ক্ষণস্থায়ী রিসেপ্টর সম্ভাব্য ভ্যানিলয়েড 4-নির্ভর এথেরোজেনিক প্রক্রিয়াগুলির একটি অভিনব প্রতিরোধক হিসাবে বিফাভোনের সনাক্তকরণ এবং কার্যকরী বিশ্লেষণ

অনুগ্রহ করে যোগাযোগ করুনoscar.xiao@wecistanche.comঅধিক জানার জন্য

মাজেন ও আলহারবি, বিদিশা দত্ত, ঋষভ গোস্বামী, শ্বেতা শর্মা, কায়। লেই ও শাইক ও. রহমান

এথেরোস্ক্লেরোসিস, বৃহৎ ধমনীর একটি প্রগতিশীল প্রদাহজনিত রোগ, যা বিশ্বব্যাপী হৃদরোগ-সম্পর্কিত মৃত্যুহার এবং অসুস্থতার ক্রমবর্ধমান বোঝার জন্য সর্বাগ্রে অবদানকারী। এথেরোস্ক্লেরোসিসের দিকে পরিচালিত করে এমন একটি গুরুত্বপূর্ণ সূচনাকারী ঘটনা যা প্রাথমিকভাবে ধমনী শাখা বিন্দুতে সাবএন্ডোথেলিয়াল মহাধমনীর অন্তরঙ্গ স্থানগুলিতে সংশোধিত লো-ডেনসিটি লাইপোপ্রোটিন (অক্সএলডিএল) কণাগুলিকে ধরে রাখা জড়িত। প্রাথমিক এথেরোজেনেসিসের সময়, এন্ডোথেলিয়াল কর্মহীনতার পর, সঞ্চালনকারী রক্তের মনোসাইটগুলি অন্তরীক্ষ অঞ্চলে স্থানান্তরিত হয় এবং টিস্যু ম্যাক্রোফেজেস-এ পার্থক্য করে। মহাধমনীর অন্তরঙ্গ স্থানগুলিতে, SRA এবং CD36-এর মতো স্ক্যাভেঞ্জার রিসেপ্টর দ্বারা সাহায্যপ্রাপ্ত ম্যাক্রোফেজগুলির দ্বারা oxLDL-এর বাঁধন এবং গ্রহণ একটি ফিডফরোয়ার্ড এথেরো-ইনফ্ল্যামেটরি লুপ তৈরি করে যার ফলে লিপিড-ভরা ফোম কোষের বিকাশ ঘটে, যা এথেরোস্ক্লেরোসিসে একটি গুরুত্বপূর্ণ প্রক্রিয়া। ফোম কোষ দ্বারা প্ররোচিত-প্রদাহজনক ঘটনাগুলির ক্যাসকেডগুলি একটি প্রাথমিক ফ্যাটি স্ট্রিক গঠনের দিকে পরিচালিত করে এবং অবশেষে উন্নত এথেরোস্ক্লেরোসিস ক্ষতগুলির উপস্থিতি দেখা দেয় যা ফাইব্রাস ক্যাপ, ক্যালসিফাইড টিস্যু, ইমিউন কোষ, ম্যাট্রিক্স প্রোটিন এবং লিপিড 2-10 এর উপস্থিতি দ্বারা চিহ্নিত করা হয়। TRPV সাবফ্যামিলির ট্রানজিয়েন্ট রিসেপ্টর পটেনশিয়াল ভ্যানিলয়েড 4 (TRPV4), Ca2 প্লাসে প্রবেশযোগ্য একটি নন-সিলেক্টিভ, পলিমোডাল ক্যাটেশন চ্যানেল ম্যাক্রোফেজ 11-24 সহ বিভিন্ন কোষের মধ্যে সর্বব্যাপী প্রকাশ করা হয়। পূর্বে একটি অসমোসেন্সর হিসাবে পরিচিত, TRPV4 এখন তাপ, ম্যাট্রিক্স কঠোরতা, অসমোলারিটি, বৃদ্ধির কারণ, pH এবং 4 ফোরবল এস্টার 11-24 সহ বহুবিধ জৈব রাসায়নিক এবং জৈব-যান্ত্রিক উদ্দীপনার প্রতিক্রিয়া জানাতে পরিচিত। TRPV4 প্রদাহ এবং নিউরোপ্যাথিতে ব্যথা সংবেদন 18,22,23, মায়োফাইব্রোব্লাস্ট ডিফারেনসেশন এবং মাইগ্রেশন 17,25,26 এবং হাড় 27-এ অস্টিওক্লাস্ট পার্থক্যের মতো বিভিন্ন শারীরবৃত্তীয় ফাংশনগুলির মধ্যস্থতা করে বলে জানা গেছে। TRPV4 মিউটেশনগুলি বেশ কয়েকটি চ্যানেলোপ্যাথি 28-31 এর সাথে যুক্ত হয়েছে। আমাদের গোষ্ঠী এবং অন্যদের সাম্প্রতিক গবেষণাগুলি ফুসফুসের আঘাত 22,32, ফোম কোষ গঠন 14,16, টিস্যু এফব্রোসিস 17,33, বিদেশী শরীরের প্রতিক্রিয়া13 এবং ক্যান্সার 34,35 এর মতো অগণিত রোগগত পরিস্থিতিতে এই চ্যানেলের সম্ভাব্য ভূমিকাকে জড়িত করেছে। পূর্বে, TRPV4 এর একটি এথেরোপ্রোটেক্টিভ ভূমিকা দেখানো হয়েছিল, যেখানে এন্ডোথেলিয়াল কোষে রাসায়নিক অ্যাগোনিস্ট-প্ররোচিত TRPV4 ফাংশনটি eNOS সক্রিয়করণ এবং এন্ডোথেলিয়াল কোষে মনোসাইট আনুগত্যের বাধার সাথে যুক্ত দেখানো হয়েছিল। বিপরীতে, TRPV4 ফাংশনগুলির ঘাটতিগুলি এন্ডোথেলিয়াল কর্মহীনতা, হ্রাস ম্যাক্রোফেজ ফোম সেল জেনারেশন এবং ভাস্কুলার রোগ 14,16,37-39 সহ অসংখ্য অ্যাথেরোইনফ্যামেটরি প্রতিক্রিয়ার সাথে যুক্ত হয়েছে। আমাদের পরীক্ষাগার সম্প্রতি TRPV4 এর একটি প্রোথেরোজেনিক ভূমিকা চিহ্নিত করেছে যার মাধ্যমে এটি অক্সএলডিএল-প্ররোচিত ম্যাক্রোফেজ ফোম কোষ গঠন নিয়ন্ত্রণ করে। যান্ত্রিকভাবে, আমরা দেখিয়েছি যে TRPV4 গ্রহণকে প্রভাবিত করে কিন্তু একটি CD36-স্বাধীন পদ্ধতিতে ম্যাক্রোফেজে অক্সএলডিএলকে আবদ্ধ করে না৷ অন্য একটি সমীক্ষায়, আমরা লিপোপলিস্যাকারাইডের উপস্থিতিতে oxLDL-প্ররোচিত ফোম কোষ গঠনের একটি TRPV4-নির্ভর বৃদ্ধি এবং ম্যাট্রিক্সের দৃঢ়তা বৃদ্ধির রিপোর্ট করেছি, এইভাবে মেকানোসেন্সিং এবং এথেরোস্ক্লেরোসিসের ঝুঁকির মধ্যে একটি লিঙ্ক প্রদান করে৷ একসাথে বিবেচনা করা হলে, এই ফলাফলগুলি TRPV4কে এথেরোস্ক্লেরোসিস এবং অন্যান্য রোগের জন্য একটি আকর্ষণীয় লক্ষ্য হিসাবে পরামর্শ দেয়, এইভাবে TRPV4 এর ছোট অণু প্রতিরোধকগুলির আবিষ্কারকে উত্সাহিত করে যা চিকিত্সাগতভাবে কার্যকর থেরাপিউটিকগুলিতে অনুবাদ করা যেতে পারে। থেরাপিউটিকসে প্রাকৃতিক যৌগগুলির ব্যবহার প্রাধান্য পেয়েছে, প্রাথমিকভাবে বর্তমানে বিদ্যমান কৃত্রিম ওষুধের তুলনায় সাশ্রয়ী এবং জৈব সামঞ্জস্যপূর্ণ যৌগের প্রয়োজনীয়তার দ্বারা চালিত হয়েছে। প্রাকৃতিক যৌগ যেমনফ্ল্যাভোনয়েড, অ্যালকালয়েড,পলিফেনল, এবং কার্কিউমিনয়েডস, বিভিন্ন প্রক্রিয়া যেমন বাধাদানের মাধ্যমে কার্ডিওভাসকুলার রোগকে প্রভাবিত করেপ্রদাহজনকসংকেত, ইনসুলিন সংবেদনশীলতা, এবং AMPK, COX1/2, eNOS, এবং Nrf2 পথ 40-45 লক্ষ্য করে রক্তের লিপিড প্রোফাইল উন্নত করা। একাধিক গোষ্ঠীর সাম্প্রতিক গবেষণায় TRPV4 কার্যকলাপের সম্ভাব্য মডুলেটর হিসাবে দুটি ফ্ল্যাভোনয়েড, বারবেরিন এবং এপিজেনিন চিহ্নিত করা হয়েছে 46,47। আমরা একটি ফ্লুরোমেট্রিক ইমেজিং প্লেট রিডার (FLIPR)-ভিত্তিক Ca2 প্লাস ইনফ্লাক্স অ্যাস ব্যবহার করে প্রাকৃতিক যৌগের একটি লাইব্রেরি থেকে TRPV4-এর সম্ভাব্য বিরোধীদের শনাক্ত করার জন্য একটি সেমি হাই-থ্রুপুট স্ক্রীনিং পদ্ধতি তৈরি এবং ব্যবহার করেছি। এখানে, আমরা ম্যাক্রোফেজে TRPV4-নির্ভর এথেরোজেনিক প্রক্রিয়াগুলির একটি অভিনব প্রতিরোধক হিসাবে লিঙ্কডিন, একটি ফ্ল্যাভোন সনাক্তকরণ এবং কার্যকরী বিশ্লেষণের প্রতিবেদন করি, এইভাবে এই প্রাকৃতিক যৌগটির আরও অধ্যয়নের ভিত্তি স্থাপন করে একটি প্রাকৃতিক অ্যান্টি-এথেরোস্ক্লেরোটিক ছোট হিসাবে অণু যৌগ। Linkedin নিউরোপ্রোটেক্টিভ প্রদর্শনের জন্য রিপোর্ট করা হয়েছে,বিরোধী কার্সিনোজেনিক, এবংপ্রদাহ বিরোধীভূমিকা48,49। আমরা অসংখ্য জৈব রাসায়নিক এবং সেলুলার অ্যাসেস ব্যবহার করে ম্যাক্রোফেজ ফোম সেল গঠনের সেটিংয়ে TRPV4 এর বিরুদ্ধে লিঙ্কডিনের ক্রিয়াকলাপের প্রক্রিয়াটি রিপোর্ট করি।

