ডি নভো ট্রান্সক্রিপ্টোম অ্যাসেম্বলি অ্যান্ড জিন ডিসকভারি অফ সিস্তানচে ডেসার্টিকোলা ফ্লেশ স্টেম-Ⅰ

পটভূমি

Cistanche deserticola একটি সম্পূর্ণরূপে অ-ফটোসিন্থেটিক পরজীবী উদ্ভিদ যা মহান ঔষধি মূল্যের সাথে এবং প্রধানত উত্তর-পশ্চিম চীনের মরুভূমিতে বিতরণ করা হয়। এর শুকনো মাংসল কাণ্ড একটি গুরুত্বপূর্ণ টনিকঐতিহ্যগত চীনা ঔষধপ্রধানত পুরুষের যৌন ফাংশন উন্নত করা এবং অনাক্রম্যতা জোরদার করার ভূমিকা নিয়ে, তবে জিনোমিক এবং ট্রান্সক্রিপ্টমিক সংস্থানগুলির অভাবের কারণে আংশিকভাবে কিছু যান্ত্রিক গবেষণা পরিচালিত হয়েছে।

ন্যাচারাল সিস্টানচে টিউবুলোসা চাইনিজ ট্র্যাডিশনাল মেডিসিন PHGS75% ECH 30% ACT 12%

ফলাফল

এই গবেষণায়, আমরা C. deserticola-এর মাংসল কাণ্ডে গভীর ট্রান্সক্রিপ্টোম সিকোয়েন্সিং করেছি এবং HiSeq2000 প্ল্যাটফর্মে ইলুমিনা পেয়ার-এন্ড সিকোয়েন্সিং ব্যবহার করে প্রায় 80 মিলিয়ন রিড তৈরি হয়েছে। ট্রিনিটি অ্যাসেম্বলার ব্যবহার করে, আমরা 200bp থেকে 15,698bp পর্যন্ত ট্রান্সক্রিপ্ট দৈর্ঘ্য সহ 95,787 ট্রান্সক্রিপ্ট সিকোয়েন্স পেয়েছি, যার গড় দৈর্ঘ্য 950 বেস এবং N50 দৈর্ঘ্য 1,519 বেস। 63,957টি ট্রান্সক্রিপ্ট সক্রিয়ভাবে 0.5 এর চেয়ে বড় বা সমান FPKM দিয়ে প্রকাশ করা হয়েছে, যাতে 30,098টি ট্রান্সক্রিপ্ট জিন বর্ণনা বা জিন অন্টোলজি পদের সাথে টীকা করা হয়েছে বিভিন্ন পাবলিক ডাটাবেসের (ইউনিপ্রট, এনআর, এবং কেজিবিআই, এবং এনটিজি) এর বিপরীতে অনুক্রমের সাদৃশ্য বিশ্লেষণের মাধ্যমে। . তদ্ব্যতীত, আমরা লিগনিন এবং ফেনিলেথানয়েড গ্লাইকোসাইডস (পিএইচজি) এর জৈব সংশ্লেষণে জড়িত মূল এনজাইম জিনগুলি সনাক্ত করেছি যা প্রাথমিক সক্রিয় উপাদান হিসাবে পরিচিত। চারটি ফেনিল্যালানাইন অ্যামোনিয়া-লাইজ (PAL) জিন, লিগনিন এবং পিএইচজি জৈব সংশ্লেষণের প্রথম মূল এনজাইম ক্রম তুলনা এবং ফাইলোজেনেটিক বিশ্লেষণের ভিত্তিতে চিহ্নিত করা হয়েছিল। পিএইচজিগুলির দুটি জৈব সংশ্লেষণ পথও প্রথমবারের জন্য প্রস্তাবিত হয়েছিল।

উপসংহার

সব মিলিয়ে, আমরা RNA-seq প্রযুক্তি ব্যবহার করে C. deserticola মাংসল স্টেম ট্রান্সক্রিপ্টমের একটি বিশ্বব্যাপী বিশ্লেষণ সম্পন্ন করেছি। লিগনিন এবং ফেনাইলেথানয়েড গ্লাইকোসাইডের জৈব সংশ্লেষণের সাথে সম্পর্কিত এনজাইম জিনের একটি সংগ্রহ একত্রিত এবং টীকাযুক্ত প্রতিলিপি থেকে চিহ্নিত করা হয়েছিল এবং PAL-এর জিন পরিবারেরও ভবিষ্যদ্বাণী করা হয়েছিল। এই অধ্যয়নের সিকোয়েন্স ডেটা এই গুরুত্বপূর্ণ ঔষধি উদ্ভিদে ভবিষ্যতের ফিনিলেথানয়েড গ্লাইকোসাইড বায়োসিন্থেসিস গবেষণা এবং কার্যকরী জিনোমিক গবেষণা পরিচালনার জন্য একটি মূল্যবান সম্পদ প্রদান করবে।

