মানব কিডনিতে মিনারলো-জৈব ন্যানো পার্টিকেল সনাক্তকরণ এবং বৈশিষ্ট্য

Tsui-Yin Wong^1,2,*, চেং-ইউ উ^1,2,3,* ইত্যাদি

একটোপিক ক্যালসিফিকেশন এথেরোস্ক্লেরোসিস, ক্যান্সার সহ বিভিন্ন মানব রোগের সাথে যুক্ত।দীর্ঘস্থায়ীকিডনিরোগ, এবংডায়াবেটিসমেলিটাস যদিও খনিজ ন্যানো পার্টিকেলগুলি ক্যালসিফাইড রক্তনালীতে সনাক্ত করা হয়েছে, মানবদেহে এই কণাগুলির প্রকৃতি এবং ভূমিকা অস্পষ্ট রয়ে গেছে। এখানে আমরা প্রথমবারের মতো সেই মানুষটিকে দেখাইকিডনিশেষ পর্যায় থেকে প্রাপ্ত টিস্যুদীর্ঘস্থায়ীকিডনিরোগবা রেনাল ক্যান্সারের রোগীদের মধ্যে 50 থেকে 1,500 এনএম বৃত্তাকার, মাল্টিলেমেলার খনিজ কণা থাকে, যেখানে স্বাস্থ্যকর নিয়ন্ত্রণে কোনো কণা পরিলক্ষিত হয় না। খনিজ কণাগুলি প্রধানত আবর্তিত টিউবুলের আশেপাশের বহির্কোষী ম্যাট্রিক্সে পাওয়া যায়, হেনলের নালী এবং লুপগুলি সংগ্রহ করে সেইসাথে টিউবুল-ডেলাইনেটিং কোষের সাইটোপ্লাজমের মধ্যে এবং হাড় এবং একসটোপিকে পাওয়া খনিজটির মতো পলিক্রিস্টালাইন ক্যালসিয়াম ফসফেট নিয়ে গঠিত। দ্যকিডনিখনিজ ন্যানো পার্টিকেলগুলিতে বেশ কয়েকটি সিরাম প্রোটিন রয়েছে যা অ্যালবুমিন, ফেটুইন-এ এবং অ্যাপলিপোপ্রোটিন A1 সহ শরীরের তরলগুলিতে একটোপিক ক্যালসিকেশনকে বাধা দেয়। যেহেতু খনিজ-জৈব ন্যানো পার্টিকেলগুলি কেবল ক্যালসিফাইড আমানতের মধ্যেই পাওয়া যায় না তবে মাইক্রোস্কোপিক ক্যালসিফিকেশন বর্জিত এলাকায়ও পাওয়া যায়, তাই আমাদের পর্যবেক্ষণগুলি ইঙ্গিত দেয় যে ন্যানো পার্টিকেলগুলি মানুষের মধ্যে ক্যালসিফিকেশন এবং রেনাল স্টোনগুলির পূর্ববর্তী প্রতিনিধিত্ব করতে পারে।

যোগাযোগ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

একটোপিক ক্যালসিফিকেশন এথেরোস্ক্লেরোসিস, ক্যান্সারের সাথে যুক্ত।দীর্ঘস্থায়ীকিডনিরোগ, এবং ডায়াবেটিস মেলিটাস 1-3। সাম্প্রতিক গবেষণা ইঙ্গিত দেয় যে এথেরোস্ক্লেরোসিস এবংদীর্ঘস্থায়ীকিডনিরোগভাস্কুলার ক্যালসিফিকেশনের লক্ষণযুক্ত রোগীরা অসুস্থতা এবং মৃত্যুর ঝুঁকি বাড়ায়, এটি পরামর্শ দেয় যে একটোপিক ক্যালসিফিকেশন মানুষের স্বাস্থ্যের জন্য ক্ষতিকর। বয়স্ক ব্যক্তিদের মধ্যেও অবাঞ্ছিত ক্যালসিফিকেশন পরিলক্ষিত হয় এবং 60 বছরের বেশি বয়সী বেশিরভাগ লোকই ভাস্কুলার ক্যালসিফিকেশনের লক্ষণ দেখায়। এই কারণে, অ্যাক্টোপিক ক্যালসিফিকেশন প্ররোচিতকারী কারণগুলির পাঠোদ্ধার করা এবং কার্যকর চিকিত্সার বিকাশ গুরুত্বপূর্ণ লক্ষ্যগুলি উপস্থাপন করে।

একটোপিক ক্যালসিফিকেশনকে সংজ্ঞায়িত করা যেতে পারে ইনহিবিটরস এবং ইনডিউসারস অব ক্যালসিফিকেশনের মধ্যে ভারসাম্যহীনতা। ক্যালসিফিকেশন ইনহিবিটরগুলির মধ্যে অ্যালবুমিন, ফেটুইন-এ, অস্টিওপন্টিন এবং ম্যাট্রিক্স জিএলএ প্রোটিনের মতো সিরাম প্রোটিনগুলির পাশাপাশি পাইরোফসফেটের মতো ছোট যৌগগুলি অন্তর্ভুক্ত, যেখানে হাইপারফসফেটেমিয়া এবং প্রদাহ ক্যালসিফিকেশন 5-7-এর প্রধান প্রবর্তককে প্রতিনিধিত্ব করে। সাম্প্রতিক অধ্যয়নগুলি ইঙ্গিত দেয় যে ক্যালসিফিকেশন ইনডিউসারগুলি ভাস্কুলার ক্যালসিফিকেশন 7,8 এর সময় হাড় গঠনের অনুরূপ একটি সেলুলার প্রক্রিয়া সক্রিয় করে। ম্যাট্রিক্স ভেসিকেলগুলির অনুরূপ যা উন্নয়নশীল হাড়গুলিতে খনিজকরণকে প্ররোচিত করে তাও ক্যালসিফাইড নরম টিস্যুতে সনাক্ত করা হয়েছে7-9। এই ম্যাট্রিক্স ভেসিকলগুলি সম্ভবত ভাস্কুলার মসৃণ পেশী কোষ দ্বারা নির্গত হয় যা অস্টিওব্লাস্ট-সদৃশ কোষে পার্থক্য করে, যা ক্যালসিফিকেশন7 প্ররোচিত করে।

খনিজ ন্যানো পার্টিকেল (NPs) নরম টিস্যুতে সনাক্ত করা হয়েছে যা একটোপিক ক্যালসিফিকেশনের লক্ষণ দেখাচ্ছে। মূল্য এবং অন্যান্য. দেখা গেছে যে ইঁদুরের সিরাম হয় বিসফসফোনেট ইটিড্রোনেট দিয়ে বা ভিটামিন ডি হারবার খনিজ-প্রোটিন কমপ্লেক্সের সাথে চিকিত্সা করা হয় যার মধ্যে ক্যালসিফিকেশন ইনহিবিটর ফেটুইন-এ এবং ম্যাট্রিক্স জিএলএ প্রোটিন 10,11 রয়েছে। একইভাবে, Jahnen-Dechent et al. পর্যবেক্ষণ করা হয়েছে যে ফেটুইন-এ-যুক্ত খনিজ কমপ্লেক্স, যেগুলিকে ক্যালসিপ্রোটিন কণা (CPPs) বলা হত, ক্যালসিফাইং পেরিটোনাইটিস12 রোগীদের অ্যাসিটিক তরলে সনাক্ত করা যেতে পারে। Bertazzo et al দ্বারা একটি সাম্প্রতিক গবেষণা। এথেরোস্ক্লেরোটিক এবং রিউম্যাটিক জ্বরের রোগীদের মহাধমনী ভালভ এবং করোনারি ধমনীতে খনিজ NP-এর উপস্থিতি প্রদর্শন করেছে13। যদিও খনিজ কণাগুলির গঠনের উপর অধ্যয়নগুলি সাধারণত মানুষের কার্ডিওভাসকুলার সিস্টেমের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করে, তবে এটি অস্পষ্ট রয়ে গেছে যে কণাগুলি অন্যান্য টিস্যুতে পাওয়া যেতে পারে এবং এই সত্তাগুলি স্বাস্থ্য বা রোগে ভূমিকা পালন করে কিনা।

আমরা আগে দেখেছি যে খনিজ-জৈব এনপিএস স্বতঃস্ফূর্তভাবে মানব এবং প্রাণীদেহের তরল 14-28 গঠন করে। এই খনিজ এনপিগুলিকে প্রাথমিকভাবে ন্যানোব্যাকটেরিয়া (NB) হিসাবে বর্ণনা করা হয়েছিল এবং বিশ্বাস করা হয়েছিল যে এটি কেবল পৃথিবীর ক্ষুদ্রতম কোষই নয়, আলঝাইমার রোগ, এথেরোস্ক্লেরোসিস, ক্যান্সার, সহ অসংখ্য রোগের সম্ভাব্য সংক্রমণযোগ্য কারণও।কিডনিপাথরগঠন, পলিসিস্টিককিডনিরোগ, এবং prostatitis30-32। যাইহোক, আমাদের ফলাফলগুলি দেখিয়েছে যে NB প্রকৃতপক্ষে নির্জীব খনিজ এনপি যা সাধারণ ব্যাকটেরিয়াকে তাদের রূপবিদ্যা, বৃদ্ধি, বিস্তার এবং উপ-সংস্কৃতির 15,18,22 অনুকরণ করে। তথাকথিত NB-এর মতো খনিজ কণাগুলি মানুষের টিস্যুতে পাওয়া যেতে পারে এবং এই কণাগুলি রোগের ক্ষেত্রে ভূমিকা পালন করে কিনা তা পরীক্ষা করা বাকি রয়েছে।

বর্তমান গবেষণায়, আমরা রোগাক্রান্ত মানুষের মধ্যে খনিজ-জৈব এনপিগুলি সনাক্ত এবং বিশ্লেষণ করার জন্য একটি ন্যানোমেটেরিয়াল পদ্ধতির বিকাশ করেছি।কিডনিটিস্যু. আমরা দেখাই যে শেষ পর্যায়ের ক্রনিক কিডনি ডিজিজ এবং রেনাল ক্যান্সারের রোগীদের কিডনি টিস্যুতে বায়োমিমেটিক খনিজ কণার মতো মাল্টিলামেলার খনিজ এনপি থাকে যা ভিট্রোতে শরীরের তরলগুলিতে স্বতঃস্ফূর্তভাবে ক্ষরণ করে। আমাদের ফলাফলগুলি এই খনিজ-জৈব কণাগুলির জৈব রাসায়নিক গঠন, গঠনের প্রক্রিয়া এবং জৈবিক ফাংশন সম্পর্কিত সমালোচনামূলক অন্তর্দৃষ্টি প্রকাশ করে এবং তারা মানবদেহে অ্যাক্টোপিক ক্যালসিফিকেশন এবং রোগের সূচনার প্রক্রিয়ার উপর আলোকপাত করে।

ফলাফল

আমরা শেষ পর্যায়ের দীর্ঘস্থায়ী কিডনি রোগ (n=2) বা রেনাল ক্যান্সার (n=18; সারণী 1 দেখুন; রেনাল ক্যান্সারের নমুনার জন্য, আমরা অ-এর উপর ফোকাস করেছি) রোগীদের অস্ত্রোপচারের মাধ্যমে অপসারণ করা কিডনি টিস্যু পরীক্ষা করেছি। - টিস্যুর ক্যান্সারযুক্ত অংশ)। স্বাস্থ্যকর নিয়ন্ত্রণ হিসাবে, আমরা ট্রমা বা হেমাটোমা রোগীদের কাছ থেকে প্রাপ্ত কিডনি বায়োপসি অধ্যয়ন করেছি কিন্তু যাদের পূর্বে কোন অস্বাভাবিক রেনাল ফাংশন ছিল না (n=2; টেবিল 1)।

সুস্থ ব্যক্তিদের কিডনির টিস্যুতে স্বাভাবিক হিস্টোলজিক্যাল বৈশিষ্ট্য দেখা যায় এবং ভন কোসা স্টেনিং (চিত্র 1এ, বি) এর পরে কোনো অ্যাক্টোপিক ক্যালসিফিকেশন পরিলক্ষিত হয়নি। অন্যদিকে, রোগাক্রান্ত ব্যক্তিদের কাছ থেকে প্রাপ্ত কিডনি টিস্যু এবং হেমাটোক্সিলিন এবং ইওসিন (H&E) দ্বারা দাগযুক্ত টিস্যু ক্ষতির প্রমাণ দেখায় (চিত্র 2A-C, তীর দ্বারা নির্দেশিত), এবং 80 শতাংশ রোগাক্রান্ত টিস্যু পরীক্ষা করা খনিজ আমানত দেখায়। ভন কোসা স্টেনিং দ্বারা (চিত্র 1C–T, চিত্র 2E,F, কালো তীর দ্বারা নির্দেশিত কালো উপাদান হিসাবে ক্যালসিফিকেশন দৃশ্যমান; এছাড়াও সারণী 1 দেখুন)। কর্টেক্স এবং মেডুলায় ক্যালসিফাইড জমা লক্ষ্য করা গেছে, যার মধ্যে রয়েছে দূরবর্তী আবর্তিত টিউবুলস, প্রক্সিমাল কনভোলুটেড টিউবুলস, হেনলের নালী এবং লুপ সংগ্রহের পাশাপাশি কোষের সাইটোপ্লাজম যা টিউবুল এবং নালীগুলিকে চিত্রিত করে (চিত্র 1C–T এবং Fig) এর চারপাশের বাইরের কোষীয় স্থান। 2E, F)। রেনাল কর্পাসকেলে (চিত্র 2D) কোনো ক্যালসিফিকেশন ধরা পড়েনি।

খনিজ অবক্ষেপের প্রকৃতি পরীক্ষা করার জন্য, আমরা ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি (TEM) দ্বারা পর্যবেক্ষণের জন্য অতি-পাতলা কিডনি বিভাগ প্রস্তুত করেছি। মাইক্রোস্কোপিক খনিজ আমানত ধারণকারী নমুনাগুলিতে, খনিজ কণা বা দানাগুলি রেনাল এপিথেলিয়াল কোষের সাইটোপ্লাজমে, বেসমেন্ট মেমব্রেনের নীচে এক্সট্রা সেলুলার ম্যাট্রিক্সে এবং প্রক্সিমাল এবং ডিস্টাল কনভোলুটেড টিউবুলসের লুমেনের মধ্যে (চিত্র 3A, B, এনলারেড অংশ) সনাক্ত করা হয়েছিল। প্যানেলে A1–A4 এবং B1–B4)। খনিজ এনপিগুলি হেনলের লুপগুলির আস্তরণ এবং সংগ্রহের নালীগুলির মধ্যেও পরিলক্ষিত হয়েছিল (চিত্র 3C, D, প্যানেল C1, C2 এবং D1 তে বড় করা হয়েছে)। রেনাল কোষের অন্তঃকোষীয় ভেসিকেলের মধ্যে কিছু কণা পাওয়া গেছে (চিত্র 3A, প্যানেল A1 এবং A2)। এখানে ব্যবহৃত ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি পদ্ধতি আমাদের খনিজ কণার অভ্যন্তরকে কল্পনা করতে দেয়; কিছু কণা আলো, ইলেকট্রন-লুসেন্ট স্তরগুলির সাথে পর্যায়ক্রমে ইলেকট্রন-ঘন রিংগুলিকে আশ্রয় করে (চিত্র 3A, প্যানেল A3 এবং A4, চিত্র 3C, প্যানেল C1)। বেশ কিছু রক্তনালী, যেমন ভাসা রেক্টা রেন্ট (কিডনির সোজা ধমনী), আমরা প্রচুর পরিমাণে খনিজ NPs (চিত্র 3D, প্যানেল D1) দ্বারা বেষ্টিত। এইভাবে খনিজ এনপিগুলি সমস্ত মানুষের কিডনি টিস্যুতে বিভিন্ন স্থানে পাওয়া গেছে যা একটোপিক ক্যালসিফিকেশনের লক্ষণ দেখায়, যেখানে স্বাস্থ্যকর নিয়ন্ত্রণ পরীক্ষায় কোনও কণা পাওয়া যায়নি।

কিডনি টিস্যুতে পাওয়া খনিজ কণাগুলি আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণায় 15,17 (এবং যাকে আমরা bions24 বলে আখ্যায়িত করেছি) দেহের তরলগুলিতে স্বতঃস্ফূর্তভাবে গঠন করা বর্ণিত খনিজ-জৈব এনপিগুলির সাথে খুব মিল বলে মনে হয়। এই সম্ভাবনা যাচাই করার জন্য, আমরা খনিজ জৈব NPs (বা বায়ন) একটি বৃষ্টিপাত পদ্ধতি ব্যবহার করে প্রস্তুত করেছি যেমনটি আমরা পূর্বে বর্ণনা করেছি15। এই পদ্ধতিতে কোষ সংস্কৃতির মাধ্যমে (Dulbecco's modified Eagle's medium or DMEM) একটি হিউম্যান সিরাম (HS) এর মত বডি ফ্লুইড ধারণ করে ক্যালসিয়াম এবং ফসফেটের মত প্রিপিটিটিং আয়ন যোগ করা হয়, তারপরে কোষ সংস্কৃতির অবস্থার ইনকিউবেশন (পদ্ধতি দেখুন)। এইভাবে উত্পাদিত কণাগুলি (HS-NPS) হয় গোলাকার বা উপবৃত্তাকার এবং একটি মসৃণ বা স্ফটিক খনিজ পৃষ্ঠ (চিত্র 4A-E) দেখায়, যা পূর্বে বডি ফ্লুইড 22,23 এবং সেইসাথে মানুষের অ্যাসাইটসে বর্ণিত কণাগুলির অনুরূপ। ক্যালসিফাইড ধমনী13. খনিজ কণাগুলি তাদের সামগ্রিক রূপবিদ্যা, বহুস্তর গঠন এবং পৃষ্ঠের বৈশিষ্ট্যের (চিত্র 4F-J) পরিপ্রেক্ষিতে কিডনি টিস্যুতে পর্যবেক্ষণ করা খনিজ NPs বা কণিকাগুলির সাথে খুব মিল ছিল। এইচএস থেকে প্রাপ্ত কণা এবং কিডনি গ্রানুলের আকারও তুলনামূলক ছিল, 50 থেকে 1,500 এনএম ব্যাস (চিত্র 4A-E, F-J)। উপরে উল্লিখিত হিসাবে, কিছু কিডনি কণিকা একটি লিপিড ঝিল্লি দ্বারা বেষ্টিত ছিল, সম্ভবত অন্তঃকোষীয় কার্গো ভেসিকল বা বহির্কোষী ঝিল্লি ভেসিকেল (চিত্র 4H,I, ঝিল্লিগুলিকে তীর দ্বারা চিহ্নিত করা হয়); ভিট্রোতে তৈরি এইচএস-এনপি নমুনাগুলিতে এই ধরনের ঝিল্লির কাঠামো অনুপস্থিত ছিল (চিত্র 4A-ই)। এই পর্যবেক্ষণগুলি পরামর্শ দেয় যে কিডনি গ্রানুলগুলি সিরামে একত্রিত মিনারলো-জৈব এনপিগুলির অনুরূপ।

নির্বাচিত এলাকা ইলেক্ট্রন ডিফ্র্যাকশন বিশ্লেষণ ব্যবহার করে, আমরা লক্ষ্য করেছি যে ভিট্রোতে এইচএস-এনপি-এর খনিজ পর্যায় একটি পলিক্রিস্টালাইন ন্যানোমেটেরিয়াল নিয়ে গঠিত (চিত্র 4E, ইনসেট; অস্পষ্ট ঘনকেন্দ্রিক রিংগুলি লক্ষ্য করুন)। অনুরূপ ফলাফল কিডনি গ্রানুলস (চিত্র 4J, ইনসেট) এবং হাড় এবং অ্যাক্টোপিক ক্যালসিফিকেশনের জন্য যেমন পূর্ববর্তী গবেষণায় বর্ণিত হয়েছে 33,35 এর জন্য প্রাপ্ত হয়েছিল।

আমরা এনার্জি-ডিসপারসিভ এক্স-রে স্পেকট্রোস্কোপি (EDX) ব্যবহার করে HS-NPs এবং কিডনি গ্রানুলের রাসায়নিক গঠন অধ্যয়ন করেছি। HS-NPs কার্বন (C), ক্যালসিয়াম (Ca), অক্সিজেন (O), এবং ফসফরাস (P) (চিত্র 4K), ক্যালসিয়াম ফসফেট খনিজ উপস্থিতির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ প্রধান শিখর দেখিয়েছে। HS-NPs (চিত্র 4K) তেও সিলিকনের একটি নিম্ন শিখর (Si) লক্ষ্য করা গেছে, সম্ভবত একটি ছোট কণা উপাদানের প্রতিনিধিত্ব করে। কিডনি গ্রানুলগুলি কার্বন, ক্যালসিয়াম, অক্সিজেন এবং ফসফরাসের শিখরগুলিও দেখায়, যা একটি ক্যালসিয়াম ফসফেট খনিজ, সিলিকন এবং আয়রন (Fe) (চিত্র 4L) এর অতিরিক্ত শিখরগুলির সাথে নির্দেশ করে। ইউরেনিয়াম পিকস (U) নমুনা তৈরির সময় একটি বিপরীত বিকারক হিসাবে ব্যবহৃত ইউরেনাইল অ্যাসিটেটকে দায়ী করা হয়েছিল (কিডনি গ্রানুলের মতো খনিজ কণার কিছু নমুনায় ইউরেনিয়ামের উপস্থিতি এবং চিত্র 4M এর নিয়ন্ত্রণ টিস্যুতে এর অনুপস্থিতিকে দায়ী করা যেতে পারে উচ্চ মাত্রার জন্য। ফসফেটের জন্য ইউরেনিয়ামের সম্বন্ধ, যেমন পূর্বে রিপোর্ট করা হয়েছে35)। কণাগুলির চারপাশে থাকা কিডনি টিস্যুর নিয়ন্ত্রণ EDX স্পেকট্রা কার্বন এবং অক্সিজেনের শিখর দেখায় (চিত্র 4M), পরামর্শ দেয় যে ক্যালসিয়াম এবং ফসফরাস প্রধানত খনিজ কণাগুলিতে পাওয়া যায়।

ক্যালসিয়াম: HS-NPs এবং কিডনি গ্রানুলের ফসফরাস (Ca:P) অনুপাত 0.65 থেকে 1.18 পর্যন্ত পরিবর্তিত। এই অনুপাতগুলি স্টোইচিওমেট্রিক হাইড্রোক্সাপাটাইটের জন্য পরিলক্ষিত 1.67 এর তাত্ত্বিক মানের থেকে পৃথক কিন্তু এখনও ক্যালসিয়াম ফসফেট এবং স্ফটিককরণের বিভিন্ন ডিগ্রীতে পরিলক্ষিত অ্যাপাটাইট স্ফটিকগুলির জন্য আগে দেখা সীমার মধ্যে রয়েছে। একসাথে, এই ফলাফলগুলি নিশ্চিত করে যে কিডনি গ্রানুলে ক্যালসিয়াম ফসফেট NPs রয়েছে।

শরীরের 36,37 পদ্ধতিগত পদ্ধতিতে অ্যাক্টোপিক ক্যালসিফিকেশনকে বাধা দিতে বিভিন্ন প্রোটিন পাওয়া গেছে। এছাড়াও, সিন্থেটিক NPs-এর পৃষ্ঠে পাওয়া প্রোটিন করোনটি vivo38,39-এর কোষে কণার জৈববণ্টন এবং প্রভাব নির্ধারণ করে বলে মনে করা হয়। অন্যদিকে, মানুষের কিডনি টিস্যুতে পাওয়া খনিজ-জৈব এনপিগুলির প্রোটিন গঠন অসম্পূর্ণভাবে বোঝা যায়। আমরা আগে দেখেছি যে অ্যালবুমিন, ফেটুইন-এ, এবং অ্যাপলিপোপ্রোটিন-এ1 (এপো-এ1) প্রধান প্রোটিনগুলিকে প্রতিনিধিত্ব করে যা শরীরের তরল 17,20 এ গঠিত মিনারলো-জৈব এনপিগুলির সাথে যোগাযোগ করে। এখানে আমরা কিডনি গ্রানুলের মধ্যে এই প্রোটিনের উপস্থিতি এবং আল্ট্রাস্ট্রাকচারাল অবস্থান পরীক্ষা করতে ইমিউনোগোল্ড লেবেলিং ব্যবহার করেছি।

আমরা হিউম্যান সিরাম অ্যালবুমিন (HSA), হিউম্যান সিরাম fetuin-A (HSF), হিউম্যান apo-1A, এবং পুরো HS-এর বিরুদ্ধে পলিক্লোনাল অ্যান্টিবডি ব্যবহার করেছি HS-NPs এবং কিডনি গ্রানুলে সিরাম প্রোটিনের উপস্থিতি পরীক্ষা করার জন্য। পলিক্লোনাল অ্যান্টিবডিগুলির নির্দিষ্টতা (আগে বর্ণিত হিসাবে প্রস্তুত 25) ওয়েস্টার্ন ব্লটিং (চিত্র 5) ব্যবহার করে যাচাই করা হয়েছিল। পলিক্লোনাল অ্যান্টিবডিগুলির প্রত্যেকটি ভিট্রোতে প্রস্তুত এইচএস-এনপিগুলির সাথে সাথে মানুষের কিডনি টিস্যুতে পাওয়া খনিজ দানাগুলির সাথে ইতিবাচকভাবে প্রতিক্রিয়া জানায় (চিত্র 6A,B, প্যানেল A1–A3 এবং B1–B3; কালো বিন্দু)। অ্যান্টিবডিগুলি প্রধানত ইলেক্ট্রন-ঘন স্তর বা HS-NPs এবং কিডনি গ্রানুলের গাঢ় কোর (চিত্র 6A, B) এর সাথে প্রতিক্রিয়া দেখায়, ইঙ্গিত করে যে এই অন্ধকার এলাকায় ইলেকট্রন-লুসেন্ট এলাকার তুলনায় উচ্চ স্তরের প্রোটিন থাকতে পারে। প্রাথমিক অ্যান্টিবডি ছাড়া সঞ্চালিত নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ কোন প্রতিক্রিয়া তৈরি করে না (চিত্র 6A, B, প্যানেল A4 এবং B4, নিয়ন্ত্রণ)। আমরা উপসংহারে পৌঁছেছি যে কিডনি গ্রানুলগুলি HS-NPs-এর অনুরূপ খনিজ-জৈব এনপিগুলিকে প্রতিনিধিত্ব করে না শুধুমাত্র তাদের অঙ্গসংস্থান এবং খনিজ গঠনের উপর ভিত্তি করে, তবে সিরামে উপস্থিত প্রধান ক্যালসিফিকেশন ইনহিবিটারগুলির সাথে তাদের আবদ্ধতার উপর ভিত্তি করে।

রোগাক্রান্ত মানুষের কিডনিতে এইচএসএ এবং এইচএসএফ ধারণকারী খনিজ গ্রানুলের উপস্থিতি নিশ্চিত করার জন্য ইমিউনোফ্লোরেসেন্স মাইক্রোস্কোপি ব্যবহার করা হয়েছিল। এই কৌশলটি ব্যবহার করে, মানুষের কিডনি টিস্যু দেখায়

রেনাল টিউবুলের আশেপাশের ইন্টারস্টিটিয়াম এবং টিউবুল-ডেলাইনেটিং কোষের সাইটোপ্লাজম সহ (চিত্র 7A, প্যানেল A1 এবং A2) বিভিন্ন ক্ষেত্রে দুটি প্রোটিনের জন্য ইতিবাচক দাগ। অ্যালবুমিন এবং ফেটুইন-এ উভয়ই সমন্বিত প্রোটিন সমষ্টিগুলিও এই অঞ্চলগুলিতে লক্ষ্য করা গেছে, যদিও একক প্রোটিনের দাগের তুলনায় কম পরিমাণে (চিত্র 7A এবং প্যানেল A3, হলুদ রঙে একত্রিত দাগ)। উল্লেখযোগ্যভাবে, আমরা লক্ষ্য করেছি যে ইমিউনোফ্লোরোসেন্স দ্বারা শনাক্ত করা প্রোটিন স্টেনিং ভন কোসা স্টেনিং ব্যবহার করে পর্যবেক্ষণ করা একটোপিক ক্যালসিফিকেশনের প্যাটার্নের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে ওভারল্যাপ করে (চিত্র 7A,B, ক্যালসিফিকেশন B-তে তীর দ্বারা নির্দেশিত কালো উপাদান হিসাবে দৃশ্যমান)। এই ফলাফলগুলি পরীক্ষা করা মানুষের কিডনি টিস্যুতে খনিজ-জৈব কণার উপস্থিতির জন্য আরও সহায়তা প্রদান করে।

আলোচনা

যদিও সিন্থেটিক এনপি এবং মানব কোষের মধ্যে মিথস্ক্রিয়া সম্পর্কে আমাদের বোঝার ক্ষেত্রে অগ্রগতি হয়েছে, আমরা খনিজ-জৈব এনপিগুলির প্রভাব সম্পর্কে যথেষ্ট কম জানি যা শরীরের তরলগুলিতে স্বতঃস্ফূর্তভাবে তৈরি হয়। আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণাগুলি দেখিয়েছে যে এই কণাগুলি জৈবিক তরলগুলিতে গঠন করে যখন ক্যালসিয়াম এবং ফসফেটের ঘনত্ব স্যাচুরেশন 15,16 ছাড়িয়ে যায়। আমরা আরও লক্ষ্য করেছি যে এই কণাগুলি ইমিউন কোষ দ্বারা অভ্যন্তরীণ করা হয় কিন্তু শুধুমাত্র বড় কণাগুলি প্রো-ইনফ্ল্যামেটরি ইমিউন প্রতিক্রিয়া প্ররোচিত করে23। যাইহোক, মানুষের টিস্যুতে এই কণাগুলির বিতরণ এবং তারা শরীরে কোনও শারীরবৃত্তীয় বা রোগগত ভূমিকা পালন করে কিনা তা এখনও পর্যন্ত পরীক্ষা করা হয়নি।

বর্তমান গবেষণায়, আমরা শেষ পর্যায়ে কিডনি রোগ বা রেনাল ক্যান্সারে আক্রান্ত মানব রোগীদের কিডনিতে প্রথমবারের মতো খনিজ-জৈব এনপি সনাক্ত করেছি। সনাক্ত করা খনিজ-জৈব NPs-এ হাড়ের খনিজগুলির অনুরূপ খারাপভাবে স্ফটিকযুক্ত ক্যালসিয়াম ফসফেট রয়েছে, সেইসাথে অ্যালবুমিন, ফেটুইন-A, এবং apo-A1 যা শরীরের তরলগুলিতে সিস্টেমিক ক্যালসিফিকেশন ইনহিবিটর হিসাবে কাজ করে। আমাদের ফলাফলগুলি পূর্ববর্তী প্রতিবেদনগুলির সাথে একমত যা ভাস্কুলার টিস্যু এবং শরীরের তরলগুলিতে খনিজ-প্রোটিন কমপ্লেক্সের উপস্থিতি বর্ণনা করেছে 12,13,34,40। যেহেতু আমরা যে কণাগুলি পর্যবেক্ষণ করেছি সেগুলি এমন অঞ্চলে পাওয়া গেছে যেখানে কোনও মাইক্রোস্কোপিক ক্যালসিফিকেশন নেই, তাই আমাদের পর্যবেক্ষণগুলি পরামর্শ দেয় যে কণাগুলি মানুষের টিস্যুতে একটোপিক ক্যালসিফিকেশনের অগ্রদূতকে প্রতিনিধিত্ব করতে পারে। খনিজ-জৈব এনপিগুলি ধীরে ধীরে আকারে বৃদ্ধি পেতে পারে এবং আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণায় বর্ণিত অনুকূল পরিস্থিতিতে কণা থেকে ফিল্ম রূপান্তরের মধ্য দিয়ে যেতে পারে এমন সম্ভাবনার প্রেক্ষিতে, এখানে উপস্থাপিত পর্যবেক্ষণগুলি পরামর্শ দেয় যে খনিজ অগ্রদূতগুলি বড় আকারের গঠনের দিকে পরিচালিত করতে পারে। ভিভোতে খনিজ জমা, যেমন র্যান্ডালের ফলক এবং কিডনিতে পাথর।

কিডনির বিভিন্ন শারীরবৃত্তীয় কাঠামোতে খনিজ একটোপিক ক্যালসিফিকেশন এবং খনিজ-জৈব এনপি পাওয়া যায় এমন আমাদের পর্যবেক্ষণগুলি এই অঙ্গে অ্যাক্টোপিক ক্যালসিফিকেশনের পূর্ববর্তী অনুসন্ধানের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। ইভান এট আল.-এর পর্যবেক্ষণগুলি নির্দেশ করে যে নেফ্রোলিথিয়াসিস রোগীদের কিডনিতে খনিজকরণ শুরু হতে পারে এবং প্রধানত হেনলে 40,42 এর লুপগুলির অন্তর্বর্তী টিস্যুতে ঘটতে পারে। এই লেখকরা পর্যবেক্ষণ করেছেন যে এই অঞ্চলে খনিজ সঞ্চয়গুলি ইউরোথেলিয়ামের বেসাল দিক থেকে বেরিয়ে আসতে পারে এবং কিডনিতে পাথর তৈরি করতে পারে। আমাদের পর্যবেক্ষণগুলি পরামর্শ দেয় যে, হেনলের লুপগুলি ছাড়াও, অন্যান্য কিডনি অঞ্চলে খনিজ এনপি থাকতে পারে যা শেষ পর্যন্ত মানুষের কিডনিতে বড় খনিজ জমা তৈরি করতে পারে। রক্ত সঞ্চালনে তৈরি হওয়া খনিজ এনপিগুলি রেনাল টিস্যুতে স্থানান্তরিত হতে পারে এবং কিডনিতে অ্যাক্টোপিক ক্যালসিফিকেশন এবং পাথর গঠন প্ররোচিত করতে পারে সেই সম্ভাবনাও আমরা তদন্ত করছি।

