সাইক্লোপেন্টানোন B16F10 মেলানোমা-এ অ্যান্টি-মেলানোজেনেসিস এবং অ্যান্টি-রিঙ্কেল কার্যকলাপগুলি প্রয়োগ করে
Mar 26, 2022
যোগাযোগ:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
হি জিন জং 1, এ কিয়ং লি 1,2, ইয়েও জিন পার্ক 1,2, সাংগওন লি 1,2, ডংওয়ান কাং 1,2, ইয়ং সুক জং 1,2, হে ইয়ং চুং 1,2 এবং হিউং রিয়ং মুন 1, 2,*
বিমূর্ত:আল্ট্রাভায়োলেট (ইউভি) বিকিরণ এক্সপোজার হল বাহ্যিক ত্বকের বার্ধক্যের প্রাথমিক কারণ, যার ফলে ত্বকের হাইপারপিগমেন্টেশন এবং কুঁচকে যায়। এই সমীক্ষায়, আমরা B16F10 মেলানোমাতে (2E,5E)-2,5-bis(3-হাইড্রক্সি-4-মিথোক্সিবেনজাইলিডিন) সাইক্লোপেন্টানোন (BHCP) এর সাদা করার প্রভাব এবং এর অ্যান্টি- এইচএস 27 ফাইব্রোব্লাস্ট কোষগুলিতে বলি কার্যকলাপ। BHCP 1.10 μM এবং 8.18 μM ফরমাইকোফেনোলেট (L-tyrosine) এবং ডিফেনোলেজ (L-DOPA) এর 50 শতাংশ ইনহিবিশন কনসেন্ট্রেশন (IC50) মান সহ টাইরোসিনেজকে শক্তিশালীভাবে বাধা দিতে দেখা গেছে, এবং এনজাইম গতিবিদ্যা গবেষণায় দেখা গেছে যে BHCP-এর মধ্যে একটি কমপিটাইটিভ-সিপি-টাইরোসিনেস। . অধিকন্তু, বিএইচসিপি মেলানিন সামগ্রী এবং সেলুলার টাইরোসিনেজ কার্যকলাপকে উল্লেখযোগ্যভাবে বাধা দেয় এবং মাইক্রোফথালমিয়া-অ্যাসোসিয়েটেড ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর (এমআইটিএফ), সিএএমপি রেসপন্স এলিমেন্ট-বাইন্ডিং (সিআরইবি) প্রোটিনের ফসফরিলেটেড লেভেল এবং টাইরোসিনেজ ইন -ইমেলানোসাইটেড-ইন্ড্রোসিনস-এর মাত্রা কমিয়ে দেয়। B16F10 মেলানোমা কোষ। তাছাড়া, BHCP Hs27 ফাইব্রোব্লাস্টে p65 এর ফসফোরিলেশন এবং ম্যাট্রিক্স মেটালোপ্রোটিনেসেস (MMP-1, MMP-9, MMP-12, এবং MMP-13) এর প্রকাশকে বাধা দেয়। UV বিকিরণ দ্বারা উদ্দীপিত। অতএব, আমাদের ফলাফলগুলি দেখায় যে হাইপারপিগমেন্টেশন এবং কুঁচকানো রোগের জন্য থেরাপিউটিক এজেন্টগুলির বিকাশের জন্য BHCP একটি ভাল প্রার্থী হতে পারে।
কীওয়ার্ড: (2E,5E)-2,5-Bis(3-hydroxy-4-methoxybenzylidene)cyclopentanone (BHCP); টাইরোসিনেজ ইনহিবিটার;মেলানোজেনেসিস-বিরোধী; বিরোধী বলি
সিস্তানচেবিরোধী wrinkling.