ভূমিকা

C. deserticola হল Orobanchaceae পরিবারের বহুবর্ষজীবী মরুভূমির উদ্ভিদের একটি বিশ্বব্যাপী প্রজাতি এবং এটি সম্পূর্ণরূপে অ-ফটোসিন্থেটিক প্রজাতি এবং সাধারণত ভূগর্ভস্থ হলোপ্যারাসিটিক উদ্ভিদ জন্মায়। এটি psammophyte Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae) এর শিকড়ে পরজীবী হয়, যা খরা এবং লবণাক্ততার উচ্চ সহনশীলতার কারণে প্রধানত মরুভূমি এবং আধা-মরুভূমিতে বাস করে। C. deserticola কঠোর পরিবেশগত অবস্থার জন্য শক্তিশালী প্রতিরোধ দেখায় এবং প্রধানত উত্তর-পশ্চিম চীনে, বিশেষ করে অভ্যন্তরীণ মঙ্গোলিয়া, গানসু এবং জিনজিয়াং-এ বিতরণ করা হয়। সাম্প্রতিক বছরগুলিতে মানুষের দ্বারা বর্ধিত খরচের কারণে এটি একটি বিপন্ন বন্য প্রজাতি হিসাবে বিবেচিত হয়। সি. ডেজার্টিকোলা যাকে প্রায়শই মরুভূমির জিনসেং বলা হয় এটি সাধারণত মরুভূমি-ব্রুমর্যাপ নামে পরিচিত এবং শুকনো মাংসল কাণ্ড বহু বছর ধরে চীন ও জাপানে ঐতিহ্যগতভাবে গুরুত্বপূর্ণ টনিক হিসেবে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়ে আসছে। এটি প্রাথমিকভাবে প্রায় 1800 বছর আগে শেন নং বেন কাও জিং (ডিকশনারি অফ চাইনিজ মেটেরিয়া মেডিকা, 1977) এ রেকর্ড করা হয়েছিল এবং এটির অন্যতম প্রধান উত্স হিসাবে বিবেচিত হয়েছিল।চীনা ঔষধি ভেষজ Cistanche.

PHGS75% ECH 30% ACT 12%

C. deserticola-এর নির্যাস বিভিন্ন ধরনের ঔষধি কার্যাবলীর অধিকারী, বিশেষ করে যৌন ক্রিয়াকলাপের উন্নতি, কিডনি টোনিফাই, লিভার রক্ষা, অ্যাপেরিয়েন্ট কার্যকলাপ, স্মৃতিশক্তি বৃদ্ধি, ইমিউনোমডুলেটরি, অ্যান্টিঅক্সিডেটিভ অ্যাক্টিভিটি, অ্যান্টি-ইনফ্ল্যামেটরি, অ্যান্টিভাইরাল কার্যকলাপ ইত্যাদির জন্য। C. deserticola এর প্রধান জৈব সক্রিয় উপাদান হল Phenylethanoid glycosides (PheGs, PhGs)। আজ পর্যন্ত, C.deserticola-এর রসালো স্টেম থেকে 20টিরও বেশি ফেনাইলেথানয়েড গ্লাইকোসাইড আলাদা করা হয়েছে। তাদের মধ্যে,অ্যাক্টিওসাইড এবং ইচিনাকোসাইডউল্লেখযোগ্য ফার্মাকোলজিক্যাল ক্রিয়াকলাপ সহ দুটি প্রধান উপাদান এবং চীনা ফার্মাকোপিয়া (2005 এবং 2010 সংস্করণ) এ সি. ডেজার্টিকোলার গুণমান মান হিসাবে নথিভুক্ত করা হয়েছে। PhG-এর তিনটি রাসায়নিক উপাদান হল জৈব অ্যাসিড, স্যাকারাইড এবং ফেনাইলেথানয়েড, যাইহোক, ফেনাইলেথানয়েড বায়োসিন্থেটিক পথের বিবরণ C.deserticola-তে খুব কম বোঝা যায়।

C.deserticola-এর বাণিজ্যিক ও ঔষধি গুরুত্ব থাকা সত্ত্বেও, এই প্রজাতির জিনোমিক এবং ট্রান্সক্রিপ্টমিক ডেটা খুবই সীমিত। NCBI ডাটাবেসে কোন EST উপলব্ধ নেই এবং ক্লোরোপ্লাস্ট জিনোম ক্রম ব্যতীত এই প্রজাতির জন্য সম্পূর্ণ জিনোম তথ্য অনুপলব্ধ থাকে। সীমিত ট্রান্সক্রিপ্টোমিক ডেটা পিএইচজি বায়োসিন্থেটিক মেকানিজমের অধ্যয়নকে বাধা দেয়। RNA-seq প্রযুক্তি লক্ষ্যযুক্ত জিনোমের প্রকাশকৃত অংশগুলির ক্রম তৈরি করতে পারে এবং NGS প্রযুক্তি প্ল্যাটফর্মগুলি ব্যবহার করে জিনগুলি [18] শনাক্ত করতে পারে (যেমন অ্যাপ্লায়েড বায়োসিস্টেম SOLID, Illumina HiSeq, এবং Roche 454)। এটি ট্রান্সক্রিপ্টোম ডি নভো অ্যাসেম্বলিতে ক্রমবর্ধমান জনপ্রিয় হয়ে উঠছে, যেহেতু এটি উচ্চ রেজোলিউশন এবং বিস্তৃত গতিশীল পরিসর সহ একটি সাশ্রয়ী এবং শক্তিশালী পদ্ধতি, বিশেষ করে যেহেতু এটি কম-প্রচুর প্রতিলিপিগুলি অন্বেষণ করার একটি সুবিধা রয়েছে৷ বিভিন্ন সুবিধার কারণে, RNA-seq সীমিত জেনেটিক সম্পদ সহ নন-মডেল জীবের জন্য বিশেষভাবে আকর্ষণীয়। যাইহোক, RNA-seq দ্বারা C. deserticola ট্রান্সক্রিপ্টোমের উপর কোন বিস্তারিত গবেষণা নেই।

এই গবেষণায়, আমরা বিশ্বব্যাপী ইলুমিনা হিসেক2000 প্ল্যাটফর্ম ব্যবহার করে C. deserticola-এর জন্য স্টেম ট্রান্সক্রিপ্টোম সিকোয়েন্স করেছি এবং 7.9G কাঁচা ডেটা পেয়েছি। সমাবেশ এবং টীকা দ্বারা, আমরা PhG এর জৈব সংশ্লেষণে জড়িত জিনগুলি এবং সমগ্র লিগনিন জৈব সংশ্লেষণের জন্য দায়ী জিনগুলিকে খনন করেছি৷ আমাদের RNA-seq বিশ্লেষণ প্রথম C. deserticola consensus transscriptome তৈরি করেছে এবং C. deserticola-এর ঔষধি মূল্যের ব্যাপক বোঝার জন্য নতুন অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করেছে। অতিরিক্তভাবে, এখানে বর্ণিত পদ্ধতিটি খুব সীমিত জিনোমিক সংস্থান সহ অন্য একটি ঔষধি উদ্ভিদে নির্দিষ্ট ঔষধি উপাদান জৈব সংশ্লেষণের পথের সাথে জড়িত জিন আবিষ্কারের সুবিধার্থে প্রোফাইল ট্রান্সক্রিপ্টোমে ব্যাপকভাবে প্রয়োগ করা যেতে পারে।