বর্তমান গবেষণায় শনাক্ত করা বেশ কয়েকটি কিডনি দানা অন্তঃকোষীয় বা বহির্কোষী ভেসিকেল (চিত্র 4H, I) এর মধ্যে পাওয়া যায় এবং এগুলি হাড় এবং দাঁত 7,8-এ ক্যালসিফিকেশন প্ররোচিত করার জন্য দেখানো ম্যাট্রিক্স ভেসিকলের অনুরূপ। আমরা সম্প্রতি লক্ষ্য করেছি যে মানব এবং প্রাণীর সিরাম থেকে বিচ্ছিন্ন ভেসিকেলগুলি ভিট্রো 25-এ খনিজ এনপি এবং মাইক্রোস্কোপিক অবক্ষেপণ গঠনে প্ররোচিত করে। Schlieper et al.34 আরও পর্যবেক্ষণ করেছেন যে ধমনীতে পাওয়া খনিজ কণাগুলি ঝিল্লি কাঠামোর সাথে যুক্ত এবং প্রস্তাব করেছেন যে ম্যাট্রিক্স ভেসিকল বা অ্যাপোপটোটিক দেহগুলি এই টিস্যুতে খনিজ কণার নিউক্লিয়েটর প্রতিনিধিত্ব করতে পারে। একইভাবে, খান এট আল। রিপোর্ট করা হয়েছে যে ইডিওপ্যাথিক কিডনিতে পাথরে আক্রান্ত মানুষের কিডনিতে পাওয়া ক্যালসিয়াম ফসফেট জমা কোলাজেন ফাইবার এবং ম্যাট্রিক্স ভেসিকেলস9 এর সাথে যুক্ত। এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে কিডনি টিস্যুতে সনাক্ত করা খনিজ-জৈব এনপিগুলি মেমব্রেন ভেসিকেল জড়িত একটি প্রক্রিয়ার মাধ্যমে তৈরি হতে পারে, যা এথেরোস্ক্লেরোটিক ধমনীতে দেখা যায় এমন একটি পরিস্থিতির সাথে সাদৃশ্যপূর্ণ। অন্যদিকে, একটি সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে মহিলাদের স্তন ধমনীতে পাওয়া একটোপিক ক্যালসিফিকেশন অস্টিওজেনিক বা অ্যাপোপটোটিক সেল মার্কার 43 এর সাথে সম্পর্কিত ছিল না, এটি পরামর্শ দেয় যে ক্যালসিফিকেশনের প্রক্রিয়াটি জড়িত অঙ্গ বা জৈবিক প্রেক্ষাপটের সাথে নির্দিষ্ট হতে পারে। এছাড়াও, খনিজ-জৈব এনপি যেমন এখানে বর্ণিত মানুষের কিডনি টিস্যুতে আয়ন (যেমন, ক্যালসিয়াম এবং ফসফেট) এবং ক্যালসিফিকেশন ইনহিবিটর (যেমন, অ্যালবুমিন, ফেটুইন-এ, এবং অ্যাপো) এর শারীরবৃত্তীয় ঘনত্ব বজায় রাখতে ব্যর্থতার কারণেও তৈরি হতে পারে। -A1) মানুষের শরীরের তরল মধ্যে.

আমাদের ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে খনিজ-জৈব এনপিগুলির ইলেকট্রন-ঘন স্তর এবং কোরে কণাগুলির ইলেকট্রন-লুসেন্ট এলাকার তুলনায় উচ্চ স্তরের প্রোটিন এবং জৈব অণু থাকতে পারে (চিত্র 6A, B)। এই ইলেকট্রন-ঘন স্তরগুলি TEM-এর অধীনে এই উপাদানটির স্ফটিক প্রকৃতির দ্বারা খনিজযুক্ত বলে মনে হয় (চিত্র 4A-J দেখুন)। Ryall41 এবং Evan et al.44 সহ অন্যান্য লেখকরা প্রস্তাব করেছেন যে ইলেকট্রন-লুসেন্ট স্তর খনিজগুলির প্রতিনিধিত্ব করতে পারে যখন ইলেকট্রন-ঘন স্তরগুলি জৈব অণুর সাথে মিলিত হতে পারে। এই ব্যাখ্যাগুলি কমপক্ষে আংশিকভাবে প্রতিটি গবেষণায় নমুনাগুলি প্রক্রিয়াকরণ এবং পরীক্ষা করার পাশাপাশি ব্যবহৃত প্রারম্ভিক টিস্যুগুলির প্রকৃতির কারণে হতে পারে।

অ্যাক্টোপিক ক্যালসিফিকেশনে ভূমিকা পালন করার পাশাপাশি, খনিজ-জৈব কণা কিডনি টিস্যুতে প্রদাহ সৃষ্টি করতে পারে। আমরা সম্প্রতি দেখিয়েছি যে যখন খনিজ-জৈব NPs মানুষের ম্যাক্রোফেজগুলির দ্বারা প্রো-ইনফ্ল্যামেটরি ইন্টারলিউকিন-1 নিঃসরণ করতে ব্যর্থ হয়, 1 μm এর চেয়ে বড় খনিজ সমষ্টি তাই করতে সক্ষম হয়23৷ স্ফটিক পদার্থের প্রতিক্রিয়ায় ইন্টারলিউকিন-1 এর প্রকাশকে ইনফ্ল্যামাসোমস 45–47 নামে অভিহিত অন্তঃকোষীয় আণবিক কমপ্লেক্সের সক্রিয়করণের উপর নির্ভর করে দেখানো হয়েছে। এছাড়াও, খনিজ কণাগুলি কিডনিতে টিউমারের আশ্রয়ে সনাক্ত করা হয়েছিল এবং ক্যান্সার এবং প্রদাহের মধ্যে সম্পর্ক এখন ভালভাবে স্বীকৃত হয়েছে48। সমষ্টিগত খনিজ কণাগুলি একটি প্রদাহকে সক্রিয় করতে পারে এবং কিডনি বা অন্যান্য টিস্যুতে প্রদাহ এবং ক্যান্সারের বিকাশে অবদান রাখতে পারে তা তদন্ত করা বাকি রয়েছে।

একটোপিক ক্যালসিফিকেশন ছাড়াও, এখানে বর্ণিত খনিজ দানাগুলি অন্যান্য রোগের প্রক্রিয়াগুলিতে অংশগ্রহণ করতে পারে। উদাহরণস্বরূপ, আমরা আগে প্রস্তাব করেছি যে খনিজ এনপিগুলি শরীরের তরলগুলিতে বিভিন্ন প্রোটিনের সাথে আবদ্ধ হতে পারে এবং শরীরের তরল থেকে এই জৈব অণুগুলিকে 20,26 শূন্য করতে পারে। অন্যদিকে, মানবদেহ স্বাভাবিক পরিস্থিতিতে ক্যালসিফিকেশন ইনহিবিটর এবং রেটিকুলোএন্ডোথেলিয়াল সিস্টেমের (অর্থাৎ, ম্যাক্রোফেজ) উপস্থিতির উপর নির্ভর করে খনিজ NPs গঠন এবং জমা হওয়া প্রতিরোধ করতে পারে। সিস্টেমিক বা স্থানীয় ক্যালসিয়াম হোমিওস্ট্যাসিস বিঘ্নিত হলে এবং যখন মানবদেহে প্রতিরক্ষামূলক ব্যবস্থা ব্যর্থ হয় তখনই খনিজ এনপিগুলি এইভাবে জমা হতে পারে।

আমরা প্রস্তাব করি যে এখানে বিকশিত ন্যানোমেটেরিয়াল পদ্ধতি প্রাণী এবং মানুষের টিস্যুতে খনিজ-জৈব এনপি গঠন অধ্যয়ন করতে ব্যবহার করা যেতে পারে। উদাহরণ স্বরূপ, অ্যালবুমিন, ফেটুইন-এ এবং এপো-এ1-এর মতো ক্যালসিফিকেশন ইনহিবিটর প্রোটিনের বিরুদ্ধে উত্থাপিত অ্যান্টিবডিগুলি প্রাণীর মডেলের টিস্যুতে খনিজ-জৈব এনপিগুলির গঠন সনাক্ত করতে এবং চিহ্নিত করতে খনিজ বিশ্লেষণের সাথে একত্রে ব্যবহার করা যেতে পারে। এই পদ্ধতি ব্যবহার করে প্রাপ্ত ফলাফলগুলি জৈবিক পরামিতিগুলি সনাক্ত করার জন্য মানবদেহের তরলগুলির উপর তৈরি ক্লিনিকাল পরিমাপের ক্ষেত্রে প্রয়োগ করা যেতে পারে যা শরীরে খনিজ কণা গঠন এবং একটোপিক ক্যালসিফিকেশনের অবস্থাকে প্রতিফলিত করে। আমরা আশা করি যে এই জ্ঞানটি একটোপিক ক্যালসিফিকেশনের সাথে সম্পর্কিত মানব রোগ এবং অবস্থার প্রতিরোধ ও চিকিত্সার জন্য অভিনব থেরাপিউটিক কৌশলগুলির বিকাশের দিকে নিয়ে যেতে পারে।

পদ্ধতি

কিডনির টিস্যু।মানুষের টিস্যু ব্যবহার এবং এই গবেষণায় সম্পাদিত পরীক্ষাগুলি চ্যাং গুং মেমোরিয়াল হাসপাতালের ইনস্টিটিউশনাল রিভিউ বোর্ড দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল; পদ্ধতি এবং পরীক্ষাগুলি অনুমোদিত নির্দেশিকা অনুসারে পরিচালিত হয়েছিল। রোগীদের কাছ থেকে লিখিত অবহিত সম্মতি প্রাপ্ত হয়েছিল। কিডনি রোগের কোনো ইতিহাস নেই এমন ট্রমা এবং হেমাটোমা রোগীদের বায়োপসি থেকে সুস্থ কিডনি টিস্যু নিয়ন্ত্রণ করা হয়েছে (n=2); কিডনি টিস্যুগুলি কিডনি ক্যান্সারের রোগীদের (n=20) এবং শেষ পর্যায়ের কিডনি রোগের রোগীদের (n=2) থেকেও পাওয়া গিয়েছিল যাদের কিডনি ট্রান্সপ্লান্ট সার্জারির সময় অপসারণ করা হয়েছিল বা বায়োপসি করা হয়েছিল (সারণী 1)। রেনাল ক্যান্সার টিস্যুগুলির জন্য, টিস্যুর অ-ক্যান্সারযুক্ত অংশটি বর্তমান গবেষণায় বিচ্ছিন্ন এবং বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