1। পরিচিতি
ত্বকের বার্ধক্য একটি জটিল এবং প্রগতিশীল প্রক্রিয়া যা ত্বকে কার্যকরী এবং নান্দনিক পরিবর্তনের দিকে পরিচালিত করে, অভ্যন্তরীণ এবং বহির্মুখী উভয় কারণই দায়ী [1]। বহির্মুখী ত্বকের বার্ধক্য পরিবেশগত আক্রমণকারীদের দ্বারা সৃষ্ট হয়, যেমন অতিবেগুনী (UV) বিকিরণ, চাপ বা ধূমপান। যাইহোক, এটি মূলত সূর্য থেকে UV-এর সাথে বারবার এক্সপোজারের কারণে ঘটে, যাকে ফটোএজিং বলা হয়। ত্বকের ফটোজিং মোটা এবং গভীর বলিরেখা, পুরুত্ব, রুক্ষতা, ডিস্পিগমেন্টেশন এবং হিস্টোলজিক্যাল পরিবর্তন [2-4] দ্বারা চিহ্নিত করা হয়।
টাইরোসিনেজ (EC 1.14.18.1), যা পলিফেনল অক্সিডেস নামেও পরিচিত, মেলানিন সংশ্লেষণে জড়িত বহুমুখী কপার-ধারণকারী এনজাইমগুলির মধ্যে একটি এবং এটি প্রকৃতিতে ব্যাপকভাবে পাওয়া যায় [৫]। টাইরোসিনেজ সাধারণত বেশিরভাগ অণুজীব, উদ্ভিদ, এবং প্রাণী। উদ্ভিদে, টাইরোসিনেজ মনোফেনলগুলিকে ডিফেনলে (মাইকোফেনোলেট কার্যকলাপ) অক্সিডাইজ করে কাজ করে এবং ও-ডিফেনলগুলিকে ও-কুইনোনে (ডিফেনোলেজ কার্যকলাপ) জারণে জড়িত, তারপরে কুইনোনগুলিকে গাঢ়-বাদামী রঙ্গকগুলিতে জারণ করে [6]।
মেলানোজেনেসিস হল এল-টাইরোসিনের 3,4-ডাইহাইড্রোক্সিফেনিল্যালানিনে (এল-ডোপা) রূপান্তর, যার ফলে এল-ডোপা ডোপা কুইনাইনে রূপান্তরিত হয় [7]। সুতরাং, টাইরোসিনেজ মেলানোসাইটগুলিতে মেলানিন উত্পাদনে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে এবং টাইরোসিনেজের বাধা হল পিগমেন্টেশন-সম্পর্কিত ব্যাধিগুলির উন্নতি এবং হোয়াইটিংএজেন্টগুলির বিকাশের জন্য একটি আকর্ষণীয় লক্ষ্য [8,9]। মেলানিন সংশ্লেষণ বিভিন্ন উদ্দীপনা দ্বারা প্ররোচিত হয়, যেমন UV এবং রাসায়নিক পদার্থ যার মধ্যে isobutylmethylxanthine (IBMX) এবং আলফা-মেলানোসাইট-উত্তেজক হরমোন ( -MSH)। -এমএসএইচ এর রিসেপ্টর মেলানোকোর্টিন 1 রিসেপ্টর (MC1R) এর সাথে আবদ্ধ করে, পরবর্তীকালে সাইটোপ্লাজমিক সাইক্লিক এএমপি (সিএএমপি) স্তর বৃদ্ধি করে। বর্ধিত সিএএমপি স্তর প্রোটিন কাইনেজ এ (পিকেএ) সক্রিয় করে, যা সিএএমপি রেসপন্সেলিমেন্ট-বাইন্ডিং প্রোটিন (সিআরইবি) এর ফসফোরিলেশনের মাধ্যমে মাইক্রোফথালমিয়া-সম্পর্কিত ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর (এমআইটিএফ) এর অভিব্যক্তিকে প্ররোচিত করে। MITF টাইরোসিনেজ, টাইরোসিনেজ-সম্পর্কিত প্রোটিন(TRP)-1, এবং TRP-2 এর অভিব্যক্তিকে প্ররোচিত করে, যার ফলে শেষ পর্যন্ত মেলানিন সংশ্লেষণ বৃদ্ধি পায় [10]। MITF মেলানোজেনেসিসের একটি কী-ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর হিসাবে বিবেচিত হয়; অতএব, মেলানোজেনেসিস [১১] প্রতিরোধ করতে এমআইটিএফ-এর অভিব্যক্তি নিয়ন্ত্রণ করতে অনেক গবেষণা করা হয়েছে।
