বোভাইন ভাইরাল ডায়রিয়া ভাইরাস সাবুনিট ভ্যাকসিন E2Fc এবং E2Ft এর মিউকোসাল ইমিউনিটি প্রভাবের মূল্যায়ন

বিমূর্ত:

ওয়ার্ল্ড অর্গানাইজেশন ফর অ্যানিম্যাল হেলথ (OIE) দ্বারা শ্রেণী বি সংক্রামক রোগ হিসাবে শ্রেণীবদ্ধ, বোভাইন ভাইরাল ডায়রিয়া/মিউকোসাল ডিজিজ একটি তীব্র, অত্যন্ত সংক্রামক রোগ যা বোভাইন ভাইরাল ডায়রিয়া ভাইরাস (BVDV) দ্বারা সৃষ্ট। বিভিডিভির বিক্ষিপ্ত রোগ প্রায়শই দুগ্ধ ও গরুর মাংস শিল্পের বিশাল অর্থনৈতিক ক্ষতির কারণ হয়। BVDV প্রতিরোধ ও নিয়ন্ত্রণের উপর আলোকপাত করার জন্য, আমরা স্থগিত HEK293 কোষের মাধ্যমে বোভাইন ভাইরাল ডায়রিয়া ভাইরাস E2 ফিউশন রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিন (E2Fc এবং E2Ft) প্রকাশ করে দুটি অভিনব সাবুনিট ভ্যাকসিন তৈরি করেছি। আমরা ভ্যাকসিনগুলির প্রতিরোধ ক্ষমতাও মূল্যায়ন করেছি। ফলাফলগুলি দেখায় যে উভয় সাবুনিট ভ্যাকসিন বাছুরের মধ্যে একটি তীব্র মিউকোসাল ইমিউন প্রতিক্রিয়া প্ররোচিত করে। যান্ত্রিকভাবে, E2Fc অ্যান্টিজেন-উপস্থাপক কোষে (APCs) Fc রিসেপ্টর (Fc ​​RI) এর সাথে বন্ধন করে এবং IgA ক্ষরণকে উন্নীত করে, যা একটি শক্তিশালী টি-সেল ইমিউন প্রতিক্রিয়ার দিকে পরিচালিত করে (Th1 প্রকার)। মিউকোসাল-ইমিউনাইজড E2Fc সাবুনিট ভ্যাকসিন দ্বারা উদ্দীপিত নিরপেক্ষ অ্যান্টিবডি টাইটার 1:64 এ পৌঁছেছে, যা E2Ft সাবুনিট ভ্যাকসিন এবং ইন্ট্রামাসকুলার ইনঅ্যাক্টিভেটেড ভ্যাকসিনের চেয়ে বেশি। এই গবেষণায় বিকশিত মিউকোসাল অনাক্রম্যতার জন্য দুটি অভিনব সাবুনিট ভ্যাকসিন, E2Fc এবং E2Ft, সেলুলার এবং হিউমারাল অনাক্রম্যতা বৃদ্ধি করে BVDV নিয়ন্ত্রণের জন্য নতুন কৌশল হিসাবে আরও ব্যবহার করা যেতে পারে।

cistanche tubulosa- ইমিউন সিস্টেম উন্নত

মূলশব্দ: BVDV; subunit ভ্যাকসিন; মিউকোসাল টিকা; আণবিক সহায়ক; এফসি রিসেপ্টর; ফেরিটিন

1। পরিচিতি

বর্ডার ডিজিজ ভাইরাস (BDV) এবং সোয়াইন ফিভার ভাইরাস (CSFV) সহ বোভাইন ভাইরাল ডায়রিয়া ভাইরাস (BVDV), ফ্ল্যাভিভিরিডি পরিবারের পেস্টিভাইরাস গণের অন্তর্গত [1]। বাছুরের মধ্যে ক্রমাগত সংক্রমণ (PI) এবং সাইটোপ্যাথিক সংক্রমণের সংমিশ্রণ প্রায়শই গুরুতর শ্লেষ্মাজনিত রোগে পরিণত হয়, মৃত্যুহার 100% [2] পর্যন্ত। তুলনামূলকভাবে উচ্চ অ্যান্টিবডি-পজিটিভ হার সহ BVDV বিশ্বে ব্যাপকভাবে বিতরণ করে। চীনে, প্রচলিত প্রকারগুলি হল 1B, 1M, এবং 1Q টাইপের-1 BVDV [3–5]। ফাইলোজেনেটিক বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে বোভাইন ভাইরাল ডায়রিয়া ভাইরাস টাইপ 1 1960-এর দশকে চীনে আমদানি করা হয়েছিল এবং অন্তত আটটি BVDV-1 জিনোটাইপ চীনে প্রচলিত রয়েছে। তাদের মধ্যে, 1B এবং 1m হল প্রধান জিনোটাইপ [6]। এটি তিব্বতে BVDV-এর আমাদের মহামারী সংক্রান্ত তদন্তের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। BVDV এর গোলাকার virion প্রায় 40-60 nm ব্যাস এবং এটি একটি ক্যাপসুল দ্বারা আবৃত। BVDV-এর একক প্লাস-স্ট্র্যান্ডেড ভাইরাল RNA জিনোমের দৈর্ঘ্য প্রায় 12.5 KB। ভাইরাল পলিপ্রোটিন পরবর্তীতে হোস্ট এবং ভাইরাল প্রোটিজগুলির সংমিশ্রণে চারটি কাঠামোগত (C, E0, E1, E2) এবং আটটি অ-কাঠামোগত (Npro, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) প্রোটিনে বিভক্ত হয় [7, 8]। BVDV-E2 শক্তিশালী ইমিউনোজেনিসিটি ধারণ করে, এবং প্রমাণ দেখায় যে সংক্রামিত প্রাণীদের মধ্যে নিরপেক্ষ অ্যান্টিবডি (NAbs) প্রধানত E2 [9] কে লক্ষ্য করে। এদিকে, BVDV-এর প্রধান সঞ্চালনকারী স্ট্রেনগুলিকে লক্ষ্য করে মাল্টিভ্যালেন্ট E2 সাবুনিট ভ্যাকসিনগুলি সমজাতীয় স্ট্রেনের বিরুদ্ধে আংশিক সুরক্ষা প্রদান করতে পারে। BVDV E2 প্রোটিন এবং বোভাইন হার্পিসভাইরাস 1 (BoHV-1) D প্রোটিন দিয়ে তৈরি একটি রিকম্বিন্যান্ট হারপিসভাইরাস ভ্যাকসিন ইন্ট্রানাসাল নেবুলাইজেশনের পরে হোস্টের উভয় ভাইরাসের জন্য নির্দিষ্ট ইমিউন প্রতিক্রিয়া প্ররোচিত করে [১০]। অতএব, ইমিউনোডোমিন্যান্ট BVDV E2 প্রোটিনকে সাবুনিট ভ্যাকসিন হিসাবে নিযুক্ত করে BVDV নিয়ন্ত্রণ করা একটি ভাল কৌশল হতে পারে। অনুনাসিক গহ্বর লিম্ফোসাইট এবং অ্যান্টিজেন-উপস্থাপক কোষে সমৃদ্ধ, মিউকোসাল ইমিউনাইজেশনের জন্য একটি উপযুক্ত মাইক্রোএনভায়রনমেন্ট প্রদান করে এবং প্রোটিন ভ্যাকসিনগুলিকে অ্যাসিড এবং ক্ষার দ্বারা অস্থিতিশীল হওয়া থেকে রক্ষা করে। এছাড়াও, ইন্ট্রানাসাল ভ্যাকসিন-প্ররোচিত ইমিউনোগ্লোবুলিন এ (আইজিএ) এবং উপরের শ্বাস নালীর আবাসিক স্মৃতি বি এবং টি লিম্ফোসাইটগুলি ভাইরাল প্রতিলিপিকে কার্যকরভাবে ব্লক করতে সক্ষম [১১]। অনুনাসিক গহ্বরের মাধ্যমে ইমিউনাইজেশন শুধুমাত্র মিউকোসাল অনাক্রম্যতাকে প্ররোচিত করে না বরং পদ্ধতিগত অনাক্রম্য প্রতিক্রিয়াকে উদ্দীপিত করে, যা অনাক্রম্য প্রতিরক্ষামূলক প্রভাব ফেলে। পূর্ববর্তী গবেষণায় পাওয়া গেছে যে মিউকোসাল এপিথেলিয়ামের এম কোষের নবজাতক এফসি রিসেপ্টর (এফসিআরএন) এ সাবুনিট ভ্যাকসিনগুলিকে লক্ষ্য করে অ্যান্টিজেনগুলি সম্পূর্ণরূপে মিউকোসাল এপিথেলিয়ামে সরবরাহ করা যেতে পারে, যার ফলে কার্যকরভাবে নির্দিষ্ট ইমিউন প্রতিক্রিয়া [12-14] উদ্দীপিত হয়। অনুনাসিক স্প্রে এর ইমিউনাইজেশন প্রভাবগুলি আণবিক সহায়ক এবং ইমিউন অ্যান্টিজেন [15] এর ফিউশন দ্বারা গঠিত একটি দ্রবণীয় রিকম্বিন্যান্ট ভ্যাকসিন ব্যবহার করে উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নত করা হয়। IgGFc মিউকোসাল পৃষ্ঠের মাধ্যমে IgG পরিবহনে অংশগ্রহণের জন্য ইমিউন কোষের পৃষ্ঠে FcRn-এর সাথে যোগাযোগ করে, স্তন্যপায়ী প্রাণীদের মধ্যে Fc-ফিউজড প্রোটিনের ইমিউনোজেনিসিটি উন্নত করে [16]। IgGFc ফিউশন প্রোটিনগুলি এফসি কব্জা অঞ্চলে ডিসালফাইড বন্ধনের মাধ্যমে স্থিতিশীল ডাইমার গঠন করে বলে রিপোর্ট করা হয়েছে যাতে রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিনের অর্ধ-জীবন এবং স্থিতিশীলতা বৃদ্ধি পায়, তাই সেলুলার, মিউকোসাল এবং হিউমারাল ইমিউন প্রতিক্রিয়া [17,18] উন্নত করে। IgGFc দ্বারা মধ্যস্থতাকৃত অভিনব ভ্যাকসিনগুলি সফলভাবে ইনফ্লুয়েঞ্জা এ ভাইরাস (HA-HuFc) [19] এবং সোয়াইন ফিভার ভাইরাস (CSFV-E2Fc) [20]-এ প্রয়োগ করা হয়েছে।

cistanche tubulosa এর উপকারিতা- ইমিউন সিস্টেমকে শক্তিশালী করা

Cistanche Enhance Immunity পণ্য দেখতে এখানে ক্লিক করুন

【আরো জন্য জিজ্ঞাসা করুন】 ইমেল:cindy.xue@wecistanche.com / Whats অ্যাপ: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

উপযুক্ত পৃষ্ঠ পরিবর্তন ন্যানো পার্টিকেলগুলিকে রক্ত ​​​​সঞ্চালন ব্যবস্থায় স্থিরভাবে বসবাস করতে সক্ষম করে [২১]। একটি বৃহৎ পৃষ্ঠ এলাকা এবং একটি ফাঁপা গোলাকার কাঠামোর দ্বারা চিহ্নিত, ফেরিটিন (Ft) বিভিন্ন ধরনের অভিব্যক্ত ফিউশন প্রোটিনের সাথে স্ব-একত্রিত হয়ে 24টি অভিন্ন পলিপেপটাইডের ন্যানো পার্টিকেল গঠন করে, যা অ্যান্টিজেন-উপস্থাপক কোষ দ্বারা অ্যান্টিজেন সনাক্তকরণ এবং গ্রহণকে উৎসাহিত করে। একটি শক্তিশালী ইমিউন প্রতিক্রিয়া প্ররোচিত করা [22,23]। ফেরিটিন ভ্যাকসিন উন্নয়নে ব্যাপকভাবে প্রয়োগ করা হয়। SARS-CoV-2 স্পাইক প্রোটিনের রিসেপ্টর-বাইন্ডিং ডোমেন (RBD) অ্যান্টিজেনের কোভ্যালেন্ট ইন্টিগ্রেশন এবং স্ব-একত্রিত হেলিকোব্যাক্টর পাইলোরি নন-হিম ফেরিটিনের ফলে নিরপেক্ষ অ্যান্টিবডিগুলির একটি শক্তিশালী উত্পাদন হয়। ফেরিটিন প্রোটিন ন্যানো পার্টিকেলগুলিরও অ্যান্টিজেন স্থিতিশীলতা উন্নত করার, জৈবিক বাধাগুলি অতিক্রম করার এবং লক্ষ্যযুক্ত ডেলিভারি অর্জনের একটি শক্তিশালী ক্ষমতা রয়েছে। যেহেতু ন্যানো-ভ্যাকসিনগুলি ডেনড্রাইটিক কোষ এবং ম্যাক্রোফেজগুলি দ্বারা দক্ষতার সাথে ক্যাপচার করা যায় [২৪], ফেরিটিন ন্যানো পার্টিকেলগুলি অ্যান্টিজেন সরবরাহের জন্য একটি নতুন এবং প্রতিশ্রুতিশীল প্ল্যাটফর্ম। বর্তমানে, BVDV-এর প্রধান উপলভ্য ভ্যাকসিনগুলি হল নিষ্ক্রিয় ভ্যাকসিন এবং সাবইউনিট ভ্যাকসিন, যেগুলির উভয়েরই ইন্ট্রামাসকুলার ইনজেকশন দ্বারা সময়সাপেক্ষ এবং শ্রম-নিবিড় টিকা প্রয়োজন। এদিকে, MDBK কোষের মাধ্যমে উত্পাদিত নিষ্ক্রিয় ভ্যাকসিনগুলি বোভাইন নিওনেটাল প্যানসাইটোপেনিয়া (BNP) [25] প্ররোচিত করার প্রবণতা রয়েছে। যাইহোক, সাবুনিট ভ্যাকসিনগুলি উচ্চতর সুরক্ষা প্রোফাইলগুলি দেখিয়েছে [26]। ইন্ট্রানাসাল ইমিউনাইজেশন এফসি আর রিসেপ্টরের অ্যান্টিজেনকে লক্ষ্য করে দেখানো হয়েছে, যার ফলে মিউকোসাল এবং সিস্টেমিক ইমিউন প্রতিক্রিয়া হয় [15,16]। যাইহোক, BVDV ভ্যাকসিনের সাথে ইন্ট্রানাসাল ইমিউনাইজেশনের ইমিউন প্রভাব এবং আণবিক সহায়ক (IgGFc এবং Ft) এর সাথে মিলিত BVDV-E2 এর কার্যকারিতা খারাপভাবে অধ্যয়ন করা হয়েছে। তাই, BVDV-E2 প্রোটিনের সাথে মিউকোসাল ভ্যাকসিনের বিকাশ তাদের ইমিউন কার্যকারিতা উন্নত করার জন্য এই ক্ষেত্রে একটি শীর্ষ অগ্রাধিকার। বর্তমান গবেষণায়, E2 প্রোটিন-ফিউজড Fc বা Ft সাবুনিট ভ্যাকসিন HEK293 কোষে তৈরি করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি দেখায় যে BVDV E2Fc সাবুনিট ভ্যাকসিনের সাথে নাকের টিকা E2Ft সাবুনিট ভ্যাকসিনের সাথে অনুনাসিক টিকা দেওয়ার চেয়ে বেশি কার্যকর ছিল, আরও ইঙ্গিতগুলিকে সমর্থন করে যে E2Fc ফিউশন প্রোটিন একটি আরও শক্তিশালী সাবুনিট ভ্যাকসিন বিকল্প।