আরো জানতে এখানে ক্লিক করুন

উপাদান এবং পদ্ধতি প্রাণী এবং কোষ সংস্কৃতি

আমরা চার্লস রিভার ল্যাবরেটরিজ (উইলমিংটন, ম্যাসাচুসেটস, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র) থেকে জন্মগত C57BL/6 বন্য ধরনের (WT) ইঁদুর কিনেছি। ইউনিভার্সিটি অফ মেরিল্যান্ড অ্যানিমাল কেয়ার অ্যান্ড ইউজ কমিটির নির্দেশিকা সমস্ত প্রাণী পরীক্ষার জন্য অনুসরণ করা হয়েছিল এবং লেখকরা ARRIVE নির্দেশিকা মেনে চলেন। থিওগ্লাইকোলেট-প্ররোচিত মুরিন রেসিডেন্ট ম্যাক্রোফেজ (MRM) এর বিচ্ছিন্নতার জন্য, 4 দিনের ইন্ট্রাপেরিটোনিয়াল থিওগ্লাইকোলেট ইনজেকশনের পরে পেরিটোনিয়াল ল্যাভেজ সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং কোষগুলি 10 শতাংশ ভ্রূণের বোভাইন সিরাম (FBS) DMEM7,14,16 ধারণকারী রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল। একটি মুরিন ম্যাক্রোফেজ সেল লাইন (RAW264.7), এবং হিউম্যান ডার্মাল ফাইব্রোব্লাস্টস (HDF) ATCC (Manassas, VA) থেকে কেনা হয়েছিল এবং যথাক্রমে DMEM বা MEM (Gibco, Waltham, MA) এর সাথে সংস্কৃত করা হয়েছিল। মুরিন অস্থি মজ্জা থেকে প্রাপ্ত ম্যাক্রোফেজগুলি (BMDMs) 6- থেকে 7- সপ্তাহ বয়সী ইঁদুর কাটা হয়েছিল, যেমন পূর্বে বর্ণিত হয়েছে 14,50,51৷ সংক্ষেপে, WT এবং TRPV4 KO ইঁদুর থেকে ফিমার সংগ্রহ করা হয়েছিল, এবং 10 শতাংশ FBS সহ সম্পূর্ণ DMEM মিডিয়ার সাথে ফিমারের অস্থি মজ্জা ফ্লাশ করা হয়েছিল। Te স্থগিত অস্থি মজ্জা কোষগুলিকে একটি 70 µm স্ট্রেনার (BD বায়োসায়েন্স) এর মাধ্যমে ফিল্টার করা হয়েছিল, সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল, এবং ম্যাক্রোফেজে পার্থক্য করার জন্য 7-8 দিনের জন্য M-CSF (25 ng/mL) এর সাথে সম্পূরক DMEM মাধ্যমে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল।

বিকারক

Linkedin এবং GSK1016790A (GSK101) সিগমা-অলড্রিচ (সেন্ট লুইস, MO) থেকে কেনা হয়েছিল এবং FLIPR ক্যালসিয়াম 6 অ্যাস কিট মলিকুলার ডিভাইস (সানিভেল, CA) থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। মানব নেটিভ এলডিএল (ভিএলডিএল) স্টেমসেল টেকনোলজিস (ভ্যাঙ্কুভার, কানাডা) থেকে কেনা হয়েছিল। আমরা তামা-অক্সিডাইজড এলডিএল (অক্সএলডিএল)7,14,16 প্রস্তুত করতে 37 ডিগ্রিতে 12 ঘন্টার জন্য 5 µM CuSO4 দিয়ে LDL ইনকিউবেশন করেছি। ফ্লুরোসেন্ট ডাই-লেবেলযুক্ত, DiI-oxLDL, Invitrogen (Carlsbad, CA) থেকে এবং MCSF R&D (Minneapolis, MN) থেকে কেনা হয়েছিল। FACS বিশ্লেষণের জন্য অ্যান্টিবডিগুলি ছিল: TRPV4 (মিলিপুর; বার্লিংটন, এমএ), CD36 (R&D; Minneapolis, MN), TLR4, এবং TLR6 (Novus Biologicals; Centennial, CO)। পিই-কঞ্জুগেটেড সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলি R&D (মিনিয়াপোলিস, MN) থেকে এবং PE-সংযুক্ত আইসোটাইপ নিয়ন্ত্রণগুলি বিডি (ফ্রাঙ্কলিন লেক, এনজে) থেকে ছিল। পরিমাণগত পলিমারেজ চেইন প্রতিক্রিয়া (qRT-PCR), আমরা QIAGEN (Redwood City, CA) থেকে RNeasy কিট ব্যবহার করেছি। সমস্ত প্রাইমার বায়ো-র্যাড (হারকিউলিস, সিএ) থেকে কেনা হয়েছিল। সেল কালচার মিডিয়া, সেল কালচার-সম্পর্কিত পণ্য এবং ওয়েস্টার্ন ব্লট রিএজেন্টগুলি থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক (ওয়ালথাম, এমএ) থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল।