বলি গঠন ত্বকের এক্সট্রা সেলুলারম্যাট্রিক্সের অবক্ষয়ের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে জড়িত বলে পরিচিত, এবং UV বিকিরণ নিউক্লিয়ার ফ্যাক্টর-κB (NF-κB) সক্রিয় করে, যার ফলে কোলাজেন ফ্র্যাগমেন্টেশন এবং ম্যাট্রিক্স মেটালোপ্রোটিনেসেস (MMPs) [2] এর উৎপাদন বৃদ্ধি পায়। এমএমপিগুলি হল জিঙ্ক-নির্ভর এন্ডোপেপ্টিডেস যা ত্বকের এক্সট্রা সেলুলার ম্যাট্রিক্সস্ট্রাকচারের পুনর্নির্মাণে গুরুত্বপূর্ণ। সুতরাং, UV-প্ররোচিত MMPs দ্বারা কোলাজেন এবং ম্যাট্রিক্সের অত্যধিক অবক্ষয় ফটোড্যামেজড ত্বকের একটি বৈশিষ্ট্যযুক্ত বৈশিষ্ট্য, এবং MMPগুলি UV-প্ররোচিত ফটোজিংয়ের পাশাপাশি ত্বকের প্রদাহের একটি প্রধান চিহ্নিতকারী হিসাবে ব্যবহৃত হয় [12]।
কারকিউমিন-এর মতো ডায়েরিলহেপ্টেনয়েড কঙ্কাল ডেরিভেটিভগুলি অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট, রিপোর্ট্যান্টিক্যান্সার, কার্যকলাপ (BHCP) (চিত্র 1),প্রদাহ-বিরোধী, মেলানোজেনেসিস-বিরোধী বিস্তৃত পরিসর প্রদর্শন করতে, বিশেষ করে, লিও এট আল। [১৯] বায়োঅ্যাক্টিভিটি, এবং অ্যান্টি-টাইরোসিনেজ [১৩-১৮] ডিবেনজাইলিডিন-সাইক্লোপেন্টানোন 2014-এ রিপোর্ট করা হয়েছে যা Wnt/ -cateninsignaling পাথওয়ের নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে মানুষের অস্টিওসারকোমার প্রতিরক্ষামূলক প্রভাবে অবদান রাখতে পারে। যাইহোক, BHCP-এর অ্যান্টি-মেলানোজেনেসিস এবং অ্যান্টি-রিঙ্কেল প্রভাবগুলি এখনও আবিষ্কৃত হয়েছে, এবং এর কার্যকলাপের অন্তর্নিহিত আণবিক প্রক্রিয়াগুলি এখনও স্পষ্টভাবে প্রতিষ্ঠিত হয়নি।
চিত্র 1. (2E,5E)-bis(3-হাইড্রক্সি-4-মিথক্সিবেনজাইলিডিন) সাইক্লোপেন্টানোন (BHCP) এর গঠন।
বর্তমান সমীক্ষায়, আমরা বিএইচসিপি-এর অ্যান্টি-মেলানোজেনেসিস এবং অ্যান্টি-রিঙ্কেল সম্ভাব্যতা তদন্ত করেছি এবং জড়িত প্রক্রিয়া চিহ্নিত করার চেষ্টা করেছি, বিশেষত মেলানিন সামগ্রী এবং সেলুলার টাইরোসিনেজ কার্যকলাপের ক্ষেত্রে, যা টাইরোসিনেজ ইনহিবিশন অ্যাস এবং এনজাইম গতিবিদ্যার বিশ্লেষণ ব্যবহার করে অন্বেষণ করা হয়েছিল। অধিকন্তু, আমরা দেখিয়েছি যে BHCP মেলানোজেনেসিস এবং বলিরেখার উপর একটি প্রতিরোধমূলক প্রভাব প্রয়োগ করে যা -MSH-প্ররোচিতB16F10 মাউস মেলানোমা কোষে সিআরইবি/এমআইটিএফ/টাইরোসিনেজের ডাউনরেগুলেশন এবং পি65 এবং এমএমপি এক্সপ্রেশন হিউম্যানব্লাস্ট-ইন্ড ফাইভস2-এর ফসফোরিলেশনের বাধার সাথে সম্পর্কিত।
