FOXO অ্যান্টিমাইক্রোবিয়াল পেপটাইডের প্রকাশ নিয়ন্ত্রণ করে এবং চিংড়ির অ্যান্টিব্যাকটেরিয়াল অনাক্রম্যতায় হেমোসাইটের ফ্যাগোসাইটোসিস প্রচার করে

বিমূর্ত

অমেরুদণ্ডী প্রাণীরা প্যাথোজেনিক সংক্রমণ প্রতিরোধ করার জন্য সহজাত অনাক্রম্যতা, হিউমারাল এবং সেলুলার অনাক্রম্যতা সহ নির্ভর করে। পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে ফর্কহেড বক্স ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর O (FOXO) স্তন্যপায়ী প্রাণীদের মিউকোসাল ইমিউন প্রতিক্রিয়া এবং অমেরুদণ্ডী প্রাণীদের অন্ত্রের হিউমারাল ইমিউন নিয়ন্ত্রণে অংশগ্রহণ করে। যাইহোক, FOXO অমেরুদণ্ডী প্রাণীদের মধ্যে সিস্টেমিক এবং সেলুলার অনাক্রম্যতা নিয়ন্ত্রণে জড়িত কিনা তা অজানা থেকে যায়। বর্তমান সমীক্ষায়, আমরা চিংড়ি থেকে একটি FOXO শনাক্ত করেছি (মারসুপেনিয়াস জাপোনিকাস) এবং দেখেছি যে এটি সাধারণ চিংড়িতে তুলনামূলকভাবে বেসাল স্তরে প্রকাশ করা হয়েছিল, তবে ভিব্রিও অ্যাঙ্গুইলারাম দ্বারা চ্যালেঞ্জ করা চিংড়িতে উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নীত করা হয়েছিল। চিংড়িতে অ্যান্টিমাইক্রোবিয়াল পেপটাইডস (এএমপি) প্রকাশের জন্য ইমিউন ডেফিসিয়েন্সি (আইএমডি) পথের ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর রেলিশের অভিব্যক্তিকে প্রচার করে FOXO হিমোলিম্ফ এবং অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটা হোমিওস্ট্যাসিস বজায় রাখতে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করেছে। আমরা আরও দেখতে পেয়েছি যে প্যাথোজেন সংক্রমণ FOXO কে সক্রিয় করেছে এবং সেরিন/থ্রোনাইন কিনেস AKT কার্যকলাপ হ্রাস করে এর পারমাণবিক ট্রান্সলোকেশনকে প্ররোচিত করেছে। নিউক্লিয়াসে, সক্রিয় FOXO ব্যাকটেরিয়া সংক্রমণের বিরুদ্ধে তার লক্ষ্য Amp এবং Relish জিনের অভিব্যক্তিকে সরাসরি নিয়ন্ত্রণ করে। অধিকন্তু, FOXO কে ফ্যাগোসাইটোটিক রিসেপ্টর স্ক্যাভেঞ্জার রিসেপ্টর C (Src) এবং দুটি ছোট GTPases, Rab5 এবং Rab7 এর অভিব্যক্তিকে আপ-রেগুলেট করার মাধ্যমে হিমোসাইটের ফ্যাগোসাইটোসিসকে উন্নীত করে সেলুলার ইমিউনিটির সাথে জড়িত হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছিল, যা ফ্যাগোসোম পাচারের সাথে সম্পর্কিত। সাইটোপ্লাজমে। একসাথে নেওয়া, আমাদের ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে FOXO স্বাভাবিক চিংড়িতে IMD পাথওয়ে সক্রিয় করে এবং ব্যাকটেরিয়া-সংক্রমিত চিংড়িতে প্যাথোজেনগুলির বিরুদ্ধে হেমোসাইটের ফ্যাগোসাইটোসিসকে প্রত্যক্ষ বা পরোক্ষভাবে প্রচার করে এবং হেমোলিম্ফের হোমিওস্ট্যাসিস এবং এন্টারিক মাইক্রোবায়োটার উপর তার প্রভাব প্রয়োগ করে। এই গবেষণায় অমেরুদণ্ডী প্রাণীদের মিউকোসাল (স্থানীয়) এবং সিস্টেমিক অ্যান্টিব্যাকটেরিয়াল অনাক্রম্যতাতে FOXO-এর বিভিন্ন কাজ প্রকাশ করা হয়েছে।

cistanche সম্পূরক উপকারিতা-কীভাবে ইমিউন সিস্টেমকে শক্তিশালী করা যায়

Cistanche Enhance Immunity পণ্য দেখতে এখানে ক্লিক করুন

【আরো জন্য জিজ্ঞাসা করুন】 ইমেল:cindy.xue@wecistanche.com / Whats অ্যাপ: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

ভূমিকা

ফর্কহেড বক্স ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর O ফ্যামিলি প্রোটিন (FOXOs) জীবের বিভিন্ন জটিল জৈবিক প্রক্রিয়ার সাথে জড়িত, যার মধ্যে রয়েছে কোষ চক্র নিয়ন্ত্রণ, ক্ষতিগ্রস্ত ডিএনএ মেরামত, ক্যান্সার প্রতিরোধ ক্ষমতা, এবং জীবনকাল নিয়ন্ত্রণ [1,2]। স্তন্যপায়ী প্রাণীদের চারটি ভিন্ন FOXO প্রোটিন থাকে (FOXO1, FOXO3, FOXO4, এবং FOXO6); যাইহোক, অমেরুদণ্ডী প্রাণীদের শুধুমাত্র একটি FOXO আছে, যা ক্যানোরহাবডিটিস এলিগানস [3]-এ Daf-16 নামেও পরিচিত। FOXO-এর ট্রান্সক্রিপশনাল অ্যাক্টিভিটি বিভিন্ন ধরনের পোস্ট-ট্রান্সলেশনাল পরিবর্তন দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়, যেমন ফসফোরিলেশন, অ্যাসিটিলেশন, মেথিলেশন এবং সর্বব্যাপীকরণ [৪]। এই পরিবর্তনগুলি FOXO পারমাণবিক ট্রান্সলোকেশন বা নিউক্লিয়াস থেকে প্রস্থানকে প্রভাবিত করে এবং সহ-দমনকারী এবং সহ-অ্যাক্টিভেটরদের সাথে এর মিথস্ক্রিয়া, যা FOXO কার্যকলাপকে প্রচার বা হ্রাস করতে পারে এবং এর বিভিন্ন জৈবিক ফাংশন [5,6] মধ্যস্থতা করতে পারে। সক্রিয়করণের পরে, FOXO বিভিন্ন টার্গেট জিনের ট্রান্সক্রিপশন নিয়ন্ত্রণ করে অনেক শারীরবৃত্তীয় ফাংশনে অংশগ্রহণ করে [7]। FOXOগুলি বৃদ্ধির কারণ, সাইটোকাইনস এবং হরমোন সহ বিভিন্ন বহিঃকোষীয় উদ্দীপনা দ্বারা সক্রিয় হয় [৮]। বৃদ্ধির সংকেত, যেমন ইনসুলিন বা ইনসুলিন-সদৃশ গ্রোথ ফ্যাক্টর 1 (IGF-1), ইনসুলিন পাথওয়ের রিসেপ্টরগুলির সাথে ইন্টারঅ্যাক্ট করে এবং ফসফ্যাটিডাইলিনোসিটল 3-কিনেস (PI3K) সংকেত সক্রিয় করে, যার ফলে FOXO-এর ফসফোরিলেশন হয় সেরিন/থ্রোনাইন কিনেস, প্রোটিন কিনেস বি (AKT) [৯]। ফসফরিলেটেড FOXO নিউক্লিয়াস থেকে সাইটোসোলে স্থানান্তরিত করে, বা সাইটোসল থেকে নিউক্লিয়াসে এর স্থানান্তরকে বাধা দেয়, যেখানে এটি সর্বব্যাপী হয়ে যায়, যার ফলে প্রোটিসোম দ্বারা এর অবক্ষয় ঘটে [10]। বিপরীতে, বাহ্যিক বৃদ্ধি সংকেতের অনুপস্থিতিতে, PI3K-AKT সিগন্যালিং পথ নিষ্ক্রিয়, এবং লক্ষ্য জিন ট্রান্সক্রিপশন প্রচারের জন্য আনফসফোরাইলেড FOXO নিউক্লিয়াসে স্থানান্তরিত করে [১১]। FOXO এছাড়াও অমেরুদণ্ডী প্রাণীদের অ্যান্টি-ব্যাকটেরিয়াল এবং অ্যান্টি-ভাইরাস সহজাত ইমিউন প্রতিক্রিয়াগুলিতে অংশগ্রহণ করে [12,13]। ড্রোসোফিলার বার্ধক্যজনিত অন্ত্রে FOXO-এর ক্রনিক অ্যাক্টিভেশন পেপ্টিডোগ্লাইকান রিকগনিশন প্রোটিন SC2 (ইমিউন ডেফিসিয়েন্সি (IMD) পথের একটি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রক) এর অভিব্যক্তিকে দমন করে এবং অন্ত্রের ইমিউন হোমিওস্টেসিস [14] ভেঙে দেয়। FOXO ক্ষুধার্ত চাপের প্রতিক্রিয়ায় অ-সংক্রমিত ড্রোসোফিলার এপিথেলিয়াল টিস্যুতে অ্যান্টিমাইক্রোবিয়াল পেপটাইড (এএমপি) জিনগুলিকে সরাসরি নিয়ন্ত্রণ করে, যা প্যাথোজেন-প্রতিক্রিয়াশীল সহজাত অনাক্রম্যতা পথ থেকে স্বাধীন [১৫]। যাইহোক, প্যাথোজেন সংক্রমণ এন্টারোসাইট FOXO কে সরাসরি সাইটোপ্লাজম থেকে ড্রোসোফিলা অন্ত্রে নিউক্লিয়াসে প্রবেশ করতে প্ররোচিত করতে পারে [12]। এএমপিগুলির FOXO-নির্ভর নিয়ন্ত্রণ স্তন্যপায়ী এপিথেলিয়াল টিস্যুতেও ঘটে, এটি পরামর্শ দেয় যে এটি বিবর্তনীয়ভাবে প্রাণীদের মধ্যে সংরক্ষিত হয় [16]। বেশ কিছু গবেষণায় দেখা গেছে যে FOXO গুলি প্যাথোজেন বা সাইটোকাইন উদ্দীপনা দ্বারা মিউকোসাল ইমিউন প্রতিক্রিয়াতে সক্রিয় হয় [17]। নিউক্লিয়াসে তাদের স্থানান্তর এবং তাদের টার্গেট জিনের প্রবর্তকদের সাথে আবদ্ধ হওয়া মাইটোজেন-অ্যাক্টিভেটেড প্রোটিন (MAP) কাইনেস পাথওয়ে দ্বারা উদ্দীপিত হয় এবং PI3K/AKT পাথওয়ে দ্বারা বাধাপ্রাপ্ত হয়। FOXO-এর টার্গেট জিনের মধ্যে রয়েছে প্রো-ইনফ্ল্যামেটরি সিগন্যালিং অণু, আঠালো অণু এবং কেমোকাইন রিসেপ্টর [17]। FOXO গুলি প্যাথোজেনের বিরুদ্ধে সিস্টেমিক ইমিউন প্রতিক্রিয়ার সাথে জড়িত কিনা তা স্পষ্ট নয়। প্যাথোজেনের বিরুদ্ধে এএমপিগুলির অভিব্যক্তি প্রচার করা অমেরুদণ্ডী প্রাণীদের মধ্যে হাস্যকর সহজাত অনাক্রম্যতার একটি গুরুত্বপূর্ণ প্রক্রিয়া [18]। ড্রোসোফিলা সহজাত অনাক্রম্যতায়, টোল এবং আইএমডি পথগুলি এএমপি এক্সপ্রেশন নিয়ন্ত্রণের সাথে জড়িত এবং এএমপিগুলি আক্রমণকারী রোগজীবাণু নির্মূলে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে [19-21]। পোকামাকড়ের অনাক্রম্যতার অনুরূপ, টোল, আইএমডি, এবং জানুস কিনেস (জেএকে)/সংকেত ট্রান্সডুসার এবং ট্রান্সক্রিপশনের অ্যাক্টিভেটর (স্ট্যাট) পথগুলি ক্রাস্টেসিয়ানগুলিতে এএমপি এক্সপ্রেশন নিয়ন্ত্রণের সাথে জড়িত [22,23]। FOXO টোল, আইএমডি, এবং জেএকে/স্ট্যাট পথগুলি থেকে স্বাধীন এএমপিগুলির অভিব্যক্তি নিয়ন্ত্রণ করতে পারে কিনা তা ক্রাস্টেসিয়ানগুলিতে প্যাথোজেন সংক্রমণের বিরুদ্ধে স্পষ্টীকরণের প্রয়োজন। হিউমারাল অনাক্রম্যতা ছাড়াও, অমেরুদণ্ডী প্রাণীরা রোগজীবাণু সংক্রমণের বিরুদ্ধে সহজাত অনাক্রম্যতা কার্য সম্পাদনের জন্য সেলুলার অনাক্রম্যতার উপরও নির্ভর করে। হেমোসাইট দ্বারা ফাগোসাইটোসিস হল প্যাথোজেন সংক্রমণের বিরুদ্ধে সেলুলার অনাক্রম্যতার একটি গুরুত্বপূর্ণ প্রক্রিয়া [24]। পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে প্রাকৃতিক হত্যাকারী (NK) কোষের বিকাশের জন্য FOXO1-মধ্যস্থ অটোফ্যাজি প্রয়োজন [25]। তদুপরি, FOXO নিউট্রোফিলস দ্বারা ব্যাকটেরিয়া ফ্যাগোসাইটোসিস প্রচারে জড়িত [26]। যদিও এনকে কোষ বা নিউট্রোফিলের মতো ক্রাস্টেসিয়ানগুলিতে কোনও বিশেষ ইমিউন কোষ নেই, চিংড়ির হিমোসাইট ফ্যাগোসাইটোসিসের মাধ্যমে প্যাথোজেনিক ব্যাকটেরিয়া সংক্রমণের বিরুদ্ধে পদ্ধতিগত সহজাত অনাক্রম্যতা প্রয়োগ করতে পারে [২৭]। যাইহোক, FOXO চিংড়িতে হেমোসাইটের প্যাথোজেন ফ্যাগোসাইটোসিসে অংশগ্রহণ করে কিনা তা স্পষ্ট নয়। চিংড়ি জলজ পালন পশু প্রোটিন উত্পাদনের জন্য বিশ্বের দ্রুততম বর্ধনশীল শিল্পগুলির মধ্যে একটি এবং প্রাণী প্রোটিনের বিশ্বব্যাপী বর্ধিত চাহিদা মেটাতে একটি গুরুত্বপূর্ণ অবদান রেখেছে৷ বর্তমানে, চিংড়ির বিশ্বব্যাপী উৎপাদন প্রায় 4.88 মিলিয়ন টন যার মূল্য প্রায় 39 বিলিয়ন মার্কিন ডলার [২৮]। যাইহোক, একসাথে প্রচুর সংখ্যক প্রাণী পালনের ফলে যথেষ্ট প্রাণীর চাপ সৃষ্টি হয়, যা ব্যাকটেরিয়া এবং ভাইরাস সহ রোগজীবাণু, গুণ এবং ক্লিনিকাল রোগকে সহায়তা করে, যার ফলে শিল্পের বড় অর্থনৈতিক ক্ষতি হয় [২৯]। চিংড়ি ইমিউন মেকানিজমের অধ্যয়ন রোগ প্রতিরোধ এবং নিয়ন্ত্রণের জন্য নতুন কৌশল প্রদান করতে পারে [30]। বর্তমান গবেষণায়, আমরা কুরুমা চিংড়িতে একটি FOXO সনাক্ত করেছি (মারসুপেনিয়াস জাপোনিকাস)। নকডাউন ফক্সো এক্সপ্রেশনের পরে, ভিব্রিও অ্যাঙ্গুইলারাম চ্যালেঞ্জ অনুসরণ করে, আমরা দেখতে পেলাম যে ব্যাকটেরিয়া ক্লিয়ারেন্স ক্ষমতা এবং চিংড়ি বেঁচে থাকার হার উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে। আরও গবেষণায় ইঙ্গিত দেওয়া হয়েছে যে FOXO প্রত্যক্ষ বা পরোক্ষভাবে AMP-এর অভিব্যক্তি প্রচার করেছে এবং চিংড়িতে ব্যাকটেরিয়ার ফ্যাগোসাইটোসিসকে উন্নত করেছে। চিংড়িতে প্যাথোজেন সংক্রমণের বিরুদ্ধে FOXO-এর প্রভাবের সম্ভাব্য প্রক্রিয়া বিশ্লেষণ করা হয়েছে।