বিরোধী ক্লান্তি জন্য cistanche

সেমি হাই-থ্রুপুট স্ক্রীনিং

আমরা ফ্লুরোমেট্রিক ইমেজিং প্লেট রিডার (FLIPR)-ভিত্তিক ক্যালসিয়াম ইনফ্লাক্স অ্যাসে 14,17 ব্যবহার করে 2000 প্রাকৃতিক যৌগগুলির (MSSP-2000, জনস হপকিন্স চেমকোর) একটি লাইব্রেরি থেকে Trpv4-এর বিরোধীদের জন্য একটি সেমি হাই-থ্রুপুট স্ক্রীনিং করেছি৷ আমরা জিঙ্কগেটিন (GGT) কে TRPV4-এর অভিনব প্রতিপক্ষ হিসেবে চিহ্নিত করেছি। প্রাথমিক এবং মাধ্যমিক স্ক্রীনিং RAW264.7, HDF, এবং BMDM-এর সাথে সম্পাদিত হয়েছিল লিঙ্কডইন এবং অন্যান্য প্রার্থীদের TRPV{10}}এলিকেটেড Ca2 প্লাস ইনফাক্স14,17 প্রতিরোধ করার ক্ষমতা মূল্যায়ন করার জন্য। নিয়ন্ত্রণ হিসাবে, আমরা A23187, একটি ক্যালসিয়াম আয়নোফোর, TRPV4 নাল BMDMs এবং GSK219, একটি নির্বাচনী TRPV4 বিরোধী17 ব্যবহার করেছি। সেকেন্ডারি স্ক্রিনিংয়ের পর, আমরা গাড়ি নিয়ন্ত্রণের তুলনায় TRPV4-মধ্যস্থ Ca2 প্লাস ইনফ্লাক্সের তিনগুণ বেশি বাধা দেখানো ছয়টি যৌগ শনাক্ত করেছি। লিঙ্কডিনকে TRPV4 কার্যকলাপের সবচেয়ে শক্তিশালী প্রতিরোধক হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছিল। BMDMs (5×104 কোষ/কূপ) কোলাজেন-কোটেড (10 µg/ml) 96-ভালোভাবে পরিষ্কার নীচের কালো প্লেটগুলিতে বীজ করা হয়েছিল এবং 37 ডিগ্রী, 5 শতাংশ CO2-এ ইনকিউব করা হয়েছিল। পরীক্ষার দিন, কোষগুলিকে এইচবিএসএস-এ ক্যালসিয়াম 6 ডাই, 20 মিলিমিটার এইচপিইএস, 2.5 মিমি প্রোবেনসিড দিয়ে লোড করা হয়েছিল এবং 37 ডিগ্রিতে 45 ​​মিনিটের জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল। ইনকিউবেশনের পরে, লাইব্রেরি যৌগগুলি প্রতিটি কূপে 2 µM এর চূড়ান্ত ঘনত্বে যুক্ত করা হয়েছিল। প্লেটগুলি 37 ডিগ্রীতে আরও 45 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। Ca2 প্লাস ইনফ্লাক্স TRPV4 অ্যাগোনিস্ট GSK1016790A-এর 10 nM যোগ করার দ্বারা প্ররোচিত হয়েছিল গাড়ি- বা যৌগ-প্রিট্রিটেড কোষে এবং ΔF/F (ম্যাক্স-মিন) পরিমাপ করে রেকর্ড করা হয়েছিল, যেমনটি পূর্বে বর্ণিত হয়েছে17। ডেটা আপেক্ষিক ফ্লুরোসেন্স ইউনিট (RFU) হিসাবে দেখানো হয়।

ইমিউনোব্লট

থিওগ্লাইকোলেট-এলিসিটেড পেরিটোনিয়াল ম্যাক্রোফেজগুলি 10 শতাংশ এফবিএস-এ ডিএমইএম ধারণকারী এবং রাতারাতি ইনকিউব করা হয়েছিল। অনুপস্থিত কোষগুলি ধুয়ে ফেলা হয়েছিল, এবং DMEM ধারণকারী 1 শতাংশ বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন (বিএসএ) প্লেটে যোগ করা হয়েছিল এবং লিঙ্কডিন চিকিত্সার আগে 3 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল। CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, TLR6, এবং GAPDH প্রোটিনের অভিব্যক্তি নির্ধারণের জন্য লিংকডিন (1 এবং 5 µM) বা oxLDL (25 µg/ml) এর উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিতে লিংকডিন (1 এবং 5 µM) বা গাড়ির সাথে রাতারাতি চিকিত্সা করা কোষ থেকে সম্পূর্ণ কোষের লাইসেট তৈরি করা হয়েছিল। ) এলপিএস-ট্রিগারড পি-জেএনকে এবং জেএনকে-এর এক্সপ্রেশনের মাত্রা নির্ধারণ করতে, কোষগুলিকে 3 ঘন্টার জন্য লিঙ্কডিন (5 এবং 10 μM) দিয়ে প্রিট্রিট করা হয়েছিল এবং তারপরে 30 মিনিটের জন্য ই. কোলি এলপিএস দিয়ে উদ্দীপিত করা হয়েছিল। সম্পূর্ণ-সেল লাইসেটগুলি দুবার ধোয়া কোষ (বরফ-ঠান্ডা পিবিএস) থেকে RIPA বাফার ব্যবহার করে যুক্ত প্রোটেজ ইনহিবিটর ককটেল (থার্মো সায়েন্টিফিক, এমএ) থেকে প্রস্তুত করা হয়েছিল। খরগোশ-বিরোধী TRPV4 (অ্যালোমন ল্যাব, জেরুজালেম, ইজরায়েল), অ্যান্টি-মাউস CD36 (R&D, Minneapolis, MN), খরগোশ-বিরোধী TLR4, খরগোশ-বিরোধী TLR6, খরগোশ-বিরোধী JNK, এবং খরগোশ-বিরোধী-পি- দিয়ে ব্লটগুলি পরীক্ষা করা হয়েছিল। জেএনকে প্রাথমিক অ্যান্টিবডি (সেল সিগন্যালিং, ড্যানভার্স, এমএ) এর পরে অ্যান্টি-রবিট এবং অ্যান্টি-মাউস এইচআরপি-কনজুগেটেড সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (R&D, মিনিয়াপোলিস, MN)। লোডিং নিয়ন্ত্রণের জন্য ব্লটগুলি ছিনিয়ে নেওয়া হয়েছিল এবং অ্যান্টি-GAPDH IgG (1:2000; সান্তা ক্রুজ, ডালাস, TX) দিয়ে পুনরায় তদন্ত করা হয়েছিল।

ফেনা কোষ গঠন।থিওগ্লাইকোলেট-ট্রিগারড এমআরএম একটি 12 ওয়েল প্লেটে DMEM, 10 শতাংশ FBS সহ কাচের কভারস্লিপগুলিতে বীজ করা হয়েছিল এবং 2 ঘন্টার জন্য 37 ডিগ্রি, 5 শতাংশ CO2 এ ইনকিউব করা হয়েছিল। কোষে GGT (1 বা 10 µM) যোগ করা হয়েছিল, এবং 3 ঘন্টা ইনকিউবেশনের পরে, oxLDL (50 µg/ml) যোগ করা হয়েছিল, এবং কালচারগুলিকে 37 ডিগ্রিতে রাতারাতি ইনকিউব করা হয়েছিল। নেটিভ LDL (50 ug/ml) গ্রুপ কূপ নিয়ন্ত্রণে যোগ করা হয়েছিল এবং রাতারাতি ইনকিউবেট করা হয়েছিল। কোষগুলিকে 4 শতাংশ প্যারাফর্মালডিহাইডে স্থির করা হয়েছিল এবং তারপরে ফেনা কোষ তৈরির পরিমাণ নির্ধারণের জন্য অয়েল রেড ও স্টেনিং করা হয়েছিল।

অ্যাডেনোভাইরাস ভেক্টর ট্রান্সডাকশন।আমরা Ad(RGD)-মাউস TRPV4 (Ade-TRPV4; ~1010 pfu/ml), এবং অ্যাডেনোভাইরাস ফাঁকা ভেক্টর, Ad(RGD)-CMV-null (Ade-Vec; 1011 pfu/ml) প্রকাশ করার জন্য অ্যাডেনোভাইরাস গঠন সংগ্রহ করেছি। ভেক্টর Biolabs, Malvern, PA. আমরা সমস্ত পরীক্ষার জন্য 1×108 pfu/ml ব্যবহার করেছি। ফোম সেল জেনারেশন স্টাডির জন্য, ম্যাক্রোফেজ ফোম সেল তৈরি করতে oxLDL যোগ করার আগে DMEM মিডিয়াতে Ade-TRPV4 বা Ade-Vec দিয়ে মাউস পেরিটোনিয়াল ম্যাক্রোফেজগুলিকে 72 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল।

ox-LDL-এর বাইন্ডিং এবং গ্রহণ।বাইন্ডিং মূল্যায়ন করার জন্য, পেরিটোনিয়াল ম্যাক্রোফেজগুলিকে লিঙ্কডিনের দুটি ডোজ (1 বা 10 µM) বা 3 ঘন্টার জন্য গাড়ি দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং এক ঘন্টার জন্য 4 ডিগ্রিতে ডিআই-অক্সএলডিএল দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। লিঙ্কডিন বা গাড়ির সাথে প্রাক-চিকিত্সা করার পরে, কোষগুলিকে ডিআই-অক্সএলডিএল দিয়ে 37 ডিগ্রিতে 30 মিনিটের জন্য গ্রহণের মূল্যায়ন করা হয়েছিল। চিত্রগুলি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি (63x) দ্বারা ক্যাপচার করা হয়েছিল এবং ফলাফলের পরিমাণ নির্ধারণের জন্য চিত্র জে ব্যবহার করা হয়েছিল।

ফ্লো সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণ।থিওগ্লাইকোলেট-এলিসিটেড পেরিটোনিয়াল ম্যাক্রোফেজগুলি 24 ঘন্টার জন্য DMEM, 10 শতাংশ FBS-তে সংস্কৃতি করা হয়েছিল। অনুপস্থিত কোষগুলি ধুয়ে ফেলা হয়েছিল, সিরাম-মুক্ত মাধ্যম যোগ করা হয়েছিল, এবং কোষগুলিকে 2 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল তারপরে 5 µM GGT বা যান যোগ করা হয়েছিল এবং 3 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেশন অব্যাহত ছিল। চিকিত্সা করা কোষগুলিকে প্লেট থেকে স্ক্র্যাপ করা হয়েছিল এবং পিবিএস, 2 শতাংশ বিএসএতে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল। কোষগুলিকে 45 মিনিটের জন্য প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলির সাথে ইনকিউবেশন করা হয়েছিল এবং তারপরে PE-সংযুক্ত সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দিয়ে 30 মিনিট ইনকিউবেশন করা হয়েছিল। একটি FACSCantoII ফ্লো সাইটোমিটার (বিডি বায়োসায়েন্স, অন্টারিও, কানাডা) ডেটা অর্জনের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। FlowJo সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে সমস্ত ডেটা প্রক্রিয়া করা হয়েছিল।

qRT-PCR।থিওগ্লাইকোলেট-প্ররোচিত ম্যাক্রোফেজগুলিকে 5 µM লিঙ্কডিন বা বাহন দিয়ে 3 ঘন্টার জন্য চিকিত্সা করা হয়েছিল; 25 µg/ml oxLDL গাড়িতে বা লিঙ্কডিন-চিকিত্সা করা কোষে যোগ করা হয়েছিল এবং রাতারাতি ইনকিউবেশন অব্যাহত ছিল। QIAGEN থেকে RNeasy মাইক্রো কিট (#74,004) মোট RNA বের করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং RNA ট্রান্সক্রাইব করার জন্য Bio-Rad থেকে একটি ইউনিভার্সাল SYBR গ্রিন ওয়ান-স্টেপ কিট ব্যবহার করা হয়েছিল। একটি C1000 টাচ থার্মাল সাইক্লার (বায়ো-র্যাড) ডেটা অর্জনের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। Bio-Rad qRT-PCR সিস্টেম ব্যবহারকারী বুলেটিনে বর্ণিত তুলনামূলক CT পদ্ধতি ব্যবহার করে GAPDH mRNA-এর তুলনায় জিন-নির্দিষ্ট mRNA-এর পরিমাণ হিসাবে একটি জিনের অভিব্যক্তি নির্ধারণ করা হয়েছিল।

পরিসংখ্যান সংক্রান্ত বিশ্লেষণ.ডেটা জৈবিক ট্রিপ্লিকেটের গড় ± SEM হিসাবে উপস্থাপন করা হয়। গ্রাফপ্যাড প্রিজম 7৷{1}} সফ্টওয়্যারটি ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং গণনাগুলি দুটি গ্রুপের জন্য ছাত্রদের টি-টেস্ট বা একাধিক গোষ্ঠীর জন্য একমুখী ANOVA ব্যবহার করে পরিচালিত হয়েছিল৷

নৈতিক অনুমোদন।ইঁদুরের উপর সমস্ত পরীক্ষা-নিরীক্ষা ইনস্টিটিউশনাল অ্যানিমাল কেয়ার অ্যান্ড ইউজ কমিটি (IACUC) নির্দেশিকা অনুসারে পরিচালিত হয়েছিল এবং ইউনিভার্সিটি অফ মেরিল্যান্ড-কলেজ পার্ক পর্যালোচনা কমিটি দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল।

ফলাফল in Semi high‑throughput screening for antagonists of TRPV4 from a library of natural compounds using a FLIPR‑based Ca2+ influx assay. A library containing a collection of structurally and functionally known natural compounds was screened using a semi high-throughput FLIPR-based Ca2+ influx assay (Fig. 1A) to investigate the modulatory effect of these compounds on TRPV4-elicited Ca2+ influx. Initial screening performed with 2000 compounds on primary human dermal fibroblasts and RAW264.7 cells identified 76 lead compounds that significantly (≥threefold) inhibited GSK101-induced (a TRPV4 specific agonist) Ca2+ influx. We performed a secondary screening of the lead compounds using the same assay on RAW 264.7 cells. We further verified and selected 6 compounds that produced reproducible and significant (>তিনগুণ পি<0.001) inhibition="" of="" trpv4-elicited="" ca2+="" influx="" in="" bmdms="" as="" compared="" to="" the="" vehicle="" control="" (fig.="" 1b).="" our="" screening="" assay="" proved="" to="" be="" a="" high="" confidence="" assay="" for="" detecting="" small="" molecule="" compounds="" with="" trpv4="" inhibitory="" effects="" as="" reflected="" by="" a="" good="" z="" factor="" value="" (0.703).="" we="" have="" used="" a23187="" (a23),="" a="" calcium="" ionophore,="" as="" the="" positive="" control,="" and="" gsk2193874="" (gsk219),="" a="" selective="" small-molecule="" chemical="" inhibitor="" of="" trpv4,="" as="" the="" negative="" control14–17.="" linkedin="" (ggt)="" was="" identified="" as="" one="" of="" the="" most="" potent="" inhibitors="" of="" trpv4="" in="" the="" screening.="" since="" previously="" published="" reports="" showed="" that="" ggt="" has="" an="" anti-inflammatory="" and="" anti-adipogenic="" effect,="" we="" selected="" ggt="" for="" further="" functional="" analysis="" on="" trpv4-dependent="" macrophage="" proatherogenic="">

চিত্র 1. প্রাকৃতিক যৌগগুলির একটি লাইব্রেরি থেকে একটি অভিনব TRPV4 ইনহিবিটর হিসাবে লিঙ্কডিনের সেমি হাই-থ্রুপুট স্ক্রীনিং-ভিত্তিক সনাক্তকরণ। (A) ফ্লো চার্ট 2000টি প্রাকৃতিক যৌগের একটি লাইব্রেরি থেকে সম্ভাব্য TRPV4 ইনহিবিটর হিসাবে জিঙ্কগেটিনের সনাক্তকরণের ফলে কার্যপ্রবাহ দেখায়। (বি) প্রতিনিধি ফ্লেক্সস্টেশন 3 রেকর্ডিং 6টি প্রাকৃতিক যৌগের প্রতিরোধক প্রভাব দেখাচ্ছে TRPV4 অ্যাগোনিস্ট (GSK1016790A)-প্ররোচিত Ca2 প্লাস ক্যালসিয়াম 6 ডাই-লোডেড BMDM-তে সেকেন্ডারি স্ক্রীনিংয়ের সময় ইনফ্লাক্স। সমস্ত 6টি যৌগের সাথে প্রিট্রিটমেন্ট TRPV4-নির্ভর Ca2 প্লাস ইনফ্লাক্সে গাড়ির সাথে প্রিট্রিটেড সেলের তুলনায় (নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ; যানবাহন প্লাস GSK1016790A (10 nM)) বা ক্যালসিয়াম আয়নোফোর (A23187, 2 μM) এর তুলনায় প্রতিরোধমূলক প্রভাব দেখিয়েছে। আমরা একটি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে নির্বাচনী TRPV4 বিরোধী, GSK2193874 (10 nM) ব্যবহার করেছি। সমস্ত পরীক্ষা-নিরীক্ষা চারগুণে তিনবার পুনরাবৃত্তি হয়েছিল। RFU: আপেক্ষিক ফ্লুরোসেন্স ইউনিট।

GGT দ্বারা TRPV4 বাধা অক্সএলডিএল-প্ররোচিত ম্যাক্রোফেজ ফোম কোষ গঠনকে বাতিল করে।আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে TRPV4-এলিকেটেড Ca2 প্লাস ইনফ্লাক্স oxLDL-মধ্যস্থিত ফোম সেল গঠন 14,16 এর সাথে জড়িত। অতএব, আমরা সম্ভাবনাটি মূল্যায়ন করেছি যে ফোম কোষ গঠনটি TRPV4 কার্যকলাপের GGT- মধ্যস্থতা বিরোধীতা দ্বারা বাধাপ্রাপ্ত হয়েছিল। জিজিটি-এর উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিতে ফোম কোষ গঠনে প্ররোচিত করতে ওয়াইল্ড-টাইপ মিউরিন পেরিটোনিয়াল ম্যাক্রোফেজগুলিকে অক্সএলডিএল দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল এবং অয়েল রেড ও স্টেনিং দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। প্রত্যাশিত হিসাবে, আমরা দেখেছি যে নেটিভ এলডিএল (চিত্র 2এ, বি) এর তুলনায় অক্সএলডিএল চিকিত্সা করা ম্যাক্রোফেজে ফোম কোষের প্রজন্ম পাঁচগুণ বেড়েছে। যাইহোক, oxLDL দিয়ে উদ্দীপনার আগে GGT (1 বা 10 µM) দিয়ে ম্যাক্রোফেজগুলির চিকিত্সা উল্লেখযোগ্যভাবে ফোম কোষের শতাংশ হ্রাস করেছে (চিত্র 2A, B)। সমষ্টিগতভাবে, এই ফলাফলগুলি ম্যাক্রোফেজ ফোম কোষ গঠনের উপর GGT-এর একটি প্রতিরোধমূলক প্রভাবের পরামর্শ দেয় যা সম্ভবত TRPV4-উদ্ভূত Ca2 প্লাস ইনফ্লাক্সকে লক্ষ্য করে। তদ্ব্যতীত, আমরা অ্যাডেনোভাইরাস কনস্ট্রাক্ট ব্যবহার করে TRPV4 নাল ম্যাক্রোফেজে TRPV4 ওভার এক্সপ্রেস করেছি এবং তারপর GGT-এর উপস্থিতিতে oxLDL ব্যবহার করে ফোম সেল গঠনকে প্ররোচিত করেছি। আমরা দেখেছি যে TRPV4-এর অত্যধিক এক্সপ্রেশন ফোম কোষের গঠনকে বাড়িয়ে দিয়েছে যা ব্লক করা হয়েছিল যখন আমরা GGT দিয়ে কোষকে প্রিট্রিট করি, পরামর্শ দেয় যে GGT দ্বারা প্রোথেরোজেনিক ফোম কোষ গঠনের বাধা TRPV4 নির্ভর (চিত্র 2C, D)।

GGT TRPV4 এবং প্রদাহজনিত রিসেপ্টরগুলির অভিব্যক্তির বেসাল স্তরকে অবরুদ্ধ করে না।স্ক্যাভেঞ্জার রিসেপ্টর CD36 অক্সএলডিএল গ্রহণ এবং বাঁধাই এবং ফোম কোষ গঠন, এথেরোস্ক্লেরোসিস4–7,54,55-এর জটিল প্রক্রিয়াগুলিতে একটি প্রধান ভূমিকা পালন করে। সম্প্রতি, প্রমাণের একটি ক্রমবর্ধমান সংস্থা এথেরোস্ক্লেরোসিসে টোল-জাতীয় রিসেপ্টরগুলির জড়িত থাকার পরামর্শ দেয় 2,4,56। CD36, TLR4, TLR6, এবং TRPV4 এর অভিব্যক্তিকে প্রভাবিত করার মাধ্যমে GGT ফোম কোষ গঠনকে অবরুদ্ধ করেছে কিনা তা তদন্ত করতে, আমরা GGT (1 বা 5 μM) এর দুটি ঘনত্বে ইমিউনোব্লট বিশ্লেষণ করেছি। আমরা CD36, TRPV4, TLR6, এবং TLR4-এর অনুরূপ অভিব্যক্তি স্তর খুঁজে পেয়েছি যা চিকিত্সা না করা নিয়ন্ত্রণের তুলনায় (চিত্র 3A-D)। ফ্লো সাইটোমেট্রিক বিশ্লেষণ এছাড়াও GGT চিকিত্সা (চিত্র 3E–H, I–L) সহ বা ছাড়া প্রোটিনের কোষ পৃষ্ঠের অভিব্যক্তিতে কোনও উল্লেখযোগ্য পার্থক্য প্রকাশ করেনি। একসাথে বিবেচনা করে, এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে GGT TRPV4, CD36, TLR4 এবং TLR6 এর পৃষ্ঠের অভিব্যক্তির বেসাল স্তরগুলিকে বাধা না দিয়ে ম্যাক্রোফেজ ফোম কোষ গঠনে বাধা দেয়।

চিত্র 2. লিঙ্কডিন দ্বারা TRPV4-এর বাধা অক্সএলডিএল-প্ররোচিত ম্যাক্রোফেজ ফোম কোষ গঠনকে বাতিল করে। (A) থিওগ্লাইকোলেট-প্ররোচিত মিউরিন পেরিটোনিয়াল ম্যাক্রোফেজগুলিকে রাতারাতি 50 μg/ml oxLDL দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল, তারপরে যানবাহন বা 1 বা 10 μM লিঙ্কডিন দিয়ে 3 ঘন্টা প্রিইনকিউবেশন করা হয়েছিল। কোষগুলিকে নিয়ন্ত্রণ হিসাবে 50 µg/mL নেটিভ LDL (VLDL) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। আসল বিবর্ধন: 40x। (B) ফলাফলের পরিমাপ (A) এ দেখানো হয়েছে। n=500 কোষ/পরিস্থিতি। ছাত্রের টি-পরীক্ষা; *** পি<0.001. data="" represent±sem.="" (c)="" trpv4="" ko="" rpms="" were="" transduced="" with="" either="" ade-vec="" or="" ade-trpv4="" and="" were="" untreated="" or="" treated="" with="" ggt="" in="" the="" presence="" of="" oxldl="" for="" 16="" h="" on="" day="" 5="" of="" transduction="" for="" macrophage="" foam="" cell="" formation.="" (d)="" quantification="" of="" the="" results="" shown="" in="" c.="" n="100" cells/condition.="" student's="" t-test;=""><>

অক্সএলডিএল গ্রহণ, কিন্তু ম্যাক্রোফেজ দ্বারা আবদ্ধ নয় GGT দ্বারা দমন করা হয়। যেহেতু TRPV4 এর আগে oxLDL এবং ফোম কোষ গঠনে ভূমিকা রয়েছে 14,16 দেখানো হয়েছে, আমরা মূল্যায়ন করেছি যে GGT-এর সাথে চিকিত্সা ম্যাক্রোফেজ পৃষ্ঠে oxLDL-এর বাঁধনে প্রতিবন্ধকতা সৃষ্টি করে কিনা। ডাব্লুটি পেরিটোনিয়াল ম্যাক্রোফেজগুলিকে ডিআই-অক্সএলডিএল দিয়ে 4 ডিগ্রিতে ইনকিউবেশনের আগে জিজিটি দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং বাঁধাই মূল্যায়ন করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি ইঙ্গিত করে যে ম্যাক্রোফেজ পৃষ্ঠে অক্সএলডিএল বাঁধাই যানবাহন নিয়ন্ত্রণের (চিত্র 5A-C) তুলনায় GGT (1 বা 10 µM) চিকিত্সা দ্বারা উল্লেখযোগ্যভাবে বাধাপ্রাপ্ত হয়নি। GGT oxLDL-এর বাঁধনকে বাধা দেয় না বলে প্রতিষ্ঠিত করার পরে, আমরা পরবর্তীতে GGT চিকিত্সার দ্বারা ম্যাক্রোফেজে oxLDL গ্রহণের প্রতিবন্ধকতা ছিল কিনা তা নির্ধারণ করার লক্ষ্য নিয়েছিলাম। মজার বিষয় হল, আমাদের ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে গাড়ি-চিকিত্সা করা গ্রুপের (চিত্র 6A, B) তুলনায় GGT প্রিট্রিটেড কোষগুলিতে ম্যাক্রোফেজে oxLDL গ্রহণে উল্লেখযোগ্য বাধা ছিল। সবকিছু একসাথে বিবেচনা করে, এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে GGT ম্যাক্রোফেজে oxLDL গ্রহণকে ব্লক করে, কিন্তু বাঁধাই নয়।

GGT ম্যাক্রোফেজে TRPV4-এর oxLDL-প্ররোচিত অভিব্যক্তিকে ব্লক করে।

আমাদের পূর্বে প্রকাশিত গবেষণায় দেখা গেছে যে TRPV4-এলিকেটেড Ca2 প্লাস oxLDL-মধ্যস্থিত ম্যাক্রোফেজ ফোম কোষ গঠনে ভূমিকা পালন করে 14,16, আমরা নির্ধারণ করতে চেয়েছিলাম যে GGT CD36-এর oxLDL-প্ররোচিত অভিব্যক্তিকে দমনের মাধ্যমে ফোম কোষ গঠনকে অবরুদ্ধ করেছে কিনা, TLR2, TLR4, TLR6, বা TRPV4। আমরা দেখতে পেয়েছি যে oxLDL-এর সাথে ম্যাক্রোফেজগুলির রাতারাতি উদ্দীপনার ফলে LDL-এর তুলনায় TRPV4 প্রোটিনের অভিব্যক্তি উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে, যখন অন্যান্য রিসেপ্টরগুলির অভিব্যক্তি (CD36, TLR2, TLR4, এবং TLR6) অপরিবর্তিত রয়েছে (ডুমুর। 4A-F)। oxLDL-এর সাহায্যে উদ্দীপনার আগে GGT-এর সাথে কোষের প্রিট্রিটমেন্ট গাড়ির চিকিৎসার তুলনায় TRPV4 প্রোটিনের প্রকাশের মাত্রা বেছে বেছে কমিয়ে দেয় (চিত্র 4A-F)। সমষ্টিগতভাবে, এই ফলাফলগুলি TRPV4 প্রোটিন অভিব্যক্তিতে GGT-এর একটি প্রতিরোধমূলক প্রভাবের পরামর্শ দেয়, যা GGT দ্বারা ফোম কোষ গঠনের দমনের সাথে জড়িত থাকতে পারে।

চিত্র 3. লিঙ্কডিন চিকিত্সা ম্যাক্রোফেজে TRPV4, CD36 এবং TLR-এর মোট প্রোটিন বা পৃষ্ঠের অভিব্যক্তিকে পরিবর্তন করে না। (A-D) 1 বা 5 µM লিঙ্কডিন বা গাড়ির সাথে রাতারাতি চিকিত্সার পরে ম্যাক্রোফেজ সমগ্র কোষের ইমিউনোব্লটগুলি লাইসেট করে। রিপ্রেজেন্টেটিভ ইমিউনোব্লট লিংকডিন-চিকিত্সা করা এবং চিকিত্সা না করা কোষগুলিতে CD36 (A), TRPV4 (B), TLR6 (C), এবং TLR4 (D) এর মোট প্রোটিনের অভিব্যক্তি দেখায়। পরীক্ষার প্রতিটি সেটের জন্য তিনটি স্বাধীন জৈবিক প্রতিলিপি এবং 3টি পরীক্ষামূলক পুনরাবৃত্তি করা হয়েছিল। (E–H) 5 µM Linkedin দিয়ে রাতারাতি চিকিত্সা করা ম্যাক্রোফেজগুলির প্রবাহ সাইটোমেট্রিক বিশ্লেষণ বা চিকিত্সা না করা হয়েছে TRPV4 (E), CD36 (F), TLR4 (G), এবং TLR6 (G) এর অপরিশোধিত এবং লিঙ্কডইন-চিকিত্সা করা কোষগুলিতে পৃষ্ঠের অভিব্যক্তি দেখানো হয়েছে। তিনটি স্বাধীন জৈবিক প্রতিলিপি এবং শর্ত প্রতি 30,{18}}টি কোষ বিশ্লেষণ করা হয়েছে। (I–L) (E–H) থেকে ফলাফলের পরিমাণগত বিশ্লেষণ। 99 শতাংশ আত্মবিশ্বাসের ব্যবধান সহ টু-টেইল্ড টি-টেস্ট দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছে। পরীক্ষা প্রতি গণনা করা কোষ, 30,000; দুটি পরীক্ষামূলক পুনরাবৃত্তি।