ড্রাগন ভেষজ cistanche
2. ফলাফল এবং আলোচনা
2.1। (2E,5E)-2,5-Bis(3-হাইড্রক্সি-4-মিথক্সিবেনজাইলিডিন) সাইক্লোপেন্টানোন (BHCP) এর সংশ্লেষণ
{{0}}হাইড্রক্সি-4-মিথক্সিবেনজালডিহাইড (100 মিলিগ্রাম, 0.66 মিমিওল, আইসোভানিলিন) এবং সাইক্লোপেন্টানোন (0.03 মিলি, 0.33) এর দ্রবণ mmol) 1 N HCl-অ্যাসিটিক অ্যাসিড দ্রবণে (0.02 mL) 2 ঘন্টার জন্য 25 ◦C এ নাড়াচাড়া করা হয়েছিল। 1 দিন দাঁড়িয়ে থাকার পর, বিক্রিয়া মিশ্রণটিকে অল্প পরিমাণে মিথানলের উপস্থিতিতে ঠান্ডা জলে শোধন করা হয়, ফিল্টার করা হয় এবং ঠান্ডা জলে ধুয়ে 56.9 শতাংশ ফলনে BHCP (65.9 mg) উৎপন্ন করা হয়। 1H এবং 13C-NMR, সেইসাথে প্রকাশিত বর্ণালী ডেটা এবং থিন লেয়ার ক্রোমাটোগ্রাফি (TLC) বিশ্লেষণের সাথে তুলনা করে [19]। কাঠামোটি চিত্র 1 এ দেখানো হয়েছে।
BHCP: হলুদ নিরাকার পাউডার (CHCl3); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ: 9.25 (s, 2H, 2 × OH), 7.28(s,2H,2×vinylicH), 7.14 (d, 2H) , J=2৷{58}} Hz, 2 × 2-H), 7.11 (dd, 2H, J=8.5, 2.0 Hz, 2×6- H),7.01 (d, 2H, J=8.5 Hz, 2 × 5-H), 3.81 (s, 6H, 2 × OMe), 3.01 (s, 4H, 2 × CH2) ; 13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6) δ: 195.5, 149.9, 147.2, 136.0, 133.1, 129.1, 124.3, 117.5, 112.8, 56.3, 26; ESI-MS: m/z 351 (M − H)−.
2.2। মাশরুম টাইরোসিনেজ কার্যকলাপের উপর বিএইচসিপি-এর প্রতিরোধমূলক প্রভাব
সারণি 1-এ দেখানো হিসাবে, BHCP 1.10 ± 0.12 μMand 8.18 ± 0.44 μM এর IC50 মান সহ টাইরোসিনেজকে বাধা দেয়, যেখানে কোজিক অ্যাসিড (ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ) এর IC50 মান ছিল 18.68 ±.13±4 ±.13 ±.13μM মনোফেনোলেজ এবং ডিফেনোলেজের জন্য যথাক্রমে μM। টাইরোসিনেজের সিন্থেটিক সম্ভাব্য ইনহিবিটরগুলির আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণায়, আমরা আণবিক মডেলিং অধ্যয়নের মাধ্যমে প্রক্রিয়াটি খুঁজে পেয়েছি যার মাধ্যমে বেনজিলিডিনের 3-হাইড্রক্সি এবং 4-মিথক্সি গ্রুপগুলি টাইরোসিনেজ সক্রিয় সাইটের দিকে দুর্দান্ত বাঁধাই করার প্রবণতা ছিল [20]। এই অধ্যয়নের ফলাফল থেকে, এটি দেখানো হয়েছিল যে এর কার্যকরী গোষ্ঠীগুলি (3-হাইড্রক্সি এবং 4-মিথক্সি গ্রুপ) টাইরোসিনেসিনহিবিটরি কার্যকলাপের উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধির সাথে যুক্ত ছিল।