পুরুষদের জন্য cistanche উপকারিতা-প্রতিরোধ ক্ষমতা শক্তিশালী করে

2. ফলাফল

2.1। সাসপেন্ডেড HEK293 কোষে রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিনের প্রকাশ

E2, E2Ft, এবং E2Fc এর কাঠামোগত ডায়াগ্রাম চিত্র 1A এ দেখানো হয়েছে। রিকম্বিন্যান্ট ফিউশন প্রোটিনের ইমিউনো-অভিব্যক্তি যাচাই করার জন্য সংরক্ষিত মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (mAb) BVDVE2 ব্যবহার করে পরোক্ষ ইমিউনোফ্লোরেসেন্স অ্যাসগুলি প্রথমে পরিচালিত হয়েছিল। E2, E2Ft, বা E2Fc জিন ধারণকারী প্লাজমিড দ্বারা স্থানান্তরিত কোষগুলি একটি ফ্লুরোসেন্ট সংকেত নির্গত করে, যখন মক-ট্রিটেড কোষগুলি একটি ফ্লুরোসেন্ট সংকেত প্রদর্শন করে না (চিত্র 1B)। এটি HEK293 কোষে E2, E2Ft এবং E2Fc এর শক্তিশালী অভিব্যক্তি নির্দেশ করে। এই প্রোটিনগুলি সিক্রেটরি প্রকাশ করা হয়েছিল কিনা তা নির্ধারণ করার জন্য, HEK293 কোষের সুপারনাট্যান্টগুলি E2, E2Ft, বা E2Fc জিন ধারণকারী প্লাজমিড দিয়ে স্থানান্তরিত 6 দিন পরে সংগ্রহ করা হয়েছিল। প্রতিটি প্রোটিনের ইমিউনো-এক্সপ্রেশন স্তরগুলি BVDV-E2 অ্যান্টিবডি সহ ওয়েস্টার্ন ব্লট দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি দেখায় যে E2, E2Ft এবং E2Fc এর জিন ধারণকারী প্লাজমিডের সাথে স্থানান্তরিত কোষগুলি যথাক্রমে 45 kDa, 60 kDa এবং 80 kDa এর আণবিক ভরের সাথে সম্পর্কিত প্রোটিন প্রকাশ করে (চিত্র 1C)। SDS-PAGE এবং Coomassie ব্লু স্টেনিং ফলাফলগুলি দেখিয়েছে যে প্রতিটি নমুনার ব্যান্ডগুলি ব্লটিং ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ ছিল (চিত্র 1D)। প্রোটিন ইমিউনো-অভিব্যক্তি সনাক্তকরণের জন্য নির্দিষ্টতা এবং নির্ভুলতা নিশ্চিত করার জন্য, BVDV-E2 mAb-এর প্রাক-শোষণ অ্যাসেগুলি প্রথমে পরিচালিত হয়েছিল এবং তারপরে ভাইরাল রেপ্লিকেশন অ্যাসেস এবং ওয়েস্টার্ন ব্লট দ্বারা BVDV E2 mAb-এর নির্দিষ্টতার সাক্ষ্য দেওয়া হয়েছিল। ফলাফলগুলি প্রকাশ করেছে যে অ্যান্টিবডি শুধুমাত্র BVDV-E2 প্রোটিনের (চিত্র S1) প্রতিক্রিয়া করতে পারে। একসাথে নেওয়া, প্রমাণগুলি দেখায় যে রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিন E2, E2Fc এবং E2Ft HEK293 কোষে প্রচুর পরিমাণে প্রকাশ করা হয়েছিল।

চিত্র 1. HEK293 কোষে E2, E2Ft, এবং E2Fc প্রোটিনের ইমিউনো-অভিব্যক্তি এবং সনাক্তকরণ। (A) BVDV-E2, BVDV-E2Ft, এবং BVDV-E2Fc এর নির্মাণ চিত্র। (B) IFA দ্বারা রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিনের ইমিউনো-অভিব্যক্তি সনাক্তকরণ; E2, E2Fc, বা E2Ft দিয়ে ট্রান্সফেক্ট হওয়ার 48 ঘন্টা পরে, HEK293 কোষগুলি IFA-এর জন্য স্থির করা হয়েছিল। BVDV E2 মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি এবং FITC-ছাগল অ্যান্টি-মাউস আইজিজি যথাক্রমে প্রাথমিক এবং মাধ্যমিক অ্যান্টিবডি হিসাবে প্রয়োগ করা হয়েছিল। নিউক্লিয়াসটি DAPI (নীল) দিয়ে দাগযুক্ত ছিল। স্কেল বার 20 µm প্রতিনিধিত্ব করে। (গ) ওয়েস্টার্ন ব্লট দ্বারা বিশুদ্ধ রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিন সনাক্তকরণ। (D) SDS-PAGE দ্বারা বিশুদ্ধ রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিন সনাক্তকরণ।

2.2। BVDV-E2Fc দ্বারা APC-Fc RI সক্রিয়করণ

ম্যাক্রোফেজ দ্বারা BVDV-E2Fc (E2, E2Ft) এর অ্যান্টিজেন স্বীকৃতি রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা সক্রিয়করণে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। ইমিউন সিস্টেমে ফিউশন প্রোটিনের সক্রিয়করণ প্রভাব সনাক্ত করার জন্য, বোভাইন অ্যালভিওলার ম্যাক্রোফেজ (BAM) দ্বারা ফিউশন প্রোটিনের স্বীকৃতি ফাংশন এবং ফ্যাগোসাইটিক কার্যকলাপ ভিট্রোতে যাচাই করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি দেখায় যে CD64 (Fc RI), সাই3-লেবেলযুক্ত ছাগল-বিরোধী আইজিজি অ্যান্টিবডি (লাল) মার্কার দ্বারা শনাক্ত করা হয়েছিল, এটি বোভাইন ম্যাক্রোফেজে সাইটোপ্লাজম এবং কোষের ঝিল্লিতে স্থানীয়করণ করা হয়েছিল। E2Fc ছাগল-বিরোধী মাউস IgG (সবুজ প্রতিপ্রভ) ব্যবহার করে সনাক্ত করা হয়েছিল। বোভাইন অ্যালভিওলার ম্যাক্রোফেজে (হলুদ রঙ; চিত্র 2A) CD64 (Fc RI) এবং E2Fc-এর সহ-স্থানীয়করণের বিশ্লেষণের জন্য চিত্রগুলি একত্রিত করা হয়েছিল। বিপরীতে, CD64 E2 বা E2Ft এর সাথে সহ-স্থানীয়করণ করেনি। ফলাফলগুলি দেখায় যে মিউকোসাল বাধা জুড়ে E2Fc ফিউশন প্রোটিনের স্থানান্তর Fc RI দ্বারা মধ্যস্থতা করা হয়েছিল।

চিত্র 2. BVDV-E2Fc দ্বারা APC-Fc RI সক্রিয়করণ। (A) BAM-এ E2Fc প্রোটিন সহ CD64 (Fc RI) এর সহ-স্থানীয়করণ বিশ্লেষণ কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল। BAM-তে CD64 (Fc RI) খরগোশ-বিরোধী CD64 এবং Cy{10}}লেবেলযুক্ত ছাগল-বিরোধী খরগোশ আইজিজিকে যথাক্রমে প্রাথমিক এবং মাধ্যমিক অ্যান্টিবডি হিসাবে দাগ দেওয়া হয়েছিল।

ফ্যাগোসাইটোসিস, ম্যাক্রোফেজ দ্বারা কণা গ্রহণ, ফ্যাগোসাইটোসিস হার হিসাবে পরিমাপ করা হয়েছিল। বোভাইন অ্যালভিওলার ম্যাক্রোফেজ দ্বারা FITC-সংযোজিত মাইক্রোস্ফিয়ার, E2 প্রোটিন, E2Ft এবং E2Fc-এর ফ্যাগোসাইটোসিস হার যথাক্রমে 28.9%, 55.6%, 57.1% এবং 65.6%। অন্য কথায়, E2Fc-এর ফ্যাগোসাইটোসিস হার E2Ft-এর তুলনায় বেশি ছিল, যা আরও প্রমাণ করে যে মনোসাইট দ্বারা অ্যান্টিজেন ক্যাপচার করা সম্পূর্ণ হয়েছিল সংশ্লিষ্ট লিগ্যান্ডগুলির সাথে এর পৃষ্ঠে একটি নির্দিষ্ট রিসেপ্টর বাঁধার মাধ্যমে। যাইহোক, বোভাইন অ্যালভিওলার ম্যাক্রোফেজগুলিতে E2 এবং E2Ft প্রোটিনের জন্য কোনও রিসেপ্টর ছিল না এবং তারা শুধুমাত্র ফ্যাগোসাইটোসিসের মাধ্যমে বিদেশী দেহগুলিকে সরিয়ে দেয়, যা শরীরের সবচেয়ে মৌলিক প্রতিরক্ষা পদ্ধতি (চিত্র 2B)।

2.3। ভিভোতে E2Fc দ্বারা প্ররোচিত শক্তিশালী মিউকোসাল এবং হিউমোরাল ইমিউন প্রতিক্রিয়া

বাছুরের টিকাদান পদ্ধতি চিত্র 3A-তে দেখানো হয়েছে। ফিউশন প্রোটিন দিয়ে টিকা দেওয়া বাছুর দ্বারা উত্পাদিত IgA এবং SIgA-এর মাত্রা পরোক্ষ ELISA দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল। সিরাম, মল এবং অনুনাসিক মিউকোসার নমুনাগুলি একটি বাণিজ্যিক ELISA কিট দ্বারা সংগ্রহ এবং সনাক্ত করা হয়েছিল। E2Fc-ইমিউনাইজড গ্রুপ সিরাম এবং মিউকোসাতে IgA এবং SIgA-এর সর্বোচ্চ মাত্রা প্রদর্শন করেছে, উভয় ইন্ট্রামাসকুলারলি এবং মিউকোসাল-ইমিউনাইজড প্রাণীদের মধ্যে (p < 0।{11}}1) (চিত্র 3B, C)। E2- E2-ইমিউনাইজড গ্রুপ এবং E2Ft-ইমিউনাইজড গ্রুপের মধ্যে IgA স্তরে কোনও উল্লেখযোগ্য পার্থক্য পরিলক্ষিত হয়নি, কিন্তু তারা SIgA স্তরে (p <0.05) পার্থক্য করেছিল। উপসংহারে, E2Fc ফিউশন প্রোটিন অন্যান্য প্রোটিনের তুলনায় আরও শক্তিশালী মিউকোসাল এবং হিউমারাল ইমিউন প্রতিক্রিয়া প্ররোচিত করতে সক্ষম হয়েছিল।

2.4। E2Fc ভিভোতে E2Ft-এর তুলনায় BVDV-এর বিরুদ্ধে শক্তিশালী টি-সেল ইমিউন প্রতিক্রিয়া (Th1 প্রকার) প্ররোচিত করতে পারে

Th{{0}} প্রকার সাইটোকাইন IFN- T কোষ এবং NK কোষ দ্বারা প্রকাশ করা সেলুলার অনাক্রম্যতা মধ্যস্থতা করে, যা ভাইরাস ক্লিয়ারেন্সের জন্য অপরিহার্য। বাছুরের মধ্যে IFN-এক্সপ্রেসিং CD4+ এবং CD8+ T কোষের বিতরণ শনাক্ত করতে, টিকা দেওয়ার 35 দিনের পরে বাছুরের পিবিএমসি থেকে লিম্ফোসাইটগুলি আলাদা করা হয়েছিল। লিম্ফোসাইটগুলিকে নিষ্ক্রিয় BVDV দিয়ে উদ্দীপিত করা হয়েছিল, এবং পরবর্তীতে IFN- -সিক্রেটিং সিডি4+ এবং CD8+ টি কোষগুলি সনাক্ত করতে প্রবাহ সাইটোমেট্রি প্রয়োগ করা হয়েছিল। E2Fc এবং E2Ft সহ মিউকোসা-ইমিউনাইজড গ্রুপগুলি E2 গ্রুপের তুলনায় IFN- -সিক্রেটিং সিডি4+ এবং সিডি8+ টি কোষের উল্লেখযোগ্যভাবে উচ্চ অনুপাত প্রদর্শন করে। যে গ্রুপটিকে E2Fc দিয়ে মিউকোসা-ইমিউনাইজ করা হয়েছিল তাদের IFN- -সিক্রেটিং সিডি3+ প্রাপ্ত সিডি8+ টি কোষের উচ্চ স্তর ছিল নিষ্ক্রিয় BVDV (p < 0.05) (চিত্র) দিয়ে টিকা দেওয়া গ্রুপের তুলনায় 4)। যাইহোক, মিউকোসা-ইমিউনাইজড E2Fc এবং নিষ্ক্রিয় BVDV সহ গোষ্ঠীগুলির মধ্যে IFN- -সিডি3+ প্রাপ্ত সিডি4+ টি কোষের গোপনীয়তার কোনও উল্লেখযোগ্য পার্থক্য পরিলক্ষিত হয়নি। সংক্ষেপে, E2Fc এর সাথে ইন্ট্রামাসকুলার ইনজেকশন এবং মিউকোসাল ইমিউনাইজেশন উভয়ই E2Ft-এর তুলনায় BVDV-এর বিরুদ্ধে শক্তিশালী টি-সেল ইমিউন প্রতিক্রিয়া (Th1 প্রকার) প্ররোচিত করে।