cistanche tubulosa- ইমিউন সিস্টেম উন্নত

ফলাফল

FOXO কে চ্যালেঞ্জবিহীন চিংড়িতে বেসাল স্তরে প্রকাশ করা হয় এবং V. অ্যাঙ্গুইলারামের সাথে চ্যালেঞ্জ করা চিংড়িতে আপ রেগুলেট করা হয়

এম. জাপোনিকাসের হেমোসাইট ট্রান্সক্রিপ্টোম সিকোয়েন্সিং থেকে, আমরা ফক্সোর পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের সিডিএনএ সিকোয়েন্স পেয়েছি (জেনব্যাঙ্ক অ্যাক্সিশন নম্বর: MW080526)। ডোমেনের তুলনা দেখায় যে ভবিষ্যদ্বাণীকৃত FOXO প্রোটিনের একটি ফোরকহেড (FH) ডোমেন রয়েছে, যা FOXO1, FOXO3, FOXO4 এবং FOXO6 সহ হোমোসেপিয়েন্স FOXO-এর মতো এবং একই রকম AKT ফসফোরিলেশন (S1A Fig) বহন করে। ফাইলোজেনেটিক বিশ্লেষণের ফলাফলগুলি দেখায় যে FOXOগুলি মেরুদণ্ডী এবং অমেরুদণ্ডী FOXO সহ দুটি ক্লাস্টারে বিভক্ত ছিল এবং চিংড়ি FOXO ফাইলোজেনেটিক গাছের (S1B চিত্র) অমেরুদণ্ডী শাখায় ক্লাস্টার করা হয়েছিল। মানুষের FOXOs [31] এর মতই, চিংড়ি FOXO-এর এক্সট্রা সেলুলার রেগুলেটেড কিনেস (ERK) ফসফোরিলেশন পরিবর্তন সাইট এবং CREB বাইন্ডিং প্রোটিন (CBP) অ্যাসিটিলেশন পরিবর্তন সাইট আছে, কিন্তু কোনো sir tuin 1 (SIRT1) deacetylation modification sites এবং c-jminal n-jminal সাইট নেই। kinase (JNK) ফসফোরিলেশন পরিবর্তন সাইট (S2 Fig)। পলিক্লোনাল অ্যান্টিবডি চিংড়ি FOXO কে চিনতে FOXO-এর রিকম্বিন্যান্ট FH ডোমেন ব্যবহার করে প্রস্তুত করা হয়েছিল যা Escherichia coli (চিত্র 1A) এ প্রকাশ করা হয়েছে। এমআরএনএ এবং প্রোটিন স্তরে FOXO-এর টিস্যু বিতরণের বিশ্লেষণ থেকে জানা গেছে যে এটি সমস্ত পরীক্ষিত টিস্যুতে প্রকাশ করা হয়েছিল (চিত্র 1B)। ভি. অ্যাঙ্গুইলারাম দ্বারা চ্যালেঞ্জ করা চিংড়ির হিমোসাইট এবং অন্ত্রে FOXO প্রকাশের সময়কাল qPCR এবং ওয়েস্টার্ন ব্লটিং ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি দেখায় যে FOXO হিমোসাইট এবং অন্ত্রে mRNA স্তরে (চিত্র 1C এবং 1D) এবং প্রোটিন স্তরে (চিত্র 1E এবং 1F) আপ-নিয়ন্ত্রিত হয়েছিল। এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে FOXO V. anguillarum সংক্রমণের প্রতিক্রিয়ার সাথে জড়িত এবং চিংড়ির রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতাতে FOXO-এর কার্যকারিতা অন্বেষণ করতে আমাদের প্ররোচিত করেছে।

FOXO সুস্থ চিংড়িতে হেমোলিম্ফ এবং অন্ত্রের মাইক্রোফ্লোরার হোমিওস্ট্যাসিস নিয়ন্ত্রণে অংশগ্রহণ করে

চিংড়িতে হেমোলিম্ফ এবং অন্ত্রের মাইক্রোফ্লোরা হোমিওস্ট্যাসিসে FOXO-এর কার্যকারিতা অন্বেষণ করতে, RNA হস্তক্ষেপ করা হয়েছিল এবং ব্যাকটেরিয়া লোড বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি দেখায় যে ফক্সো-আরএনএআই চিংড়িতে (চিত্র 2A এবং 2B) ফক্সোর অভিব্যক্তি উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে। ফক্সো আরএনএআই-এর অফ-টার্গেট প্রভাবগুলিও অন্যান্য ফক্স পরিবারের জিনের অভিব্যক্তি (ফক্সক 2 এবং ফক্সন 3 সহ) সনাক্ত করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি দেখায় যে Foxo-এর নকডাউন Foxk2 বা Foxn3 (S3A–S3C Fig) এর অভিব্যক্তি মাত্রা হ্রাস করেনি। ওয়েস্টার্ন ব্লটিং এবং ফ্লুরোসেন্ট ইমিউনোসাইটোকেমিস্ট্রি অ্যাসেস ব্যবহার করে, আমরা ফক্সোর নীরবতার পরে ব্যাকটেরিয়া দ্বারা চ্যালেঞ্জ করা চিংড়ির অন্ত্র এবং হিমোসাইটগুলিতে FOXO-এর উপকোষীয় বিতরণ পর্যবেক্ষণ করেছি। ফলাফলগুলি দেখায় যে dsGfp গ্রুপের সাথে তুলনা করে, Foxo-RNAi চিংড়িতে নিউক্লিয়াসে FOXO স্তর উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে, এমনকি যদি চিংড়ি V. anguillarum (S3D–S4E' Figs) দ্বারা সংক্রমিত হয়। উপরের সমস্ত ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে আমাদের ফক্সো আরএনএআই অ্যাস বিশেষভাবে হেমোসাইট এবং অন্ত্রে (সাইটোপ্লাজম এবং নিউক্লিয়াস সহ) ফক্সোকে নীরব করতে পারে। এর পরে, আমরা স্বাভাবিক অবস্থায় (ব্যাকটেরিয়াল চ্যালেঞ্জ ছাড়া) চিংড়িতে ফক্সোকে নকডাউন করার পরে হেমোলিম্ফ এবং অন্ত্রে ব্যাকটেরিয়া লোড বিশ্লেষণ করেছি। ফলাফলগুলি দেখায় যে Foxo এক্সপ্রেশন সফলভাবে ছিটকে যাওয়ার পরে হিমোলিম্ফ এবং অন্ত্রে ব্যাকটেরিয়ার সংখ্যা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 2C এবং 2D)। আমরা ব্যাকটেরিয়া চ্যালেঞ্জ ছাড়াই Foxo-RNAi চিংড়ির বেঁচে থাকার হার আরও বিশ্লেষণ করেছি এবং ফলাফলগুলি দেখায় যে Foxo-নকডাউন চিংড়ির বেঁচে থাকার হার নিয়ন্ত্রণের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে (চিত্র 2E)। এই ফলাফলগুলি আরও যাচাই করার জন্য, আমরা অ্যান্টিবায়োটিকের সাথে চিকিত্সা করা Foxo-RNAi চিংড়ির বেঁচে থাকার হার বিশ্লেষণ করেছি এবং ফলাফলগুলি দেখিয়েছে যে dsGfp গ্রুপের তুলনায়, জীবাণুমুক্ত চিংড়ির বেঁচে থাকার হার উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পায়নি (চিত্র 2F)। সমস্ত ফলাফলে পরামর্শ দেওয়া হয়েছে যে FOXO স্বাভাবিক অবস্থায় চিংড়িতে ইন ভিভো মাইক্রোবায়োটা (হেমোলিম্ফ এবং এন্টারিক মাইক্রোবায়োটা সহ) হোমিওস্টেসিসে ভূমিকা পালন করে।

cistanche সম্পূরক উপকারিতা-অনাক্রম্যতা বৃদ্ধি

FOXO সুস্থ চিংড়িতে Relish এবং Amp অভিব্যক্তি প্রচার করে হেমোলিম্ফ এবং অন্ত্রের মাইক্রোফ্লোরা হোমিওস্টেসিস নিয়ন্ত্রণে অংশগ্রহণ করে

পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে সুস্থ চিংড়িতে কম কিন্তু স্থিতিশীল সংখ্যক ব্যাকটেরিয়া থাকে যা সঞ্চালনকারী হেমোলিম্ফে এবং উচ্চ পরিমাণে ব্যাকটেরিয়া থাকে যদিও গ্যাস্ট্রোইনটেস্টাইনাল ট্র্যাক্টে ধ্রুবক পরিমাণে ব্যাকটেরিয়া থাকে এবং ইমিউন ইফেক্টর যেমন অ্যান্টিমাইক্রোবিয়াল পেপটাইডস (AMPs) পারমাণবিক ফ্যাক্টর কাপা বি (NF) দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়। -κB) পথ এবং প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতি (ROS) দ্বৈত অক্সিডেস (DUOX) পথ দ্বারা নিয়ন্ত্রিত, হোমিওস্ট্যাসিস হেমোলিম্ফ এবং অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটা [32-34] এ একটি অপরিহার্য ভূমিকা পালন করে। স্বাভাবিক অবস্থায় হেমোলিম্ফ এবং অন্ত্রের মাইক্রোফ্লোরা হোমিওস্টেসিসের নিয়ন্ত্রণে FOXO-এর জড়িত থাকার প্রক্রিয়াটি অন্বেষণ করতে, আমরা প্রথমে স্বাভাবিক অবস্থায় হেমোসাইট এবং অন্ত্রে FOXO-এর উপকোষীয় বিতরণ সনাক্ত করেছি। ফলাফলগুলি স্বাভাবিক অবস্থায় চিংড়ির হিমোসাইট এবং অন্ত্রের কোষের নিউক্লিয়াসে FOXO-এর একটি দুর্বল সংকেত দেখায় (চিত্র 3A এবং 3B), পরামর্শ দেয় যে স্বাভাবিক অবস্থায় চিংড়িতে ইন ভিভো মাইক্রোবায়োটা দ্বারা সামান্য FOXO সক্রিয় করা হয়েছিল। এএমপি এক্সপ্রেশনটি ড্রোসোফিলার অন্ত্রের আইএমডি পথ দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয় [35]। অতএব, আমরা ধরে নিয়েছি যে ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর রিলিশ FOXO-এর একটি টার্গেট জিন হতে পারে। আমরা Foxo-এর নকডাউনের পরে চিংড়ির হিমোসাইট এবং অন্ত্রে, IMD পাথওয়ের ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর, Relish-এর mRNA এক্সপ্রেশন সনাক্ত করেছি। ফলাফলগুলি দেখায় যে Foxo-নকডাউন চিংড়িতে (Fig 3C এবং 3D) রেলিশের অভিব্যক্তি উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে এবং প্রোটিন স্তরে (চিত্র 3E এবং 3E') অনুরূপ ফলাফল পাওয়া গেছে। ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে FOXO Relish এর অভিব্যক্তি প্রচার করতে পারে এবং IMD পাথওয়েকে সক্রিয় করতে পারে। আইএমডি সিগন্যালিংয়ের মাধ্যমে FOXO হিমো লিম্ফ এবং গ্যাস্ট্রোইনটেস্টাইনাল ট্র্যাক্ট হোমিওস্ট্যাসিসে অংশগ্রহণ করে তা নিশ্চিত করতে, জীবাণু-মুক্ত চিংড়ি প্রাপ্ত করা হয়েছিল (চিত্র 3F) এবং RELISH অ্যাক্টিভেশন এবং AMP এক্সপ্রেশন সনাক্ত করা হয়েছিল। নিয়ন্ত্রণের সাথে তুলনা করে, অন্ত্রের কোষ এবং হিমোসাইটের নিউক্লিয়াসে FOXO এবং RELISH-এর পরিমাণ উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে (চিত্র 3G এবং 3H)। ইতিমধ্যে, ক্রাস্টিনস (CrusI-2 থেকে 5) এবং অ্যান্টি-লাইপোপলিস্যাকারাইড ফ্যাক্টর (Alf A1, B1, C1, D1 এবং E1) সহ এএমপিগুলির অভিব্যক্তি, সম্ভবত FOXO এবং/অথবা RELISH দ্বারা নিয়ন্ত্রিত জীবাণুতে স্ক্রীন করা হয়েছিল -মুক্ত চিংড়ি, এবং ফলাফলগুলি দেখিয়েছে যে CrusI-3, Alf-B1 এবং Alf-C1-এর অভিব্যক্তি চিংড়ির হিমোসাইট এবং অন্ত্রে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে (চিত্র 3I এবং 3J)। প্রদত্ত যে Alf-B1 এবং Alf C1-এর অভিব্যক্তি IMD পাথওয়ে দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়েছিল [36], এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে FOXO হিমোলিম্ফ এবং গ্যাস্ট্রোইনটেস্টাইনাল ট্র্যাক্টের হোমিওস্ট্যাসিস নিয়ন্ত্রণে অংশ নেয় সাধারণ অবস্থায় IMD পাথওয়ের মাধ্যমে অভিব্যক্তি প্রচার করে। এএমপি