সারণী 1. টাইরোসিনেজ ইনহিবিটরি অ্যাক্টিভিটি এবং বিএইচসিপির এনজাইম গতিগত বিশ্লেষণ।
তদ্ব্যতীত, বিএইচসিপি দ্বারা টাইরোসিনেজ প্রতিরোধের জন্য দায়ী প্রক্রিয়াটি বর্তমান গবেষণায় এনজাইম গতিগত বিশ্লেষণ দ্বারা তদন্ত করা হয়েছিল (সারণী 1 এবং চিত্র 2)। লাইনওয়েভার-বার্ক প্লটগুলি গতিগত অধ্যয়ন থেকে প্রাপ্ত ডেটা ব্যবহার করে এবং ডিক্সন প্লট থেকে ইনহিবিশন কনস্ট্যান্ট (কি) প্রাপ্ত হয়েছিল। লাইনওয়েভার-বার্ক ডবল পারস্পরিক প্লটগুলি প্রতিযোগিতামূলক-প্রকার বাধা নির্দেশ করে। চিত্র 2a-c-তে দেখানো হয়েছে, BHCP L-tyrosine এবং L-DOPA উভয়েরই একটি প্রতিযোগিতামূলক প্রতিরোধক হিসাবে কাজ করেছে। তাছাড়া, ডিক্সন প্লটের x-অক্ষে বাধাগুলি সাধারণত একটি এনজাইম-ইনহিবিটর কমপ্লেক্স [21,22] এর জন্য এনজাইম ইনহিবিশন কনস্ট্যান্টস (Ki) এর ধরন নির্ধারণ করতে ব্যবহৃত হয়, যেখানে থিক্স-অক্ষের মান −Ki-এর মান নির্দেশ করে। চিত্র 2b–d-এ যেমন দেখানো হয়েছে, BHCP-এর কি মানগুলি যথাক্রমে L-tyrosine এবং L-DOPA-এর সাবস্ট্রেট হিসাবে 1.7 μMand 10.5 μM ছিল। যেহেতু কি মান একটি এনজাইম-ইনহিবিটর কমপ্লেক্স গঠনের জন্য প্রয়োজনীয় ঘনত্বের প্রতিনিধিত্ব করে, তাই কম কি মান টাইরোসিনেজের বিরুদ্ধে আরও কার্যকরী প্রতিরোধের পরামর্শ দেয়।
চিত্র 2. লাইনওয়েভার-বার্ক (a,c) এবং ডিক্সন (b,d) BHCP দ্বারা টাইরোসিনেজ এনজাইম বাধার জন্য প্লট।
2.3। B16F10 মেলানোমা এবং Hs27 ফাইব্রোব্লাস্ট কোষের কোষের কার্যক্ষমতার উপর BHCP-এর প্রভাব
BHCP কোনো অ্যান্টি-মেলানোজেনেসিস এবং অ্যান্টি-রিঙ্কেল ক্রিয়াকলাপ প্রয়োগ করেছে কিনা তা নির্ধারণ করার আগে, আমরা বিভিন্ন সময়ের ব্যবধানে BHCP-এর বিভিন্ন ঘনত্বের সাথে চিকিত্সার মাধ্যমে BHCP থেকে B16F10 কোষ এবং Hs27 কোষগুলির সাইটোটক্সিসিটি পরীক্ষা করেছি এবং কোষের কার্যক্ষমতা EZ-সাইটক্স অ্যাস দিয়ে পরিমাপ করা হয়েছিল। চিত্র 3a,b-তে দেখানো হয়েছে, 48 ঘন্টার জন্য BHCP-এর 10 μM পর্যন্ত B16F10 কোষ বা Hs27 কোষের বেঁচে থাকাকে হ্রাস করেনি। পরবর্তীকালে, BHCP-এর অ্যান্টি-মেলানোজেনেসিস এবং অ্যান্টি-রিঙ্কেল ক্রিয়াকলাপগুলির উপর আরও ইন ভিট্রো অধ্যয়নগুলি 1, 5, এবং 10 μM দিয়ে পরিচালিত হয়েছিল।
চিত্র 3।B16F10 মেলানোমাতে BHCP এর কোষের কার্যকারিতা (a) এবং Hs27 ফাইব্রোব্লাস্ট কোষ (b).