চিত্র 3. বাছুরের টিকাদান পরীক্ষাগুলি ভিভোতে E2Fc দ্বারা প্ররোচিত ফ্লো চার্ট এবং মিউকোসাল এবং হিউমারাল ইমিউন প্রতিক্রিয়া। (A) BVDV সাবইউনিট ভ্যাকসিন নির্মাণ এবং বাছুরের ইমিউনাইজেশন পরীক্ষার ফ্লো চার্ট। (B, C) ELISA দ্বারা সেকেন্ডারি ইমিউনাইজেশনের পরে 14 তম দিনে সংগৃহীত অনুনাসিক সোয়াব, মল এবং সিরাম নমুনায় (B) IgA এবং (C) সেক্রেটরি IgA স্তরের পরিমাপ। n=5, * p < 0৷{6}}5, এবং ** p < 0.01

চিত্র 4. ভিভোতে BVDV-এর বিরুদ্ধে টি-সেল ইমিউন প্রতিক্রিয়া। বোভাইন পেরিফেরাল রক্তের মনোনিউক্লিয়ার কোষে উদ্দীপনার পর (A) CD4+ IFN- + T কোষ এবং (B) CD8+ IFN- + T কোষের শতাংশ। n=5, * p < 0৷{9}}5, ** p < 0৷{13}}1, *** p < 0.001, এবং ** ** পি <0.0001।

2.5। রিকম্বিন্যান্ট সাবুনিট ভ্যাকসিনের সাথে টিকাদান থ1-টাইপ সাইটোকাইনের সামগ্রী বাড়ায়

সেলুলার ইমিউন প্রতিক্রিয়ার উপর রিকম্বিন্যান্ট সাবুনিট ভ্যাকসিনের প্রভাব যাচাই করতে, আমরা ইমিউনাইজড বাছুরের পেরিফেরাল রক্তে লিম্ফোসাইট এবং সাইটোকাইন বিস্তারের মাত্রা বিশ্লেষণ করেছি। প্রথমত, টিকা দেওয়ার 49 দিন পরে বাছুর থেকে অ্যান্টিকোয়াগুল্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল। লিম্ফোসাইটগুলি বিভাজনের পরে অতিবেগুনী-নিষ্ক্রিয় BVDV দ্বারা উদ্দীপিত হয়েছিল, এবং সম্পর্কযুক্ত সূচকগুলি পরিমাপ করা হয়েছিল। পিবিএস গ্রুপের সাথে তুলনা করে, সাবুনিট ভ্যাকসিন (E2, E2Fc, এবং E2Ft) দিয়ে টিকা দেওয়া গ্রুপগুলির লিম্ফোসাইট স্টিমুলেশন ইনডেক্স (SI) সবগুলিই বিভিন্ন ডিগ্রীতে বাড়ানো হয়েছিল, সর্বোচ্চ লিম্ফোসাইট স্টিমুলেশন সূচক (p < 0}। 001) E2Fc-ইমিউনাইজড এবং নিষ্ক্রিয় ভ্যাকসিন গ্রুপে (চিত্র 5A)। এছাড়াও, বাণিজ্যিক ডাবল অ্যান্টিবডি স্যান্ডউইচ ELISA কিটগুলি বোভাইন IFN-, IL-2, এবং IL-4-এর বিরুদ্ধে Th1- এবং Th2-টাইপ সাইটোকাইন স্তর সনাক্ত করতে প্রয়োগ করা হয়েছিল ইমিউনাইজড বাছুরের পেরিফেরাল রক্ত। পিবিএস-চিকিত্সা করা বাছুরের সাথে তুলনা করে, IFN- এবং IL-2-এর মাত্রা ইমিউনাইজ করা বাছুরগুলিতে প্রকাশিত IL-4 থেকে 49 দিনের পোস্ট-ইমিউনাইজেশনে উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল। IFN- এর মাত্রা নিষ্ক্রিয় ভ্যাকসিন গ্রুপের তুলনায় IN-E2Fc গ্রুপে বেশি ছিল (p <0.05), কিন্তু IM-E2Fc এবং IL-2 এবং IL-4-এর মধ্যে কোনও পার্থক্য ছিল না নিষ্ক্রিয় ভ্যাকসিন গ্রুপ (চিত্র 5B-D)। এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে IN-E2Fc সাবইউনিট ভ্যাকসিন বাছুরের মধ্যে Th1-টাইপ সেলুলার ইমিউন প্রতিক্রিয়াকে উল্লেখযোগ্যভাবে প্রচার করেছে।

চিত্র 5. রিকম্বিন্যান্ট সাবুনিট ভ্যাকসিনের সাথে টিকা দেওয়ার পরে Th1-টাইপ সাইটোকাইনের বিষয়বস্তু বৃদ্ধি পায়। (A) টিকা দেওয়ার 49 দিন পরে বাছুরের পেরিফেরাল রক্তের লিম্ফোসাইটের কোষের বিস্তার লিম্ফোসাইট প্রসারণ অ্যাস কিট দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল। (B–D) লিম্ফোসাইট সুপারন্যাট্যান্টের Th1 এবং Th2 সাইটোকাইনগুলি বোভাইন IFN-, IL-2, IL-4 ডাবল-অ্যান্টিবডি স্যান্ডউইচ ELISA কিট দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল৷ n=5, * p < {{10}}৷{14}}5, ** p < 0.01, এবং *** p < 0৷{15}}

2.6। বিভিডিভি-নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডিগুলি ভিভোতে রিকম্বিন্যান্ট E2Ft এবং E2Fc সাবুনিট ভ্যাকসিন দ্বারা দৃঢ়ভাবে প্ররোচিত হতে পারে

E2, E2Ft, এবং E2Fc সাবুনিট ভ্যাকসিন দ্বারা প্ররোচিত হিউমারাল ইমিউন প্রতিক্রিয়া অন্বেষণ করার জন্য ELISA দ্বারা BVDV-নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি সনাক্ত করা হয়েছিল। BVDV-নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডিগুলি টিকা দেওয়ার আগে সমস্ত বাছুরের মধ্যে সনাক্ত করা যায়নি। E2Ft এবং E2Fc সাবইউনিট ভ্যাকসিন দ্বারা প্ররোচিত অ্যান্টিবডিগুলির মাত্রা ইমিউনাইজেশনের সূচনা (প্রথম ডোজ) এর 21 দিন পর E2 গ্রুপের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল (p < 0৷{17}}0 1)। 35 দিন (দ্বিতীয় ডোজ পরে 14 দিন পরে) এবং 49 দিন (তৃতীয় ডোজের 14 দিন পরে) মিউকোসাল অনাক্রম্যতার জন্য অ্যান্টিবডি স্তরগুলি E2Ft এবং E2 গ্রুপগুলির মধ্যে উল্লেখযোগ্যভাবে পৃথক ছিল (p <0.05)। উপরন্তু, E2Fc উল্লেখযোগ্যভাবে E2 (p <0.001) এর চেয়ে বেশি ছিল। মিউকোসাল ইমিউনাইজেশন গ্রুপের (IN-E2Ft এবং IN-E2Fc গ্রুপ) অ্যান্টিবডি স্তর ইন্ট্রামাসকুলার ইনজেকশন গ্রুপের (IM-E2Ft এবং IM-E2Fc গ্রুপ) থেকে বেশি ছিল এবং নিষ্ক্রিয় ভ্যাকসিন গ্রুপের অ্যান্টিবডি স্তর উল্লেখযোগ্যভাবে ছিল না। IN-E2Fc গ্রুপের থেকে আলাদা (চিত্র 6)। একসাথে নেওয়া, রিকম্বিন্যান্ট E2Ft এবং E2Fc সাবুনিট ভ্যাকসিনগুলি শক্তিশালী হিউমারাল ইমিউন প্রতিক্রিয়া প্ররোচিত করতে সক্ষম হয়েছিল, এবং মিউকোসাল ইমিউনিটি ইন্ট্রামাসকুলার ইনজেকশনের তুলনায় উচ্চতর ছিল, যা নির্দেশ করে যে রিকম্বিন্যান্ট E2Fc এবং E2Ft সাবুনিট ভ্যাকসিনগুলি অত্যন্ত অ্যান্টিজেনিক।

চিত্র 6. ইমিউনাইজেশনের পরে 0, 21, 35, এবং 49 তারিখে ELISA দ্বারা ইমিউনাইজড বাছুরের সিরাম নমুনায় অ্যান্টিবডি সনাক্তকরণ। n=5, * p < 0৷{8}}5 এবং *** p < 0.001

2.7। ভিভোতে রিকম্বিন্যান্ট সাবুনিট ভ্যাকসিন দ্বারা প্ররোচিত BVDV-এর বিরুদ্ধে অ্যান্টিবডিগুলিকে নিরপেক্ষ করা

প্রথম টিকা দেওয়ার পর 0, 21, 35 এবং 49 দিন বাছুরের জগুলার শিরা থেকে রক্তের নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল। সিরামের নমুনাগুলি 56 ◦C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য জলের স্নানে নিষ্ক্রিয়ভাবে পৃথক করা হয়েছিল। বিচ্ছিন্ন সিরামে অ্যান্টিবডি স্তর নির্ধারণের জন্য নিরপেক্ষকরণ অ্যাসেগুলি পরিচালিত হয়েছিল। BVDV-এর বিরুদ্ধে নিরপেক্ষ অ্যান্টিবডিগুলি 1:64 পর্যন্ত E2Fc নিরপেক্ষ অ্যান্টিবডির টাইটার সহ রিকম্বিন্যান্ট সাবুনিট ভ্যাকসিন সহ মিউকোসাল-ইমিউনাইজড গ্রুপে সনাক্ত করা হয়েছিল। এটি নিষ্ক্রিয় ভ্যাকসিনের সাথে তুলনীয় এবং ইন্ট্রামাসকুলারলি ইনজেক্ট করা E2Ft এবং E2Fc রিকম্বিন্যান্ট সাবুনিট ভ্যাকসিনের চেয়ে ভাল (চিত্র 7)।

চিত্র 7. টিকা দেওয়ার পরে 0, 21, 35, এবং 49 তারিখে ইমিউনাইজড বাছুরের সিরাম নমুনাগুলিতে নিরপেক্ষ অ্যান্টিবডি সনাক্তকরণ। নিষ্ক্রিয় সিরামের নমুনাগুলি 1 ঘন্টার জন্য 200 TCID50 BVDV XZ02 দিয়ে অনুপাত মিশ্রিত এবং প্রি-ইনকিউব করা হয়েছিল৷ সিরাম নমুনাগুলি পরবর্তীতে কূপ প্লেটে 96- কোষে যোগ করা হয়েছিল এবং 72 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল৷ খরগোশের অ্যান্টি-ই 2 অ্যান্টিবডি এবং এফআইটিসি-সংযুক্ত ছাগল অ্যান্টি-রবিট আইজিজি প্রাথমিক এবং মাধ্যমিক অ্যান্টিবডি হিসাবে নিযুক্ত করা হয়েছিল। n=5, * p < 0.05, এবং ** p < 0.01