উপকরণ এবং পদ্ধতি

উদ্ভিদ উপাদান সংগ্রহ

উত্তর-পশ্চিম চীনের অভ্যন্তরীণ মঙ্গোলিয়ার আলক্সা লিগের বায়ানহট সিটিতে একটি উদ্ভিদ বেস থেকে খনন পর্যায়ে C. deserticola-এর জন্য তাজা রসালো স্টেম সংগ্রহ করা হয়েছিল। সংগ্রহের অনুমতি প্ল্যান্ট বেসের মালিকের (হংকুই কংরং গ্রুপ) কাছ থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। ভাউচারের নমুনাটি বেইজিং ইনস্টিটিউট অফ জিনোমিক্স, চাইনিজ একাডেমি অফ সায়েন্সের কোর জিনোমিক ফ্যাসিলিটিতে জমা করা হয়েছিল৷ পরিষ্কার করার পরে, রসালো স্টেম টিস্যুগুলিকে ছোট ছোট টুকরো করে কেটে অবিলম্বে তরল নাইট্রোজেনে হিমায়িত করা হয়, এবং পরবর্তী প্রক্রিয়া না হওয়া পর্যন্ত -80 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়।

আরএনএ নিষ্কাশন, সিডিএনএ লাইব্রেরি নির্মাণ, এবং ইলুমিনা সিকোয়েন্সিং

প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে TRIzol Reagent (Invitrogen Inc., California, USA) ব্যবহার করে রসালো স্টেম থেকে মোট RNA বের করা হয়েছিল। যেকোন জিনোমিক ডিএনএ অপসারণের জন্য ফলাফলের নমুনাগুলিকে DNase I দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। নিষ্কাশিত আরএনএগুলি একটি Agilent 21{10}}0 বায়োঅ্যানালাইজার (Agilent Technologies) ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল এবং ইথিডিয়াম ব্রোমাইড স্টেনিং সহ ডিনাচারিং অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস ব্যবহার করে অখণ্ডতা পরীক্ষা করা হয়েছিল৷ 1.9 এবং 2.1 এর মধ্যে A260/A280 অনুপাত সহ RNA নমুনা, RNA 28S:18S অনুপাত 1.0 এর চেয়ে বেশি, এবং RNA ইন্টিগ্রিটি নম্বর (RINs) -8.5 পরবর্তী বিশ্লেষণে ব্যবহার করা হয়েছিল৷

RNA-seq লাইব্রেরিগুলি Illumina Truseq RNA স্যাম্পল প্রিপারেশন কিট ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে ডিনাল লিগো(ডিটি)25 পুঁতি ব্যবহার করে পলি(এ)+ আরএনএ মোট আরএনএ থেকে বিচ্ছিন্ন ছিল। বিশুদ্ধকরণের পরে, এমআরএনএকে ছোট টুকরোতে ভাঙতে একটি ফ্র্যাগমেন্টেশন বাফার যুক্ত করা হয়েছিল। সুপারস্ক্রিপ্ট III রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ এবং N6 র্যান্ডম হেক্সামার প্রাইমার সহ এই ছোট টুকরোগুলিকে টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহার করে প্রথম-স্ট্র্যান্ড cDNA সংশ্লেষিত হয়েছিল। সেকেন্ড-স্ট্র্যান্ড cDNA তারপর বাফার, dNTPs, RNaseH, এবং DNA পলিমারেজ I ব্যবহার করে সংশ্লেষিত হয়েছিল। ফলস্বরূপ ডাবল-স্ট্র্যান্ডেড cDNA টি 4 ডিএনএ পলিমারেজ, ডিএনএ পলিমারেজ I ক্লেনো ফ্র্যাগমেন্ট, এবং T4 পলিনিউক্লিওটাইড কিনেস ব্যবহার করে শেষ মেরামতের শিকার হয়েছিল, এবং লিগেটেড হয়েছিল। T4 DNA ligase ব্যবহার করে অ্যাডাপ্টার। অ্যাডাপ্টর-লিগেটেড টুকরোগুলি একটি QiaQuick PCR নিষ্কাশন কিট ব্যবহার করে শুদ্ধ করা হয়েছিল এবং EB বাফারের সাহায্যে এলুট করা হয়েছিল। অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস ব্যবহার করে বিশ্লেষণের পরে, পিসিআর পরিবর্ধনের জন্য টেমপ্লেট হিসাবে উপযুক্ত টুকরো নির্বাচন করা হয়েছিল। ফলস্বরূপ সিডিএনএ লাইব্রেরির সিকোয়েন্সিং একটি ইলুমিনা হাইসেক 2000 সিস্টেমের সাথে করা হয়েছিল।

নভো সমাবেশ এবং জিন এক্সপ্রেশন পরিমাণ নির্ধারণের প্রতিলিপি

সিকোয়েন্সিং থেকে তৈরি করা কাঁচা রিডগুলি একটি ইন-হাউস পদ্ধতি ব্যবহার করে অ্যাডাপ্টার সিকোয়েন্সগুলি (ATCTCGTATGCCGTC) সরিয়ে দিয়ে পরিষ্কার করা হয়েছিল। তারপরে আমরা একটি কঠোর নিম্ন-মানের ফিল্টারিং প্রক্রিয়া চালিয়েছি। প্রথমত, 20-এর কম ফ্রেড মানের স্কোর সহ বেসগুলিকে ক্রমটির 3'প্রান্ত থেকে ছাঁটাই করা হবে, যতক্ষণ না উচ্চ মানের (20 এর চেয়ে বড় বা সমান) একটি বেসে চলে যায়। পঠিত দৈর্ঘ্য 50bp-এর চেয়ে কম হলে, এটি বাতিল করা হবে। দ্বিতীয়ত, পঠনগুলিকে আরও ফিল্টার করা হবে এই মাপদণ্ডে যে একটি পাঠের 70% বেসের উচ্চ-মানের স্কোর রয়েছে (20 এর চেয়ে বড় বা সমান)। তৃতীয়ত, আরও সমাবেশের জন্য শুধুমাত্র পেয়ারড-এন্ড রিড ব্যবহার করা হয়েছিল। ডি নভো ট্রান্সক্রিপ্ট সমাবেশটি ট্রিনিটি রিলিজ ব্যবহার করে পরিচালিত হয়েছিল_20130216 [30] যা তিনটি ধারাবাহিক সফ্টওয়্যার মডিউল নিয়ে গঠিত: ইঞ্চওয়ার্ম, ক্রাইসালিস এবং বাটারফ্লাই। অ্যাসেম্বলি প্যারামিটারগুলি নীচে সেট করা হয়েছিল:-seqType fq-JM 300G -min_contig_দৈর্ঘ্য 200-CPU 20-inchworm_cpu {{21} }bflyCPU 20।

ট্রান্সক্রিপ্ট প্রাচুর্য পরিমাপ করার জন্য, ক্রমিক জোড়া-শেষ পাঠগুলি ট্রিনিটিতে একটি স্ক্রিপ্ট ব্যবহার করে একত্রিত প্রতিলিপিগুলির সাথে পুনরায় সারিবদ্ধ করা হয়েছিল। ম্যাপড রিডগুলি RSEM (RNA-Seq by Expectation Maximization) সফ্টওয়্যার দ্বারা পরিমাণ নির্ধারণের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল। জিন বা আইসোফর্মের প্রাচুর্য প্রতি মিলিয়ন ফ্র্যাগমেন্ট ম্যাপ করা (FPKM) মানের প্রতি ট্রান্সক্রিপ্টের প্রতি কিলোবেসের টুকরা দ্বারা প্রতিনিধিত্ব করা হয়েছিল, সেই সমস্ত প্রতিলিপিগুলিকে FPKM মান 0.05 এর সমান বা বড় হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছিল।

প্রকাশিত প্রতিলিপিগুলির কার্যকরী টীকা

ক্লোরোপ্লাস্ট জিনোম [1] ব্যতীত C. deserticola-এর কোনো জিন টীকা সেট নেই। ব্লাস্ট প্রোগ্রাম (E< = 1e-20). Meanwhile, all expressed transcripts were translated into potential proteins according to ORF prediction by TransDecoder and predicated for the conserved domains based on the Pfam database.

জিন অন্টোলজি এবং কেইজিজি পাথওয়ে টীকা ইউনিপ্রোট ডাটাবেসের সাথে ক্রম সাদৃশ্য সারিবদ্ধকরণের মাধ্যমে ( সমস্ত একত্রিত প্রতিলিপিগুলির জিন অন্টোলজি (জিও) টীকাটি (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/) থেকে ডাউনলোড করা একটি অ্যাসোসিয়েশন ফাইল ব্যবহার করে প্রাপ্ত করা হয়েছিল ডেটাবেস/GO/goa/UNIPROT/gene_অ্যাসোসিয়েশন goa_uniprot.gz) কাস্টম স্ক্রিপ্ট ব্যবহার করে জিনগুলিকে টীকা করা হয়েছিল৷ CC, BP, এবং MF বিভাগ আলাদাভাবে।

অনলাইন টুল KAAS (KEGG স্বয়ংক্রিয় টীকা সার্ভার) ব্যবহার করে সমস্ত ভবিষ্যদ্বাণীকৃত প্রোটিন সিকোয়েন্সের জন্য KEGG পাথওয়ে তথ্য বরাদ্দ করা হয়েছিল [34]। ফাস্টা ফর্ম্যাটে সিকোয়েন্সগুলি KAAS অনুরোধে জমা দেওয়া হয়েছিল, এবং C. deserticola স্টেম ট্রান্সক্রিপ্টোমের সাথে সম্পর্কিত সমস্ত পথের তথ্যের ফলস্বরূপ ফাইলগুলি ডাউনলোড করা হয়েছিল। কেইজিজিতে 13টি উদ্ভিদ জীবের জিন ডেটা সেটগুলি বিবিএইচ (দ্বি-দিকনির্দেশক সেরা হিট) পদ্ধতি ব্যবহার করে টীকা দেওয়ার জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল।

ন্যাচারাল সিস্টানচে টিউবুলোসা সিস্টানচে এক্সট্রাক্ট PHGS75% ECH 30% ACT 12%

RT-qPCR বিশ্লেষণ

DNase I এর সাথে হজম হওয়ার পরে, oligo(dT)15 প্রাইমার এবং GoScript রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন সিস্টেম (প্রোমেগা) এর সাথে বিপরীত-প্রতিলিপি বিক্রিয়ার মাধ্যমে মোট RNA-এর প্রায় 5ug কে প্রথম-স্ট্র্যান্ড cDNA-তে রূপান্তরিত করা হয়েছিল। সিডিএনএ পণ্যগুলিকে রিয়েল-টাইম পিসিআর-এ টেমপ্লেট হিসাবে ব্যবহারের আগে নিউক্লিজ-মুক্ত ডিওনাইজড জল দিয়ে 10-ভাঁজ মিশ্রিত করা হয়েছিল। নির্দিষ্ট সিডিএনএগুলিকে GoTaq 2-স্টেপ RT-qPCR সিস্টেম (প্রোমেগা) দ্বারা 20 ul এর আয়তনে পরিবর্ধিত করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে 7500 রিয়েল-টাইম পিসিআর ডিটেকশন সিস্টেম (অ্যাপ্লাইড বায়োসিস্টেম) সহ 60 ডিগ্রি অ্যানিলিং তাপমাত্রায় পিসিআর পরিবর্ধন করা হয়েছিল। 7500 ম্যানেজার সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে একটি অভ্যন্তরীণ মান হিসাবে জিন "comp10579_c0" সহ তুলনামূলক চক্র থ্রেশহোল্ড পদ্ধতি দ্বারা আপেক্ষিক প্রতিলিপি প্রাচুর্য গণনা করা হয়েছিল।

RT-PCR-এর জন্য প্রাইমার জোড়াগুলি অনলাইন সফ্টওয়্যারের (http://primer3.ut.ee/) উপর ভিত্তি করে ডিজাইন করা হয়েছে এবং S1 ডেটাসেটে তালিকাভুক্ত করা হয়েছে।

ফলাফল

আরএনএ সিকোয়েন্সিং এবং ডি নভো ট্রান্সক্রিপ্টোম অ্যাসেম্বলি অফ সি. মরুভূমির মাংসল কাণ্ড

C. deserticola এর স্টেম বহু বছর ধরে চীন ও জাপানে ঐতিহ্যগতভাবে গুরুত্বপূর্ণ টনিক হিসেবে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়ে আসছে। C. deserticola মাংসল কান্ডে জিনের অভিব্যক্তির একটি বিশ্বব্যাপী ওভারভিউ প্রাপ্ত করার জন্য, আমরা যথাক্রমে 2013 এবং 2014 সালে একই উদ্ভিদ ভিত্তির C. deserticola স্টেম নমুনা সংগ্রহ করেছি। পেয়ারড-এন্ড RNA-seq লাইব্রেরি নির্মাণের জন্য মোট আরএনএগুলি বের করা হয়েছিল এবং পলিএ + আরএনএগুলিকে শুদ্ধ করা হয়েছিল। 79,433,734 এবং 86,019,176 পেয়ার-এন্ড রিডগুলি ইলুমিনা হাইসেক 2000 সিকোয়েন্সিং ব্যবহার করে সিকোয়েন্সের প্রায় 8 বিলিয়ন এবং 8.6 বিলিয়ন বেসগুলির সাথে সম্পর্কিত।