2.4। B16F10 মেলানোমা কোষে মেলানিন সামগ্রী এবং সেলুলার টাইরোসিনেজ কার্যকলাপের বিরুদ্ধে BHCP-এর বাধা
BHCP -MSH-প্ররোচিতB16F10 কোষের মেলানিন সামগ্রীর উপর প্রতিরোধ ক্ষমতা প্রয়োগ করে কিনা তা নির্ধারণ করতে, কোষগুলিকে 24 ঘন্টার জন্য BHCP বা কোজিক অ্যাসিড (5 মিমি) নির্দেশিত বিভিন্ন ঘনত্ব (1, 5, এবং 10 μM) দিয়ে প্রিট্রিট করা হয়েছিল এবং তারপরে উদ্দীপিত করা হয়েছিল। 48 ঘন্টার জন্য -MSH সহ। চিত্র 4a তে দেখানো হয়েছে, -এমএসএইচ-এর উপস্থিতিতে BHCP-এর সাথে চিকিত্সা করা কোষে মেলানিনের পরিমাণ ঘনত্ব-নির্ভর পদ্ধতিতে হ্রাস পায়, যা 1 μM-এ 113 শতাংশ, 5 μM-তে 106 শতাংশ এবং 10 μM-তে 102 শতাংশ দেখায়। নিয়ন্ত্রণ গ্রুপ শুধুমাত্র -এমএসএইচ দিয়ে চিকিত্সা করা হয় (186 শতাংশ)। মজার বিষয় হল, বিএইচসিপি (1 μM) কোজিক অ্যাসিডের (5 মিমি) তুলনায় মেলানিনের উপাদানকে বেশি বাধা দেয়। অধিকন্তু, B16F10 কোষে BHCP-এর প্রতিরোধক প্রভাব পরিমাপ করার জন্য একটি সেলুলার টাইরোসিনেজ কার্যকলাপ অ্যাসেই করা হয়েছিল। চিত্র 4b-তে দেখানো হয়েছে, শুধুমাত্র -MSH-এর সাথে চিকিত্সা করা নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর তুলনায় BHCP 1 μM-এ 120 শতাংশ, 5 μM-এ 116 শতাংশ এবং 10 μM-তে 105 শতাংশ টাইরোসিনেজ কার্যকলাপের সাথে ঘনত্ব-নির্ভর পদ্ধতিতে হ্রাস পেয়েছে (181) শতাংশ .কোজিক অ্যাসিডের তুলনায় বিএইচসিপি-এর প্রতিরোধমূলক প্রভাব অনেক বেশি শক্তিশালী ছিল; 1 μM এ BHCP এর বাধা 5 মিমি (131 শতাংশ) এ কোজিক অ্যাসিডের চেয়ে উচ্চতর ছিল। এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে B16F10 মেলানোসাইটগুলিতে মেলানিন জৈব সংশ্লেষণ এবং অন্তঃকোষীয় টাইরোসিনেজ সংশ্লেষণকে বাধা দিয়ে বিএইচসিপি-এর একটি সাদা প্রভাব রয়েছে।
চিত্র 4. B16F10 মেলানোমা কোষে BHCP এর মেলানিন বিষয়বস্তু (a) এবং সেলুলার টাইরোসিনেজ কার্যকলাপ (b) এর বাধা।
2.5। B16F10 কোষে MITF/Tyrosinase এবং Phosphorylated CREB এর প্রকাশের উপর BHCP-এর প্রভাব
এমআইটিএফ, একটি নির্দিষ্ট ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর, টাইরোসিনেজ সহ মেলানোজেনিকজিনগুলিকে কার্যকরভাবে সক্রিয় করতে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে, মেলানিন জৈব সংশ্লেষণে হার-সীমিত পদক্ষেপকে অনুঘটক করে: টিআরপি-1, এবং টিআরপি-2।এমআইটিএফ-এর অভিব্যক্তি হতে পারে CREB এর ফসফোরিলেশন দ্বারা বৃদ্ধি পায় [23]। CREB হল একটি গুরুত্বপূর্ণ MITF প্রবর্তক [24,25], এবং মেলানোসাইটগুলিতে CREB-এর ফসফোরিলেশন মেলানোসাইটগুলিতে CREB (c-AMP প্রতিক্রিয়া উপাদান-বাইন্ডিং প্রোটিন) এর সাথে আবদ্ধ হয়ে MITF অভিব্যক্তি বাড়ায় [26]। B16F10 কোষে BHCP-এর অ্যান্টি-মেলানোজেনিক প্রভাবের জন্য দায়ী আণবিক পথগুলি ব্যাখ্যা করার জন্য, আমরা CREB এবং MITF সহ মূল অণুর প্রোটিন স্তরগুলি পরীক্ষা