3. আলোচনা

এটি রিপোর্ট করা হয়েছে যে স্তন্যপায়ী কোষে প্রকাশিত E2 প্রোটিন ব্যাকুলোভাইরাস ইনসেক্ট এক্সপ্রেশন সিস্টেম (brE2) [27] থেকে প্রাপ্ত E2 প্রোটিনের তুলনায় BVDV-এর বিরুদ্ধে সুরক্ষা নিরপেক্ষ করতে বেশি কার্যকর। স্তন্যপায়ী কোষের সাসপেনশন সংস্কৃতি একটি সহজ প্রক্রিয়া এবং উচ্চ ফলন দ্বারা চিহ্নিত করা হয় [২৮]। স্থগিত HEK293 কোষগুলি সিরাম-মুক্ত অবস্থার অধীনে বৃদ্ধি পেতে সক্ষম, এবং কোষের সংখ্যা অনুগত সংস্কৃতির তুলনায় বহুগুণ বেশি, যা অ্যান্টিবডিগুলির বড় আকারের উত্পাদনের জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে [২৯]। এই গবেষণায় প্রয়োগ করা ইউক্যারিওটিক সাসপেনশন সেল ট্রানজিয়েন্ট এক্সপ্রেশন সিস্টেমের সাথে মিলিত pcDNA3.1-এর এক্সপ্রেশন দক্ষতা তুলনামূলকভাবে বেশি ছিল, এবং রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিন 30 mg·L −1 পর্যন্ত ঘনত্ব সহ ট্রান্সফেকশন-পরবর্তী ছয় দিন সংগ্রহ করা যেতে পারে। পরবর্তী প্রাণী প্রয়োগের জন্য যথেষ্ট ছিল।

cistanche tubulosa- ইমিউন সিস্টেম উন্নত

বোভাইন ভাইরাল ডায়রিয়া ভাইরাস প্রধানত উপরের শ্বাস নালীর এবং পরিপাকতন্ত্রে আক্রমণ করে, যার ফলে রাইনোরিয়া, কাশি, শ্বাসকষ্ট, শরীরের তাপমাত্রা বৃদ্ধি এবং লিউকোপেনিয়া হয় এবং ভাইরাসটি রক্তে প্রবেশ করার পরে এটি viremia দ্বারা অনুসরণ করে। অতএব, ইনহেলড ইন্ট্রানাসাল ভ্যাকসিনেশন ভাইরাস সংক্রমণের সাইটগুলিতে সরাসরি সরবরাহ করা ভ্যাকসিনের চেয়ে আরও কার্যকর সুরক্ষা প্রদান করতে পারে। সম্প্রতি, এটি দেখানো হয়েছে যে ইন্ট্রানাসাল ইমিউনাইজেশন এফসি আর রিসেপ্টরগুলিতে অ্যান্টিজেন উপস্থাপন করতে পারে এবং মিউকোসাল এবং পদ্ধতিগত ইমিউন প্রতিক্রিয়া প্রকাশ করতে পারে [16]। অধিকন্তু, বোভাইন IgG1Fc বোভাইন Fc R, IgG [30]-এর জন্য একটি উচ্চ-সম্পর্কযুক্ত রিসেপ্টরকে আবদ্ধ করতে সক্ষম ছিল। আমাদের ফলাফলগুলি প্রমাণ দিয়েছে যে বোভাইন আইজিজি 1 থেকে এফসি ট্রান্সমিউকোসাল পরিবহন অর্জনের জন্য বোভাইন অ্যালভিওলার ম্যাক্রোফেজেস (বিএএম) এ এফসি RI এর সাথে আবদ্ধ হতে পারে। এটি শরীরে ফিউশন প্রোটিনের দীর্ঘায়ুকে দীর্ঘায়িত করতে পারে এবং নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডিগুলির উত্পাদনকে উন্নীত করতে পারে। আমাদের ফলাফল প্রকাশ করেছে যে মিউকোসাল-ইমিউনাইজড E2Fc দ্বারা প্ররোচিত SIgA-এর মাত্রা মিউকোসাল-ইমিউনাইজড E2 (p < 0৷{30}}1) এর তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল৷ যাইহোক, ইন্ট্রামাসকুলার-ইনজেক্টেড E2Fc গ্রুপ এবং মিউকোসাল-ইমিউনাইজড E2 গ্রুপের মধ্যে শুধুমাত্র একটি ছোট পার্থক্য পরিলক্ষিত হয়েছিল। এটি এই কারণে ঘটতে পারে যে ছোট অন্ত্রের মিউকোসা এবং মেসেন্টেরিক লিম্ফ নোড উভয়ই 1313VG এর সাথে E2Fc এর সাথে ইন্ট্রামাসকুলার ইনজেকশনের প্রতিক্রিয়া হিসাবে একটি ক্ষুদ্র পরিমাণ SIgA মুক্ত করবে। E2Fc এর সাথে মিউকোসা-ইমিউনাইজেশনের মাধ্যমে IFN-এর মাত্রাগুলি E2 (p <0.01), E2Fc-এর সাথে ইন্ট্রামাসকুলার ইমিউনাইজেশন এবং E2Ft-এর সাথে মিউকোসাল ইমিউনাইজেশনের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল। E2Fc এর সাথে মিউকোসা-ইমিউনাইজেশনের মাধ্যমে IL-2 এর মাত্রাগুলি E2 এর সাথে মিউকোসাল ইমিউনাইজেশন এবং E2Ft (p <0.01) এর সাথে ইন্ট্রামাসকুলার ইমিউনাইজেশনের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল। পরের ধাপে, তৃতীয় টিকা দেওয়ার পরে সামগ্রিক অ্যান্টিবডি স্তর সনাক্ত করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি দেখায় যে E2Fc এর সাথে মিউকোসাল ইমিউনাইজেশন E2 (p <0.001) এর সাথে মিউকোসাল ইমিউনাইজেশনের তুলনায় সামগ্রিক অ্যান্টিবডিগুলির উল্লেখযোগ্যভাবে উচ্চ স্তরে প্ররোচিত করেছে, যেখানে ইন্ট্রামাসকুলারলি ইনজেকশন করা E2Fc এবং মিউকোসাল ইমিউনাইজড E2 দ্বারা প্ররোচিত অ্যান্টিবডি স্তরগুলি E2F এর সাথে তুলনীয় ছিল। দল E2Fc সাবুনিট ভ্যাকসিনের মিউকোসাল ইমিউনাইজেশনের সামগ্রিক ইমিউন প্রভাবগুলি ইন্ট্রামাসকুলার ইমিউনাইজেশনের তুলনায় উচ্চতর ছিল। E2Fc-এর মিউকোসাল ইমিউনাইজেশন শুধুমাত্র SIgA এর ক্ষরণকে প্ররোচিত করে না বরং নির্দিষ্ট থ

এটি রিপোর্ট করা হয়েছিল যে ফেরিটিন ন্যানোকেজের পৃষ্ঠে প্রদর্শিত CSFV E2 গ্লাইকোপ্রোটিন খরগোশের সহজাত ইমিউন সাইটোকাইন IL-4 এবং IFN-এর শক্তিশালী অভিব্যক্তিকে প্ররোচিত করে [31]। SARS-CoV-2 এর রিসেপ্টর বাইন্ডিং ডোমেন (RBD) এর সাথে স্ব-একত্রিত ফেরিটিনকে সমন্বিতভাবে আবদ্ধ করে একটি ন্যানো পার্টিকেল ভ্যাকসিনও একটি শক্তিশালী হিউমারাল এবং সেলুলার ইমিউন প্রতিক্রিয়া [24] প্রকাশ করতে প্রমাণিত হয়েছিল। অনুনাসিক গহ্বর মিউকোসা-সম্পর্কিত লিম্ফয়েড টিস্যুতে সমৃদ্ধ, এবং আমরা দেখিয়েছি যে মিউকোসাল-ইমিউনাইজড E2Ft দ্বারা প্ররোচিত SIgA স্তরগুলি E2 এর চেয়ে বেশি ছিল (p < 0৷{19}}5)৷ CD4+ এবং CD8+ T কোষগুলি E2 গ্রুপের তুলনায় মিউকোসাল-ইমিউনাইজড E2Ft গ্রুপে উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল (p <0.01)। CD4+ এবং CD8+ টি কোষ ভাইরাল সংক্রমণের বিরুদ্ধে প্রতিরক্ষায় গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে [৩২]। নিরপেক্ষকরণ পরীক্ষা এবং অ্যান্টিবডি অ্যাসের ফলাফলগুলিও দেখায় যে E2Ft-এর সাথে মিউকোসাল ইমিউনাইজেশন ইন্ট্রামাসকুলার E2Ft এবং E2 এর টিকা দেওয়ার চেয়ে বেশি কার্যকর ছিল। এটি সম্ভবত ছিল কারণ জীবের অ্যান্টিজেন সনাক্তকরণ এবং উপস্থাপনা ব্যবস্থা কার্যকরভাবে ফ্যাগোসাইটোসড ফেরিটিন (E2Ft) 24 সাবইউনিট পলিমার সহ, যার ফলে ভিভোতে একটি সংবেদনশীল এবং কার্যকর অ্যান্টিবডি প্রতিক্রিয়া দেখা দেয়। অ্যান্টিবডিগুলি রক্তরস কোষ দ্বারা নিঃসৃত হয় এবং অ্যান্টিবডির মাত্রা নিরপেক্ষ করা ইমিউন প্রভাব সনাক্তকরণের জন্য একটি গুরুত্বপূর্ণ সূচক। যখন BVDV ভ্যাকসিনের নিরপেক্ষ অ্যান্টিবডি ক্ষমতা 1:24-এর বেশি হয়, তখন এটি নির্দেশ করে যে ভ্যাকসিনটি ইমিউনোজেনিক [33]।

এই গবেষণায়, E2 রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিন দ্বারা প্ররোচিত নিরপেক্ষ অ্যান্টিবডি স্তরের মূল্যায়ন করার জন্য নিরপেক্ষকরণ অ্যাসেস করা হয়েছিল। অতএব, সিরামে আইজিজি অ্যান্টিবডির মাত্রা সনাক্ত করতে ইমিউনাইজড বাছুরের জগুলার শিরাস্থ রক্ত ​​সংগ্রহ করা হয়েছিল। ফলাফলগুলি দেখায় যে সমস্ত টিকা দেওয়া বাছুর দ্বিতীয় টিকা দেওয়ার 14 দিনের মধ্যে বিভিন্ন মাত্রার নিরপেক্ষ অ্যান্টিবডি তৈরি করে। মিউকোসাল-ইমিউনাইজড E2Fc গ্রুপ এবং নিষ্ক্রিয় ভ্যাকসিন গ্রুপের বাছুরের মধ্যে নিরপেক্ষ অ্যান্টিবডির মাত্রা উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে এবং তৃতীয় টিকা দেওয়ার 14 দিন পর 1:64-এ রয়ে গেছে (ষষ্ঠ সপ্তাহ পর্যন্ত নিরপেক্ষ অ্যান্টিবডি টাইটারগুলি সনাক্ত করা হয়েছিল)। যাইহোক, এটি লক্ষণীয় যে মিউকোসাল-ইমিউনাইজড E2 এবং E2Ft এবং ইন্ট্রামাসকুলার-ইমিউনাইজড E2Fc এবং E2Ft গ্রুপগুলির নিরপেক্ষ অ্যান্টিবডি স্তরগুলি 1:8 এবং 1:16 এর মধ্যে বজায় রাখা হয়েছিল। আমরা অনুমান করি যে E2Fc রিকম্বিন্যান্ট ভ্যাকসিনের অ্যান্টিজেনগুলি Fc রিসেপ্টর দ্বারা ধীরে ধীরে মুক্তি পায়, তাই দীর্ঘায়িত হিউমারাল এবং সেলুলার ইমিউন প্রতিক্রিয়া সৃষ্টি করে। বিপরীতে, অন্য চারটি সাবুনিট ভ্যাকসিন একটি সংশ্লিষ্ট রিসেপ্টরের অভাবের কারণে খুব শীঘ্রই শরীরে অবস্থান করে। তাই, প্রত্যাশিত ইমিউন প্রভাব অর্জনের জন্য একটি বুস্টার টিকা বা সহায়ক পরিবর্তনের প্রয়োজন হতে পারে।

পুরুষদের জন্য cistanche উপকারিতা-প্রতিরোধ ক্ষমতা শক্তিশালী করে

4. উপকরণ এবং পদ্ধতি

4.1। ভাইরাস এবং কোষ

টাইপ 1b BVDV XZ02 স্ট্রেন (GenBank Accession number: MF278652) তিব্বত থেকে বিচ্ছিন্ন ছিল এবং Madin-Darby বোভাইন কিডনি কোষ (MDBK) ব্যবহার করে সংস্কৃতি করা হয়েছিল। পোরসিন মহামারী ডায়রিয়া ভাইরাস (PEDV) আমাদের পরীক্ষাগারে সংরক্ষিত ছিল। MDBK কোষগুলি ATCC (ATCC- CCL-22) থেকে কেনা হয়েছিল এবং DMEM (Cat NO. SH302403.01, HyClone, Shanghai, China) এ রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল এবং RPMI তে বোভাইন অ্যালভিওলার ম্যাক্রোফেজ কোষগুলি (BAM) রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল৷ {8}} (Cat NO. SH30027, Cytiva, Shanghai, China); সমস্ত মাধ্যমগুলিতে 10% তাপ-নিষ্ক্রিয় ঘোড়ার সিরাম রয়েছে (বিড়াল নং 16050122, জিবকো, কার্লসব্যাড, CA, USA,) এবং 5% CO2 সহ একটি আর্দ্রতাযুক্ত ইনকিউবেটরে 37 ◦C তাপমাত্রায় ইনকিউব করা হয়েছিল৷ সাসপেন্ড করা HEK293 সেলগুলি ATCC (ATCC CRL-1573) থেকে কেনা হয়েছিল এবং একটি সিরাম-মুক্ত KOP293 মাধ্যমের (Cat NO. M21201121A, KAIRUI -biotech, Zhuhai, China) মধ্যে সংস্কৃত করা হয়েছিল৷

4.2। অ্যান্টিবডি এবং টেস্ট কিট

এই গবেষণায় নিম্নলিখিত অ্যান্টিবডি এবং টেস্ট কিটগুলি ব্যবহার করা হয়েছিল: অ্যান্টি-BVDV E2 অ্যান্টিবডি (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK); HRP-ছাগল অ্যান্টি-মাউস অ্যান্টিবডি (Cat NO. ab205719, Abcam, Cambridge, UK); সাই3-ছাগল অ্যান্টি-মাউস অ্যান্টিবডি (বিড়াল নম্বর AS008, ABclonal, Boston, MA, USA); FITC-ছাগল অ্যান্টি-মাউস অ্যান্টিবডি (Cat NO. ab150117, Abcam, Cambridge, UK); CD64 (Fc RI) অ্যান্টিবডি (Cat NO. abs135850, Absin, Shanghai, China); Alexa Fluor® 488 ছাগল এন্টি-মাউস IgG অ্যান্টিবডি (Cat NO. ab150113, Abcam, Cambridge, UK); সাই3-ছাগল অ্যান্টি-রবিট আইজিজি অ্যান্টিবডি (বিড়াল নম্বর ab6939, Abcam, Cambridge, UK); FITC সংযোজিত মাইক্রোস্ফিয়ার (Cat NO. 17155, Polysciences, Warrington, PA, USA); FITC-CD4 অ্যান্টিবডি (Cat NO. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, CA, USA); PE-CD8 অ্যান্টিবডি (Cat NO. MCA837, BIO-RAD, Hercules, CA, USA); IFN- অ্যান্টিবডি (Cat NO. MCA1783A, BIORAD, Hercules, CA, USA); FITC-ছাগল বিরোধী- খরগোশ IgG অ্যান্টিবডি (বিড়াল নম্বর AS011, ABclonal, Boston, MA, USA)। কিট এবং রিএজেন্টগুলির মধ্যে রয়েছে BVDV-E2 অ্যান্টিবডি সনাক্তকরণ কিট (Cat NO. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., LTD, Shanghai, China); IgA সনাক্তকরণ কিট (Cat NO. 177090b, CAMILO, Nanjing, China); SIgA সনাক্তকরণ কিট (Cat NO.177053b, CAMILO, Nanjing, China); IFN- সনাক্তকরণ কিট (Cat NO. 177020b, CAMILO, Nanjing, China); IL-2 সনাক্তকরণ কিট (বিড়াল নম্বর 177028b, CAMILO, Nanjing, China); IL-4 সনাক্তকরণ কিট (বিড়াল নম্বর 1770131b, CAMILO, Nanjing, China); TA-293 ট্রান্সফেকশন রিএজেন্ট (Cat NO. R21203107A, KAIRUI biotech, Zhuhai, China); লিম্ফোসাইট বিচ্ছেদ মাধ্যম (Cat NO. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, USA)।

4.3। প্লাজমিড নির্মাণ

TMHMM ওয়েব টুল (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ 12-এ অ্যাক্সেস করা) ব্যবহার করে E2 এর ট্রান্সমেমব্রেন অঞ্চল (জিন সিকোয়েন্স অ্যাকসেশান নম্বর: MF278652) সরিয়ে দিয়ে ছেঁটে যাওয়া E2 (এখন থেকে E2 হিসেবে চিহ্নিত) তৈরি করা হয়েছে। জানুয়ারী 2023) এবং সি-টার্মিনাসে একটি হিস্টিডিন ট্যাগ যুক্ত করা হচ্ছে (চিত্র 1A)। জিনের ক্রমটি পরিপূরক উপাদান S1 এ দেখানো হয়েছে। E2Fc প্লাজমিড E2-এর সি-টার্মিনালে ই2- সিন্থেটিক নমনীয় পেপটাইড-কবজা অঞ্চলের অর্ডিন্যাল অবস্থানের সাথে বোভাইন IgG1 (অ্যাক্সেশন নম্বর: x62916.1) এর কব্জা অঞ্চল ধারণকারী একটি Fc খণ্ড যুক্ত করে তৈরি করা হয়েছিল -CH2-CH3 ডোমেন-6 × তার [20]। জিনের ক্রমটি পরিপূরক উপাদান S2 এ দেখানো হয়েছে। E2Ft প্লাজমিড E2 কে হেলিকোব্যাক্টর পাইলোরি ফেরিটিন (অবশিষ্ট 5-167) লিঙ্কার (Gly)3Ser [34] এর মাধ্যমে সংযুক্ত করে তৈরি করা হয়েছিল। জিনের ক্রমটি পরিপূরক উপাদান S3 এ দেখানো হয়েছে। IL-2 সিগন্যাল পেপটাইডকে E2, E2Fc, এবং E2Ft-এর N-টার্মিনালে যোগ করা হয়েছিল যাতে সিক্রেটরি এক্সপ্রেশনের সুবিধা হয় [35]। লক্ষ্য জিনগুলি (E2, E2Ft, এবং E2Fc) যথাক্রমে BamHI এবং XhoI এর সাথে pcDNA3.1 এ ক্লোন করা হয়েছিল।

4.4। প্রোটিন এক্সপ্রেশন এবং পরিশোধন

সূচকীয় পর্যায়ে প্রায় 10{{30}} মিলি স্থগিত HEK293 কোষ (প্রায় 2~4 × 106 কোষ/mL) সংশ্লিষ্ট প্লাজমিডের সাথে স্থানান্তরিত হয়েছিল। সংক্ষেপে, 5ml KPM (ট্রান্সফেকশন বাফার) এবং 100 µg জীবাণুমুক্ত প্লাজমিড ডিএনএ একটি জীবাণুমুক্ত সেন্ট্রিফিউজ টিউবে যোগ করা হয়েছিল, এবং 5 mL KPM এবং 500 μL TA-293 (Cat NO. R21203107A, biotech, Zhuhai, China ) ট্রান্সফেকশন রিএজেন্টগুলি অন্য জীবাণুমুক্ত সেন্ট্রিফিউজ টিউবে যুক্ত করা হয়েছিল। তারপরে, একটি পাতলা ট্রান্সফেকশন রিএজেন্ট মিশ্রিত প্লাজমিডে যোগ করা হয়েছিল এবং পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে মিশ্রিত করা হয়েছিল। ঘরের তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য ইনকিউবেশনের পরে, কোষগুলিতে একটি ডিএনএ-ট্রান্সফেকশন রিএজেন্ট কমপ্লেক্স যুক্ত করা হয়েছিল, যার সাথে কাঁপুনি ছিল। 140 rpm/মিনিটের কম্পন গতিতে 5% CO2 সহ 37 ◦C তাপমাত্রায় একটি আর্দ্রতাযুক্ত ইনকিউবেটরে কোষগুলিকে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। 12,000 rpm/মিনিটে 30 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে কোষগুলিকে ট্রান্সফেকশনের পরে ছয় দিনের জন্য সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং অবশিষ্ট কোষের ধ্বংসাবশেষ অপসারণের জন্য 0.22 মিমি ফিল্টার দিয়ে ফিল্টার করা হয়েছিল। নিকেল অ্যাফিনিটি ক্রোমাটোগ্রাফি কলামগুলি (বিড়াল নম্বর 17531801, জিই, বোস্টন, এমএ, ইউএসএ) হিস্টিডিন (তার) E2, E2Ft এবং E2Fc প্রোটিনের ট্যাগযুক্ত অ্যাফিনিটি পরিশোধনের জন্য নিযুক্ত করা হয়েছিল [36]। সংক্ষেপে, 1 মিলি/মিনিট হারে অ্যাফিনিটি কলামে 100 mL নমুনা যোগ করা হয়েছিল। কলামগুলি পরবর্তীতে 1 মিলি/মিনিট হারে বাফার A (0.1 M PBS, 300 mM NaCl, 5 mM) এর পাঁচটি কলাম ভলিউম (CV) দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। অবশেষে, ইমিডাজলের ঘনত্ব গ্রেডিয়েন্ট (0 থেকে 500 মিমি পর্যন্ত) 1 মিলি/মিনিট হারে কলামের মধ্য দিয়ে প্রবাহিত হতে দেওয়া হয়েছিল প্রধান শিখরের সাথে সম্পর্কিত তরল সংগ্রহ করতে। বিসিএ প্রোটিন সনাক্তকরণ কিট দিয়ে প্রোটিনের ঘনত্বের পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল। সংগৃহীত প্রোটিনগুলি পশ্চিমা ব্লট বিশ্লেষণের জন্য আরও ব্যবহার করা হয়েছিল।

cistanche উদ্ভিদ-বৃদ্ধি প্রতিরোধ ক্ষমতা

4.5। পশ্চিম ফোঁটার

SDS-PAGE ব্যবহার করে প্রোটিন আলাদা করা হয়েছিল। NC ফিল্টার মেমব্রেনে স্থানান্তরিত হওয়ার পর, প্রোটিনগুলিকে 2% স্কিমড মিল্ক পাউডার দিয়ে রাতারাতি 4 ◦C তাপমাত্রায় অবরুদ্ধ করা হয়েছিল এবং পরবর্তীতে ঘরের তাপমাত্রায় 2 ঘন্টার জন্য অ্যান্টি-BVDV E2 অ্যান্টিবডি (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK) দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। . টিবিএস-টি দিয়ে তিনবার ধোয়ার পর, ঝিল্লিগুলিকে এইচআরপি-ছাগলের অ্যান্টি-মাউস (বিড়াল নম্বর ab205719, Abcam, Cambridge, UK) অ্যান্টিবডি দিয়ে ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘণ্টার জন্য ধূসরিত করা হয়েছিল। টিবিএস-টি দিয়ে তিনবার ধোয়ার পর, ইসিএল কেমিলুমিনেসেন্স সিস্টেম প্রোটিন ইমিউনো-অভিব্যক্তি সনাক্ত করতে নিযুক্ত করা হয়েছিল।

4.6। পরোক্ষ ইমিউনোফ্লোরেসেন্স

রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিনের ইমিউনো-অভিব্যক্তির ইমিউনোফ্লুরোসেন্স সনাক্তকরণের জন্য, HEK293 কোষগুলি E2, E2Ft এবং E2Fc প্রকাশকারী প্লাজমিড দ্বারা স্থানান্তরিত হয়েছিল; স্থানান্তরের 48 ঘন্টা পরে, কোষগুলি 15 মিনিটের জন্য প্যারাফর্মালডিহাইড দিয়ে স্থির করা হয়েছিল। পিবিএস দিয়ে তিনবার ধোয়ার পর, কোষগুলিকে 15 মিনিটের জন্য 0.5% Trition-X100 দিয়ে প্রবেশ করানো হয়েছিল। PBS এর সাথে একটি নিবিড় ধোয়ার পরে, কোষগুলিকে পরবর্তীতে 2% BSA দিয়ে ব্লক করা হয়েছিল এবং 1:500 মিশ্রিত BVDV E2 মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (আমাদের পরীক্ষাগারে প্রস্তুত) 37 ◦C তাপমাত্রায় 2 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল। Cy3 (Cat NO. AS008, ABclonal, Boston, MA, USA) বা FITC-সংযোজিত ছাগলের অ্যান্টি-মাউস অ্যান্টিবডি (Cat NO. ab150117, Abcam, Cambridge, UK) সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি হিসাবে প্রয়োগ করা হয়েছিল৷ কক্ষ তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য DAPI দিয়ে নিউক্লিয়াস দাগযুক্ত ছিল। প্রোটিনগুলি কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি (LSM 510, Zeiss, Oberkochen, Germany) দ্বারা কল্পনা করা হয়েছিল [37]।

4.7। E2Fc রিকম্বিন্যান্ট ফিউশন প্রোটিনের APC-টার্গেটিং

বোভাইন অ্যালভিওলার ম্যাক্রোফেজ (বিএএম) এ এফসি আরআই-তে BVDV-E2Fc ফিউশন প্রোটিনের আবদ্ধতা নিশ্চিত করতে ইমিউনোফ্লোরেসেন্স কোলোকালাইজেশন বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, 3 µg বিশুদ্ধ E2, E2Ft, বা E2Fc বোভাইন অ্যালভিওলার ম্যাক্রোফেজে যোগ করা হয়েছিল। 37 ◦C তাপমাত্রায় 12 ঘন্টা ইনকিউবেশনের পরে, কোষগুলিকে ফসফেট-বাফারযুক্ত স্যালাইনে (PBS) 0.1% BSA দিয়ে ধুয়ে 20 ◦ এ মিথানল/এসিটোন (1:1) দিয়ে স্থির করা হয়েছিল। গ. কোষগুলিকে পরবর্তীতে 0.5% Trition-X100 দিয়ে 15 মিনিটের জন্য ব্যাপ্ত করা হয়েছিল এবং 2% BSA দিয়ে 37 ◦C তাপমাত্রায় 2 ঘন্টার জন্য ব্লক করা হয়েছিল। তারপরে, কোষগুলিকে পিবিএস দিয়ে তিনবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং 2-এর জন্য BVDV E2 মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (মাউসের উত্স; আমাদের পরীক্ষাগারে প্রস্তুত) এবং বোভাইন CD64 (Fc RI) পলিক্লোনাল অ্যান্টিবডি (Cat NO. abs135850, Absin, Shanghai, China) দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। জ. কোষগুলিকে পিবিএস দিয়ে তিনবার ধুয়ে আলেক্সা ফ্লুর® 488 ছাগল অ্যান্টি-মাউস আইজিজি (বিড়াল নম্বর ab150113, অ্যাবক্যাম, ক্যামব্রিজ, ইউকে) এবং সাই3-লেবেলযুক্ত ছাগল অ্যান্টি-র্যাবিট আইজিজি অ্যান্টিবডি (বিড়াল নম্বর) দিয়ে ঢেকে দেওয়া হয়েছিল। ab6939, Abcam, Cambridge, UK) ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য। নিউক্লিয়াস DAPI দিয়ে দাগযুক্ত ছিল। ইমিউনোফ্লোরেসেন্স কোলোকালাইজেশন (LSM 880, Zeiss, Oberkochen, Germany) ব্যবহার করে ছবিগুলি তোলা হয়েছিল।

4.8। বোভাইন অ্যালভিওলার ম্যাক্রোফেজগুলির ফ্যাগোসাইটিক হার নির্ধারণ

বোভাইন অ্যালভিওলার ম্যাক্রোফেজ (BAM) এর ফ্যাগোসাইটোসিসে রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিন E2, E2Ft এবং E2Fc-এর প্রভাব নির্ধারণ করতে, 1 × 106টি কোষ/mL এর ঘনত্বে বোভাইন অ্যালভিওলার ম্যাক্রোফেজগুলি রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিনের সাথে প্রাক-ইনকিউবেট করা হয়েছিল। 4 ঘন্টার জন্য E2, E2Ft, বা E2Fc (সমস্ত ঘনত্ব 350 ng/mL এ সামঞ্জস্য করা হয়েছিল)। PBS দিয়ে তিনবার ধোয়ার পর, প্রতিটি কূপে 10 μL FITC-সংযোজিত মাইক্রোস্ফিয়ার (Cat NO. 17155, Polysciences, Warrington, PA, USA) এবং 990 μL RPMI-1640 মিডিয়াম যোগ করা হয়েছিল . ইনকিউবেশনের 2 ঘন্টা পরে, বহিরাগত FITC-সংযুক্ত মাইক্রোস্ফিয়ারগুলি অপসারণ করতে পিবিএস দিয়ে কোষগুলি ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। অনুগত ম্যাক্রোফেজগুলি 0.05% ইডিটিএ ধারণকারী ট্রিপসিন (জিবকো) দিয়ে হজম করা হয়েছিল এবং সম্পূর্ণ হজমের পরে 1640 সম্পূর্ণ মাধ্যম দিয়ে হজম বন্ধ করা হয়েছিল। তারপরে কোষগুলিকে 0.45 গ্রাম গ্লুকোজ এবং 0.3 গ্রাম বিএসএ সহ 10 মিলি পিবিএস-এর উপরের স্তরে যুক্ত করা হয়েছিল, তারপরে 10 মিনিটের জন্য 400 × g এ গ্রেডিয়েন্ট সেন্ট্রিফিউগেশন করা হয়েছিল। পৃথক কোষগুলি পিবিএস দিয়ে দুবার ধুয়ে এবং 800 μL পিবিএস দিয়ে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল। 488 এনএম এ ফ্লুরোসেন্সের তীব্রতা বেকম্যান ফ্লো সাইটোমিটার (MoFloAstrios EQ, BECKMAN, Pasadena, CA, USA) দ্বারা নির্ধারিত হয়েছিল।

4.9। ভ্যাকসিন প্রস্তুতি এবং ইমিউনাইজেশন পদ্ধতি

HEK{{0}}প্রকাশিত E2, E2Ft, এবং E2Fc 200 μg/mL এর চূড়ান্ত প্রোটিনের ঘনত্বের সমান অনুপাতে IMS 1313VG অ্যাডজুভেন্ট (Seppic, France) দিয়ে ইমালসিফাইড করা হয়েছিল এবং 4 ◦C-তে সংরক্ষণ করা হয়েছিল মান পরিদর্শন. BVDV-E0 এবং BVDV-E2 অ্যান্টিবডি-নেগেটিভ (Cat NO. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) 3-মাস বয়সী বাছুর (n=35) ছিল সাতটি সমান দলে বিভক্ত। চারটি গ্রুপের বাছুর যথাক্রমে PBS, E2, E2Ft এবং E2Fc সহ অনুনাসিক-মিউকোসাল ইমিউনাইজড (ইন) ছিল। বাকি তিনটি গ্রুপের বাছুরগুলিকে ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে E2Ft, E2Fc, এবং BVDV নিষ্ক্রিয় ভ্যাকসিন দিয়ে ইন্ট্রামাসকুলারলি ইনজেকশন (im) দেওয়া হয়েছিল (Cat NO. 202002003, Huaweit, Jiangsu, China)। পরীক্ষার 1, 21 এবং 35 দিনে বাছুরকে টিকা দেওয়া হয়েছিল এবং প্রতিটি বাছুরকে 200 µg/mL প্রোটিন ঘনত্ব সহ 1 mL টিকা দিয়ে টিকা দেওয়া হয়েছিল। অন্যান্য সূচকের জন্য পরীক্ষার 1, 21, 35 এবং 49 দিনে বাছুর থেকে রক্ত ​​সংগ্রহ করা হয়েছিল (চিত্র 3A)। সমস্ত পরীক্ষামূলক প্রোটোকল কলেজ অফ ভেটেরিনারি মেডিসিন, হুয়াজং এগ্রিকালচারাল ইউনিভার্সিটি, হুবেই, চীন (নং HZAUCA-2022-0011) এর গবেষণা নীতিশাস্ত্র কমিটি দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল৷

4.10। মল এবং সিরামে IgA উৎপাদন

সেকেন্ডারি ইমিউনাইজেশনের পরে 14 দিনে বাছুরের অনুনাসিক সোয়াব, মল এবং সিরাম নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল। তাজা গরুর মল PBS এর সাথে 15% মল সাসপেনশনে মিশ্রিত করা হয়েছিল, সাসপেনশনটি 18,000×g 4 ◦C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং পরবর্তী ব্যবহারের জন্য সুপারনাট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল। গরুর অনুনাসিক গহ্বরের গভীরে 6-8 বার ঘুরিয়ে জীবাণুমুক্ত তুলার সোয়াব ঘোরানোর মাধ্যমে অনুনাসিক সোয়াবগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল। 1% পেনিসিলিন-স্ট্রেপ্টোমাইসিন সমন্বিত একটি পিবিএস টিউবে সোয়াবগুলি রাখা হয়েছিল এবং ব্যাপকভাবে মিশ্রিত করা হয়েছিল। নমুনাগুলিকে 18,000× g 4 ◦C তাপমাত্রায় 10 মিনিটের জন্য কেন্দ্রীভূত করা হয়েছিল, এবং পরবর্তী ব্যবহারের জন্য সুপারনাট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল। বোভাইন রক্তের নমুনাগুলি একটি ইথিলেনেডিয়ামিনেটেট্রাসেটিক অ্যাসিড (EDTA)--অ্যান্টিকোয়াগুল্যান্ট টিউব ধারণকারী দিয়ে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং রক্তের নমুনাগুলিকে 5 মিনিটের জন্য 4 ◦C এবং 400 গ্রাম সেন্ট্রিফিউজ করে সিরামের নমুনাগুলি প্রাপ্ত করা হয়েছিল৷ IgA (Cat NO. 177090b, CAMILO, Nanjing, China) এবং SIgA নির্মাতার নির্দেশ অনুসারে ELISA কিট (Cat NO.177053b CAMILO, Nanjing, China) দিয়ে সনাক্ত করা হয়েছে৷

4.11। ফ্লো সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণ

রক্তে CD3+ লিম্ফোসাইটের মধ্যে IFN- -CD3+ CD4+ এবং CD3+ CD8+ T কোষ তৈরির ফ্রিকোয়েন্সি ছিল প্রবাহ সাইটোমেট্রি ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়। বুস্টার টিকা দেওয়ার 14 দিন পরে নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল [36]। পেরিফেরাল ব্লাড মনোনিউক্লিয়ার সেল (PBMC) পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং সম্পূর্ণ RPMI-1640 মাঝারি সহ 1 × 106 কোষ/mL তে পাতলা করা হয়েছিল, UV- নিষ্ক্রিয় BVDV XZ02 (MOI=0.1) দিয়ে উদ্দীপিত, এবং 37 এ ইনকিউব করা হয়েছিল ◦C 5% CO2 সহ 72 ঘন্টার জন্য। কনকানাভালিন A (Con A) (5 µg/mL; সিগমা) একটি ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। প্রোটিন ট্রান্সপোর্ট ইনহিবিটর ব্রেফেলডিন A (BFA, 3 µg/mL, eBioscience) IFN- নিঃসরণকে ব্লক করার জন্য কোষ সংগ্রহের 12 ঘন্টা আগে সমস্ত নমুনায় যোগ করা হয়েছিল। কোষের 200 μL পরিমাণ FCM টিউবে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল এবং অন্ধকারে 4 ◦C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য FITC-লেবেলযুক্ত CD4 অ্যান্টিবডি (Cat NO. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল। পিবিএস দিয়ে তিনবার ধোয়ার পরে, কোষগুলিকে আর-পিই-লেবেলযুক্ত CD8 অ্যান্টিবডি (বিড়াল নম্বর MCA837, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। তিনবার ধোয়ার পর, কোষগুলিকে মাউস অ্যান্টি-বোভাইন IFN- অ্যান্টিবডি (Cat NO. MCA1783A, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) দিয়ে 20 মিনিটের জন্য অন্ধকারে ইন্ট্রাসেলুলার সাইটোকাইন স্টেনিংয়ের জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল। ধোয়ার পরে, 1% FBS সমন্বিত পিবিএস-এ কোষগুলি পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল। ফ্লো সাইটোমেট্রি এফএসিএস ক্যালিবার ফ্লো সাইটোমিটার (বিডি বায়োসায়েন্সেস, ফ্র্যাঙ্কলিন লেকস, এনজে, ইউএসএ) দিয়ে পরিচালিত হয়েছিল এবং পূর্বে বর্ণিত হিসাবে ডেটা সংগ্রহ ও বিশ্লেষণ করা হয়েছিল [38]।

4.12। লিম্ফোসাইট বিস্তার এবং সাইটোকাইন সনাক্তকরণ

প্রতিটি বাছুরের অ্যান্টিকোয়াগুলেটেড পেরিফেরাল ব্লাড মনোনিউক্লিয়ার সেল (পিবিএমসি) একটি লিম্ফোসাইট সেপারেশন মাধ্যম (বিড়াল নম্বর RNBJ9540, SIGMA, সেন্ট লুইস, MO, USA) টিকা দেওয়ার পরে 49 দিনে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। বোভাইন পেরিফেরাল রক্তের লিম্ফোসাইটগুলিকে 10% FBS 1640 মাঝারি থেকে 1 × 106 কোষ/mL দিয়ে পাতলা করা হয়েছিল। তারপর, 100 μL মিশ্রিত কোষ একটি কূপ প্লেটের প্রতিটি কূপে যোগ করা হয়েছিল এবং যথাক্রমে UV- নিষ্ক্রিয় BVDV, কনকানাভালিন (পজিটিভ কন্ট্রোল), অথবা কালচার মিডিয়াম (নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ) দিয়ে উদ্দীপিত হয়েছিল। 5% CO2 সহ 37 ◦C তাপমাত্রায় 72 ঘন্টা ইনকিউবেশনের পর, প্রতিটি কূপে 30 µL MTS যোগ করা হয়েছিল, এবং প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে কোষগুলি 1 ঘন্টার জন্য 37 ◦C তাপমাত্রায় সংষ্কৃত হতে থাকে। 492 এনএম এ শোষণ একটি স্বয়ংক্রিয় মাইক্রোপ্লেট বিশ্লেষক দিয়ে পরিমাপ করা হয়েছিল। প্রতিটি নমুনার লিম্ফোসাইট বিস্তার টাইটার উদ্দীপনা সূচক (এসআই) দ্বারা নির্ধারিত হয়েছিল। গণনা করা SI=(খালি নিয়ন্ত্রণের নমুনা-OD-এর OD)/(শূন্য নিয়ন্ত্রণের ঋণাত্মক নমুনার-OD-এর OD) [৩৯]। ইন্টারফেরন (IFN)- , interleukin (IL)-2, এবং interleukin (IL)-4 ELISA কিট ব্যবহার করে শনাক্ত করা হয়েছে৷ সংক্ষেপে, PBMC গুলিকে বিচ্ছিন্ন করে 4 × 106 কোষ/mL-এ RPMI 1640 মাধ্যম সহ 10% FBS ধারণ করে এবং 24-ওয়েল টিস্যু কালচার প্লেটে স্থাপন করা হয়েছিল। 37 ◦C তাপমাত্রায় 48 ঘন্টার জন্য নিষ্ক্রিয় BVDV XZ02 (MOI=1) দিয়ে কোষগুলিকে উদ্দীপিত করা হয়েছিল, এবং পরবর্তীকালে সুপারনাট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল। IFN- (Cat NO. 177020b, CAMILO, Nanjing, China), IL-2 (Cat NO. 177028b, CAMILO, Nanjing, China), এবং IL-4 (Cat NO. 1770131b, CAMILO, নানজিং, চীন) স্তরগুলি প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে সংশ্লিষ্ট ELISA কিটগুলি ব্যবহার করে সনাক্ত করা হয়েছিল নমুনায় IFN- , IL-2, এবং IL-4 এর বিষয়বস্তু স্ট্যান্ডার্ড কার্ভ ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল৷

4.13। সেরোলজিক্যাল পরীক্ষা

E2/E0 অ্যান্টিবডি শনাক্ত করতে, টিকা দেওয়ার পর 0, 21, 35 এবং 49 দিনে প্রতিটি বাছুর থেকে রক্তের নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল। 20 মিনিটের জন্য 1000 × g এ রক্তের নমুনা কেন্দ্রীভূত করে সিরাম নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল। BVDV E2 অ্যান্টিবডি সনাক্তকরণ কিট (Cat NO. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) এর প্রয়োজনীয়তা অনুসারে সিরাম নমুনাগুলি প্রক্রিয়া করা হয়েছিল৷ BVBV E2 অ্যান্টিজেনের সাথে প্রলিপ্ত মাইক্রোপ্লেটগুলি ঘরের তাপমাত্রায় 20 মিনিটের জন্য ভারসাম্যপূর্ণ ছিল। তারপরে, মাইক্রোপ্লেটে যথাক্রমে 50 μL নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ, ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ এবং সিরাম নমুনা যোগ করা হয়েছিল। হর্সরাডিশ পেরোক্সিডেস (HRP)-লেবেলযুক্ত শনাক্তকরণ অ্যান্টিবডির 50 µL পরিমাণ পরবর্তীতে মাইক্রোপ্লেটে যোগ করা হয়েছিল এবং 60 মিনিটের জন্য 37 ◦C তাপমাত্রায় ইনকিউব করা হয়েছিল। ওয়াশিং বাফার দিয়ে পাঁচবার ধোয়ার পর, প্রতিটি ইমিউনাইজেশন গ্রুপে E2 অ্যান্টিবডির মাত্রা নির্ধারণ করতে 450 এনএম-এ মাইক্রোপ্লেট রিডারের শোষণ পরিমাপ করার জন্য একটি ক্রোমোজেনিক দ্রবণ যোগ করা হয়েছিল। সিরাম নমুনাগুলির নিরপেক্ষ অ্যান্টিবডি স্তর সনাক্ত করার জন্য নির্দিষ্ট ভাইরাস তরল সিরাম পদ্ধতিটি নিযুক্ত করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, সম্পূর্ণ নিষ্ক্রিয় ইমিউন সিরামের নমুনাগুলি 2−1 থেকে 2−12 দ্বারা পাতলা করা হয়েছিল, এবং প্রতিটি পাতলা টাইটারে 50 µL সিরাম যোগ করা হয়েছিল 96-ওয়েল প্লেটে। পরবর্তীকালে, প্রতিটি কূপে 200 টিসিআইডি50- BVDV XZ02 ভাইরাস ধারণকারী 50 μL মিশ্রিত ভাইরাস দ্রবণ যোগ করা হয়েছিল। প্লেট আলতো করে ঝাঁকান এবং মিশ্রিত করা হয়. 37 ◦C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টা ইনকিউবেশনের পর, 5 × 105 কোষ/mL ঘনত্বের MDBK কোষগুলিকে 96-ওয়েল প্লেটে যোগ করা হয়েছিল এবং 72 ঘন্টার জন্য 5% CO2 সহ একটি আর্দ্রতাযুক্ত ইনকিউবেটরে 37 ◦C তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করা হয়েছিল৷ সিরাম নমুনাগুলির নিরপেক্ষ প্রভাব সনাক্ত করার জন্য, কোষগুলিকে প্রাথমিক অ্যান্টিবডি হিসাবে E{40}}নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK) এবং FITC-সংযুক্ত ছাগল-বিরোধী খরগোশ আইজিজিকে সেকেন্ডারি হিসাবে বিবেচনা করা হয়েছিল। অ্যান্টিবডি, (Cat NO. AS011, ABclonal, Boston, MA, USA)। একটি সাধারণ সবুজ ফ্লুরোসেন্ট সংকেত নিরপেক্ষকরণের অনুপস্থিতি নির্দেশ করে। ফটোগ্রাফগুলি একটি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের অধীনে নেওয়া হয়েছিল (TE2000, নিকন, টোকিও, জাপান)। সিরাম নিউট্রালাইজেশন টাইটার রিড-মুয়েঞ্চ পদ্ধতি অনুসারে গণনা করা হয়েছিল এবং সিরামের সর্বাধিক তরলকরণ যা সম্পূর্ণরূপে ফ্লুরোসেন্সকে বাধা দিতে পারে তা সিরামের নিরপেক্ষকরণ টাইটার হিসাবে নির্ধারিত হয়েছিল।

4.14। BVDV E2 মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডির নির্দিষ্টতা সনাক্তকরণ

BVDV E2 মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডির প্রাক-শোষণ অ্যাসগুলি প্রথমে পরিচালিত হয়েছিল, তারপরে BVDV E2 mAb-এর নির্দিষ্টতা প্রমাণ করার জন্য ভাইরাল রেপ্লিকেশন অ্যাসেস এবং ওয়েস্টার্ন ব্লট দ্বারা অনুসরণ করা হয়েছিল। ভাইরাল রেপ্লিকেশন অ্যাস এর জন্য, BVDV-এর 400 টিসিআইডি50 যথাক্রমে 1 ঘন্টার জন্য 37 ◦C-তে PBS এবং 100 µg বা 200 µg E2 mAb এর সাথে প্রাক-ইনকিউবেটেড ছিল। ইনকিউবেশনের পরে, প্রাক-চিকিত্সা করা BVDV কে MDBK কোষে টিকা দেওয়া হয়েছিল এবং কোষগুলিকে একটি আর্দ্র ইনকিউবেটরে 37 ◦C তাপমাত্রায় সংষ্কৃত করা হয়েছিল। কোষগুলি 18 বা 24 এইচপিআই (ঘন্টা পোস্ট-ইনফেকশন) এ সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং TRIZOL বিকারক দিয়ে আরএনএ বের করা হয়েছিল। BVDV E2 জিনের আপেক্ষিক অভিব্যক্তি নির্ধারণ করতে RT-qPCR পরিচালিত হয়েছিল। ওয়েস্টার্ন ব্লট অ্যাসের জন্য, E2 mAb যথাক্রমে 4 ◦C তাপমাত্রায় 2 ঘন্টার জন্য Tween20, PEDV S প্রোটিন, বা TBS-T-তে BVDV E2 প্রোটিনের সাথে প্রাক-ইনকিউবেটেড ছিল। BVDV E2 বা PEDV S প্রোটিনের প্রতিক্রিয়া সনাক্ত করতে প্রাথমিক অ্যান্টিবডি হিসাবে প্রাক-চিকিত্সা করা E2 mAb কে ওয়েস্টার্ন ব্লট অ্যাস করা হয়েছিল।

4.15। পরিসংখ্যান সংক্রান্ত বিশ্লেষণ

সমস্ত বিশ্লেষণের জন্য পরিসংখ্যানগত প্রোগ্রাম গ্রাফপ্যাড প্রিজম ব্যবহার করা হয়েছিল। টু-টেইল আনপেয়ারড টি-টেস্ট ডেটা বিশ্লেষণ করতে এবং p মান তৈরি করতে ব্যবহার করা হয়েছিল (*, p < 0৷{4}}5; **, p < 0৷{{ 8}}1; ***, p < 0.001, **** p < 0.0001)। যেখানে অন্যথায় উল্লেখ করা হয়েছে তা ছাড়া, ডেটা গড় ± SD হিসাবে দেখানো হয়।

5। উপসংহার

আমাদের গবেষণায়, তিনটি রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিন, BVDV-E2, BVDV-E2Ft এবং BVDV-E2Fc প্রকাশ করা হয়েছিল, এবং সংশ্লিষ্ট সাবুনিট ভ্যাকসিন তৈরি করা হয়েছিল। ভিভো পরীক্ষায় দেখা গেছে যে E2Fc সাবুনিট ভ্যাকসিন E2Ft এবং E2 এর চেয়ে বেশি কার্যকর ছিল, উভয় মিউকোসাল এবং ইন্ট্রামাসকুলার ইমিউনাইজেশনে। আমরা নিশ্চিত করেছি যে মিউকোসাল-ইমিউনাইজড E2Fc এবং E2Ft দ্বারা প্ররোচিত নিরপেক্ষ অ্যান্টিবডি টাইটারগুলি যথাক্রমে 1:64 এবং 1:16 ছিল, আরও ইঙ্গিত করে যে E2Fc ট্রান্সমিউকোসাল পরিবহন অর্জনের জন্য বোভাইন অ্যালভিওলার ম্যাক্রোফেজে Fc RI এর সাথে বন্ধন করেছে। BVDV-এর প্রধান মহামারী স্ট্রেনের মাল্টিভ্যালেন্ট E2Fc সাবুনিট ভ্যাকসিনের মিউকোসাল টিকা ইমিউন প্রভাবকে উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নত করেছে এবং এটি ব্যবহারিক ব্যবহারের জন্য উপযুক্ত। আমাদের অধ্যয়ন একটি মিউকোসাল ভ্যাকসিন নিযুক্ত করে সময়-সাপেক্ষ এবং শ্রম-নিবিড় প্রচলিত টিকা দেওয়ার একটি সমাধান প্রদান করে। BVDV E2 প্রোটিন হল অ্যান্টিবডি নিরপেক্ষ করার জন্য একটি আদর্শ লক্ষ্য, এবং এই গবেষণায় নির্মিত E2Fc এবং E2Ft ফিউশন প্রোটিনগুলি BVDV সংক্রমণের বিরুদ্ধে নিরাপদ এবং কার্যকর সাবুনিট ভ্যাকসিন হিসাবে আরও প্রয়োগ করা হবে বলে আশা করা হচ্ছে।

তথ্যসূত্র

1. Truyers, IG; মেলোর, ডিজে; নরকুয়ে, আর.; গুন, জিজে; এলিস, অর্কনি 2001 থেকে 2008 পর্যন্ত বোভাইন ভাইরাল ডায়রিয়া ভাইরাসের জন্য কেএ নির্মূল কর্মসূচি। Rec. 2010, 167, 566–570। [ক্রসরেফ]

2. পিটারহ্যান্স, ই.; Schweizer, M. BVDV: একটি পেস্টিভাইরাস সহনশীলতা সহনশীলতা প্রতিরোধী প্রতিক্রিয়া. জীববিজ্ঞান 2013, 41, 39-51। [ক্রসরেফ]

3. ঝং, এফ.; লি, এন.; হুয়াং, এক্স।; গুও, ওয়াই.; চেন, এইচ.; ওয়াং, এক্স।; শি, সি.; ঝাং, এক্স। পশ্চিম চীনে বোভাইন ভাইরাল ডায়রিয়া ভাইরাসের জেনেটিক টাইপিং এবং এপিডেমিওলজিক পর্যবেক্ষণ। ভাইরাস জিন 2011, 42, 204-207। [ক্রসরেফ]

4. ডেং, ওয়াই.; শান, টিএল; টং, ডব্লিউ.; ঝেং, এক্সসি; গুও, ওয়াইওয়াই; ঝেং, এইচ.; কাও, এসজে; ওয়েন, এক্সটি; টং, জিজেড একটি বোভাইন ভাইরাল ডায়রিয়া ভাইরাসের জিনোমিক বৈশিষ্ট্য 1 সোয়াইন থেকে বিচ্ছিন্ন। খিলান। ভাইরল। 2014, 159, 2513–2517। [ক্রসরেফ] [পাবমেড]

5. ডেং, ওয়াই.; সূর্য, CQ; কাও, এসজে; লিন, টি।; ইউয়ান, এসএস; ঝাং, এইচবি; ঘাই, এসএল; হুয়াং, এল.; শান, টিএল; ঝেং, এইচ.; ইত্যাদি চীনা সোয়াইন পালগুলিতে বোভাইন ভাইরাল ডায়রিয়া ভাইরাস 1 এর উচ্চ প্রকোপ। পশুচিকিত্সক মাইক্রোবায়োল। 2012, 159, 490-493। [ক্রসরেফ] [পাবমেড]

6. ওয়াং, এল.; উ, এক্স।; ওয়াং, সি.; গান, সি.; বাও, জে.; ডু, জে. চীনে বোভাইন ভাইরাল ডায়রিয়া ভাইরাস টাইপ 1 এর উৎপত্তি এবং সংক্রমণ ফাইলোডাইনামিক বিশ্লেষণের মাধ্যমে প্রকাশিত হয়েছে। Res. পশুচিকিত্সক বিজ্ঞান 2020, 128, 162–169। [ক্রসরেফ] [পাবমেড]

7. টাউটজ, এন.; টিউস, বিএ; মেয়ার্স, জি. পেস্টিভাইরাসের আণবিক জীববিজ্ঞান। অ্যাড. ভাইরাস রেস. 2015, 93, 47-160।

8. বেচার, পি.; টাউটজ, এন. পেস্টিভাইরাসে আরএনএ পুনর্মিলন: ভাইরাল জিনোমে সেলুলার আরএনএ সিকোয়েন্স ভাইরাল স্থায়ীত্ব এবং প্রাণঘাতী রোগের জন্য হোস্ট ফ্যাক্টরগুলির ভূমিকাকে হাইলাইট করে। আরএনএ বায়োল। 2011, 8, 216-224। [ক্রসরেফ]

9. লি, ওয়াই; ওয়াং, জে.; কানাই, আর.; মোডিস, ওয়াই. বোভাইন ভাইরাল ডায়রিয়া ভাইরাস থেকে গ্লাইকোপ্রোটিন E2 এর স্ফটিক গঠন। Proc. Natl. আকদ। বিজ্ঞান USA 2013, 110, 6805–6810। [ক্রসরেফ]

10. উইলিয়ামস, এলবিএ; ভাজা, এলএম; হারন্ডন, ডিআর; ফ্রান্সেসচি, ভি.; স্নাইডার, ডিএ; Donofrio, G.; নোলস, ডিপি একটি রিকম্বিন্যান্ট বোভাইন হার্পিসভাইরাস-4 ভেক্টরযুক্ত ভ্যাকসিন যা ইন্ট্রানাসাল নেবুলাইজেশনের মাধ্যমে দেওয়া হয় যা গবাদি পশুদের মধ্যে ভাইরাল নিরপেক্ষ অ্যান্টিবডি টাইটার বের করে। PLOS ONE 2019, 14, e0215605। [ক্রসরেফ]

11. আইনাই, এ.; ভ্যান রিট, ই.; ইতো, আর.; ইকেদা, কে.; সেঞ্চি, কে.; সুজুকি, টি.; তামুরা, এসআই; আসানুমা, এইচ.; ওদাগিরি, টি.; তাশিরো, এম.; ইত্যাদি একটি ইন্ট্রানাসাল নিষ্ক্রিয় এইচ 5 ইনফ্লুয়েঞ্জা ভ্যাকসিনের মাধ্যমে মানুষের ইমিউন প্রতিক্রিয়া। মাইক্রোবায়োল। ইমিউনল। 2020, 64, 313-325। [ক্রসরেফ] [পাবমেড]

12. কাং, এইচ.; ইয়ান, এম.; ইউ, প্র.; ইয়াং, প্র. মুরগির মধ্যে অনুনাসিক-সম্পর্কিত লিম্ফয়েড টিস্যু (NALT) এবং নাকের শোষণ ক্ষমতার বৈশিষ্ট্য। PLOS ONE 2013, 8, e84097। [ক্রসরেফ] [পাবমেড]

13. ইয়ে, এল.; জেং, আর.; বাই, ওয়াই.; রুপেনিয়ান, ডিসি; ঝু, এক্স। নবজাতক এফসি রিসেপ্টর দ্বারা মধ্যস্থতা করা কার্যকর মিউকোসাল টিকা। নাট। বায়োটেকনোল। 2011, 29, 158-163। [ক্রসরেফ] [পাবমেড]

14. প্যাবস্ট, আর. ইন্ট্রানাসাল রুট দ্বারা মিউকোসাল টিকা। নাক-সম্পর্কিত লিম্ফয়েড টিস্যু (NALT)-গঠন, কার্যকারিতা এবং প্রজাতির পার্থক্য। ভ্যাকসিন 2015, 33, 4406–4413। [ক্রসরেফ]

15. ঝাং, ওয়াই.; Zhou, Z.; ঝু, এসএল; জু, এক্স।; ওয়াং, জেড.; ঝাং, এলকে; ওয়াং, ডব্লিউ; Xiao, G. একটি উপন্যাস RSV F-Fc ফিউশন প্রোটিন ভ্যাকসিন শ্বাসযন্ত্রের সিনসাইটিয়াল ভাইরাস সংক্রমণ দ্বারা প্ররোচিত ফুসফুসের আঘাত হ্রাস করে। অ্যান্টিভাইর। Res. 2019, 165, 11-22। [ক্রসরেফ]

16. উইডিঞ্জার, কে.; McCauley, J.; Bitsaktsis, C. স্ট্রেপ্টোকক্কাস নিউমোনিয়া সংক্রমণের বিরুদ্ধে টিকা দেওয়ার কৌশল হিসাবে ফিউশন প্রোটিন ব্যবহার করে PspA-এর এফসি গামা রিসেপ্টর টার্গেটিং-এর আইসোটাইপ-নির্দিষ্ট ফলাফল। ভ্যাকসিন 2020, 38, 5634–5646। [ক্রসরেফ]

17. Czajkowsky, DM; হু, জে.; শাও, জেড.; দয়া করে, আরজে এফসি-ফিউশন প্রোটিন: নতুন উন্নয়ন এবং ভবিষ্যতের দৃষ্টিকোণ। EMBO Mol. মেড. 2012, 4, 1015-1028। [ক্রসরেফ]

18. চেন, এক্স।; জেং, এফ.; হুয়াং, টি.; চেং, এল.; লিউ, এইচ.; গং, আর. স্থিতিশীলতা এবং সমষ্টি প্রতিরোধের উন্নতির জন্য এফসি-তে অপ্টিমাইজেশন। কার ফার্ম। বায়োটেকনোল। 2016, 17, 1353–1359। [ক্রসরেফ]

19. Loureiro, S.; রেন, জে.; ফাপুগ্রাংকুল, পি.; কোলাকো, CA; বেইলি, সিআর; শেলটন, এইচ.; মোলেস্টি, ই.; টেম্পারটন, এনজে; বার্কলে, WS; জোন্স, ইনফ্লুয়েঞ্জা ভ্যাকসিনের একটি পদ্ধতি হিসাবে হেমাগ্লুটিনিন-এফসি ফিউশন প্রোটিনের সাথে আইএম অ্যাডজুভেন্ট-মুক্ত টিকাদান। জে. ভিরোল। 2011, 85, 3010-3014। [ক্রসরেফ]

20. লি, জে.; লি, এক্স।; মা, এইচ.; রেন, এক্স।; হাও, জি.; ঝাং, এইচ.; ঝাও, জেড.; ফ্যাং, কে.; লি, এক্স।; Rong, Z.; ইত্যাদি একটি অভিনব ক্লাসিক্যাল সোয়াইন ফিভার ভাইরাস ই2-নিওনেটাল এফসি রিসেপ্টর দ্বারা মধ্যস্থিত এফসি ফিউশন প্রোটিনের দক্ষ মিউকোসাল টিকা। ভ্যাকসিন 2020, 38, 4574–4583। [ক্রসরেফ]

21. ঝেন, জেড; ট্যাং, ডব্লিউ.; টড, টি.; ইমেজিং এবং ড্রাগ ডেলিভারির জন্য ন্যানোপ্ল্যাটফর্ম হিসাবে Xie, J. Ferritins. বিশেষজ্ঞ মতামত. ড্রাগ ডেলিভ। 2014, 11, 1913-1922। [ক্রসরেফ] [পাবমেড]

22. লোপেজ-সাগাসেটা, জে.; মালিটো, ই.; রাপুওলি, আর.; বটমলি, এমজে ভ্যাকসিনের ডিজাইনে প্রোটিন ন্যানো পার্টিকেল সেলফ-এসেম্বলিং। কম্পিউট গঠন. বায়োটেকনোল। জে. 2016, 14, 58-68। [ক্রসরেফ] [পাবমেড]

23. জ্যাকব, এসআই; খোগির, বি.; বাম্পোস, এন.; শেপার্ড, টি.; শোয়ার্টজ, আর.; লো, ফেরিটিন-ভিত্তিক ইনফ্লুয়েঞ্জা অ্যান্টিজেন পরিশোধনের জন্য সিন্থেটিক অ্যাফিনিটি লিগ্যান্ডের বিকাশ এবং প্রয়োগ। বায়োকনজুগেট কেম। 2017, 28, 1931-1943। [ক্রসরেফ] [পাবমেড]

24. মা, এক্স।; Zou, F.; ইউ, এফ.; লি, আর.; ইউয়ান, ওয়াই.; ঝাং, ওয়াই.; ঝাং, এক্স।; ডেং, জে.; চেন, টি.; গান, জেড.; ইত্যাদি SARS-CoV-2 এর রিসেপ্টর বাইন্ডিং ডোমেন (RBD) এবং Heptad Repeat (HR) এর উপর ভিত্তি করে ন্যানো পার্টিকেল ভ্যাকসিনগুলি শক্তিশালী প্রতিরক্ষামূলক ইমিউন প্রতিক্রিয়া প্রকাশ করে। অনাক্রম্যতা 2020, 53, 1315–1330.e1319। [ক্রসরেফ] [পাবমেড]

25. বেনেডিক্টাস, এল.; বেল, সিআর ভ্যাকসিন উৎপাদনের জন্য অ্যালোজেনিক সেল লাইন ব্যবহারের ঝুঁকি: বোভাইন নিওনেটাল প্যানসাইটোপেনিয়ার উদাহরণ। বিশেষজ্ঞ রেভ. ভ্যাকসিন 2017, 16, 65–71। [ক্রসরেফ]

26. পেকোরা, এ.; Aguirreburualde, MS; Aguirreburualde, A.; লিউন্ডা, এমআর; ওডিয়ন, এ.; চিয়াভেনা, এস.; বোচোয়ায়ের, ডি.; স্পিটেলার, এম.; ফিলিপি, জেএল; দুস সান্তোস, এমজে; ইত্যাদি গবাদি পশুতে বোভাইন ভাইরাল ডায়রিয়া ভাইরাসের পরীক্ষামূলক সংক্রমণ রোধ করতে স্তন্যপায়ী কোষে উত্পাদিত E2 গ্লাইকোপ্রোটিন সাবুনিট ভ্যাকসিনের নিরাপত্তা এবং কার্যকারিতা। পশুচিকিত্সক Res. কমুন 2012, 36, 157-164। [ক্রসরেফ]

27. টমাস, সি.; ইয়াং, এনজে; হেনি, জে.; কলিন্স, ME; ব্রাউনলি, জে. স্তন্যপায়ী এবং ব্যাকুলোভাইরাসের কার্যকারিতার মূল্যায়ন E2 সাবুনিট ভ্যাকসিন প্রার্থীদের বোভাইন ভাইরাল ডায়রিয়া ভাইরাসে প্রকাশ করেছে। ভ্যাকসিন 2009, 27, 2387-2393। [ক্রসরেফ]

28. এরিনা, টিএ; ক্ষতি, পিডি; Wong, AW ক্ষণস্থায়ী প্রোটিন উৎপাদনের জন্য HEK293 কোষের উচ্চ থ্রুপুট ট্রান্সফেকশন। পদ্ধতি Mol. বায়োল 2018, 1850, 179–187।

29. ভেনেরিও-সানচেজ, এ.; গিলবার্ট, আর.; সিমোনেউ, এম.; ক্যারন, এ.; চাহাল, পি.; চেন, ডব্লিউ; Ansorg, S.; লি, এক্স।; হেনরি, ও.; কামেন, এ. হেমাগ্লুটিনিন এবং নিউরামিনিডেস এইচইকে-293 সাসপেনশন কালচারে উত্পাদিত ভাইরাসের মতো কণা: একটি কার্যকর ইনফ্লুয়েঞ্জা ভ্যাকসিন প্রার্থী। ভ্যাকসিন 2016, 34, 3371–3380। [ক্রসরেফ]

30. ইয়ান, ওয়াই।; লি, এক্স।; ওয়াং, এ.; ঝাং, জি. আণবিক ক্লোনিং এবং বোভাইন আইজিজি (এফসি গামা আরআই) এর জন্য পূর্ণ-দৈর্ঘ্যের সিডিএনএ এনকোডিং হাই-অ্যাফিনিটি এফসি রিসেপ্টর সনাক্তকরণ। পশুচিকিত্সক ইমিউনল। ইমিউনোপ্যাথল। 2000, 75, 151-159। [ক্রসরেফ]

31. ঝাও, জেড.; চেন, এক্স।; চেন, ওয়াই.; লি, এইচ.; ফ্যাং, কে.; চেন, এইচ.; লি, এক্স।; Qian, P. ক্লাসিক্যাল সোয়াইন ফিভার ভ্যাকসিন ডিজাইন করার জন্য একটি স্ব-একত্রিত ফেরিটিন ন্যানোপ্ল্যাটফর্ম: শক্তিশালী নিরপেক্ষ অ্যান্টিবডির নির্মূল। ভ্যাকসিন 2021, 9, 45। [CrossRef] [PubMed]

32. Hsieh, MS; Hsu, CW; তু, এলএল; চাই, কেএম; ইউ, এলএল; উ, সিসি; চেন, আমার; চিয়াং, সিওয়াই; লিউ, এসজে; লিয়াও, সিএল; ইত্যাদি রিকম্বিন্যান্ট অ্যান্টিজেন-এফএলআইপিআর ফিউশন প্রোটিনের সাথে ইন্ট্রানাসাল টিকা একা দীর্ঘস্থায়ী সিস্টেমিক অ্যান্টিবডি প্রতিক্রিয়া এবং বিস্তৃত টি কোষ প্রতিক্রিয়া প্ররোচিত করে। সামনে। ইমিউনল। 2021, 12, 751883। [ক্রসরেফ] [পাবমেড]

33. বেলিডো, ডি.; Baztarrica, J.; রোচা, এল.; পেকোরা, এ.; অ্যাকোস্টা, এম.; এসক্রিবানো, জেএম; পাররেনো, ভি.; Wigdorovitz, A. একটি উপন্যাস MHC-II লক্ষ্যযুক্ত BVDV সাবুনিট ভ্যাকসিন গিনিপিগ এবং গবাদি পশুদের মধ্যে একটি নিরপেক্ষ ইমিউনোলজিকাল প্রতিক্রিয়া প্ররোচিত করে। ট্রান্সবাউন্ড এমার্জ ডিস. 2021, 68, 3474–3481। [ক্রসরেফ] [পাবমেড]

34. মা, এইচ.; লি, এক্স।; লি, জে.; ঝাও, জেড.; ঝাং, এইচ.; হাও, জি.; চেন, এইচ.; Qian, P. পোরসিন রিপ্রোডাক্টিভ এবং রেসপিরেটরি সিনড্রোম ভাইরাসের রিকম্বিন্যান্ট ফিউশনের সাথে GP5 পরিবর্তিত এবং ফেরিটিন শূকরদের প্রতিরক্ষামূলক অনাক্রম্যতা উন্নত করে। ভাইরোলজি 2021, 552, 112-120। [ক্রসরেফ] [পাবমেড]

35. নিয়ন, এমপি; ডু, এল.; Tseng, CK; সিড, সিএ; পোলেট, জে.; Naceanceno, KS; আগরওয়াল, এ.; আলগাইসি, এ.; পেং, বিএইচ; তাই, ডব্লিউ.; ইত্যাদি একটি MERS-করোনাভাইরাস ভ্যাকসিন অ্যান্টিজেনের অভিব্যক্তির জন্য একটি স্থিতিশীল CHO সেল লাইন ইঞ্জিনিয়ারিং। ভ্যাকসিন 2018, 36, 1853-1862। [ক্রসরেফ]

36. বেলিনি, এম।; রিভা, বি.; টিনেলি, ভি.; রিজুতো, এমএ; সালভিওনি, এল.; কলম্বো, এম.; মিংগোজি, এফ.; ভিসিওলি, এ.; Marongiu, L.; ফ্রাসকোটি, জি.; ইত্যাদি ক্যান্সারে ন্যানোড্রাগ ডেলিভারির বায়োলুমিনিসেন্স ট্র্যাকিংয়ের জন্য ইঞ্জিনিয়ারড ফেরিটিন ন্যানো পার্টিকেলস। ছোট 2020, 16, e2001450। [ক্রসরেফ]

37. ঝাং, এইচ.; লি, এক্স।; পেং, জি.; ট্যাং, সি.; ঝু, এস.; কিয়ান, এস.; জু, জে.; Qian, P. গ্লাইকোপ্রোটিন E2 ক্লাসিক্যাল সোয়াইন ফিভার ভাইরাসের দ্বারা প্রকাশ করা হয় যা ব্যাকুলোভাইরাস খরগোশের মধ্যে প্রতিরক্ষামূলক প্রতিরোধ ক্ষমতা প্ররোচিত করে। ভ্যাকসিন 2014, 32, 6607–6613। [ক্রসরেফ]

38. ইউয়ান, এল.; ওয়েন, কে.; আজেভেদো, এমএস; গঞ্জালেজ, এএম; Zhang, W.; সাইফ, এলজে ভাইরাস-নির্দিষ্ট অন্ত্রের IFN-গামা টি কোষের প্রতিক্রিয়া যা মানুষের রোটাভাইরাস সংক্রমণ দ্বারা প্ররোচিত হয় এবং ভ্যাকসিনগুলি জিনোটোবায়োটিক শূকরের রোটাভাইরাস ডায়রিয়ার বিরুদ্ধে সুরক্ষার সাথে সম্পর্কযুক্ত। ভ্যাকসিন 2008, 26, 3322–3331। [ক্রসরেফ]

39. ওয়াং, YP; লিউ, ডি.; গুও, এলজে; ট্যাং, কিউএইচ; উই, ওয়াইডব্লিউ; উ, এইচএল; লিউ, জেবি; লি, এসবি; হুয়াং, এলপি; লিউ, সিএম ইঁদুরের মধ্যে রিকম্বিন্যান্ট পোরসিন IFN-গামার সহ-প্রশাসনের মাধ্যমে PCV2 সাবুনিট ভ্যাকসিনের প্রতিরক্ষামূলক প্রতিরোধ ক্ষমতা উন্নত করেছে। ভ্যাকসিন 2013, 31, 833–838। [ক্রসরেফ]