হিস্টোলজিকাল বিশ্লেষণ।কিডনির টিস্যু প্যারাফিন ব্লকে মাউন্ট করা হয়েছিল। ব্লকগুলিকে ভাগ করা হয়েছিল এবং প্যারাফিন অপসারণের জন্য টিস্যু স্লাইসগুলিকে 70 ডিগ্রিতে 30 মিনিটের জন্য গরম প্লেটে গরম করা হয়েছিল। অবশিষ্ট প্যারাফিন সম্পূর্ণরূপে অপসারণের জন্য বিভাগগুলিকে 15 মিনিটের জন্য তিনবার জাইলিনের একটি তাজা দ্রবণে নিমজ্জিত করা হয়েছিল। বিভাগগুলি প্রতিবার 5 মিনিটের জন্য 95 শতাংশ, 80 শতাংশ এবং 70 শতাংশ ইথানল দিয়ে পুনরায় হাইড্রেট করা হয়েছিল। রিহাইড্রেটেড নমুনাগুলি 5 মিনিটের জন্য ডাবল-ডিস্টিল ওয়াটার (ddH2O) দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। সেল নিউক্লিয়াস 8 মিনিটের জন্য হেমাটোক্সিলিন দিয়ে দাগযুক্ত ছিল। 10 মিনিটের জন্য উষ্ণ জল দিয়ে নমুনাগুলি থেকে ছোপানো মুছে ফেলা হয়েছিল। কিডনির নমুনাগুলি ddH2O দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং 95 শতাংশ ইথানলে 10 বার ডুবানো হয়েছিল। ইথানল-চিকিত্সা করা নমুনাগুলি 1 মিনিটের জন্য ইওসিন ওয়াই দিয়ে পাল্টা দাগ দেওয়া হয়েছিল। প্রতিবার 10 মিনিটের জন্য 95 শতাংশ এবং 100 শতাংশ ইথানল দিয়ে নমুনাগুলি ডিহাইড্রেট করা হয়েছিল, তারপরে 10 মিনিটের জন্য জাইলিনের একটি ডিহাইড্রেশন ধাপ ছিল। চূড়ান্ত ডিহাইড্রেটেড কিডনির নমুনাগুলি 50 শতাংশ গ্লিসারল সহ কাচের স্লাইডে মাউন্ট করা হয়েছিল এবং একটি ডিজিটাল ক্যামেরা দিয়ে সজ্জিত একটি হালকা মাইক্রোস্কোপের নীচে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।

ডি-প্যারাফিনাইজড এবং রিহাইড্রেটেড নমুনাগুলি H&E স্টেনিংয়ের জন্য বর্ণিত হিসাবে প্রস্তুত করা হয়েছিল। রিহাইড্রেটেড অংশগুলি সিলভার নাইট্রেট (5 শতাংশ) দিয়ে দাগযুক্ত ছিল, তারপরে 20 মিনিটের জন্য UV আলোর সংস্পর্শে আসে। সমাধানটি 15 মিনিটের জন্য ddH2O দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। বিভাগগুলি 5 মিনিটের জন্য সোডিয়াম থায়োসালফেট (5 শতাংশ) দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল, তারপরে 15 মিনিটের জন্য ddH2O দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। বিভাগগুলি 5 মিনিটের জন্য পারমাণবিক দ্রুত লাল (সিগমা-অলড্রিচ, সেন্ট লুইস, এমআই) দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল। দাগযুক্ত নমুনাগুলি 10 মিনিটের জন্য জাইলিনের ডিহাইড্রেশনের আগে 10 মিনিটের জন্য 95 শতাংশ এবং 100 শতাংশ ইথানল দিয়ে পরপর ডিহাইড্রেট করা হয়েছিল। কিডনির নমুনাগুলি কাচের স্লাইডে মাউন্ট করা হয়েছিল এবং উপরে বর্ণিত হিসাবে পরীক্ষা করা হয়েছিল।

ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি এবং EDX বিশ্লেষণ।এলজিপিএস ডিসেকশন মাইক্রোস্কোপ (অলিম্পাস, টোকিও, জাপান) ব্যবহার করে কিডনির নমুনাগুলি 1 মিমি পুরু ছোট ছোট টুকরোগুলিতে কাটা হয়েছিল। টিস্যুগুলিকে 2.5 শতাংশ গ্লুটারালডিহাইড এবং 1 শতাংশ প্যারাফর্মালডিহাইড দিয়ে স্থির করা হয়েছিল 0.1 এম ক্যাকোডিলেট বাফারে রাতারাতি 4 ডিগ্রিতে। স্থির নমুনাগুলি 10 মিনিটের জন্য বরফে 8 শতাংশ সুক্রোজে (pH 7.2) 0.1 M cacodylate বাফার দিয়ে তিনবার ধোয়া হয়েছিল৷ ধোয়া টিস্যুগুলি ফসফেট-বাফারযুক্ত স্যালাইনে (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4) 1 শতাংশ অসমিয়াম টেট্রোক্সাইড এবং 1.5 শতাংশ পটাসিয়াম ফেরোসায়ানাইড 2 ঘন্টার জন্য বরফের উপর ধারণ করে। টিস্যুগুলি ddH2O দিয়ে 10 মিনিটের বরফে তিনবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। ধোয়া টিস্যুগুলি 1 ঘন্টার জন্য ddH2O-তে 1 শতাংশ ইউরানাইল অ্যাসিটেট দিয়ে বরফের উপর দাগ দেওয়া হয়েছিল, বরফে ddH2O দিয়ে তিনবার ধোয়ার আগে। কিডনির টিস্যুগুলি প্রতিবার 10 মিনিটের জন্য 30, 50, 70, 80 এবং 90 শতাংশ ইথানল দিয়ে ডিহাইড্রেট করা হয়েছিল, ইথানল 70 শতাংশে পৌঁছানোর সময় ছাড়া, যে ক্ষেত্রে নমুনাগুলি রাতারাতি 4 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়েছিল। টিস্যুগুলি 15 মিনিটের জন্য 95 শতাংশ ইথানলে 1 শতাংশ ফসফোটাংস্টিক অ্যাসিড দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল, ডিহাইড্রেশনের আগে 5 মিনিটের জন্য 95 শতাংশ ইথানল দিয়ে। নমুনাগুলি প্রতিবার 10 মিনিটের জন্য 40, 57, 67 এবং 100 শতাংশ ইথানলে প্রোপিলিন অক্সাইডে নিমজ্জিত করা হয়েছিল, তারপরে 5 মিনিটের জন্য 100 শতাংশ প্রোপিলিন অক্সাইডে আরেকটি নিমজ্জন করা হয়েছিল। প্রতিবার 1 ঘন্টার জন্য 50, 70 এবং 100 শতাংশ এপোনেট 812 (টেড পেল্লা, রেডিং, CA) দিয়ে কিডনির টিস্যুতে অনুপ্রবেশ করা হয়েছিল। এপোনেট 812-এম্বেডেড কিডনির নমুনাগুলিকে 100 শতাংশ এপোনেটে দুবার ইনকিউব করে প্রস্তুত করা হয়েছিল৷ রজন পলিমারাইজেশনের অনুমতি দেওয়ার জন্য এমবেডেড নমুনাগুলি রাতারাতি 60 ডিগ্রীতে একটি ওভেনে ইনকিউব করা হয়েছিল।

উপরে প্রাপ্ত HS-NP পেলেটগুলিকে ddH2O-তে গ্লুটারালডিহাইড (2.5 শতাংশ) এবং প্যারাফর্মালডিহাইড (1 শতাংশ) দিয়ে 4 ঘন্টার জন্য 4 ডিগ্রিতে স্থির করা হয়েছিল। প্রতিবার 10মিনিটের জন্য তিনবার ddH2O দিয়ে ফিক্সড পেলেটগুলি ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। প্রতিবার 10 মিনিটের জন্য 30, 50, 70, 80, 90, 95 এবং 100 শতাংশ ইথানলে ক্রমাগত ইনকিউবেশনের মাধ্যমে পেলেটগুলি ডিহাইড্রেটেড হয়েছিল, ইথানল 70 শতাংশে পৌঁছানোর সময় ছাড়া, যেখানে পেলেটগুলি রাতারাতি 4 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়েছিল। অন্যান্য ইথানল দ্রবণগুলি শুধুমাত্র 10 মিনিটের জন্য ছুরির সংস্পর্শে রাখা হয়েছিল। ডিহাইড্রেটেড পেলেটগুলি প্রতিটি 30 মিনিটের জন্য ইথানল এবং এলআর মিডিয়ামের বিভিন্ন অনুপাত (3:1, 1:1, এবং 1:3) ব্যবহার করে এলআর হোয়াইট এম্বেডিং মাধ্যম (ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি সায়েন্সেস, হ্যাটফিল্ড, পিএ) দিয়ে অনুপ্রবেশ করা হয়েছিল। পলিমারাইজেশনের আগে রাতারাতি তাজা এলআর মিডিয়াম (100 শতাংশ) দিয়ে পেলেটগুলি অনুপ্রবেশ করা হয়েছিল। রজন পলিমারাইজেশনের অনুমতি দেওয়ার জন্য এলআর মিডিয়াম দিয়ে অনুপ্রবেশ করা পেলেটগুলিকে 60 ডিগ্রীতে 2 দিনের জন্য একটি ওভেনে ইনকিউব করা হয়েছিল। কিডনি এবং এইচএস-এনপিগুলির ব্লকগুলি একটি রেইচার্ট আল্ট্রাকাট এস মাইক্রোটোম (লাইকা, ওয়েটজলার, জার্মানি) ব্যবহার করে 70-100 এনএম পুরুত্বের সাথে স্লাইস তৈরি করতে বিভাগ করা হয়েছিল। 100 কেভিতে পরিচালিত JEM 1230 ট্রান্সমিশন ইলেকট্রন মাইক্রোস্কোপের (JEOL, টোকিও, জাপান) অধীনে ভিজ্যুয়ালাইজেশনের আগে টিস্যু বিভাগগুলি 4 শতাংশ ইউরানাইল অ্যাসিটেট দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল। একই সিস্টেম ব্যবহার করে ইলেকট্রন বিচ্ছুরণ নিদর্শন প্রাপ্ত করা হয়েছিল। নিকেল গ্রিড সমর্থন হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল।

EDX বিশ্লেষণের জন্য, কিডনি টিস্যুগুলির পাতলা অংশগুলিকে ইউরানাইল অ্যাসিটেট দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল এবং উপরের মতো ddH2O দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল, তারপরে একটি ইলেকট্রনিক ডেসিকেটর ক্যাবিনেটে শুকানো হয়েছিল। 120 কেভিতে চালিত একটি উচ্চ-রেজোলিউশন JEM 2100 ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপের (JEOL) অধীনে নমুনাগুলি পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। EDX স্পেকট্রা একটি INCA এনার্জি EDS সিস্টেম (অক্সফোর্ড ইন্সট্রুমেন্টস, অ্যাবিংডন, ইউকে) ব্যবহার করে ট্রিপলিকেটে প্রাপ্ত হয়েছিল। এইচএস-এনপিগুলির পাতলা বিভাগগুলি দাগ ছাড়াই পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।

খনিজ-জৈব NP-এর প্রস্তুতি।সমস্ত প্রারম্ভিক সমাধানগুলি pH 7.4 এ সামঞ্জস্য করা হয়েছিল এবং ব্যবহারের পূর্বে 0.2μm ঝিল্লির মাধ্যমে পরিস্রাবণের মাধ্যমে জীবাণুমুক্ত করা হয়েছিল৷ একটি প্রচলিত ভেনিপাংচার কৌশল ব্যবহার করে সুস্থ মানব স্বেচ্ছাসেবকদের কাছ থেকে এইচএস প্রাপ্ত হয়েছিল। এই গবেষণায় মানব জৈবিক তরল ব্যবহার লিঙ্কো চ্যাং গুং মেমোরিয়াল হাসপাতালের প্রাতিষ্ঠানিক পর্যালোচনা বোর্ড দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল এবং স্বেচ্ছাসেবকদের কাছ থেকে লিখিত অবহিত সম্মতি প্রাপ্ত হয়েছিল। HS-NP গুলি 3 mM CaCl2 এবং Na2HPO4 যোগ করে DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) প্রতিটিতে 10 শতাংশ HS যুক্ত করে প্রস্তুত করা হয়েছিল, তারপরে কোষ সংস্কৃতির অবস্থায় এক সপ্তাহের জন্য ইনকিউবেশন (37 ডিগ্রি, 5 শতাংশ CO2, আর্দ্র বায়ু)। কণাগুলিকে সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে 16,000 ×g 4 ডিগ্রিতে 15 মিনিটের জন্য ছুঁড়ে ফেলা হয়েছিল এবং একই সেন্ট্রিফিউগেশন পদ্ধতি ব্যবহার করে HEPES বাফার (20 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল।

SDS-পৃষ্ঠা এবং ওয়েস্টার্ন ব্লটিং।এসডিএস-পেজ এবং ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ মূলত 15 এর আগে হিসাবে সম্পাদিত হয়েছিল। সংক্ষেপে, HS প্রোটিনের 0.2 ug (চিত্র 5A,D) বা 1.2 ug (চিত্র 5B,C), 47 ug (চিত্র 5A,B,D) বা 590ug HS-NP প্রোটিন (চিত্র 5C), 0.1ug HSA (চিত্র 5A–D), এবং 0.6ug (চিত্র 5A, C, D) বা {{23} }.15ug HSF (চিত্র 5B) 5× "লোডিং বাফার" (0.313 M Tris-HCl pH 6.8, 10 শতাংশ SDS, 0.05 শতাংশ ব্রোমোফেনল নীল, 50 শতাংশ গ্লিসারল, 12.5 শতাংশ -) দ্রবীভূত হয়েছিল mercaptoethanol) 1× এর চূড়ান্ত ঘনত্বে, 5 মিনিটের জন্য 95 ডিগ্রীতে গরম করার আগে এবং একটি মিনি-জেল সিস্টেম (হোফার, হলিস্টন, এমএ) ব্যবহার করে 10 শতাংশ SDS-পৃষ্ঠাতে ডিনাচারিং এবং হ্রাস করার শর্তে বিচ্ছেদ। NP কন্ট্রোল (চিত্র 5A-D-এর লেন 1-এ ব্যবহৃত) খনিজ NP গুলি নিয়ে গঠিত যা 3 mM CaCl2 এবং Na2HPO4 যোগ করে DMEM (চূড়ান্ত আয়তন 1ml), তারপর কোষ সংস্কৃতির অবস্থায় একদিনের জন্য ইনকিউবেশন করা হয়; কণাগুলিকে সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে 16,000 ×g 15 মিনিটের জন্য খোঁচা দেওয়া হয়েছিল, HEPES বাফার দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং HEPES বাফারের 50ul-এ পুনরায় স্থগিত করা হয়েছিল। উপরোক্ত হিসাবে SDS-PAGE-এর জন্য পুনরায় সাসপেন্ড করা কণার 20ul এর একটি অ্যালিকোট প্রক্রিয়া করা হয়েছিল। ঘরের তাপমাত্রায় 5 শতাংশ (w/v) ডিফ্যাটেড দুধে PVDF ঝিল্লি 1 ঘন্টার জন্য অবরুদ্ধ ছিল। 25-এর আগে বর্ণিত প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলি 1:1,000 ( -apo-A1 এবং -HS-NP), 1:3,000 ( -HSF) এর একটি পাতলা করে ব্যবহার করা হয়েছিল। , অথবা 1:6,000 ( -HSA)। ছাগল বিরোধী খরগোশ হর্সরাডিশ পারক্সিডেস-কনজুগেটেড সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি প্রস্তুতকারকের দেওয়া নির্দেশাবলীর উপর ভিত্তি করে ব্যবহার করা হয়েছিল (মিলিপুর, বিলেরিকা, এমএ)। বর্ধিত কেমিলুমিনেসেন্স (আমেরশাম বায়োসায়েন্সেস, আমেরশাম, ইউকে) এবং অটোরেডিওগ্রাফিক ফিল্ম ব্যবহার করে দাগগুলি প্রকাশ করা হয়েছিল।

ইমিউনোগোল্ড লেবেলিং।TEM পর্যবেক্ষণের জন্য নমুনা প্রস্তুত করা হয়েছিল। HS-NP ব্লকগুলিকে 70 nm পুরু স্লাইসে ভাগ করা হয়েছিল৷ 25 মিনিটের জন্য 0.1 M HEPES বাফারে (pH 8.0) 1 শতাংশ ফিশ জেলটিন (সিগমা) দিয়ে গ্রিডের নমুনা বিভাগগুলি ব্লক করা হয়েছিল। গ্রিডগুলি নিম্নলিখিত প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলির সাথে ক্ষয়প্রাপ্ত হয়েছিল: -HSA, 1:30; -এইচএসএফ, 1:50; -apo-A1, 1:30; -এইচএস-এনপি, 1:60। নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণে কোনও প্রাথমিক অ্যান্টিবডি নেই (এইচপিইএস বাফারে 1 শতাংশ ফিশ জেলটিন)। ইনকিউবেটেড বিভাগগুলি 15 মিনিটের জন্য HEPES বাফার দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। 20 মিনিটের জন্য HEPES বাফারে 1 শতাংশ ফিশ জেলটিন দিয়ে ধুয়ে ফেলা বিভাগগুলি ব্লক করা হয়েছিল। নমুনাগুলিকে 1 ঘন্টার জন্য সেকেন্ডারি 5-nm-গোল্ড-কনজুগেট ছাগল-বিরোধী খরগোশ IgG দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। নমুনাগুলি 10 মিনিটের জন্য HEPES বাফার দিয়ে ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল, 10 মিনিটের জন্য ddH2O দিয়ে ধোয়ার আগে। TEM পর্যবেক্ষণগুলি উপরের হিসাবে সম্পাদিত হয়েছিল।

ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি।উপরের মত তৈরি হিস্টোলজিকাল কিডনি টিস্যু স্লাইডগুলি ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য 1 শতাংশ বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন দিয়ে ব্লক করা হয়েছিল। স্লাইডগুলিকে 1:4,000 এর পাতলা করে প্রাথমিক পলিক্লোনাল অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। ধাপ ধোয়ার পরে, নমুনাগুলি 1:100 এ সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি ছাগল অ্যান্টি-র্যাবিট-FITC (492/520nm) এবং ছাগল অ্যান্টি-র্যাবিট-TRITC (550/570nm) (জ্যাকসন ইমিউনো রিসার্চ, ওয়েস্ট গ্রোভ, PA) দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। 1ঘ. কমপ্লেক্সগুলি 15 মিনিটের জন্য পিবিএসটি দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। ফ্লুরোসেন্ট দাগ 4′,6-ডায়ামিডিনো-2-ফেনিলিন্ডোল (DAPI) 15 মিনিটের জন্য 10 ug/ml-এ ব্যবহার করা হয়েছিল৷ ডিএপিআই-দাগযুক্ত নমুনাগুলি প্রতিটি 10 ​​মিনিটের জন্য 95 এবং 100 শতাংশ ইথানল দিয়ে ডিহাইড্রেটেড হয়েছিল, তারপরে আরও 10 মিনিটের জন্য জাইলিনের ডিহাইড্রেশন হয়েছিল। ডিহাইড্রেটেড কিডনির নমুনাগুলি Vectashield ফ্লুরোসেন্স H-1000 মাউন্টিং মিডিয়াম (ভেক্টর ল্যাবরেটরিজ, বার্লিংগেম, CA) দিয়ে মাউন্ট করা হয়েছিল এবং একটি স্পট ফ্লেক্স ক্যামেরা দিয়ে সজ্জিত একটি কনফোকাল মাইক্রোস্কোপের (LSM510 মেটা; Zeiss, Oberkochen, Germany) অধীনে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল৷

Cistanche tubulosa কিডনি রোগ প্রতিরোধ করে, নমুনা পেতে এখানে ক্লিক করুন

তথ্যসূত্র

1. গিয়াচেলি, সিএম একটোপিক ক্যালসিফিকেশন: নরম টিস্যু খনিজকরণ সম্পর্কে কঠিন তথ্য সংগ্রহ করা। এএম জে পাথোল 154, 671–675 (1999)।

2. আবেদিন, এম., টিনটুট, ওয়াই এবং ডেমার, এলএল ভাস্কুলার ক্যালসিফিকেশন: মেকানিজম এবং ক্লিনিকাল রেমিফিকেশন। Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 1161–1170 (2004)।

3. এ্যাথেরোস্ক্লেরোসিসে অ্যালেক্সোপোলোস, এন. এবং রাগি, পি. ক্যালসিফিকেশন। ন্যাট রেভ কার্ডিওল 6, 681–688 (2009)।

4. অ্যালিসন, এমএ, ক্রিকুই, এমএইচ অ্যান্ড রাইট, সিএম প্যাটার্নস এবং সিস্টেমিক ক্যালসিফাইড এথেরোস্ক্লেরোসিসের ঝুঁকির কারণ। Arterioscler Thromb Vasc Biol 24, 331–336 (2004)।

5. কেটেলার, এম. এট আল। ডায়ালাইসিস রোগীদের মধ্যে ক্যালসিয়াম-নিয়ন্ত্রক প্রোটিনের ঘাটতি: ইউরেমিয়াতে কার্ডিওভাসকুলার ক্যালসিফিকেশনের একটি অভিনব ধারণা। কিডনি Int Suppl 84, S84–87 (2003)।

6. কাপুস্টিন, এ. এবং শানাহান, সিএম টার্গেটিং ভাস্কুলার ক্যালসিফিকেশন: হার্ড টার্গেটকে নরম করা। Curr Opin Pharmacol 9, 84–89 (2009)।

7. কাপুস্টিন, এএন এবং শানাহান, সিএম ক্যালসিয়াম রেগুলেশন অফ ভাস্কুলার মসৃণ পেশী কোষ থেকে প্রাপ্ত ম্যাট্রিক্স ভেসিকল। ট্রেন্ডস কার্ডিওভাস্ক মেড 22, 133–137 (2012)।

8. ডোহার্টি, টিএম এট আল। এথেরোস্ক্লেরোসিসে ক্যালসিফিকেশন: হাড়ের জীববিজ্ঞান এবং ধমনী চৌরাস্তায় দীর্ঘস্থায়ী প্রদাহ। Proc Natl Acad Sci USA 100, 11201–11206 (2003)।

9. খান, এসআর, রড্রিগেজ, ডিই, গাওয়ার, এলবি এবং মঙ্গা, এম. অ্যাসোসিয়েশন অফ র্যান্ডালস প্লেকস উইথ কোলাজেন ফাইবার এবং মেমব্রেন ভেসিকল। J Urol 187, 1094–1100 (2012)।

10. মূল্য, PA, Nguyen, TM & Williamson, MK জৈব রাসায়নিক বৈশিষ্ট্য সিরাম fetuin-খনিজ কমপ্লেক্স। J Biol Chem 278, 22153–22160 (2003)।

11. মূল্য, পিএ, উইলিয়ামসন, এমকে, নুগুয়েন, টিএম এবং থান, ফেটুইন-খনিজ কমপ্লেক্সের টিএন সিরাম স্তরগুলি ইঁদুরের ধমনী ক্যালসিফিকেশনের সাথে সম্পর্কযুক্ত। J Biol Chem 279, 1594–1600 (2004)।

12. হেইস, এ. এবং অন্যান্য। ক্যালসিয়াম ফসফেট কণার গঠন এবং স্থিতিশীলকরণে ফেটুইন-এ এবং অ্যাসিডিক সিরাম প্রোটিনগুলির শ্রেণিবদ্ধ ভূমিকা। J Biol Chem 283, 14815–14825 (2008)।

13. Bertazzo, S. et al. ন্যানো-বিশ্লেষণমূলক ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি মানুষের কার্ডিওভাসকুলার টিস্যু ক্যালসিফিকেশনের মৌলিক অন্তর্দৃষ্টি প্রকাশ করে। ন্যাট মেটার 12, 576–583 (2013)।

14. মার্টেল, জে. অ্যান্ড ইয়ং, জেডি মানুষের রক্তে ক্যালসিয়াম কার্বনেট ন্যানো পার্টিকেল হিসাবে ন্যানোব্যাকটেরিয়াকে উদ্দেশ্য করে। Proc Natl Acad Sci USA 105, 5549–5554 (2008)।

15. ইয়াং, জেডি এট আল। পুটেটিভ ন্যানোব্যাকটেরিয়া স্বাভাবিক ক্যালসিয়াম হোমিওস্টেসিসের শারীরবৃত্তীয় অবশিষ্টাংশ এবং সংস্কৃতির উপজাতের প্রতিনিধিত্ব করে। Plos One 4, e4417 (2009)।

16. ইয়াং, জেডি এট আল। প্লোমোরফিক মিনারেলো-প্রোটিন কমপ্লেক্স এবং পুটেটিভ ন্যানোব্যাকটেরিয়ার অগ্রদূত হিসাবে সিরামে ক্যালসিয়াম এবং অ্যাপাটাইটের গ্রানুলেশনের বৈশিষ্ট্য। Plos One 4, e5421 (2009)।

17. Wu, CY, Martel, J., Young, D. & Young, JD Fetuin-A/albumin-খনিজ কমপ্লেক্সের অনুরূপ সিরাম ক্যালসিয়াম গ্রানুলস এবং পুটেটিভ ন্যানোব্যাকটেরিয়া: একটি দ্বৈত বাধা-বীজ ধারণার প্রদর্শন। Plos One 4, e8058 (2009)।

18. ইয়াং, জেডি এবং মার্টেল, জে. ন্যানোব্যাকটেরিয়ার উত্থান এবং পতন। Sci Am 302, 52–59 (2010)।

19. মার্টেল, জে., উ, সিওয়াই এবং ইয়াং, জেডি সংস্কৃতিতে ফিডার হিসাবে ব্যবহৃত গামা-বিকিরণযুক্ত সিরামের সমালোচনামূলক মূল্যায়ন এবং পুটেটিভ ন্যানোব্যাকটেরিয়া এবং ক্যালসিফাইং ন্যানো পার্টিকেলগুলির প্রদর্শন। Plos One 5, e10343 (2010)।

20. মার্টেল, জে. এট আল। মানবদেহের তরল থেকে প্রাপ্ত খনিজ ন্যানো পার্টিকেলগুলির ব্যাপক প্রোটিওমিক বিশ্লেষণ এবং তরল ক্রোমাটোগ্রাফি-ট্যান্ডেম ভর স্পেকট্রোমেট্রি দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছে। অ্যানাল বায়োকেম 418, 111–125 (2011)।