করেছি, যা ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণের মাধ্যমে মেলানোজেনেসিসে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। কোষগুলিকে বিএইচসিপি বা কোজিক অ্যাসিড দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং তারপর 48 ঘন্টার জন্য -এমএসএইচ দ্বারা উদ্দীপিত হয়েছিল। পরিমাপের জন্য সময়ের ব্যবধান পূর্ববর্তী গবেষণায় বর্ণিত পদ্ধতি অনুসরণ করে [27]। চিত্র 5-এ দেখানো হয়েছে, টাইরোসিনেজ এবং MITF মাত্রা -MSH-এর সাথে বৃদ্ধি পেয়েছে, কিন্তু BHCP এই প্রোটিনের মাত্রা হ্রাস করেছে। অধিকন্তু, CREB-এর ফসফোরিলেশন উল্লেখযোগ্যভাবে BHCP দ্বারা দমন করা হয়েছিল। -এমএসএইচ-প্ররোচিত সিআরইবি ফসফোরিলেশনের নিয়ন্ত্রণ পিগমেন্টেশন নিয়ন্ত্রণে সম্ভাব্য গুরুত্বপূর্ণ বলে পরিচিত [২৮]। এই ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে বিএইচসিপি-এর অ্যান্টি-মেলানোজেনিক প্রভাবগুলি ফসফরিলেটেড সিআরইবি-র ডাউনরেগুলেশনের মাধ্যমে এমআইটিএফ এবং টাইরোসিনেজের নিম্ন নিয়ন্ত্রণের ফলে। বর্তমান সমীক্ষায় পরামর্শ দেওয়া হয়েছে যে টাইরোসিনেজ এবং মেলানোজেনেসিসে বিএইচসিপি-এর প্রতিরোধ প্রক্রিয়ার ব্যাখ্যা অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ এবং ভবিষ্যতে আরও তদন্ত করা আবশ্যক। যদিও B16F10 মেলানোমা সেল লাইন সাধারণত ভিট্রোতে সিগন্যালিং মেকানিজমের তদন্তের জন্য বেশি উপযুক্ত, B16F10 সেল লাইনটি একটি ইঁদুর মেলানোমা। অতএব, ফলাফলগুলি নিশ্চিত করার জন্য মানব মেলানোসাইটের উপর আরও গবেষণা করা প্রয়োজন।
চিত্র 5।সিআরইবি, এমআইটিএফ এবং টাইরোসিনেসিনের ফসফোরিলেশনের অভিব্যক্তি স্তরে বিএইচসিপি-র প্রভাব -এমএসএইচ-উদ্দীপিত B16F10 মেলানোমা কোষ।
2.6। Hs27 কোষে UV-প্ররোচিত NF-κB p-p65 সক্রিয়করণের উপর BHCP-এর প্রভাব
আমরা পরবর্তীতে Hs27 ফাইব্রোব্লাস্ট ব্যবহার করে প্রদাহজনক মধ্যস্থতার UV-প্ররোচিত অভিব্যক্তিতে BHCP-এর প্রভাব তদন্ত করেছি। এটি পূর্বে রিপোর্ট করা হয়েছে যে p65 (Ser536) এর ফসফোরিলেশন জিনগুলিকে ট্রান্স্যাক্টিভেট করার ক্ষমতার জন্য অপরিহার্য [29]। অতএব, p-p65 (Ser536) এবংp65 এর প্রোটিন স্তরগুলি ওয়েস্টার্ন ব্লটিং দ্বারা নিউক্লিয়াস ভগ্নাংশে পরীক্ষা করা হয়েছিল। চিত্র 6a,b-তে যেমন নির্দেশ করা হয়েছে, Hs27 কোষে, UV নিউক্লিয়াসে p-p65 (Ser536) প্রোটিনের মাত্রা বাড়িয়েছে, যেখানে BHCP-এর চিকিত্সা নিউক্লিয়াস p-p65 (Ser536) প্রোটিনের মাত্রা হ্রাস করেছে। তদনুসারে, p65 এর মোট পরিমাণ সাইটোপ্লাজমে UV দ্বারা হ্রাস পেয়েছে এবং BHCP দ্বারা পুনরুদ্ধার করা হয়েছে (চিত্র 6c,d)। যদিও p65 এর প্রোটিন এক্সপ্রেশন লেভেল সাইটোপ্লাজমে হ্রাস পেয়েছিল এবং UV ইনডাকশনের পরে নিউক্লিয়াসে বৃদ্ধি পেয়েছে, BHCP এর সাথে প্রিট্রিটমেন্ট ডোজ-নির্ভর পদ্ধতিতে এই প্রবণতাগুলিকে বিপরীত করেছে। সুতরাং, এই ফলাফলগুলি ইