা দ্বারা দৃঢ়ভাবে বৃদ্ধি পায়। তা সত্ত্বেও, এমনকি বেসাল স্তরেও, ISG15 অনেক হোস্ট প্রোটিন 20-এর সাথে সংযুক্ত হয়, যার মধ্যে MDA5 সহ আমাদের কাজ দেখায়, যা প্রাথমিক MDA5 সক্রিয়করণের জন্য যথেষ্ট হতে পারে। ভাইরাল সংক্রমণের সময় যা একাধিক PRR দ্বারা অনুভূত হয়, MDA5 ISGylation একটি 'প্রাইমিং' প্রক্রিয়া হতে পারে যেখানে ISG15 একটি অবিলম্বে সহজাত সেন্সর দ্বারা আপগ্র্যুলেশন (উদাহরণস্বরূপ, RIG-I) 41 প্রাইম MDA5 কে 'কিক-স্টার্ট' মোডে প্রবেশ করে। যেহেতু ISG15 নেতিবাচকভাবে RIG-I16,17 নিয়ন্ত্রণ করে, ISGylation 'সেন্সর সুইচিং' ট্রিগার করতে পারে যেখানে MDA5 অ্যাক্টিভেশন প্রচার করা হয় যখন ISG15 মাত্রা বৃদ্ধি পায়, যখন RIG-I কার্যকলাপ স্যাঁতসেঁতে হয়। আমরা শনাক্ত করেছি যে SCoV2 PLpro সেন্সরের সাথে আবদ্ধ হওয়ার পরে তার এনজাইমেটিক কার্যকলাপের মাধ্যমে MDA5 ISGylation-এর প্রতিপক্ষ; এই কৌশলটি সম্ভবত করোনভাইরাসগুলির মধ্যে সংরক্ষণ করা হয়েছে, যা আরও তদন্তের ওয়ারেন্টি দেয়। ক্রাইও-ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি বিশ্লেষণে জানা গেছে যে করোনাভাইরাল Nsp3 হল একটি ছিদ্র কমপ্লেক্সের অংশ যা এন্ডোপ্লাজমিক রেটিকুলাম থেকে প্রাপ্ত ডাবল-মেমব্রেন ভেসিকেলকে বিস্তৃত করে এবং নতুন সংশ্লেষিত ভাইরাল RNA42 রপ্তানি করে। এইভাবে, PAMP সনাক্তকরণের সুবিধার্থে MDA5 ভাইরাল RNA রপ্তানির সাইটের কাছাকাছি অবস্থান করতে পারে; যাইহোক, Nsp3 এর PLpro ডোমেইন (যা সাইটোপ্লাজমিক সাইডে) সরাসরি ডি-আইএসজিলেশনের মাধ্যমে MDA5 সিগন্যালিংকে ব্লক করে। কিছু ভাইরাস MDA5 ফসফোরিলেশনের ডিসরিগুলেশনের মাধ্যমে MDA5 আইএসজিলেশনকেও বাধা দিতে পারে, যেমনটি MeV-V-এর জন্য দেখানো হয়েছে। সংক্ষেপে, আমাদের অধ্যয়ন MDA5-মধ্যস্থিত প্রতিরোধ ক্ষমতা সক্রিয় করার পাশাপাশি SCoV2 দ্বারা এর প্রতিরোধে ISGylation-এর একটি বিশিষ্ট ভূমিকা উন্মোচন করে, COVID-এর বিরুদ্ধে থেরাপিউটিকস ডিজাইনের জন্য একটি সম্ভাব্য আণবিক লক্ষ্য উন্মোচন করে-19।

তথ্যসূত্র

1. লিউ, জি এবং গ্যাক, এমইউ স্বতন্ত্র এবং সহজাতভাবে আরএনএ সেন্সরগুলির অর্কেস্ট্রেটেড ফাংশন। অনাক্রম্যতা 53, 26–42 (2020)।

2. উ, জে. এবং চেন, জেডজে ইননেট ইমিউন সেন্সিং এবং সাইটোসোলিক নিউক্লিক অ্যাসিডের সংকেত। আন্নু। রেভ. ইমিউনল। 32, 461–488 (2014)।

3. চৌ, কেটি, গেল, এম.জেআর অ্যান্ড লু, ওয়াইএম আরআইজি-আই এবং অ্যান্টিভাইরাল অনাক্রম্যতায় অন্যান্য আরএনএ সেন্সর। আন্নু। রেভ. ইমিউনল। 36, 667–694 (2018)।

4. শ্লি, এম. প্যাথোজেনিক RNA-এর মাস্টার সেন্সর—RIG-I লাইক রিসেপ্টর। ইমিউনোবায়োলজি 218, 1322–1335 (2013)।

5. Rehwinkel, J. & Gack, MU RIG-I-এর মতো রিসেপ্টর: RNA সেন্সিংয়ে তাদের নিয়ন্ত্রণ এবং ভূমিকা। নাট। রেভ. ইমিউনল। 20, 537-551 (2020)।

6. Wies, E. et al. ফসফেটেস PP1 দ্বারা RNA সেন্সর RIG-I এবং MDA5 এর ডিফোসফোরিলেশন সহজাত ইমিউন সিগন্যালিং এর জন্য অপরিহার্য। অনাক্রম্যতা 38, 437–449 (2013)।

7. গ্যাক, এমইউ এট আল। TRIM25 RING-Finger E3 ubiquitin ligase RIG-I-মধ্যস্থিত অ্যান্টিভাইরাল কার্যকলাপের জন্য অপরিহার্য। প্রকৃতি 446, 916-920 (2007)।

8. চিয়াং, সি. এবং গ্যাক, MU অন্তঃকোষীয় প্যাথোজেন সেন্সিং পাথওয়ের অনুবাদ-পরবর্তী নিয়ন্ত্রণ। ট্রেন্ডস ইমিউনল। 38, 39–52 (2017)।

9. Lazear, HM, Scoggins, JW & Diamond, MS শেয়ার্ড এবং টাইপ I এবং টাইপ III ইন্টারফেরনের স্বতন্ত্র ফাংশন। অনাক্রম্যতা 50, 907–923 (2019)।

10. স্কোগিন্স, JW ইন্টারফেরন-উদ্দীপিত জিন: তারা সবাই কি করে? আন্নু। রেভ. ভাইরল। 6, 567–584 (2019)।

11. Zhang, D. & Zhang, DE ইন্টারফেরন-উদ্দীপক জিন 15 এবং প্রোটিন ISGylation সিস্টেম। জে. ইন্টারফেরন সাইটোকাইন রেস। 31, 119-130 (2011)।

12. অ্যান্টিভাইরাল অনাক্রম্যতা এবং তার বাইরেও Perng, YC এবং Lenschow, DJ ISG15। নাট। রেভ. মাইক্রোবায়োল। 16, 423–439 (2018)। 13. হাজাদজ, জে. এট আল। প্রতিবন্ধী টাইপ I ইন্টারফেরন কার্যকলাপ এবং গুরুতর COVID-19 রোগীদের মধ্যে প্রদাহজনক প্রতিক্রিয়া। বিজ্ঞান 369, 718–724 (2020)।

14. Klemm, T. et al. SARS-CoV-2 এর প্যাপেইন-সদৃশ প্রোটিজ, PLpro এর প্রক্রিয়া এবং বাধা। EMBO J. 39, e106275 (2020)।

15. শিন, ডি. এট আল। Papain-এর মতো প্রোটিস SARS-CoV-2 ভাইরাল বিস্তার এবং সহজাত অনাক্রম্যতা নিয়ন্ত্রণ করে। প্রকৃতি 587, 657–662 (2020)।

16. কিম, এমজে, হোয়াং, এসওয়াই, ইমাইজুমি, টি. ও ইউ, জেওয়াই ইন্টারফেরন-প্ররোচিত ISG15 সংমিশ্রণ দ্বারা RIG-I-মধ্যস্থতাকারী অ্যান্টিভাইরাল সিগন্যালিংয়ের নেতিবাচক প্রতিক্রিয়া নিয়ন্ত্রণ। জে. ভিরোল। 82, 1474-1483 (2008)।

17. Du, Y. et al. LRRC25 অটোফেজিক অবক্ষয়ের জন্য ISG15-সংশ্লিষ্ট RIG-I লক্ষ্য করে টাইপ I IFN সিগন্যালিংকে বাধা দেয়। EMBO J. 37, 351–366 (2018)।