GGT প্রোথেরোজেনিক JNK2 সক্রিয়করণ এবং ম্যাক্রোফেজে প্রদাহকে ব্লক করে। আমাদের পরীক্ষাগার এবং অন্যদের থেকে প্রকাশিত রিপোর্টগুলি দেখিয়েছে যে JNK2 সক্রিয়করণ ফোম কোষ গঠন এবং এথেরোস্ক্লেরোসিস7,57-এ একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। GGT JNK1/2 এর সক্রিয়করণকে বাধা দিতে পারে কিনা তা নির্ধারণ করতে, ম্যাক্রোফেজগুলিকে GGT দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং LPS বা oxLDL দিয়ে উদ্দীপনা দ্বারা অনুসরণ করা হয়েছিল। ইমিউনোব্লট বিশ্লেষণের ফলাফলগুলি দেখায় যে GGT-এর সাথে চিকিত্সা উল্লেখযোগ্যভাবে oxLDL- বা LPS-প্ররোচিত ফসফোরিলেশনকে JNK1/2-এর চিকিত্সা না করা বা স্থানীয় LDL-চিকিত্সা নিয়ন্ত্রণের (চিত্র 7A-D) তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে দমন করে। এটি দেখানো হয়েছে যে ম্যাক্রোফেজে JNK অ্যাক্টিভেশন এথেরোস্ক্লেরোসিস 58-60 এর সাথে যুক্ত প্রোইনফ্ল্যামেটরি মধ্যস্থতাকারীদের প্রতিলিপিকে প্ররোচিত করে। GGT ম্যাক্রোফেজে এই প্রোইনফ্ল্যামেটরি নিয়ন্ত্রকগুলির অভিব্যক্তিকে সম্ভাব্যভাবে ব্লক করতে পারে কিনা তা নির্ধারণ করতে, GGT-প্রিট্রিটেড কোষগুলিকে oxLDL দিয়ে উদ্দীপিত করা হয়েছিল, এবং TNF, IL 6, IL12, IL1 এবং MCP1-এর mRNA এক্সপ্রেশন স্তরগুলি qRT-PCR বিশ্লেষণের দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল। আমরা গাড়ি-চিকিত্সা নিয়ন্ত্রণের তুলনায় GGT-চিকিত্সা করা কোষগুলিতে TNF, IL12, IL1, এবং MCP1 mRNA-এর oxLDL-প্ররোচিত এক্সপ্রেশন স্তরগুলিতে উল্লেখযোগ্য নিম্ন নিয়ন্ত্রণ শনাক্ত করেছি (চিত্র 7E–I)৷ একসাথে নেওয়া, এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে GGT ম্যাক্রোফেজে oxLDL উদ্দীপনার প্রতিক্রিয়া হিসাবে প্রোথেরোজেনিক JNK2 সক্রিয়করণ এবং প্রদাহজনক জিনের অভিব্যক্তিকে ব্লক করে। আলোচনা ফ্ল্যাভোনয়েড এবং পলিফেনলের মতো প্রাকৃতিক যৌগগুলি বিভিন্ন প্রক্রিয়ার মাধ্যমে কার্ডিওভাসকুলার প্রতিক্রিয়াগুলিকে সংশোধন করতে পরিচিত, যেমন প্রোইনফ্ল্যামেটরি সংকেতকে বাধা দেওয়া, ইনসুলিন সংবেদনশীলতা, অক্সিডেটিভ অবস্থা এবং রক্তের লিপিড প্রোফেলগুলি 40-45 উন্নত করা। এখানে, আমরা ম্যাক্রোফেজে TRPV{{32}নির্ভর প্রোথেরো জেনিক/প্রদাহজনক প্রক্রিয়াগুলির একটি অভিনব প্রতিষেধক হিসাবে লিঙ্কডিনের আধা-উচ্চ-থ্রুপুট স্ক্রীনিং-ভিত্তিক সনাক্তকরণ এবং কার্যকরী বৈশিষ্ট্যের প্রতিবেদন করি, একটি ফ্ল্যাভোন। আমরা বিশেষভাবে দেখিয়েছি যে i) জিঙ্কগেটিন TRPV4-মধ্যস্থিত Ca2 প্লাস ম্যাক্রোফেজে প্রবেশকে ব্লক করে, ii) জিঙ্কগেটিন ব্লকেড TRPV4 ফাংশন উল্লেখযোগ্যভাবে ম্যাক্রোফেজে অক্সএলডিএল গ্রহণকে দমন করে অক্সএলডিএল-প্ররোচিত ফোম কোষের গঠন হ্রাস করে, এবং আইজিটিন ব্লক করে JNK1/2 এর LPS- এবং oxLDL-প্ররোচিত ফসফোরিলেশন, TRPV4 প্রোটিনের অভিব্যক্তি, এবং প্রদাহজনক জিনের অভিব্যক্তি। সামগ্রিকভাবে, আমাদের গবেষণার ফলাফলগুলি দেখিয়েছে যে জিঙ্কগেটিন টিআরপিভি4-নির্ভর পদ্ধতিতে প্রোথেরোজেনিক/প্রদাহজনক ম্যাক্রোফেজ ফাংশনকে বাধা দেয়। এথেরোস্ক্লেরোসিস, একটি মহাধমনী রোগ, প্রাথমিকভাবে প্রদাহ এবং oxLDL-এর সাথে ম্যাক্রোফেজগুলির সংমিশ্রণ দ্বারা উদ্দীপিত হয়, যা ম্যাক্রোফেজ ফোম কোষগুলির গঠনকে প্ররোচিত করে, যা পরবর্তীকালে এথেরোমা 2-10 গঠনে অগ্রসর হয়। যেহেতু ফোম কোষ গঠন এথেরোজেনেসিসের একটি গুরুত্বপূর্ণ প্রক্রিয়া, তাই ফেনা কোষ গঠনকে বোঝা এবং ম্যানিপুলেট করার থেরাপিউটিক সম্ভাবনা থাকতে পারে। ম্যাক্রোফেজগুলি ঝিল্লি অনুপ্রবেশকারী আয়ন চ্যানেল এবং পাম্পগুলির একটি বিন্যাস প্রকাশ করতে পরিচিত, যার মধ্যে রয়েছে TRPV4, একটি যান্ত্রিক সংবেদনশীল পলিমোডাল Ca2 প্লাস ভেদযোগ্য আয়ন চ্যানেল, যা শারীরিক এবং জৈব রাসায়নিক উদ্দীপনা 11-24 উভয় দ্বারা সক্রিয় হয়। আমাদের পরীক্ষাগার এবং অন্যদের দ্বারা প্রকাশিত গবেষণাগুলি ম্যাক্রোফেজ প্রদাহ এবং oxLDL-প্ররোচিত ফোম কোষ গঠন14-16,26-এ TRPV4-এর ভূমিকা চিহ্নিত করেছে। TRPV4 এইভাবে প্রোথেরোজেনিক প্রক্রিয়াগুলির ক্ষয় করার জন্য একটি কার্যকর লক্ষ্য হিসাবে কাজ করতে পারে।

চিত্র 5. Linkedin ম্যাক্রোফেজগুলির সাথে DiI-oxLDL বাইন্ডিং দমন করে না। ম্যাক্রোফেজগুলিকে যানবাহন বা লিঙ্কডিন (1 বা 10 μM) দিয়ে 3 ঘন্টার জন্য প্রিট্রিট করা হয়েছিল এবং তারপরে 4 ডিগ্রিতে 1 ঘন্টার জন্য ডিআই-লেবেলযুক্ত oxLDL (2.5 µg/mL) দিয়ে ইনকিউবেশন করা হয়েছিল। (A) ম্যাক্রোফেজ মেমব্রেন পৃষ্ঠে (n=20 কোষ/অবস্থা) DiI-oxLDL বাইন্ডিংয়ের প্রতিনিধি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপিক চিত্র (মূল বিবর্ধন, 63×)। (বি) এনআইএইচ ইমেজজে সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে প্লট প্রোফাইল হিসাবে দেখানো পরীক্ষা A থেকে ফলাফল। (C) A. n=20 কোষ/পরিস্থিতি থেকে ফলাফলের পরিমাণগত বিশ্লেষণ। MMP-2 এবং MMP-9 হ্রাস করে এবং rat52-এর থোরাসিক অর্টাসে NO এবং NOS-এর মাত্রা বৃদ্ধি করে এথেরোস্ক্লেরোসিসের উন্নতিতে। বর্তমান সমীক্ষায়, আমরা দেখিয়েছি যে জিঙ্কগেটিন TRPV4-এক্সিটেড Ca2 প্লাস ম্যাক্রোফেজে প্রবেশকে ব্লক করে। যান্ত্রিকভাবে, আমরা দেখিয়েছি যে জিঙ্কগেটিন ম্যাক্রোফেজে oxLDL গ্রহণে বাধা দেয়, কিন্তু বাঁধাই করে না। ভিভো এবং ইন ভিট্রোতে করা অধ্যয়নগুলি অক্সএলডিএল এবং ম্যাক্রোফেজ ফোম কোষ গঠন 2-7 গ্রহণে প্রধান স্ক্যাভেঞ্জার রিসেপ্টর হিসাবে CD36-এর একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকার পরামর্শ দিয়েছে। এটি দেখানো হয়েছিল যে CD36 নাল ইঁদুর যাদের ApoE বা LDLR এর অভাব রয়েছে তাদের এথেরোস্ক্লেরোটিক ক্ষত 5,6 হওয়ার ঝুঁকি কম। আমাদের গ্রুপের পূর্ববর্তী গবেষণাগুলি ম্যাক্রোফেজ ফোম কোষ গঠনে CD36-জেএনকে সিগন্যালিং ক্যাসকেডের একটি অপরিহার্য ভূমিকা চিহ্নিত করেছে7৷ টোল-সদৃশ রিসেপ্টর TLR2, TLR4, এবং TLR6 CD36 এর সাথে মিথস্ক্রিয়া করে কোরসেপ্টর হিসাবে কাজ করে এবং এথেরোজেনেসিস 2,56,63 এর সাথে জড়িত দেখানো হয়েছে। আমরা সম্ভাব্যতা পরীক্ষা করেছি যে লিঙ্কডিন-চিকিত্সা করা ম্যাক্রোফেজে দেখা যাওয়া ফোম কোষ গঠনের অভাব CD36, TRPV4, TLR2, TLR4, বা TLR6 প্রোটিনের প্রকাশ হ্রাসের কারণে হয়েছিল। মজার বিষয় হল, লিঙ্কডিন চিকিত্সা বেসাল স্তরে বা অক্সএলডিএল উদ্দীপিত অবস্থার অধীনে CD36, TLR2, TLR4, বা TLR6 প্রোটিনের অভিব্যক্তি উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করেনি। যাইহোক, লিঙ্কডিন বিশেষভাবে TRPV4 প্রোটিনের অভিব্যক্তির oxLDL-প্ররোচিত আপগ্র্যুলেশনকে অবরুদ্ধ করেছে, যখন বেসাল স্তরে এর অভিব্যক্তি অপরিবর্তিত ছিল। সবকিছু একসাথে বিবেচনা করে, এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে জিঙ্কগেটিন CD36 এবং TLR এক্সপ্রেশন থেকে স্বাধীন, কিন্তু TRPV4 এর উপর নির্ভরশীল একটি প্রক্রিয়ার মাধ্যমে অক্সএলডিএল-প্ররোচিত ফোম কোষ গঠনে বাধা দেয়। আমাদের গ্রুপ এবং অন্যান্যদের পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে JNK2 অ্যাক্টিভেশন ফোম সেল গঠন এবং এথেরোস্ক্লেরোটিক ক্ষত বিকাশের সাথে জড়িত 7,57। এটিও রিপোর্ট করা হয়েছিল যে JNK MMP-9 এবং MMP-13-এর মডুলেশনের সাথে জড়িত, যেগুলি এথেরোস্ক্লেরোটিক ক্ষত 64–68-এ অতিমাত্রায় প্রকাশ পায়৷ এথেরোজেনিক প্রক্রিয়াগুলিতে JNK এর স্বীকৃত লিঙ্ক দেওয়া, আমরা নির্ধারণ করতে চেয়েছিলাম যে জিঙ্কগেটিন JNK এর সক্রিয়করণকে বাধা দিতে পারে কিনা। পূর্ববর্তী প্রতিবেদনগুলির সাথে সঙ্গতিপূর্ণ, আমাদের ফলাফলগুলিও দেখিয়েছে যে জিঙ্কগেটিন ম্যাক্রোফেজে JNK2 এর প্রদাহজনক উদ্দীপনা-প্ররোচিত ফসফোরিলেশন ব্লক করে। এই ফলাফলটি একটি সম্ভাব্য প্রক্রিয়ার পরামর্শ দেয় যার দ্বারা লিঙ্কডিন ফোম কোষ গঠনকে ব্লক করে। তদ্ব্যতীত, আমরা গাড়ি নিয়ন্ত্রণের তুলনায় জিঙ্কগেটিন-চিকিত্সা করা কোষগুলিতে TNF, IL12, IL1 এবং MCP1 mRNA-এর oxLDL-প্ররোচিত অভিব্যক্তিতে একটি উল্লেখযোগ্য ডাউনরেগুলেশন পেয়েছি, যা oxLDL-এর প্রতিক্রিয়ায় জিঙ্কগেটিনের সম্ভাব্য অ্যান্টি-ইনফ্ল্যামেটরি ভূমিকা হাইলাইট করে। সংক্ষেপে, আমাদের ফলাফলগুলি দেখিয়েছে যে জিঙ্কগেটিন প্রোথেরোজেনিক এবং প্রদাহজনক ম্যাক্রোফেজ ফাংশনকে টিআরপিভি4-নির্ভর পদ্ধতিতে বাধা দেয়। এই ফলাফলগুলি এইভাবে সম্ভাব্য থেরাপিউটিকস এবং/অথবা কেমোপ্রেভেন্টিভ রিএজেন্টগুলির বিকাশে প্রাকৃতিক যৌগগুলির ব্যবহারের যুক্তিকে শক্তিশালী করে।