চিত্র 1. ভি. অ্যাঙ্গুইলারাম দ্বারা চ্যালেঞ্জ করা চিংড়িতে FOXO কে উন্নীত করা হয়েছিল। (A) খরগোশের মধ্যে প্রস্তুত FOXO-এর বিরুদ্ধে পলিক্লোনাল অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে FOXO সনাক্ত করতে ই. কোলি এবং ওয়েস্টার্ন ব্লটিং-এ FOXO-এর FH ডোমেনের রিকম্বিন্যান্ট এক্সপ্রেশন। লেন 1, Foxo-pGEX4T-1 সহ E. coli এর মোট প্রোটিন। লেন 2, IPTG আনয়নের পর ব্যাকটেরিয়ার মোট প্রোটিন। লেন 3, পরিশোধিত রিকম্বিন্যান্ট ফক্সো। লেন 4, FOXO ওয়েস্টার্ন ব্লটিং ব্যবহার করে অপরিশোধিত চিংড়ির অন্ত্রে সনাক্ত করা হয়েছিল। এম, প্রোটিন আণবিক ভর চিহ্নিতকারী। (বি) এমআরএনএ (উপরের প্যানেল) এবং প্রোটিন (নিম্ন প্যানেল) স্তরে ফক্সোর টিস্যু বিতরণ যথাক্রমে আরটি-পিসিআর এবং ওয়েস্টার্ন ব্লটিং দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল। ACTB হল -actin এর সংক্ষিপ্ত রূপ। (C, D) হেমোসাইট (C) এবং অন্ত্রের (D) মধ্যে Foxo-এর mRNA এক্সপ্রেশন প্যাটার্নগুলি qPCR দ্বারা -অ্যাক্টিন এবং Ef-1-এর জ্যামিতিক গড় অভিব্যক্তি অন্তঃসত্ত্বা নিয়ন্ত্রণ জিন হিসাবে ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। (E, F) হেমোসাইট (E) এবং অন্ত্রে (F) FOXO-এর প্রোটিন এক্সপ্রেশন প্যাটার্নগুলি পশ্চিমা ব্লটিং দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল। তিনটি প্রতিলিপির পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণের ফলাফল নিম্ন প্যানেলে দেখানো হয়েছিল। তিনটি স্বাধীন পুনরাবৃত্তি থেকে ব্যান্ডগুলি স্ক্যান করে ইমেজজে সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে ওয়েস্টার্ন ব্লটের ব্যান্ডগুলিকে ডিজিটাল করা হয়েছিল। FOXO/ -actin-এর আপেক্ষিক অভিব্যক্তি স্তরগুলিকে গড় ± SD হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছিল এবং নিয়ন্ত্রণ চিংড়ির মান একটি হিসাবে সেট করা হয়েছিল। চিত্রের ত্রুটি বারগুলি SDs নির্দেশ করে (তিনটি প্রতিলিপি)।

FOXO চিংড়িতে ভি অ্যাঙ্গুইলারাম চ্যালেঞ্জ দ্বারা সক্রিয় হয় এবং হেমোলিম্ফ এবং অন্ত্রের প্যাথোজেন ক্লিয়ারেন্সে অংশগ্রহণ করে

এটি রিপোর্ট করা হয়েছে যে FOXO ব্যাকটেরিয়া বা সাইটোকাইন উদ্দীপনা দ্বারা সক্রিয় হতে পারে এবং স্তন্যপায়ী প্রাণীদের নির্দিষ্ট লক্ষ্য জিনের অভিব্যক্তি নিয়ন্ত্রণ করতে নিউক্লিয়াসে স্থানান্তরিত হয় [17]। ব্যাকটেরিয়া দ্বারা চ্যালেঞ্জ করা চিংড়িতে FOXO সক্রিয় ছিল কিনা তা সনাক্ত করতে, চিংড়ির অন্ত্রে FOXO-এর উপকোষীয় বিতরণ পশ্চিমী ব্লটিং ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি দেখায় যে অন্ত্রের কোষের সাইটোপ্লাজমে FOXO-এর পরিমাণ V. অ্যাঙ্গুইলারাম চ্যালেঞ্জ (চিত্র 4A) এর পরে 2 থেকে 4 ঘন্টার মধ্যে ধীরে ধীরে হ্রাস পেয়েছে। বিপরীতে, অন্ত্রের কোষের নিউক্লিয়াসে FOXO-এর পরিমাণ V. anguillarum (Fig 4B) সংক্রমণের পরে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পায়। পদ্ধতিগত অনাক্রম্যতায় FOXO-এর ভূমিকা বিশ্লেষণ করার জন্য, একটি ফ্লুরোসেন্ট ইমিউনোসাইটোকেমিক্যাল অ্যাস ব্যবহার করা হয়েছিল চিংড়ির হিমোসাইটে FOXO-এর পারমাণবিক ট্রান্সলোকেশন পর্যবেক্ষণ করার জন্য 2 ঘন্টা পরে V. বার্ষিক ল্যারাম স্টিমুলেশন। আমরা দেখতে পেয়েছি যে নিউক্লিয়াসে ব্যাকটেরিয়া চ্যালেঞ্জ-প্ররোচিত FOXO ট্রান্সলোকেশন উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে কিন্তু PBS-চ্যালেঞ্জড চিংড়িতে (চিত্র 4C এবং 4C') কোনো সুস্পষ্ট পরিবর্তন হয়নি। পারমাণবিক ট্রান্সলোকেটেড FOXO প্যাথোজেন ক্লিয়ারেন্সের সাথে জড়িত কিনা তা অন্বেষণ করতে, আমরা ব্যাকটেরিয়া চ্যালেঞ্জের পরে 6 ঘন্টায় ফক্সো-নকডাউন চিংড়িতে হেমোলিম্ফ এবং অন্ত্রে ব্যাকটেরিয়া লোড বিশ্লেষণ করেছি। আমরা দেখতে পেয়েছি যে ফক্সো-এর নকডাউনের পরে, হিমোলিম্ফ এবং অন্ত্রে ব্যাকটেরিয়া লোড নিয়ন্ত্রণ গ্রুপের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 4D)। অধিকন্তু, ভি. অ্যাঙ্গুইলারাম দ্বারা সংক্রমিত ফক্সো-নকডাউন চিংড়ির বেঁচে থাকার হার নিয়ন্ত্রণের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে (চিত্র 4ই)। এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে FOXO অন্ত্রের কোষ এবং হিমোসাইটগুলিতে সক্রিয় ছিল এবং পরামর্শ দেয় যে FOXO ব্যাকটেরিয়া সংক্রমণের বিরুদ্ধে স্থানীয় এবং সিস্টেমিক ইমিউন প্রতিক্রিয়াগুলিতে অংশগ্রহণ করে।

চিত্র 2. FOXO অন্ত্রের (স্থানীয়) এবং সিস্টেমিক অ্যান্টিব্যাকটেরিয়াল ইমিউন প্রতিক্রিয়াতে অংশগ্রহণ করে। (A, B) চিংড়ির হিমোসাইট (A) এবং অন্ত্রে (B) Foxo-RNAi-এর কার্যকারিতা, যেমন qPCR (A) এবং ওয়েস্টার্ন ব্লটিং (B) ব্যবহার করে নির্ধারিত হয়। এন্ডোজেনাস কন্ট্রোল জিন হিসাবে -অ্যাক্টিন এবং Ef-1 এর জ্যামিতিক গড় প্রকাশ ব্যবহার করে qPCR তারিখ বিশ্লেষণ। ত্রুটি বার SD দেখায়. (গ) কঠিন এলবি কালচার দ্বারা ফক্সো-নকডাউন চিংড়ির হেমোলিম্ফ ব্যাকটেরিয়া সনাক্তকরণ (তিনটি পুনরাবৃত্তি); ডিএসজিএফপি ইনজেকশন নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। পাতলা অনুপাত ছিল 1:10। (D)। ব্যাকটেরিয়া চ্যালেঞ্জ ছাড়াই ফক্সো নকডাউন চিংড়ি এবং ডিএসজিএফপি-ইনজেকশন চিংড়িতে হেমোলিম্ফ এবং অন্ত্রে ব্যাকটেরিয়ার সংখ্যা। (ই)। ব্যাকটেরিয়া চ্যালেঞ্জ ছাড়াই Foxo-RNAi চিংড়ির বেঁচে থাকার হার। ডিএসজিএফপি ইনজেকশন নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। (চ)। অ্যান্টিবায়োটিক দিয়ে চিকিত্সা করা Foxo-RNAi চিংড়ির বেঁচে থাকার হার। ডিএসজিএফপি ইনজেকশন নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। সাধারণ: বন্য ধরনের চিংড়ি অ্যান্টিবায়োটিক দিয়ে চিকিত্সা করা হয় না।

চিত্র 3. FOXO-এর একটি বেসাল পরিমাণ হিমোসাইট এবং অন্ত্রের কোষের নিউক্লিয়াসে স্থানান্তরিত করে রিলিশ এক্সপ্রেশনকে উৎসাহিত করে এবং পরবর্তীতে স্বাভাবিক অবস্থায় হিমোলিম্ফ এবং অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটা হোমিওস্ট্যাসিস নিয়ন্ত্রণের জন্য IMD পথকে সক্রিয় করে। (A) ইমিউনোসাইটোকেমিস্ট্রি সাধারণ চিংড়ির হিমোসাইটে FOXO-এর উপকোষীয় বিতরণ সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। স্কেল বার=20 μm। Cy: সাইটোপ্লাজম; অনু: নিউক্লিয়াস। (বি) ওয়েস্টার্ন ব্লটিং সাধারণ চিংড়ি এবং ভি অ্যাঙ্গুইলারাম-সংক্রমিত চিংড়ি থেকে অন্ত্রের কোষে FOXO-এর উপকোষীয় বিতরণ সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। (C) অন্তঃসত্ত্বা নিয়ন্ত্রণ জিন হিসাবে -অ্যাক্টিন এবং Ef-1-এর জ্যামিতিক গড় অভিব্যক্তি ব্যবহার করে qPCR দ্বারা ফক্সোকে নকডাউন করার পরে mRNA স্তরে রিলিশের অভিব্যক্তিটি চিংড়ির হিমোসাইটগুলিতে সনাক্ত করা হয়েছিল। (D) Foxo এর নকডাউনের পরে চিংড়ির অন্ত্রে mRNA স্তরে Relish এর অভিব্যক্তি qPCR দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল -অ্যাক্টিন এবং Ef-1-এর জ্যামিতিক গড় অভিব্যক্তি অন্তঃসত্ত্বা নিয়ন্ত্রণ জিন হিসাবে ব্যবহার করে। (E) Foxo-এর নকডাউনের পরে চিংড়িতে ওয়েস্টার্ন ব্লটিং ব্যবহার করে RELISH স্তর সনাক্ত করা হয়েছিল। (E') প্যানেল E এর তিনটি প্রতিলিপি ইমেজজে সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে ডিজিটালাইজ করা হয়েছিল। (চ) চিংড়িতে হিমোলিম্ফ এবং অন্ত্রের ব্যাকটেরিয়া লোড 24 ঘন্টা পরে অ্যান্টিবায়োটিক চিকিত্সা। (জি) নিউক্লিয়াসে FOXO হিমোসাইট এবং চিংড়ির অন্ত্রে ওয়েস্টার্ন ব্লটিং ব্যবহার করে 24 ঘন্টা অ্যান্টিবায়োটিক দিয়ে চিকিত্সার পরে সনাক্ত করা হয়েছিল। (এইচ) অ্যান্টিবায়োটিকের সাথে চিকিত্সার 24 ঘন্টা পরে চিংড়ির হিমোসাইট এবং অন্ত্রে ওয়েস্টার্ন ব্লটিং ব্যবহার করে নিউক্লিয়াসে RELISH সনাক্ত করা হয়েছিল। (I, J) জীবাণু-মুক্ত চিংড়ির হিমোসাইট (I) এবং অন্ত্রে (J) এম্পসের অভিব্যক্তি qPCR দ্বারা -অ্যাক্টিন এবং Ef-1 একটি অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিন হিসাবে ব্যবহার করে নির্ধারিত হয়েছিল। নিয়ন্ত্রণ হিসাবে সাধারণ চিংড়ি (H2O ইনজেকশন) ব্যবহার করা হয়েছিল।

পূর্ববর্তী গবেষণায় ইঙ্গিত দেওয়া হয়েছে যে FOXO ট্রান্সক্রিপশনাল কার্যকলাপ ফসফোরিলেশন পরিবর্তন দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয় এবং সেরিন/থ্রোনাইন কিনেস AKT ফর্কহেড ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টরগুলির ক্রিয়াকলাপকে ফসফরিলেট করে এবং তাদের অস্পষ্ট ট্রান্সলোকেশনকে বাধা দিয়ে নিয়ন্ত্রণ করে [9,37]। প্যাথোজেনিক ব্যাকটেরিয়া সংক্রমণের পরে নিউক্লিয়াসে FOXO-এর বৃদ্ধি AKT দ্বারা প্রভাবিত হয় কিনা তা তদন্ত করার জন্য, আমরা প্রথমে চিংড়ির Akt এর নকডাউনের পরে ওয়েস্টার্ন ব্লটিং দ্বারা সাইটোপ্লাজম এবং নিউক্লিয়াসে FOXO-এর বিষয়বস্তু সনাক্ত করেছি। ফলাফলগুলি দেখায় যে হিমোসাইট এবং অন্ত্রের কোষগুলির নিউক্লিয়াসে FOXO-এর পরিমাণ উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে V. অ্যাঙ্গুইলারাম (চিত্র 5C এবং 5C') এর সংক্রমণের 2 ঘন্টা পরে চিংড়িতে Akt এক্সপ্রেশন (চিত্র 5A এবং 5B) নকডাউন করার পরে। পরীক্ষামূলক ফলাফল যাচাই করার জন্য, আমরা Akt-এর নকডাউনের পরে চিংড়ির হিমোসাইটগুলিতে FOXO-এর উপকোষীয় বিতরণ পর্যবেক্ষণ করতে একটি ইমিউনোসাইটোকেমিস্ট্রি অ্যাসও ব্যবহার করেছি। ফলাফলগুলি দেখায় যে হিমোসাইটের নিউক্লিয়াসে FOXO উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছিল যখন Akt ভি. অ্যাঙ্গুইলারাম (চিত্র 5D এবং 5D') এর সাথে 2 ঘন্টা পোস্ট-ইনফেকশনে আঘাত করে। প্যাথোজেন সংক্রমণ AKT কার্যকলাপকে প্রভাবিত করে কিনা তা অন্বেষণ করতে, আমরা মানব p-AKT (Ser473) অ্যান্টিবডি (চিংড়ি AKT-এর ফসফোরিলেশন সাইট হল Ser486) ব্যবহার করে প্যাথোজেন সংক্রমণের পরে AKT-এর ফসফোরিলেশন পরিবর্তন শনাক্ত করেছি এবং দেখতে পেয়েছি যে ফসফরিলেটেড AKT-এর মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে কমে গেছে। ভি অ্যাঙ্গুইলারাম সংক্রমণের 30 মিনিট পরে চিংড়ির হিমোসাইট এবং অন্ত্র (চিত্র 5E এবং 5F)। এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে প্যাথোজেন সংক্রমণ ফসফরিলেটেড AKT-এর মাত্রা কমাতে পারে, যা এনজাইমের কার্যকলাপকে বাধা দেয় এবং AKT-এর ফসফরিলেট ফক্সো করার ক্ষমতা হ্রাস করে। নন-ফসফরিলেটেড FOXO নিউক্লিয়াসে প্রবেশ করে এবং এর লক্ষ্য জিনের অভিব্যক্তিকে প্ররোচিত করে। চিত্রটি SDs নির্দেশ করে।

cistanche নির্যাস

প্যাথোজেন সংক্রমণ AKT-এর কার্যকলাপ হ্রাস করে এবং FOXO পারমাণবিক ট্রান্সলোকেশনকে প্ররোচিত করে

FOXO ব্যাকটেরিয়া দ্বারা সংক্রামিত চিংড়িতে অ্যান্টিমাইক্রোবিয়াল পেপটাইডের অভিব্যক্তি নিয়ন্ত্রণ করে আক্রমণকারী ব্যাকটেরিয়ার বিরুদ্ধে প্রতিরোধ ক্ষমতা প্রয়োগ করে

FOXO চিংড়িতে ব্যাকটেরিয়া সংক্রমণের বিরুদ্ধে প্রতিক্রিয়াকে প্রভাবিত করে এমন প্রক্রিয়াটি অন্বেষণ করতে, আমরা প্রথমে FOXO দ্বারা নিয়ন্ত্রিত ইমিউন ইফেক্টর জিনগুলি সনাক্ত করেছি। ভি. অ্যাঙ্গুইলারাম চ্যালেঞ্জ সহ বা ছাড়া চিংড়ির হেমোসাইট এবং অন্ত্রে ফক্সো সফলভাবে ছিটকে যাওয়ার পর, নীরব চিংড়ির তুলনায় CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 এবং Alf-E1-এর প্রকাশের মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে কন্ট্রোল গ্রুপের সাথে (চিত্র 6A এবং 6B)। ফলাফল আরও যাচাই করার জন্য, আমরা Akt-এর নকডাউনের পরে চারটি AMP-এর অভিব্যক্তিও শনাক্ত করেছি। ফলাফলগুলি দেখায় যে চারটি এএমপি-এর অভিব্যক্তি 6 ঘন্টা পরে V. অ্যাঙ্গুইল ল্যারাম সংক্রমণ নিয়ন্ত্রণ গ্রুপের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 6C এবং 6D)। স্বাভাবিক অবস্থায় (চিত্র 3I এবং 3J) আপ-রেগুলেটেড এএমপিগুলির (আলফ-বি1 এবং আলফ-সি1 সহ) তুলনায়, ভি দ্বারা সংক্রামিত চিংড়িতেও এএমপিগুলির অতিরিক্ত জিন (CrusI-3, Alf-E1) আপ-রেগুলেট করা হয়েছিল। অ্যাঙ্গুইলারাম (চিত্র 6A এবং 6B)। আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণায় ইঙ্গিত দেওয়া হয়েছে যে RELISH চিংড়িতে Alf-B1 এবং Alf-C1 এর প্রকাশকে প্রচার করেছে [36]। এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত করে যে FOXO সরাসরি AMP এক্সপ্রেশন নিয়ন্ত্রণ করতে পারে, যেমন CrusI-3 এবং Alf-E1, IMD সিগন্যালিং পাথ উপায় থেকে স্বাধীন। অনুমানটি নিশ্চিত করার জন্য, FOXO Alf-E1 এর প্রবর্তকের সাথে আবদ্ধ হতে পারে কিনা তা সনাক্ত করতে একটি চিপ অ্যাস করা হয়েছিল। Alf-E1 এর প্রবর্তক ক্রম প্রাপ্ত হয়েছিল (S4 Fig) এবং FOXO বাইন্ডিং সাইটগুলির পূর্বাভাস দেওয়া হয়েছিল (চিত্র 6E)। চিপ ফলাফল দেখায় যে FOXO Alf-E1 প্রোমোটার (চিত্র 6F) এর সাথে আবদ্ধ হতে পারে। এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে FOXO চিংড়িতে এএমপিগুলির অভিব্যক্তিকে সরাসরি নিয়ন্ত্রণ করে ব্যাকটেরিয়াল প্রতিরোধ ক্ষমতাতেও অংশগ্রহণ করে।

চিত্র 4. FOXO চিংড়ির নিউক্লিয়াসে স্থানান্তরিত হয়েছে ভি. অ্যাঙ্গুইলারাম দ্বারা চ্যালেঞ্জ করা হয়েছে। (A, B) ব্যাকটেরিয়া দ্বারা চ্যালেঞ্জ করা চিংড়ির অন্ত্রের কোষের সাইটোপ্লাজম (A) এবং নিউক্লিয়াস (B) এ FOXO বিতরণের ধরণ, যেমন পশ্চিমা ব্লটিং (A এবং B এর নিম্ন প্যানেল) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছে। পশ্চিমা ব্লটিং ব্যান্ডগুলি তিনটি পুনরাবৃত্তি থেকে ব্যান্ডগুলি স্ক্যান করে ইমেজজে সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে ডিজিটালাইজ করা হয়েছিল। FOXO/ -actin বা FOXO/Histone 3-এর আপেক্ষিক অভিব্যক্তি স্তরগুলিকে গড় ± SD হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছিল, এবং নিয়ন্ত্রণ চিংড়ির মান একটি হিসাবে সেট করা হয়েছিল। (C) চিংড়ির হিমোসাইটে FOXO-এর পারমাণবিক স্থানান্তর 2 ঘন্টা-পরবর্তী। অ্যাঙ্গুইলারাম চ্যালেঞ্জ ফ্লুরোসেন্ট ইমিউনোসাইটোকেমিক্যাল অ্যাসেস ব্যবহার করে সনাক্ত করা হয়েছিল। পিবিএস ইনজেকশন একটি নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। স্কেল বার=20 μm। (C') প্যানেল C এর পরিসংখ্যান বিশ্লেষণ WCIF ImageJ সফ্টওয়্যার দ্বারা হেমোসাইটগুলিতে FOXO এবং DAPI-দাগযুক্ত নিউক্লিয়াসের সমষ্টিগতকরণ বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। (D) ফক্সো-নকডাউন চিংড়ির হিমোলিম্ফ এবং অন্ত্রে ব্যাকটেরিয়া সংখ্যা V. অ্যাঙ্গুইলারাম ইনজেকশন অনুসরণ করে; ব্যাকটেরিয়া ইনজেকশনের পরে চিংড়িতে dsGfp-ইনজেকশন নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। (ঙ) V. অ্যাঙ্গুইলারাম দ্বারা সংক্রমিত Foxo-RNAi চিংড়ির বেঁচে থাকার হার। ডিএসজিএফপি ইনজেকশন নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।

FOXO SRC এক্সপ্রেশনকে প্রচার করে ব্যাকটেরিয়ার বিরুদ্ধে হেমোসাইটের ফ্যাগোসাইটোসিস প্রচার করে

পূর্ববর্তী গবেষণায় জানা গেছে যে FOXO স্তন্যপায়ী প্রাণীদের নিউট্রোফিলের ফ্যাগোসাইটোসিস নিয়ন্ত্রণ করতে CXCR2 এবং CD11b এর প্রবর্তক অঞ্চলের সাথে সরাসরি যোগাযোগ করে [26]। চিংড়ির অ্যান্টিব্যাকটেরিয়াল অনাক্রম্যতায় FOXO হেমোসাইট ফ্যাগোসাইটোসিসের সাথে যুক্ত কিনা তা পরীক্ষা করার জন্য, আমরা বিভিন্ন পদ্ধতি ব্যবহার করে ফক্সোর হস্তক্ষেপের পরে ফ্যাগোসাইটিক হার পরীক্ষা করেছি। ফক্সো-র নকডাউনের পরে, ফক্সো-নকডাউন গ্রুপের ফ্যাগোসাইটিক রেট এবং ফাগোসাইটিক সূচক নিয়ন্ত্রণ গ্রুপের (dsGfp) (চিত্র 7A এবং 7A') তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে কম ছিল। আমরা Foxo এর নীরবতার পরে হিমোসাইটের ফাগোসাইটিক হার পরিমাপ করতে ফ্লো সাইটোমেট্রিও ব্যবহার করেছি। ফলাফলগুলি দেখায় যে ফক্সো-আরএনএআই গ্রুপের ফেজ সাইটোসিস হারও ডিএসজিএফপি গ্রুপের (চিত্র 7বি এবং 7বি') তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে। এই ফলাফলগুলি আরও যাচাই করার জন্য, আমরা Akt-এর নকডাউনের পরে ফ্যাগোসাইটিক হারও পরীক্ষা করেছি। ফলাফলগুলি দেখায় যে নিয়ন্ত্রণ গ্রুপের তুলনায়, ফ্যাগোসাইটিক হার এবং ফাগোসাইটিক সূচক উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 7C এবং 7C')। এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে FOXO চিংড়িতে হেমোসাইটের ফ্যাগোসাইটোসিসকে প্রচার করে। FOXO কীভাবে চিংড়িতে হেমোসাইট ফ্যাগোসাইটোসিস বাড়ায় তা অন্বেষণ করতে, আমরা চিংড়ির ফাগোসাইটোসিসে জড়িত পূর্বে রিপোর্ট করা জিনের অভিব্যক্তি সনাক্ত করেছি। স্ক্যাভেঞ্জার রিসেপ্টর ক্লাস বি (এসআরবি) এবং ক্লাস সি (এসআরসি) হিমোসাইট ফ্যাগোসাইটোসিসে জড়িত বলে জানা গেছে [38,39]। আমরা দেখতে পেয়েছি যে Srb-এর পরিবর্তে Src-এর mRNA এক্সপ্রেশন লেভেল হিমোসাইট এবং অন্ত্রে (চিত্র 7D এবং 7E) ফক্সোকে নীরব করার পরে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে, যেখানে চিংড়িতে Akt-এর নকডাউনের পরে Src-এর অভিব্যক্তি উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 7F)। অনুরূপ ফলাফল প্রোটিন স্তরে প্রাপ্ত হয়েছিল (চিত্র 7G এবং 7G')। এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে FOXO SRC এক্সপ্রেশনকে প্রচার করে চিংড়িতে প্যাথোজেনগুলির হেমোসাইট ফ্যাগোসাইটোসিস প্রচার করে।

FOXO চিংড়িতে ফাগোসাইটোসিসের সময় RAB5 এবং RAB7-এর অভিব্যক্তি প্রচার করে

পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে ছোট GTPases, RAB5 এবং RAB7 হল নতুন এন্ডোসাইটোসড ভেসিকেলগুলিকে প্রারম্ভিক এবং দেরী এন্ডোসোমে পরিবহনের মূল নিয়ামক [40]। RAB5 প্রাথমিক ফিউশন ইভেন্টগুলির একটি মূল নিয়ন্ত্রক এবং প্রাথমিক এন্ডোসোমের একটি চিহ্নিতকারী [41,42]। দেরী ফাগোসোম-লাইসোসোম ফিউশনের জন্য RAB7 প্রয়োজন এবং এটি দেরী এন্ডোসোমের চিহ্নিতকারী [43]। RAB5 এবং RAB7 চিংড়িতে প্যাথোজেন ক্লিয়ারেন্সের সাথে জড়িত কিনা তা অন্বেষণ করতে, আমরা প্রথমে Rab5 এবং Rab7 এর এক্সপ্রেশন প্যাটার্নগুলি বিশ্লেষণ করেছি এবং দেখতে পেয়েছি যে দুটি ছোট GTPases ব্যাকটেরিয়া (S5A–S5D চিত্র) দ্বারা চ্যালেঞ্জ করা চিংড়িতে আপগ্রুলেট করা হয়েছিল। আমরা ব্যাকটেরিয়া চ্যালেঞ্জের পরে র‌্যাব5-আরএনএআই এবং র‌্যাব7-আরএনএআই চিংড়ির বেঁচে থাকার হার আরও বিশ্লেষণ করেছি, এবং ফলাফলগুলি দেখায় যে নিয়ন্ত্রণের তুলনায় Rab5 এবং Rab7 নকডাউন চিংড়ির বেঁচে থাকার হার উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে ( S5E এবং S5F চিত্র)। এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে RAB5 এবং RAB7 ব্যাকটেরিয়া রোগজীবাণুগুলির বিরুদ্ধে প্রতিরোধে গুরুত্বপূর্ণ কাজ করে। RAB5 এবং RAB7 ফক্সো-মধ্যস্থ ফাগোসাইটোসিসে জড়িত কিনা তা অন্বেষণ করতে, আমরা চিংড়িতে ফক্সো এক্সপ্রেশনে হস্তক্ষেপের পরে Rab5 এবং Rab7 এর mRNA এক্সপ্রেশন স্তরগুলি পরীক্ষা করেছি। ফলাফলগুলি দেখায় যে Rab5 এবং Rab7 এর অভিব্যক্তি মাত্রা হিমোসাইট এবং অন্ত্রে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে (Figs 8A এবং S6A)। যেখানে চিংড়িতে Akt-এর নকডাউনের পরে Rab5 এবং Rab7-এর অভিব্যক্তি উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 8B)। উপরের ফলাফলগুলি আরও নিশ্চিত করার জন্য, Foxo বা Akt নকডাউন চিংড়িতে RAB5 এবং RAB7 এর প্রোটিনের মাত্রাও সনাক্ত করা হয়েছিল। ডিএসজিএফপি ইনজেকশন গ্রুপের সাথে তুলনা করে, ফক্সো-নকডাউন চিংড়িতে হেমোসাইট এবং অন্ত্রে RAB5 এবং RAB7 মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে কিন্তু V. অ্যাঙ্গুইলারাম (ডুমুর 8C–8D'; S6B) দ্বারা 2 ঘন্টা পোস্ট-স্টিমুলেশনে Akt-নকডাউন চিংড়িতে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে। এবং S6B')। এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে RAB5 এবং RAB7 চিংড়িতে হেমোসাইটের FOXO- মধ্যস্থতাকারী ফেজ সাইটোসিসে অংশগ্রহণ করে। আমরা আরও শনাক্ত করেছি যে RAB5 এবং RAB7 চিংড়ির হিমোসাইটে V. অ্যাঙ্গুইলারামের সাথে সহ-স্থানীয় করা হয়েছিল (চিত্র 9)। একসাথে নেওয়া, ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে RAB5 এবং RAB7 চিংড়িতে FOXO- মধ্যস্থতাযুক্ত ফ্যাগোসাইটোসিসে জড়িত।

চিত্র 5. প্যাথোজেন সংক্রমণ AKT কার্যকলাপ হ্রাস করে, যা চিংড়ির হিমোসাইট এবং অন্ত্রের কোষগুলিতে FOXO পারমাণবিক ট্রান্সলোকেশনকে উন্নীত করে। (A, B) চিংড়ির হিমোসাইট এবং অন্ত্রে Akt-RNAi-এর কার্যকারিতা, qPCR দ্বারা নির্ধারিত জ্যামিতিক গড় অভিব্যক্তি -অ্যাক্টিন এবং Ef-1 এন্ডোজেনাস কন্ট্রোল জিন (A) এবং ওয়েস্টার্ন ব্লটিং (B) হিসাবে ব্যবহার করে। (সি) অ্যাক্ট-নকডাউন চিংড়ি থেকে সাইটোপ্লাজম এবং অন্ত্রের নিউক্লিয়াসে FOXO-এর পরিমাণ ওয়েস্টার্ন ব্লটিং দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। dsGfp একটি নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। (C') প্যানেলের পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ (C)। ইমেজজে সফ্টওয়্যারটি তিন-পুনরাবৃত্তির ছবি স্ক্যান করে ব্যান্ডগুলিকে ডিজিটাল করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। (D) অ্যাক্ট-নকডাউন চিংড়ির হেমোসাইটগুলিতে FOXO-এর পারমাণবিক স্থানান্তর একটি ফ্লুরোসেন্ট ইমিউনোসাইটোকেমিক্যাল অ্যাস ব্যবহার করে ভি অ্যাঙ্গুইলারাম চ্যালেঞ্জের 2 ঘন্টা পরে সনাক্ত করা হয়েছিল। dsGfp একটি নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। স্কেল বার=20 μm। (D') (D) এর পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ। ডাব্লুসিআইএফ ইমেজজে সফ্টওয়্যারটি এক্সপোজার মান ঠিক করার পরে হিমোসাইটগুলিতে অ্যান্টি-ফক্সো (সবুজ) এবং DAPI-দাগযুক্ত নিউক্লিয়াস (নীল) এর ফ্লুরোসেন্স তীব্রতা অনুপাত দ্বারা সহ-স্থানীয়করণ বিশ্লেষণ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। (E, F) চিংড়ির হিমোসাইট (E) এবং অন্ত্রে (F) ফসফরিলেটেড AKT (p-AKT) এর বিষয়বস্তুর পরিবর্তন ভি. অ্যাঙ্গুইলারাম দ্বারা চ্যালেঞ্জ করা হয়েছে। নিম্ন প্যানেলগুলি যথাক্রমে ওয়েস্টার্ন ব্লটিং এবং পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণের ব্যান্ডগুলির উপর ভিত্তি করে (E) এবং (F) এর ডিজিটালাইজড পরিসংখ্যান।

সিস্তানচে চা

আলোচনা

FOXO, একটি অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর হিসাবে, অনেক শারীরবৃত্তীয় এবং বিপাকীয় ফাংশনে অংশগ্রহণ করে [44,45]। বর্তমান গবেষণায়, আমরা চিংড়ি (M. japonicus) থেকে একটি FOXO সনাক্ত করেছি এবং দেখেছি যে এটি স্বাভাবিক অবস্থায় এএমপি এক্সপ্রেশন নিয়ন্ত্রণ করে হেমোলিম্ফ এবং এন্টারিক মাইক্রোবায়োটার হোমিওস্ট্যাসিস নিয়ন্ত্রণে অংশগ্রহণ করে। FOXO চিংড়িতে ব্যাকটেরিয়া সংক্রমণ দ্বারা সক্রিয় হতে পারে এবং নিউক্লিয়াসে স্থানান্তরিত হতে পারে, যেখানে এটি প্রত্যক্ষ ও পরোক্ষভাবে (আইএমডি পাথওয়ে দ্বারা) এএমপিগুলির অভিব্যক্তি নিয়ন্ত্রণ করে। FOXO ফাগোসাইটোসিস-সম্পর্কিত জিনের অভিব্যক্তি, যেমন SRC এবং ছোট GTPases, RAB5 এবং RAB7, প্যাথোজেনের বিরুদ্ধে হেমোসাইট ফ্যাগোসাইটোসিসকে উন্নীত করে। অতএব, চিংড়ি FOXO রোগজীবাণুগুলির বিরুদ্ধে সিস্টেমিক এবং স্থানীয় (অন্ত্রের) প্রতিরোধক প্রতিক্রিয়াগুলিতে বিভিন্ন ভূমিকা পালন করে (চিত্র 10)। মানুষের FOXO-এর সাথে তুলনা করে, চিংড়ি FOXO-এর তুলনামূলকভাবে সংরক্ষিত অ্যামিনো অ্যাসিড সিকোয়েন্স এবং AKT ফসফোরিলেশন সাইট রয়েছে; যাইহোক, চিংড়ি FOXO-এর দ্বিতীয় AKT ফসফোরিলেশন সাইটটি সেরিনের পরিবর্তে থ্রোনাইন। FOXO এর AKT ফসফোরিলেশন FOXO এর পারমাণবিক এবং সাইটোপ্লাজমিক পরিবহন নিয়ন্ত্রণ করে [9]। এই গবেষণায়, আমরা দেখতে পেয়েছি যে AKT FOXO-এর পারমাণবিক প্রবেশ নিয়ন্ত্রণের সাথে সম্পর্কিত। V. অ্যাঙ্গুইলারাম সংক্রমণের পর, ফসফরিলেটেড AKT-এর মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে কমে গিয়েছিল, যা নির্দেশ করে যে পাথ-ওজেন-সংক্রমিত চিংড়িতে AKT কার্যকলাপ হ্রাস পেয়েছে, এইভাবে FOXO-এর পারমাণবিক ধারণ বা পারমাণবিক ট্রান্সলোকেশন বৃদ্ধি পেয়েছে, এবং পরবর্তীতে লক্ষ্য জিনের প্রকাশকে প্ররোচিত করেছে, যেমন রেলিশ এবং অ্যাম্প, প্যাথোজেন সংক্রমণের বিরুদ্ধে প্রতিরোধের জন্য। পূর্ববর্তী গবেষণায় পাওয়া গেছে যে FOXO এএমপি এক্সপ্রেশনের পাথওয়েকে সক্রিয় করার জন্য পেপ্টিডোগ্লাইকান রিকগনিশন প্রোটিন SC2 (আইএমডি পাথওয়ের নেতিবাচক নিয়ন্ত্রক) এর অভিব্যক্তিকে দমন করে ড্রোসোফিলা অন্ত্রের নাল মাইক্রোফ্লোরার হোমিওস্টেসিসে অংশগ্রহণ করে [14]। ড্রোসোফিলায় হাইপোক্সিয়া সহনশীলতা নিয়ন্ত্রণে FOXO-এর মূল লক্ষ্য জিন হিসাবে রিলিশকে রিপোর্ট করা হয়েছিল [46]। অন্যান্য প্রাণীর মতো, চিংড়ির গ্যাস্ট্রোইনটেস্টাইনাল ট্র্যাক্টে তুলনামূলকভাবে উচ্চ এবং ধ্রুবক মাইক্রোবায়োটা থাকে। ক্রমবর্ধমান প্রমাণ আরও প্রকাশ করে যে চিংড়ি সহ কিছু জলজ সুস্থ অমেরুদণ্ডী প্রাণীর হিমোলিম্ফও স্থিতিশীল পরিমাণে ব্যাকটেরিয়াকে আশ্রয় করে [৪৭]। আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে একটি সি-টাইপ লেকটিন এএমপির অভিব্যক্তি বজায় রেখে হেমোলিম্ফ মাইক্রোবায়োটার হোমিওস্ট্যাসিস নিয়ন্ত্রণে অংশগ্রহণ করে [৩৪], তবে আমরা জানি না যে এএমপি এক্সপ্রেশন নিয়ন্ত্রণের সাথে কোন সংকেত পথ জড়িত। এখানে, আমাদের ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে FOXO স্বাভাবিক অবস্থায় আইএমডি সংকেতের মাধ্যমে হেমোলিম্ফ এবং এন্টারিক মাইক্রোফ্লোরা হোমিওস্টেসিস নিয়ন্ত্রণে জড়িত। অসংক্রমিত চিংড়িতে, Foxo-এর নকডাউনের ফলে Relish-এর প্রকাশ উল্লেখযোগ্যভাবে কমে যায় এবং চিংড়ির বেঁচে থাকার হার উল্লেখযোগ্যভাবে কমে যায়, এমনকি ব্যাকটেরিয়া সংক্রমণ ছাড়াই। আমরা সাধারণ চিংড়ি কোষের নিউক্লিয়াসে অল্প পরিমাণে FOXOও পেয়েছি। অতএব, আমরা মনে করি যে FOXO রেলিশ এক্সপ্রেশন প্রচার করে এবং তারপরে IMD পাথওয়ে দ্বারা এএমপি এক্সপ্রেশন বাড়িয়ে স্বাভাবিক অবস্থায় হেমোলিম্ফ এবং এন্টারিক ফ্লোরার হোমিওস্ট্যাসিস নিয়ন্ত্রণে অংশগ্রহণ করে। এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে FOXO চিংড়িতে হেমোলিম্ফ এবং গ্যাস্ট্রোইনটেস্টাইনাল ট্র্যাক্টের মাইক্রোবায়োটা হোমিওস্ট্যাসিসকে উন্নীত করতে স্থানীয় এবং পদ্ধতিগত অনাক্রম্যতায় অংশগ্রহণ করে। হিউমারাল অনাক্রম্যতা এএমপিগুলির একটি ব্যাটারি [২১,৪৮] উৎপাদনের মাধ্যমে বিপরীত হারে প্যাথোজেন সংক্রমণের প্রতিরোধে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। হিউমারাল রেসপন্সের মধ্যে রয়েছে এএমপি-এর ইনডিসিবল সংশ্লেষণ এবং নিঃসরণ, যা হিমোলিম্ফের মধ্যে একটি সিস-টেমিক রেসপন্স হিসাবে মুক্তি পায়, বা এপিডার্মাল পৃষ্ঠে বা গ্যাস্ট্রোইনটেস্টাইনাল ট্র্যাক্টের গহ্বরে স্থানীয় প্রতিক্রিয়া হিসাবে ছেড়ে দেওয়া হয় [19]। এএমপি এক্সপ্রেশন মূলত টোল/ডিফ এবং আইএমডি/রিলিশ সিগন্যালিং পাথওয়ে দ্বারা ফল মাছি [৪৯] দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়। বর্তমানে, ক্রাস্টিন, অ্যান্টি-লাইপোপলিস্যাকারাইড ফ্যাক্টর (আলফস) এবং পেনাইডিন সহ চিংড়িতে এএমপিগুলির বেশ কয়েকটি পরিবার সনাক্ত করা হয়েছে [৫০]। বর্তমান সমীক্ষায় দেখা গেছে যে FOXO প্রত্যক্ষ বা পরোক্ষভাবে (IMD/Relish সিগন্যালিং এর মাধ্যমে) CrusI-3, Alf-B1, Alf-C1 এবং Alf-E1 সহ AMP-এর অভিব্যক্তি নিয়ন্ত্রণ করতে পারে। আমরা ভেবেছিলাম যে স্বাভাবিক অবস্থায় চিংড়ির হিমোসাইট এবং অন্ত্রে FOXO-এর কম সক্রিয়তা ইন ভিভো মাইক্রোবায়োটার হোমিওস্ট্যাসিস বজায় রাখার জন্য Foxo-এর মূল টার্গেট জিন অর্থাৎ রেলিশকে নিয়ন্ত্রণ করতে পারে। সংক্রমণের সময়, আক্রমণকারী প্যাথোজেনগুলি FOXO কে সক্রিয় করে, যার বেশিরভাগই নিউক্লিয়াসে স্থানান্তরিত হয়, যেখানে এটি কিছু AMPs, যেমন Alf-E1 এবং CrusI-3, রেলিশ ছাড়াও আরও লক্ষ্য জিনগুলিকে নিয়ন্ত্রণ করে। একসাথে নেওয়া, FOXO হেমোলিম্ফ এবং গ্যাস্ট্রোইনটেস্টাইনাল ট্র্যাক্টে আইএমডি সংকেতের বেসাল-লেভেল অ্যাক্টিভেশনের মাধ্যমে সুস্থ চিংড়িতে হেমোলিম্ফ এবং অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটা হোমিওস্ট্যাসিস নিয়ন্ত্রণে অংশগ্রহণ করে। প্যাথোজেন সংক্রমণ AKT কার্যকলাপ হ্রাস করে FOXO কে সক্রিয় করে এবং সিস্টেমিক অনাক্রম্যতা এবং স্থানীয় (অন্ত্রের) অনাক্রম্যতায় প্রত্যক্ষ ও পরোক্ষভাবে এএমপিগুলির প্রকাশকে প্রচার করে। ফ্যাগোসাইটোসিস হল একটি রিসেপ্টর-মধ্যস্থতা, অ্যাক্টিন এবং এটিপি-নির্ভর, ঘটনা যা নির্দিষ্ট সাইটোমেমব্রেন রিসেপ্টরগুলিতে কণা বা প্যাথোজেনগুলির আবদ্ধতার দ্বারা ট্রিগার হয় এবং একটি গুরুত্বপূর্ণ ইমিউন প্রক্রিয়ার প্রতিনিধিত্ব করে যার মাধ্যমে হোস্ট নিজেকে প্যাথোজেন থেকে রক্ষা করতে পারে [24]। ছোট GTPases, যেমন RAB5 এবং RAB7, ফ্যাগোসাইটোসিসে অবিরত ঝিল্লি পুনর্নির্মাণ এবং ভেসিকল ট্র্যাফিকের সাথে জড়িত। আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণায় জানা গেছে যে স্ক্যাভেঞ্জার রিসেপ্টর SRB এবং SRC চিংড়িতে রিসেপ্টর হিসাবে হেমোসাইট ফ্যাগোসাইটোসিসে জড়িত [38,39]। বর্তমান সমীক্ষায়, আমরা দেখতে পেয়েছি যে Foxo-এর নকডাউনের পরে, Src এক্সপ্রেশন উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে, এবং হেমোসাইট ফ্যাগোসাইটোসিস হার উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে, পরামর্শ দেয় যে Src হল FOXO-এর একটি টার্গেট জিন এবং FOXO প্যাথোজেনিক ব্যাকটেরিয়ার SRC-মধ্যস্থ ফাগোসাইটোসিসে জড়িত। FOXO দুটি ছোট GTPases, RAB5 এবং RAB7-এর অভিব্যক্তি প্রচার করতে পারে। এই ছোট GTPases ক্রমিক পরিবহনের সাথে জড়িত এবং প্রাথমিক এবং দেরী ফাগোসোমের মূল নির্ধারক [51]। ফ্যাগোসোমগুলি কোষের পরিধি থেকে অন্তঃকোষীয় অঞ্চলে স্থানান্তরিত হয়, পরিবহনের সময় RAB5 RAB7 দ্বারা প্রতিস্থাপিত হয় এবং চূড়ান্ত পণ্যগুলি অবক্ষয়ের জন্য লাইসোসোমে পরিবাহিত হয় [52,53]। আমরা আরও দেখতে পেয়েছি যে RAB5 এবং RAB7 হিমোসাইটের প্যাথোজেনগুলির সাথে সহ-স্থানীয়করণ করতে পারে, যা ইঙ্গিত করে যে প্যাথোজেনগুলি চিংড়িতে হেমোসাইট দ্বারা ফাগোসাইটাইজড হয়েছিল এবং শেষ পর্যন্ত লাইসোসোমে অবনমিত হওয়ার আগে প্রাথমিক এবং দেরী ফাগোসোমের মধ্য দিয়ে যায়। অতএব, FOXO হিমোসাইটের ফাগোসাইটোসিস প্রচার করে সেলুলার ইমিউন প্রতিক্রিয়ার সাথে জড়িত। উপসংহারে, আমাদের ফলাফলগুলি ইঙ্গিত দেয় যে FOXO শুধুমাত্র সাধারণ অবস্থায় মাইক্রোবায়োটা হোমিওস্ট্যাসিস নিয়ন্ত্রণে অংশগ্রহণ করে না বরং এএমপি এবং হেমোসাইটের ফাগোসাইটোসিস প্রকাশের মাধ্যমে সংক্রামিত চিংড়িতে প্যাথোজেনিক ব্যাকটেরিয়া ক্লিয়ারেন্সেও অংশগ্রহণ করে।

চিত্র 6. FOXO এএমপি-এর অভিব্যক্তি নিয়ন্ত্রণ করে চিংড়িতে তার ব্যাকটেরিয়ারোধী ভূমিকা পালন করে। (A, B) ফক্সো-নকডাউন চিংড়ির হিমোসাইট (A) এবং অন্ত্রে (B) এম্পসের অভিব্যক্তি, যেমন qPCR দ্বারা নির্ধারিত হয় -অ্যাক্টিন এবং Ef-1 এর জ্যামিতিক গড় অভিব্যক্তি অন্তঃসত্ত্বা নিয়ন্ত্রণ জিন হিসাবে; চিংড়িতে dsGfp ইনজেকশন নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। মান-হোয়াইটনি ইউ পরীক্ষা ব্যবহার করে ডেটা পরিসংখ্যানগতভাবে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। (C, D) Akt নকডাউন চিংড়ির হিমোসাইট (C) এবং অন্ত্রের (D) মধ্যে Amps-এর অভিব্যক্তি qPCR দ্বারা -অ্যাক্টিন এবং Ef-1-এর জ্যামিতিক গড় অভিব্যক্তি অন্তঃসত্ত্বা নিয়ন্ত্রণ জিন হিসাবে ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল; চিংড়িতে dsGfp ইনজেকশন নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। একমুখী আনোভা ব্যবহার করে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। (E) Alf-E1 প্রোমোটারে FOXO-এর পূর্বাভাসিত বাঁধাই সাইটগুলির পরিকল্পিত চিত্র। (F) চিপ এবং আরটি-পিসিআর প্রাইমার ব্যবহার করে Alf-E1 প্রোমোটার সিকোয়েন্সে FOXO বাইন্ডিং সনাক্ত করতে ব্যবহার করা হয়েছিল (আলফ-ই1-F এবং Alf-E1-আর, টেবিল 1)। RT-PCR চিপ ব্যবহার করে RT-PCR প্রাইমার (Alf-E1-RT-F এবং Alf-E1-RT-R. টেবিল 1) সহ Alf-E1-এর এনকোডিং অঞ্চলকে প্রসারিত করতেও ব্যবহৃত হয়েছিল টেমপ্লেট হিসাবে ডিএনএ প্রাপ্ত। আইজিজি অ্যান্টিবডি নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল এবং লক্ষ্য ব্যান্ড নিশ্চিত করতে সাধারণ জিনোমিক ডিএনএ পরিবর্ধিত খণ্ডটি ব্যবহার করা হয়েছিল।

Fig 7. FOXO SRC এক্সপ্রেশন প্রচার করে চিংড়িতে প্যাথোজেনের হেমোসাইট ফ্যাগোসাইটোসিস বাড়ায়। (A) একটি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের অধীনে ফ্লুরোসেন্ট ইমিউনোসাইটোকেমিক্যাল অ্যাস ব্যবহার করে ভি অ্যাঙ্গুইলারামের হেমোসাইট ফ্যাগোসাইটোসিস পর্যবেক্ষণ করা হয়েছে। ভি. অ্যাঙ্গুইলারামকে FITC (সবুজ) লেবেল করা হয়েছিল এবং কোষের নিউক্লিয়াসকে DAPI (নীল) দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল। লাল তীরটি ফ্যাগোসাইটিক হিমোসাইট নির্দেশ করে। স্কেল বার=20 μm। (A') ফক্সো-নকডাউন চিংড়িতে ফ্যাগোসাইটিক হার এবং ফ্যাগোসাইটিক সূচকের পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ। ডিএসজিএফপি ইনজেকশন গ্রুপটি নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। প্রতিটি পরীক্ষায় ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের অধীনে পাঁচশো হিমোসাইট গণনা করা হয়েছিল। শিক্ষার্থীর টি-টেস্ট ব্যবহার করে ডেটা পরিসংখ্যানগতভাবে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। (বি) ফ্লো সাইটোমেট্রি ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হেমোসাইট দ্বারা ব্যাকটেরিয়া ফ্যাগোসাইটোসিস। আইডিয়াস অ্যাপ্লিকেশন v6৷{8}} সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে হেমোসাইটে লেবেলযুক্ত ব্যাকটেরিয়ার ফ্লুরোসেন্স সিগন্যালের ভিত্তিতে ব্যাকটেরিয়া (R2) ধারণকারী ফ্যাগোসাইটোসড হেমোসাইটগুলিকে নন-ফ্যাগোসাইটোসড হেমোসাইট (R3) থেকে আলাদা করা হয়েছিল৷ (B') প্রবাহ সাইটোমেট্রি ডেটার উপর ভিত্তি করে হেমোসাইটের ফাগোসাইটিক হার। প্রতিটি বিশ্লেষণের জন্য তিন হাজার হিমোসাইট গণনা করা হয়েছিল এবং তিনটি পুনরাবৃত্তি করা হয়েছিল। ডিএসজিএফপি গ্রুপটি নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। (গ) অ্যাক্ট নকডাউন চিংড়িতে ভি অ্যাঙ্গুইলারামের হেমোসাইট ফ্যাগোসাইটোসিস ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের নীচে পর্যবেক্ষণ করে। স্কেল বার=10 μm। (C') প্যানেলের ডেটার উপর ভিত্তি করে ফ্যাগোসাইটিক হার এবং ফ্যাগোসাইটিক সূচকের পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ। (D) Foxo নকডাউন চিংড়ি থেকে হেমোসাইটগুলিতে Srb এবং Src-এর mRNA এক্সপ্রেশন স্তর qPCR দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছে -অ্যাক্টিন এবং Ef-1-এর জ্যামিতিক গড় অভিব্যক্তি অন্তঃসত্ত্বা নিয়ন্ত্রণ জিন হিসাবে ব্যবহার করে। ডিএসজিএফপি ইনজেকশন নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। (E) Foxo-RNAi চিংড়ির অন্ত্রে Srb এবং Src-এর mRNA এক্সপ্রেশন qPCR দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছে -অ্যাক্টিন এবং Ef-1 এর জ্যামিতিক গড় অভিব্যক্তি অন্তঃসত্ত্বা নিয়ন্ত্রণ জিন হিসাবে ব্যবহার করে। (F) অ্যাক্ট-আরএনএআই চিংড়ির হিমোসাইটে Src-এর mRNA এক্সপ্রেশন qPCR দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছে -অ্যাক্টিন এবং Ef-1-এর জ্যামিতিক গড় অভিব্যক্তি অন্তঃসত্ত্বা নিয়ন্ত্রণ জিন হিসাবে ব্যবহার করে। (G) Foxo-RNAi বা Akt-RNAi চিংড়ির হেমোসাইটে SRC-এর প্রোটিন স্তর, যেমন পশ্চিমা ব্লটিং ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছে। নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত dsGfp ইনজেকশন। (G') প্যানেলের তিনটি প্রতিলিপি (G) এর ডেটার উপর ভিত্তি করে পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ।

উপকরণ এবং পদ্ধতিসমূহ

নীতিশাস্ত্র বিবৃতি

সমস্ত প্রাণী পরীক্ষা চীন জাতীয় নির্দেশাবলী (GB 14922.2–2011 এবং GB 14925–2010) মেনে সঞ্চালিত হয়েছিল। গবেষণায় অ্যান্টিবডি প্রস্তুতির জন্য খরগোশের পরীক্ষাগুলি শানডং ইউনিভার্সিটি স্কুল অফ লাইফ সায়েন্সেস (SYDWLL-2021-54) এ অ্যানিমাল কেয়ার অ্যান্ড ওয়েলফেয়ার কমিট টি দ্বারা অনুমোদিত প্রোটোকল অনুসারে পরিচালিত হয়েছিল। আমাদের গবেষণায় চিংড়ি ব্যবহারের নিয়ম অনুসারে অনুমোদনের প্রয়োজন ছিল না কারণ আমাদের গবেষণায় সীমিত সংখ্যক সাধারণ চিংড়ি ব্যবহার করা হয়েছে যা ব্যাপক সম্প্রদায়ের দ্বারা ঘন ঘন খাওয়া হয়।

প্রাণী

স্বাস্থ্যকর চিংড়ি (মারসুপেনিয়াস জাপোনিকাস), যার ওজন প্রায় 6-10 গ্রাম, চীনের শানডং প্রদেশের কিংডাওতে জলজ পণ্যের বাজার থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। পরীক্ষা-নিরীক্ষার আগে, চিংড়ি চাষ পদ্ধতিতে কমপক্ষে 1 দিনের জন্য 23-25˚C তাপমাত্রায় বায়ুযুক্ত সমুদ্রের জল দিয়ে নতুন পরিবেশের সাথে মিলিত হওয়ার জন্য চিংড়ি চাষ করা হয়েছিল।

চিত্র 8. RAB5 এবং RAB7 চিংড়িতে হেমোসাইটের FOXO-মধ্যস্থ ফাগোসাইটোসিসের সাথে জড়িত। (এ, বি) কিউপিসিআর ব্যাকটেরিয়া সংক্রমণ সহ এবং ছাড়াই ফক্সো-নকডাউন চিংড়ি (এ) এবং আকট-নকডাউন চিংড়ি (বি) এর হিমোসাইটে Rab5 এবং Rab7 এর mRNA এক্সপ্রেশন স্তর বিশ্লেষণ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। qPCR -এক্টিন এবং Ef-1-এর জ্যামিতিক গড় অভিব্যক্তিকে এন্ডোজেনাস কন্ট্রোল জিন হিসেবে ব্যবহার করেছে। (C) 2 ঘন্টা পরে Foxo-নকডাউন চিংড়ির হেমোসাইটে RAB5 এবং RAB7-এর প্রোটিনের মাত্রা ওয়েস্টার্ন ব্লটিং ব্যবহার করে নির্ধারিত হয়। (C') প্যানেলের তিনটি প্রতিলিপি (C) এর ডেটার উপর ভিত্তি করে পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ। (D) অ্যাক্ট-নকডাউন চিংড়ির হেমোসাইটে RAB5 এবং RAB7-এর প্রোটিনের মাত্রা 2 ঘন্টা পরে V. অ্যাঙ্গুইলারাম চ্যালেঞ্জ ওয়েস্টার্ন ব্লটিং ব্যবহার করে নির্ধারিত হয়। (D') প্যানেলের তিনটি প্রতিলিপি (D) এর ডেটার উপর ভিত্তি করে পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ।

বায়োইনফরম্যাটিক বিশ্লেষণ

Foxo-এর পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের cDNA ক্রমটি M. japonicus (BGI, Shenzhen, China) এর হিমোসাইট এবং অন্ত্রের ট্রান্সক্রিপ টোম সিকোয়েন্সিং থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। ক্রম নিশ্চিতকরণের জন্য ফক্সোর ওপেন রিডিং ফ্রেম (ওআরএফ) এক জোড়া প্রাইমার (ফক্সো-এক্স-এফ এবং ফক্সো-এক্স-আর; টেবিল 1) ব্যবহার করে প্রশস্ত করা হয়েছিল। সংশ্লিষ্ট cDNA ধারণাগতভাবে ExPASy-ট্রান্সলেশন টুল (http://cn.expasy.org/) ব্যবহার করে অনুমানকৃত প্রোটিন ক্রম প্রাপ্ত করার জন্য অনুবাদ করা হয়েছিল। ব্লাস্ট (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/) ব্যবহার করে সাদৃশ্য বিশ্লেষণ করা হয়েছিল, এবং ডোমেন আর্কিটেকচারের পূর্বাভাস SMART (http://smart.emblheidelberg.de) ব্যবহার করে সম্পাদিত হয়েছিল। MEGA 6 ব্যবহার করে বিভিন্ন প্রজাতির FOXO-এর একটি ফাইলোজেনেটিক গাছ তৈরি করা হয়েছিল৷{8}} প্রোগ্রাম [54]৷

চিত্র 9. RAB5 এবং RAB7 ভি. অ্যাঙ্গুইলারামের সাথে সহ-স্থানীয়করণ করে। FITC লেবেলযুক্ত-V সহ RAB5 এবং RAB7-এর সহ-স্থানীয়করণ। ফ্লুরোসেন্ট ইমিউনোসাইটোকেমিক্যাল অ্যাস ব্যবহার করে বিশ্লেষিত হিসাবে চিংড়ির হিমোসাইটে অ্যাঙ্গুইলারাম। ব্যাকটেরিয়া FITC (সবুজ) দিয়ে লেবেল করা হয়েছিল এবং চিংড়িতে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। ব্যাকটেরিয়া ইনজেকশনের পরে 30 মিনিট এবং 1 ঘন্টা পাঁচটি চিংড়ি থেকে হিমোসাইট সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং অ্যান্টি-আরএবি 5 বা অ্যান্টি-আরএবি 7 অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি ছিল অ্যান্টির্যাবিট আইজিজি অ্যালেক্সা-546 (লাল)। নিউক্লিয়াস DAPI (নীল) দিয়ে দাগযুক্ত ছিল। হিমোসাইটে সহ-স্থানীয়করণ সাদা তীর দ্বারা নির্দেশিত হয়। স্কেল বার=10 μm।

চিত্র 10. চিংড়িতে স্থানীয় এবং পদ্ধতিগত সহজাত অনাক্রম্যতায় FOXO জড়িত থাকার পরিকল্পিত উপস্থাপনা। (ক) অসংক্রমিত অবস্থায়, FOXO রেলিশ এবং পরবর্তীতে এএমপি অভিব্যক্তি প্রচার করে হেমোলিম্ফ এবং অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটার হোমিওস্ট্যাসিস বজায় রাখে। (খ) সংক্রমিত অবস্থায়, প্যাথোজেন সংক্রমণের ফলে AKT ফসফোরিলেশন হ্রাস পায়, যার ফলে নিউক্লিয়াসে FOXO সামগ্রী বৃদ্ধি পায়। FOXO আক্রমণাত্মক রোগজীবাণু নির্মূল করার জন্য সরাসরি Relish এবং AMP-এর অভিব্যক্তি প্রচার করে; অন্যদিকে, FOXO এসআরসি-মধ্যস্থ ফাগোসাইটোসিস পথের মাধ্যমে প্যাথোজেনগুলির ফ্যাগোসাইটোসিসকে প্রচার করে।

ব্যাকটেরিয়া চ্যালেঞ্জ এবং নমুনা সংগ্রহ

Vibrio anguillarum (ATCC 43305) Marine College, Shandong University (Wei hai, China) থেকে প্রাপ্ত এবং এখন আমাদের পরীক্ষাগারে সংরক্ষিত। ভি. অ্যাঙ্গুইলারাম রাতারাতি 37˚C তাপমাত্রায় LB মিডিয়ামে সংষ্কৃত হয় এবং দ্বিতীয় দিনে 1:100 টিকাতে 4 ঘন্টা পুনঃসংস্কৃতি করা হয়। লগারিদমিক বৃদ্ধির পর্যায়ে ব্যাকটেরিয়াগুলিকে 5000 × g সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে 4˚C তাপমাত্রায় 5 মিনিটের জন্য সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং ফসফেট-বাফারযুক্ত স্যালাইন (PBS: 10 mM Na2HPO4, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, এবং KM4 1. KH2) দিয়ে দুইবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। pH 7.4)। চিংড়ি চ্যালেঞ্জের জন্য ফসফেট বাফারযুক্ত স্যালাইনে ভি. অ্যাঙ্গুইলারাম পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছে। প্রায় 2 × 107 কলোনি গঠন ইউনিট (CFU)/ চিংড়ি একটি মাইক্রোসিরিঞ্জ ব্যবহার করে প্রতিটি চিংড়ির পেটে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। কন্ট্রোল গ্রুপটিকে একই ভলিউম পিবিএস দিয়ে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। আরএনএ এবং প্রোটিন নিষ্কাশনের জন্য কমপক্ষে তিনটি চিংড়ি থেকে হিমোসাইট, হার্ট, হেপাটোপ্যানক্রিয়াস, ফুলকা, পাকস্থলী এবং অন্ত্র সংগ্রহ করা হয়েছিল। হিমোসাইট সংগ্রহের জন্য, 0.8 মিলি অ্যান্টিকোয়াগুল্যান্ট বাফার (10% সোডিয়াম সাইট্রেট) সহ প্রিলোড করা একটি সিরিঞ্জ ব্যবহার করে ভেন্ট্রাল সাইনাস থেকে হিমোলিম্ফ বের করা হয়েছিল, এবং তারপর দ্রুত হিমোসাইট বিচ্ছিন্নতার জন্য 4˚C তাপমাত্রায় 8 মিনিটের জন্য 700 × g এ সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল।

আরএনএ এবং প্রোটিন নিষ্কাশন, এবং সিডিএনএ সংশ্লেষণ

TRIzol (ET101, ট্রান্সজেন, বেইজিং, চীন) ব্যবহার করে হিমোসাইট এবং চিংড়ির বিভিন্ন অঙ্গ থেকে মোট আরএনএ বের করা হয়েছিল। রেডিওইমিউনোপ্রেসিপিটেশন অ্যাস (RIPA) লাইসিস বাফার (P0013B, Beyotime, Jiangsu, China) ব্যবহার করে বিভিন্ন অঙ্গ থেকে প্রোটিন বের করা হয়েছিল। প্রথম স্ট্র্যান্ড সিডিএনএ সংশ্লেষণ একটি সিডিএনএ সংশ্লেষণ কিট (5x অল-ইন-ওয়ান RT মাস্টারমিক্স; ফলিত জৈবিক উপাদান-এবিএম, ভ্যাঙ্কুভার, কানাডা) ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল, যা প্রস্তুতকারকের নির্দেশাবলী অনুসরণ করে।

সারণী 1. এই গবেষণায় ব্যবহৃত প্রাইমারের ক্রম।

মাস্টারমিক্স; ফলিত জৈবিক উপকরণ-এবিএম, ভ্যাঙ্কুভার, কানাডা), প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসরণ করে।

রিকম্বিন্যান্ট এক্সপ্রেশন এবং অ্যান্টিবডি প্রস্তুতি

Foxo-এর cDNA ক্রমটি রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন পলিমারেজ চেইন রিঅ্যাকশন (RT-PCR) দ্বারা প্রাইমার Foxo-EX-F এবং Foxo-EX-R (টেবিল 1) ব্যবহার করে প্রশস্ত করা হয়েছিল। বিশুদ্ধ পিসিআর পণ্যগুলি তখন সীমাবদ্ধতা এনজাইম ব্যবহার করে হজম করা হয়েছিল এবং প্লাজমিড pGEX-4T-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) এ সংযুক্ত করা হয়েছিল। এবং নির্মিত প্লাজমিডগুলি Escher ichia coli Rosseta (DE3) কোষে রূপান্তরিত হয়েছিল। 37˚C তাপমাত্রায় 1 মিমি আইসোপ্রোপাইল{10}} ডি-থিও গ্যালাকটোপিরানোসাইড ব্যবহার করে প্রোটিন প্রকাশ করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসরণ করে রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিনগুলি গ্লুটাথিয়ন (জিএসটি) রজন (C600031, BBI, Shanghai, China) ব্যবহার করে অ্যাফিনিটি ক্রোমাটোগ্রাফির শিকার হয়েছিল। FOXO-এর বিরুদ্ধে খরগোশের অ্যান্টিসেরা পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে প্রস্তুত করা হয়েছিল [55]।

পশ্চিমা শোষক

বিভিন্ন অঙ্গ বা হিমোসাইট থেকে আহরিত প্রোটিন 10% সোডিয়াম ডোডেসিল সালফেট পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস (SDS-PAGE) ব্যবহার করে আলাদা করা হয়েছিল। SDS-PAGE জেলের প্রোটিনগুলি স্থানান্তর বাফার ব্যবহার করে সেলুলোজ নাইট্রেট ঝিল্লিতে স্থানান্তরিত হয়েছিল (25 মিমি ট্রিস–এইচসিএল, 20 মিমি গ্লাইসিন, 0.037% এমএম এসডিএস, এবং 20% ইথানল) এবং 5% স্কিম মিল্ক বা 3% বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন (BSA) ট্রিস-বাফারযুক্ত স্যালাইনে (TBS: 150 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, pH 8.0) ঘরের তাপমাত্রায় মৃদু কাঁপুনি সহ 1 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়। তারপরে ঝিল্লিগুলিকে প্রাথমিক অ্যান্টিসারাম দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল: অ্যান্টি-ফক্সো 1:100 ডিলিউশনে, অ্যান্টি-র‌্যাব5 1:25 এ, অ্যান্টি-র‌্যাব7 1:25 এ, অ্যান্টি-বিটা অ্যাক্টিন (ACTB) 1:250 এ (আমাদের পরীক্ষাগারে প্রস্তুত করা হয়েছে) ); হিস্টোন-3 পলি ক্লোনাল অ্যান্টিবডি (A2348, ABclonal, Wuhan, China, 1:2500); অ্যান্টি-ফসফরিলেটেড (p)-AKT পলিক্লোনাল অ্যান্টিবডি (WLP001a, Wanleibio, Shenyang, China, 1:500) এবং 4˚C তাপমাত্রায় রাতের বেলা আলতোভাবে ঝাঁকান। টিবিএসটি দিয়ে তিনবার ধোয়ার পর (0.1% টুইন-20 টিবিএসে যোগ করা হয়েছে), মেম ব্রেনগুলি সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (ZB2308 ZSGB-Bio, Beijing, China, 1:5,000) বা ( ZB2301 ZSGB-Bio, Beijing, China, 1:5,000) 3 ঘন্টার জন্য ঘরের তাপমাত্রায় মৃদু ঝাঁকুনি দিয়ে। ইমিউনোর্যাক্টিভ প্রোটিন ব্যান্ডগুলি একটি নাইট্রোটেট্রাজোলিয়াম ব্লু ক্লোরাইড (A610379, BBI) এবং P-toluidine লবণ (A610072, BBI) দ্রবণ অন্ধকার অবস্থায় বা উন্নত কেমিলুমিনেসেন্স (ECL) ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল। -অ্যাক্টিন বা হিস্টোন-3 রেফারেন্স ব্যবহার করা হয়েছেs.

ব্যাকটেরিয়া দ্বারা চ্যালেঞ্জ করা চিংড়িতে টিস্যু বিতরণ এবং প্রকাশের ধরণ

হেমোসাইট, হৃৎপিণ্ড, ফুলকা, থুতু, পাকস্থলী এবং অন্ত্রে ফক্সো/ফক্সো-এর টিস্যু বন্টন প্রাইমার ফক্সো-এফ এবং ফক্সো-আর (টেবিল 1) সহ RT-PCR ব্যবহার করে এবং অ্যান্টি-ফক্সো অ্যান্টিবডি সহ পশ্চিমা ব্লটিং দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল, যথাক্রমে পিসিআর পদ্ধতিতে 3 মিনিটের জন্য 94˚C তাপমাত্রায় একটি প্রাথমিক ইনকিউবেশন থাকে; এরপর 30 সেকেন্ডের জন্য 94˚C, 30 সেকেন্ডের জন্য 50˚C এবং 30 সেকেন্ডের জন্য 72˚C এর 35টি চক্র; 10 মিনিটের জন্য 72˚C দ্বারা অনুসরণ করুন৷ পিসিআর পণ্যগুলি অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস (1.5% অ্যাগারোজ) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। -অ্যাক্টিন জিন ( -অ্যাক্টিন-এফ এবং -অ্যাক্টিন-আর; টেবিল 1) অভ্যন্তরীণ নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। RNA-তে Foxo/FOXO-এর টাইম কোর্স এক্সপ্রেশন প্যাটার্ন এবং V. anguillarum-এর সাথে চ্যালেঞ্জ করা চিংড়িতে প্রোটিন স্তরগুলি একটি থার্মাল সাইক্লারে পরিমাণগত রিয়েল-টাইম PCR (qPCR) ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল (qTOWER3, ANALYTIK JENA AG, Jena, Germany) এবং দ্বারা যথাক্রমে west ern blotting. qPCR পদ্ধতির মধ্যে রয়েছে: 10 মিনিটের জন্য 95˚C; 10 সেকেন্ডের জন্য 95˚C এবং 50 সেকেন্ডের জন্য 60˚C তাপমাত্রায় 40টি চক্র; এবং তারপর 65˚C থেকে 95˚C পর্যন্ত একটি গলে যাওয়ার সময়কাল। Foxo-এর এক্সপ্রেশন প্রো ফাইলগুলি 2-ΔΔCT পদ্ধতি [56] ব্যবহার করে স্বাভাবিককরণের জন্য -actin এবং Ef-1-এর দুটি অভ্যন্তরীণ নিয়ন্ত্রণ জিনের জ্যামিতিক গড় ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল। কিউপিসিআর-এ প্রাইমার জোড়ার কার্যকারিতা MIQE পদ্ধতি অনুসরণ করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল [57] একটি লিনিয়ার স্ট্যান্ডার্ড বক্ররেখা তৈরি করতে একটি সিডিএনএ মিশ্রণের একটি 10-ভাঁজ লগারিদমিক পাতলা করে।

পারমাণবিক এবং সাইটোপ্লাজমিক প্রোটিনের বিচ্ছিন্নতা

অন্ত্রের টিস্যু চিংড়ি থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং পিবিএসে তিনবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। প্রোটিন নিষ্কাশন একটি পারমাণবিক এবং সাইটোপ্লাজমিক প্রোটিন নিষ্কাশন কিট (R0050, Solarbio, Beijing, China) ব্যবহার করে প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসরণ করে করা হয়েছিল। পৃথক পার্থক্য দূর করতে প্রোটিন নিষ্কাশনের জন্য কমপক্ষে তিনটি চিংড়ি ব্যবহার করা হয়েছিল।

আরএনএ হস্তক্ষেপের পরীক্ষা

জিন ফাংশন বিশ্লেষণ করতে, আমরা আরএনএ হস্তক্ষেপ (আরএনএআই) অ্যাসেস সম্পাদন করেছি। T7 প্রোমোটার সিকোয়েন্স সহ কয়েকটি জোড়া প্রাইমার (Foxo-RI-F এবং Foxo-RI-R; Rab5-RI-F এবং Rab5 -RI-R; Rab7-RI- F এবং Rab7 -RI-R; Akt-RI-F এবং Akt-RI-R. টেবিল 1) dsRNA সংশ্লেষণের জন্য টেমপ্লেটগুলিকে প্রশস্ত করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছিল৷ T7 RNA পলিমারেজ (EP0111, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) এবং cDNA টেমপ্লেট ব্যবহার করে, আমরা dsRNA ফ্র্যাগমেন্টগুলিকে সংশ্লেষিত করেছি। ডাবল-স্ট্র্যান্ড গ্রিন ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন dsGfp RNA নিয়ন্ত্রণ হিসাবে কাজ করেছিল, যা dsGfp সংশ্লেষণের জন্য প্রাইমার হিসাবে Gfp-RI-F এবং Gfp -RI-R (টেবিল 1) ব্যবহার করে প্রশস্ত করা হয়েছিল। তারপরে, ডিএসআরএনএ টুকরাগুলি (50 ইউজি/প্রতিটি) একটি মাইক্রোসিরিঞ্জ ব্যবহার করে এম. জাপোনিকাসের পেটের অংশে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল এবং একই ডোজ ব্যবহার করে 12 ঘন্টা পরে একটি দ্বিতীয় ইনজেকশন করা হয়েছিল। আরএনএ হস্তক্ষেপ দক্ষতা পরিমাণগত রিয়েল-টাইম রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন পিসিআর (কিউআরটি-পিসিআর, সিডিএনএ গঠনের জন্য আরএনএর বিপরীত প্রতিলিপি সমন্বিত, যা তখন একটি কিউপিসিআর অ্যাসেতে টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল) বা ওয়েস্টার্ন ব্লটিং 24 ঘন্টা পোস্ট সেকেন্ড ইনজেকশন ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। -অ্যাক্টিন অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।

তথ্যসূত্র

1. Calnan DR, Brunet A. FoxO কোড। অনকোজিন। 2008; 27(16):2276–2288। https://doi.org/10.1038/ onc.2008.21 PMID: 18391970।

2. Tran H, Brunet A, Grenier JM, Datta SR, Fornace AJ, DiStefano PS, et al. Gadd45 প্রোটিনের মাধ্যমে ফর্কহেড ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর FOXO3a দ্বারা ডিএনএ মেরামত পথের উদ্দীপনা। বিজ্ঞান. 2002; 296 (5567):530-534। https://doi.org/10.1126/science.1068712 PMID: 11964479।

3. মার্টিন্স আর, লিথগো জিজে, লিংক ডব্লিউ. লং লাইভ ফক্সো: বার্ধক্য এবং দীর্ঘায়ুতে FOXO প্রোটিনের ভূমিকা উদ্ঘাটন করা। এজিং সেল। 2016; 15(2):196–207। https://doi.org/10.1111/acel.12427 PMID: 26643314।

4. Vogt PK, Jiang H, Aoki M. ট্রিপল লেয়ার কন্ট্রোল-ফসফোরিলেশন, অ্যাসিটাইলেশন এবং FOXO প্রোটিনের সর্বব্যাপীকরণ। কোষ চক্র. 2005; 4(7):908-913। https://doi.org/10.4161/cc.4.7.1796 PMID: 15917664. 5. Daitoku H, Sakamaki J, Fukamizu A. acetylation এবং pro tein-protein interactions দ্বারা FoxO ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর নিয়ন্ত্রণ। বিবিএ-মল সেল রেস. 2011; 1813(11):1954-1960। https://doi.org/10.1016/j bbamcr.2011.03.001 PMID: 21396404।

6. Wang Y, Zhou YM, Graves DT. FOXO ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর: তাদের ক্লিনিকাল তাত্পর্য এবং নিয়ন্ত্রণ। Biomed Res Int. 2014; 2014:1-13। https://doi.org/10.1155/2014/925350 PMID: 24864265।

7. মারফি CT, McCarroll SA, Bargmann CI, Fraser A, Kamath RS, Ahringer J, et al. যে জিনগুলি ক্যানোরহাবডিটিস এলিগানের জীবনকালকে প্রভাবিত করতে DAF-16 এর প্রবাহে কাজ করে। প্রকৃতি। 2003; 424(6946):277– 284. https://doi.org/10.1038/nature01789 PMID: 12845331. 8. Sergi C, Shen F, Liu SM. ইনসুলিন/IGF-1R, SIRT1, এবং FOXOs পথ-হাড় এবং অস্টিওসারকোমার জন্য একটি আকর্ষণীয় মিথস্ক্রিয়া প্ল্যাট ফর্ম। ফ্রন্ট এন্ডোক্রিনোল (লসান)। 2019; 10:93-103। https://doi.org/10। 3389/fendo.2019.00093 PMID: 30881341।

9. ব্রুনেট এ, বনি এ, জিগমন্ড এমজে, লিন এমজেড, জুও পি, হু এলএস, এট আল। Akt ফসফোরিল্যাট দ্বারা কোষের বেঁচে থাকার প্রচার করে এবং একটি কাঁটাচামচ প্রতিলিপি ফ্যাক্টরকে বাধা দেয়। সেল। 1999; 96(6):857–868। https://doi.org/10.1016/ s0092-8674(00)80595-4 PMID: 10102273.

10. Huang H, Regan KM, Wang F, Wang DP, Smith DI, van Deursen JMA, et al. Skp2 টিউমার দমনে FOX01কে বাধা দেয় ইউবিকুইটিন-মধ্যস্থ অবনতির মাধ্যমে। P Natl Acad Sci USA. 2005; 102(5):1649– 1654। https://doi.org/10.1073/pnas.0406789102 PMID: 15668399।

11. Ogg S, Paradis S, Gottlieb S, Patterson GI, Lee L, Tissenbaum HA, et al. ফর্ক হেড ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর ডিএএফ-16 সি. এলিগানসে ইনসুলিনের মতো বিপাকীয় এবং দীর্ঘায়ু সংকেত স্থানান্তর করে। প্রকৃতি। 1997; 389 (6654):994–999। https://doi.org/10.1038/40194 PMID: 9353126।

12. Fink C, Hoffmann J, Knop M, Li Y, Isermann K, Roeder T. Intestinal FoxO সিগন্যালিং ড্রোসোফিলায় মৌখিক সংক্রমণ থেকে বাঁচার জন্য প্রয়োজন। মিউকোসাল ইমিউনল। 2016; 9(4):927-936। https://doi.org/10.1038/mi 2015.112 পিএমআইডি: 26627459।

13. স্পেলবার্গ এমজে, মার এমটি। FOXO ড্রোসোফিলায় আরএনএ হস্তক্ষেপ নিয়ন্ত্রণ করে এবং আরএনএ ভাইরাস সংক্রমণ থেকে রক্ষা করে। P Natl Acad Sci USA. 2015; 112(47):14587–14592। https://doi.org/10.1073/pnas। 1517124112 পিএমআইডি: 26553999।

14. Guo LL, Karpac J, Tran SL, Jasper H. PGRP-SC2 কমেন সাল ডিসবায়োসিস সীমিত করতে এবং আয়ু বাড়াতে অন্ত্রের ইমিউন হোমিওস্ট্যাসিসকে উন্নীত করে। সেল। 2014; 156(1-2):109-122। https://doi.org/10.1016/j.cell.2013.12। 018 পিএমআইডি: 24439372।

15. বেকার T, Loch G, Beyer M, Zinke I, Aschenbrenner AC, Carrera P, et al. সহজাত ইমিউন হোমিওস্টেসিসের ফক্সো-নির্ভর নিয়ন্ত্রণ। প্রকৃতি। 2010; 463(7279):369–373। https://doi.org/10.1038/ nature08698 PMID: 20090753।

16. Seiler F, Hellberg J, Lepper PM, Kamyschnikow A, Herr C, Bischoff M, et al. FOXO ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টরগুলি শ্বাসযন্ত্রের এপিথেলিয়াল কোষে সহজাত ইমিউন মেকানিজম নিয়ন্ত্রণ করে। জে ইমিউনল। 2013; 190(4):1603– 1613। https://doi.org/10.4049/jimmunol.1200596 PMID: 23315071।

17. গ্রেভস ডিটি, মিলোভানোভা টিএন। মিউকোসাল অনাক্রম্যতা এবং FOXO1 ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর। সামনের ইমিউনল। 2019; 10:2530-2541। https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.02530 PMID: 31849924।

18. বুলেট পি, স্টকলিন আর, মেনিন এল। অ্যান্টি-মাইক্রোবিয়াল পেপটাইডস: অমেরুদণ্ডী থেকে মেরুদন্ডী পর্যন্ত। ইমিউনল রেভ. 2004; 198:169-184। https://doi.org/10.1111/j৷{8}}.2004.0124.x PMID: 15199962৷

19. বুচন এন, সিলভারম্যান এন, চেরি এস. ড্রোসোফিলা মেলানোগাস্টারে অনাক্রম্যতা—অণুজীবের স্বীকৃতি থেকে পুরো-জীব শারীরবিদ্যা পর্যন্ত। ন্যাট রেভ ইমিউনল। 2014; 14(12):796–810। https://doi.org/10.1038/nri3763 PMID: 25421701।

20. Hoffmann JA, Reichhart JM. ড্রোসোফিলা সহজাত অনাক্রম্যতা: একটি বিবর্তনীয় দৃষ্টিকোণ। ন্যাট ইমিউনল। 2002; 3(2):121–126। https://doi.org/10.1038/ni0202-121 PMID: 11812988।

21. হাল্টমার্ক ডি. ড্রোসোফিলা অনাক্রম্যতা: পথ এবং নিদর্শন। Curr Opin Immunol. 2003; 15(1):12-19। https:// doi.org/10.1016/s0952-7915(02)00005-5 PMID: 12495727।

22. লি এফএইচ, জিয়াং জেএইচ। চীনে চিংড়ির সহজাত রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা নিয়ে গবেষণায় সাম্প্রতিক অগ্রগতি। ডেভ কম ইমিউনল। 2013; 39(1-2):11-26। https://doi.org/10.1016/j.dci.2012.03.016 PMID: 22484214।

23. সান জেজে, ল্যান জেএফ, ঝাও এক্সএফ, ভাস্তা জিআর, ওয়াং জেএক্স। ডোমেলেস রিসেপ্টরের সাথে একটি সি-টাইপ লেকটিনের কয়েলড-কয়েল ডোমেনের আবদ্ধতা ব্যাকটে রিয়ালের সংক্রমণে চিংড়ির ইমিউন প্রতিক্রিয়াতে সরাসরি JAK/STAT পথকে সক্রিয় করে। পিএলওএস প্যাথগ। 2017; 13(9):e1006626। https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006626 PMID: 28931061।

24. গর্ডন এস. ফ্যাগোসাইটোসিস: একটি ইমিউনোবায়োলজিক প্রক্রিয়া। রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা। 2016; 44(3):463–475। https://doi.org/ 10.1016/j.immuni.2016.02.026 PMID: 26982354।

25. ওয়াং এস, জিয়া পিওয়াই, হুয়াং জিএল, ঝু পিপি, লিউ জে, ইয়ে বিকিউ, এট আল। FoxO1-NK কোষের বিকাশ এবং সহজাত অনাক্রম্যতার জন্য মধ্যস্থতামূলক অটোফ্যাজি প্রয়োজন। ন্যাট কমুন। 2016; 7:11023–11037। https://doi.org/10.1038/ ncomms11023 PMID: 27010363।

26. ডং জি, সং এল, তিয়ান সি, ওয়াং ওয়াই, মিয়াও এফ, ঝেং জে, এট আল। FOXO1 ব্যাকটেরিয়া-প্ররোচিত নিউট্রোফিল কার্যকলাপ নিয়ন্ত্রণ করে। সামনের ইমিউনল। 2017; 8:1088-1102। https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01088 PMID: 28928749।

27. ওয়াং এক্সডাব্লু, ঝাও এক্সএফ, ওয়াং জেএক্স। সি-টাইপ লেকটিন একটি অমেরুদণ্ডী প্রাণীতে হেমোসাইটিক ফ্যাগোসাইটোসিসকে উন্নীত করতে বিটা-ইন্টিগ্রিনের সাথে আবদ্ধ হয়। জে বায়োল কেম। 2014; 289(4):2405–2414। https://doi.org/10.1074/jbc.M113.528885 PMID: 24324258।

28. নরুজিটালব পি, বারুয়া কে, ভ্যানরোম্পে ডি, বসিয়ার পি। চিংড়িকে সংক্রমণের বিরুদ্ধে লড়াই করতে আত্মরক্ষা শেখানো। ট্রেন্ডস বায়োটেকনোল। 2019; 37(1):16-19। https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2018.05.007 PMID: 29914649।

29. Flegel TW. এশিয়ায় চিংড়ি রোগজীবাণুর ঐতিহাসিক উত্থান, প্রভাব এবং বর্তমান অবস্থা। জে ইনভার্টেব্র প্যাথল। 2012; 110(2):166–173। https://doi.org/10.1016/j.jip.2012.03.004 PMID: 22429834।

30. Wang PH, Huang TZ, Zhang XB, He JG. চিংড়িতে অ্যান্টিভাইরাল প্রতিরক্ষা: সহজাত অনাক্রম্যতা থেকে ভাইরাল ইনশনফেক পর্যন্ত। অ্যান্টিভির রেস. 2014; 108:129-141। https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2014.05.013 PMID: 24886688।

31. Obsil T, Obsilova V. FOXO ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক টরসের অন্তর্নিহিত নিয়ন্ত্রণের কাঠামো/ফাংশন সম্পর্ক। অনকোজিন। 2008; 27(16):2263–2275। https://doi.org/10.1038/onc.2008.20 PMID: 18391969।