18. Hato, SV et al. টে মেনগোভাইরাস লিডার প্রোটিন ইন্টারফেরন-আলফা/বিটা জিন ট্রান্সক্রিপশন ব্লক করে এবং ইন্টারফেরন রেগুলেটরি ফ্যাক্টর 3. সেল মাইক্রোবায়োলের সক্রিয়করণকে বাধা দেয়। 9, 2921-2930 (2007)।

19. ডেডডুচে, এস. এট আল। পিকোর্নাভাইরাস-সংক্রমিত কোষে একটি এলজিপি2-সংশ্লিষ্ট MDA5 অ্যাগোনিস্টের সনাক্তকরণ। eLife 3, e01535 (2014)।

20. Durfee, LA, Lyon, N., Seo, K. & Huibregtse, JM Te ISG15 কনজুগেশন সিস্টেম বিস্তৃতভাবে নতুন সংশ্লেষিত প্রোটিনকে লক্ষ্য করে: ISG15 এর অ্যান্টিভাইরাল ফাংশনের জন্য প্রভাব। মোল। সেল 38, 722–732 (2010)।

21. Lenschow, DJ et al. ভিভোতে সিন্দবিস ভাইরাস সংক্রমণের সময় একটি অ্যান্টিভাইরাল অণু হিসাবে ইন্টারফেরন-উদ্দীপিত জিন 15 এর সনাক্তকরণ। জে. ভিরোল। 79, 13974-13983 (2005)।

22. Gack, MU, Nistal-Villan, E., Inn, KS, Garcia-Sastre, A. & Jung, JU ফসফোরিলেশন-মধ্যস্থতা RIG-I অ্যান্টিভাইরাল কার্যকলাপের নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ। জে. ভিরোল। 84, 3220–3229 (2010)।

23. নিস্টাল-ভিলান, ই. এট আল। ইন্টারফেরন-বিটা উৎপাদন নিয়ন্ত্রণে RIG-I সেরিন 8 ফসফোরিলেশনের নেতিবাচক ভূমিকা। জে. বিওল। কেম। 285, 20252–20261 (2010)।

24. মহারাজ, NP, Wies, E., Stoll, A. & Gack, MU প্রচলিত প্রোটিন কাইনেজ সি-আলফা (PKC-আলফা) এবং PKC-বিটা নেতিবাচকভাবে RIG-I অ্যান্টিভাইরাল সংকেত ট্রান্সডাকশন নিয়ন্ত্রণ করে। জে. ভিরোল। 86, 1358-1371 (2012)।

25. ডেভিস, ME এবং অন্যান্য। হামের ভাইরাস V প্রোটিনের দ্বারা ফসফেটেস PP1-এর বৈরিতা MDA5 এর সহজাত ইমিউন পালানোর জন্য প্রয়োজন। সেল হোস্ট মাইক্রোব 16, 19–30 (2014)।

26. লিন, জেপি, ফ্যান, ওয়াইকে এবং লিউ, এইচএম টে 14-3-3ইটা চ্যাপেরোন প্রোটিন এমডিএ5 অলিগোমারাইজেশন এবং আন্তঃকোষীয় পুনঃবণ্টনের সুবিধার মাধ্যমে অ্যান্টিভাইরাল সহজাত অনাক্রম্যতা প্রচার করে। পিএলওএস প্যাথগ। 15, e1007582 (2019)।

27. উ, বি. এবং অন্যান্য। dsRNA স্বীকৃতি, ফিলামেন্ট গঠন, এবং MDA5 দ্বারা অ্যান্টিভাইরাল সংকেত সক্রিয়করণের জন্য কাঠামোগত ভিত্তি। সেল 152, 276–289 (2013)।

28. Yu, Q., Qu, K. & Modis, Y. Cryo-EM কাঠামো ATP হাইড্রোলাইসিসের বিভিন্ন পর্যায়ে MDA5-dsRNA ফিলামেন্ট। মোল। সেল 72, 999–1012 (2018)।

29. Bruns, AM, Leser, GP, Lamb, RA & Horvath, CM Te সহজাত ইমিউন সেন্সর LGP2 MDA5–RNA মিথস্ক্রিয়া এবং ফিলামেন্ট সমাবেশ নিয়ন্ত্রণ করে অ্যান্টিভাইরাল সংকেত সক্রিয় করে। মোল। সেল 55, 771–781 (2014)।

30. উচিকাওয়া, ই. এট আল। অ্যান্টি-ভাইরাল প্যাটার্ন রিকগনিশন রিসেপ্টর এলজিপি 2 এবং এমডিএ 5 এর সাথে DSRNA বাঁধার কাঠামোগত বিশ্লেষণ। মোল। সেল 62, 586–602 (2016)।

31. মালাখোভা, ওএ এবং অন্যান্য। UBP43 হল ইন্টারফেরন সিগন্যালিং এর একটি অভিনব নিয়ন্ত্রক যা এর ISG15 isopeptidase কার্যকলাপ থেকে স্বাধীন। EMBO J. 25, 2358–2367 (2006)।

32. ঝাং, এক্স. এট আল। মানুষের অন্তঃকোষীয় ISG15 ইন্টারফেরন-আলফা/বিটা ওভার-এম্প্লিফিকেশন এবং অটো-প্রদাহ প্রতিরোধ করে। প্রকৃতি 517, 89–93 (2015)।

33. হারকোর্ট, বিএইচ এট আল। গুরুতর তীব্র শ্বাসযন্ত্রের সিন্ড্রোম করোনাভাইরাস প্রতিলিপি পণ্য সনাক্তকরণ এবং প্যাপেইন-সদৃশ প্রোটিজ কার্যকলাপের বৈশিষ্ট্য। জে. ভিরোল। 78, 13600–13612 (2004)।

34. Roth-Cross, JK, Bender, SJ & Weiss, SR Murine করোনাভাইরাস মাউস হেপাটাইটিস ভাইরাস MDA5 দ্বারা স্বীকৃত এবং মস্তিষ্কের ম্যাক্রোফেজ/মাইক্রোগ্লিয়ায় টাইপ I ইন্টারফেরন প্ররোচিত করে। জে. ভিরোল। 82, 9829–9838 (2008)।

35. মেনাচারি, ভিডি এবং অন্যান্য। 2′-ও-মিথাইলট্রান্সফেরেজ কার্যকলাপের অভাবের গুরুতর তীব্র শ্বাসযন্ত্রের সিন্ড্রোম করোনভাইরাস মিউট্যান্টের মনোযোগ এবং পুনরুদ্ধার। জে. ভিরোল। 88, 4251–4264 (2014)।

36. বেকস, এম. এট আল। SARS করোনভাইরাস প্যাপেইন-সদৃশ প্রোটিসের সাথে যুক্ত ডাই-ইউবিকুইটিন এবং ডিউবিকুইটিনেটিং কার্যক্রম Lys48-এর স্বীকৃতি। মোল। সেল 62, 572–585 (2016)।

37. শিশু, কে. এবং অন্যান্য। mda-5, কিন্তু RIG-I নয়, প্যারামাইক্সোভাইরাস V প্রোটিনের জন্য একটি সাধারণ লক্ষ্য। ভাইরোলজি 359, 190-200 (2007)।

38. Shi, HX et al. ISG15 পরিবর্তনের মাধ্যমে Herc5 দ্বারা ইন্টারফেরন নিয়ন্ত্রক ফ্যাক্টর 3 সক্রিয়করণের ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ। মোল। সেল বায়োল। 30, 2424–2436 (2010)।

39. ব্লাঙ্কো-মেলো, ডি. এট আল। SARS-CoV-2 এর প্রতি ভারসাম্যহীন হোস্ট প্রতিক্রিয়া COVID-19 এর বিকাশকে চালিত করে। সেল 181, 1036–1045 (2020)।

40. স্পিয়ার, এসডি এবং অন্যান্য। ISG15 এর ঘাটতি এবং মানুষের মধ্যে ভাইরাল প্রতিরোধের বৃদ্ধি কিন্তু ইঁদুর নয়। নাট। কমুন 7, 11496 (2016)।

41. Errett, JS, Suthar, MS, McMillan, A., Diamond, MS & Gale, M. Jr. Te অপরিহার্য, পশ্চিম নীল ভাইরাস সংক্রমণ সনাক্তকরণ এবং নিয়ন্ত্রণে RIG-I এবং MDA5 এর অপ্রয়োজনীয় ভূমিকা। জে. ভিরোল। 87, 11416–11425 (2013)।

42. উলফ, জি. এট আল। একটি আণবিক ছিদ্র করোনভাইরাস প্রতিলিপি অর্গানেলের ডাবল মেমব্রেনকে বিস্তৃত করে। বিজ্ঞান 369, 1395–1398 (2020)।

43. মেজর, ইও এবং অন্যান্য। মানব ভ্রূণের গ্লিয়াল কোষের একটি লাইন স্থাপন করা যা JC ভাইরাস গুণকে সমর্থন করে। Proc. Natl Acad. বিজ্ঞান USA 82, 1257–1261 (1985)।

44. হার্টজগ, জে. এট আল। জিকা ভাইরাসের ব্রাজিলিয়ান আইসোলেটে সংক্রমণ RIG-I উদ্দীপক আরএনএ এবং ভাইরাল NS5 প্রোটিন ব্লক টাইপ I IFN ইন্ডাকশন এবং সিগন্যালিং তৈরি করে। ইউরো. জে. ইমিউনল। 48, 1120-1136 (2018)।

45. সেরিকান, বি. এট আল। একটি কী rho GTPase নিয়ন্ত্রকের দীর্ঘস্থায়ী বিমোচন থেকে উদ্ভূত কোষ-অভ্যন্তরীণ অভিযোজন। দেব। সেল 39, 28–43 (2016)।

46. ​​চ্যান, ওয়াইকে এবং গ্যাক, এমইউ একটি ফসফোমিমেটিক-ভিত্তিক প্রক্রিয়া ডেঙ্গু ভাইরাসের সহজাত অনাক্রম্যতাকে প্রতিপক্ষ করে। নাট। ইমিউনল। 17, 523–530 (2016)।

47. Riedl, W. et al. জিকা ভাইরাস NS3 একটি সেলুলার নকল করে 14-3-3-আরআইজি-আই- এবং MDA5-মধ্যস্থ সহজাত অনাক্রম্যতাকে প্রতিপক্ষ করার জন্য আবদ্ধ মোটিফ৷ সেল হোস্ট মাইক্রোব 26, 493–503 (2019)।

48. Ulane, CM, Rodriguez, JJ, Parisien, JP & Horvath, CM STAT3 সর্বব্যাপীতা এবং মাম্পস ভাইরাস দ্বারা অবনতি সাইটোকাইন এবং অনকোজিন সংকেতকে দমন করে। জে. ভিরোল। 77, 6385–6393 (2003)।

49. ওডশুর্ন, ডি. এট আল। HERC6 হল মাউস কোষে গ্লোবাল ISG15 কনজুগেশনের জন্য প্রধান E3 ligase। PLOS ONE 7, e29870 (2012)।

50. কিম, ডিকে এবং অন্যান্য। SARS-CoV-2 কোডিং অঞ্চলগুলির একটি ব্যাপক, নমনীয় সংগ্রহ৷ G3 (বেথেসডা) 10, 3399–3402 (2020)।

51. চিয়াং, সি. এট আল। মানব প্যাপিলোমাভাইরাস E6 অনকোপ্রোটিন RIG-I-মধ্যস্থিত সহজাত ইমিউন সিগন্যালিং দমন করতে USP15 এবং TRIM25 কে লক্ষ্য করে। জে. ভিরোল। 92, e01737-17 (2018)।

52. গ্যাক, এমইউ এট আল। TRIM25-মিডিয়াটেড অ্যান্টিভাইরাল সিগন্যাল ট্রান্সডাকশনে RIG-I N-টার্মিনাল ট্যান্ডেম কার্ড এবং স্প্লাইস ভেরিয়েন্টের ভূমিকা। Proc. Natl Acad. বিজ্ঞান USA 105, 16743–16748 (2008)।

53. চিয়াং, জেজে এট আল। সেলুলার 5S rRNA সিউডোজিন ট্রান্সক্রিপ্টের ভাইরাল মাস্কিং RIG-I-মধ্যস্থতা প্রতিরোধকে প্ররোচিত করে। নাট। ইমিউনল। 19, 53–62 (2018)।

54. স্পারার, কেএমজে এট আল। TRIM23 TBK1 সক্রিয়করণের মাধ্যমে ভাইরাস-প্ররোচিত অটোফ্যাজির মধ্যস্থতা করে। নাট। মাইক্রোবায়োল। 2, 1543–1557 (2017)।