প্ল্যাটফর্ম 2013-বছর এবং 2014- বছরের নমুনা (সারণী 1)। অ্যাডাপ্টার সিকোয়েন্সগুলি সরানোর পরে এবং নিম্ন-মানের রিডগুলি ফিল্টার করার পরে (পদ্ধতিগুলিতে বিশদ বিবরণ দেখুন), 2013- বছরের নমুনায় 64,831,040টি উচ্চ-মানের পেয়ার-এন্ড রিডগুলি ডি নভো ট্রান্সক্রিপ্টোম সমাবেশের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল৷ ট্রিনিটি সিকোয়েন্স অ্যাসেম্বলার ব্যবহার করে [30], 200 bp থেকে 15,698 bp পর্যন্ত ট্রান্সক্রিপ্ট দৈর্ঘ্য সহ 51,719 জিন এবং 95,787 ট্রান্সক্রিপ্ট সিকোয়েন্স তৈরি করা হয়েছিল। একত্রিত প্রতিলিপিগুলির গড় দৈর্ঘ্য হল 950 বেস এবং N50 দৈর্ঘ্য হল 1,519 বেস৷ বিভিন্ন দৈর্ঘ্যের প্রতিলিপির সংখ্যা প্রকাশ করেছে যে একত্রিত প্রতিলিপিগুলির 57.32% প্রায় 500 bp বা তার বেশি (চিত্র 1A)। 2014- বছরের নমুনায় উচ্চ-মানের পেয়ার-এন্ড রিডগুলি একত্রিত ট্রান্সক্রিপ্টোমে ম্যাপ করা হয়েছিল৷ এছাড়াও, আমরা দেখতে পেয়েছি যে প্রতিটি একত্রিত জিনের জন্য ট্রান্সক্রিপ্ট নম্বর বৈচিত্র্যময় এবং একটি প্রকাশকৃত আইসোফর্ম সহ 69% জিন এবং 31% জিন দুটি বা ততোধিক প্রতিলিপি প্রকাশ করেছে (চিত্র 1B)।

একত্রিত প্রতিলিপিগুলির এক্সপ্রেশন পরিমাণ নির্ধারণ এবং কার্যকরী টীকা

জিন বা প্রতিলিপি প্রাচুর্য RSEM প্যাকেজ ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল, যেখানে ক্রমিক পাঠগুলি বোটি ব্যবহার করে একত্রিত জিন বা ট্রান্সক্রিপ্টের ক্রমগুলির সাথে পুনরায় সারিবদ্ধ করা হয়েছিল এবং সেই ম্যাপড রিডগুলি পরিমাণ নির্ধারণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। প্রতিটি জিন বা প্রতিলিপির জন্য FPKM মান গণনা করা হয়েছিল, এবং অবশেষে, আমরা 63,957 এবং 52,857টি সক্রিয়ভাবে প্রকাশিত প্রতিলিপি (FPKM মান 0.5 এর চেয়ে বড় বা সমান) চিহ্নিত করেছি। 2{{17} যথাক্রমে 13 এবং 2014। 44,776 প্রতিলিপি ({13}} বছরের নমুনায় 70.01%, 2014- বছরের নমুনায় 84.71%) সাধারণত দুটি প্রতিলিপিতে প্রকাশ করা হয়েছিল, এবং তাদের অভিব্যক্তি ডেটার পারস্পরিক সম্পর্ক (পিয়ারসন পারস্পরিক সম্পর্ক সহগ: 0.91979) ছিল S1 চিত্রে দেখানো হয়েছে। সিকোয়েন্সিং কাঁচা ডেটা NCBI SRA ডাটাবেসে আপলোড করা হয়েছে (অ্যাক্সিশন নম্বর: SRX857402 এবং SRX858938)। আমরা আরও বিশ্লেষণের জন্য 2013- বছরের নমুনায় চিহ্নিত প্রকাশিত জিন ব্যবহার করেছি। সমস্ত প্রকাশিত প্রতিলিপিগুলির জন্য কার্যকরী টীকা তথ্য দুটি পদ্ধতি ব্যবহার করে প্রাপ্ত হয়েছিল। প্রথমত, সমস্ত প্রকাশিত প্রতিলিপিগুলি ব্লাস্ট অ্যালগরিদম দ্বারা পৃথকভাবে পরিচিত নিউক্লিওটাইড (জেনব্যাঙ্ক এনটি) এবং পেপটাইড সিকোয়েন্স ডেটাবেস (জেনব্যাঙ্ক এনআর এবং অ্যারাবিডোপসিস পেপটাইড) এর সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল। 63,957 টির মধ্যে প্রকাশিত প্রতিলিপি,

29,220 (45.7%) টীকা করা হয়েছে এবং E-value cutoff 1e-20 সহ তিনটি বিষয়ের ডেটাবেসের যে কোনো একটিতে অনুক্রমের সমতা দেখানো হয়েছে। ইতিমধ্যে, ট্রান্সডিকোডার সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে সমস্ত প্রকাশিত ট্রান্সক্রিপ্ট সিকোয়েন্সের জন্য প্রার্থী কোডিং অঞ্চলগুলি ভবিষ্যদ্বাণী করা হয়েছিল, এবং প্রতিটি প্রতিলিপির জন্য দীর্ঘতম ORFগুলি Pfam ডোমেন অনুসন্ধানের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল। ফলস্বরূপ, Pfam ডাটাবেসের উপর ভিত্তি করে 21,358 (33.4%) প্রতিলিপি টীকা করা হয়েছিল। সামগ্রিকভাবে, 30,098 (47.1%) প্রতিলিপিগুলি উপরের দুটি পদ্ধতিকে একত্রিত করে পাবলিক ডাটাবেসে পরিচিত জিনের সাথে উল্লেখযোগ্যভাবে মিলেছে। ফাংশন টীকা সহ সম্পূর্ণ প্রকাশিত প্রতিলিপি তালিকা সম্পূরক ডেটা (S2 ডেটাসেট) এ দেখানো হয়েছিল।

আমরা 18.99% সিকোয়েন্সিং রিডের সাথে সঙ্গতিপূর্ণ শীর্ষ 20টি সর্বাধিক প্রকাশিত ট্রান্সক্রিপ্ট (টেবিল 2) জরিপ করেছি এবং দেখেছি যে তাদের বেশিরভাগই অ্যাবায়োটিককে সাড়া দেয় জিন।

স্ট্রেস উদ্দীপনা। ডিহাইড্রিন (DHNs), হাইড্রোফিলিক এবং থার্মোস্টেবল স্ট্রেস প্রোটিনের একটি শ্রেণী যার উচ্চ সংখ্যক চার্জযুক্ত অ্যামিনো অ্যাসিড রয়েছে যা গ্রুপ II লেট এমব্রায়োজেনেসিস অ্যাবন্ড্যান্ট (LEA) পরিবারের অন্তর্গত, সবচেয়ে বেশি প্রকাশ করা জিন। তিনটি ভিন্ন ডিহাইরিন ট্রান্সক্রিপ্ট (com28713_c0_seq1/2/4) শনাক্ত করা হয়েছে যেগুলি মাংসল কান্ডে অত্যন্ত প্রকাশ করা হয়েছে যা খরার চাপের কারণে কোষকে ক্ষতির হাত থেকে রক্ষা করতে জড়িত হতে পারে। অন্যান্য স্ট্রেস-সম্পর্কিত জিন যেমন হিট শক প্রোটিন, প্যাথোজেন-সম্পর্কিত প্রোটিন এবং মেটালোথিওনিনকেও খুব বেশি প্রকাশ পাওয়া গেছে, যা এর গুরুতর বেঁচে থাকার পরিবেশের সাথে সম্পর্কিত হতে পারে। উপরন্তু, 26S রাইবোসোমাল RNA জিন (comp22329_c2_seq1), auxin-repressed/ dormancy-সংযুক্ত প্রোটিন (comp20999_c0_seq1) সহ কিছু গঠনমূলক জিন, ADP-রাইবোসিলেশন ফ্যাক্টর (comp20499_ c0_seq1)ও অত্যন্ত প্রতিলিপি করা হয়েছিল।

PHGS75% ECH 30% ACT 12% ইমিউনিটি উন্নত করার জন্য ন্যাচারাল সিস্টানচে টিউবুলোসা