তথ্যসূত্র
1. বারকেরা, এস. এট আল। এথেরোস্ক্লেরোটিক কার্ডিওভাসকুলার রোগের মহামারীবিদ্যার গ্লোবাল ওভারভিউ। খিলান। মেড. Res. 46, 328–338 (2015)।
2. মুর, কেজে এবং তাবাস, আই. এথেরোস্ক্লেরোসিসে ম্যাক্রোফেজের সেলুলার বায়োলজি। সেল 145, 341–355 (2011)।
3. লিবি, পি. এথেরোস্ক্লেরোসিসে প্রদাহ। প্রকৃতি 407, 233-241 (2002)।
4. ম্যাকলারেন, জেই, মিচে, ডিআর, অ্যাশলিন, টিজি এবং রামজি, ডিপি সাইটোকাইনস, ম্যাক্রোফেজ লিপিড বিপাক এবং ফোম কোষ: কার্ডিওভাসকুলার রোগের থেরাপির প্রভাব। অনুষ্ঠান লিপিড রেস 50, 331–347 (2011)।
5. ফেব্রেইও, এম. এট আল। ক্লাস B স্ক্যাভেঞ্জার রিসেপ্টর CD36 এর লক্ষ্যযুক্ত ব্যাঘাত ইঁদুরের এথেরোস্ক্লেরোটিক ক্ষত বিকাশের বিরুদ্ধে রক্ষা করে। জে ক্লিন। বিনিয়োগ করুন। 105, 1049-1056 (2000)।
6. কুঞ্জথুর, ভিভি এবং অন্যান্য। স্ক্যাভেঞ্জার রিসেপ্টর ক্লাস AI/II এবং CD36 হল প্রধান রিসেপ্টর যা পরিবর্তিত নিম্ন-ঘনত্বের লাইপোপ্রোটিন গ্রহণের জন্য দায়ী যা ম্যাক্রোফেজে লিপিড লোডিংয়ের দিকে পরিচালিত করে। জে. বিওল। কেম। 277, 49982–49988 (2002)।
7. রহমান, এসও এবং অন্যান্য। ম্যাক্রোফেজ ফোম কোষ গঠনের জন্য একটি সিডি36-নির্ভর সিগন্যালিং ক্যাসকেড প্রয়োজন। সেল মেটাব। 4, 211-221 (2006)।
8. রস, আর. এথেরোস্ক্লেরোসিস-একটি প্রদাহজনিত রোগ। এন ইংলিশ জে মেড। 340(2), 115-126 (1999)।
9. লিবি পি. এথেরোস্ক্লেরোসিসের থ্রম্বোটিক জটিলতার আণবিক প্রক্রিয়া। জে. ইন্টার্ন। মেড. 517-527, 2008।
10. লুসিস, এজে অ্যাথেরোস্ক্লেরোসিস। প্রকৃতি 407, 233-241 (2000)।
11. ম্যাথিউস, বিডি এবং অন্যান্য। TRPV4 আয়ন চ্যানেলগুলির অতি দ্রুত সক্রিয়করণ যান্ত্রিক শক্তি দ্বারা কোষের পৃষ্ঠের বিটা 1 ইন্টিগ্রিনগুলিতে প্রয়োগ করা হয়। পূর্ণসংখ্যা। বায়োল (ক্যাম্ব)। 2(9), 435–442 (2010)।
12. শর্মা, এস., গোস্বামী, আর. ও রহমান, SO Te TRPV4-টিএজেড মেকানোট্রান্সডাকশন সিগন্যালিং অক্ষ ম্যাট্রিক্স স্টিফনেস- এবং TGF 1-প্ররোচিত এপিথেলিয়াল-মেসেনকাইমাল ট্রানজিশন। সেল মোল। Bioeng.12, 139–152 (2019)।
13. গোস্বামী, আর., আর্য, আরকে, বিশ্বাস, ডি., ঝু, এক্স. এবং রহমান, এসও ট্রানজিয়েন্ট রিসেপ্টর পটেনশিয়াল ভ্যানিলয়েড 4 বিদেশী শরীরের প্রতিক্রিয়া এবং দৈত্য কোষ গঠনের জন্য প্রয়োজন। আমি জে পাথল। 189(8), 1505–1512 (2019)।
14. গোস্বামী, আর. এবং অন্যান্য। TRPV4 ক্যালসিয়াম-ভেদ্য চ্যানেল হল অক্সিডাইজড এলডিএল-প্ররোচিত ম্যাক্রোফেজ ফোম কোষ গঠনের একটি অভিনব নিয়ামক। ফ্রি রেডিক। বায়োল মেড. 110, 142–150 (2017)।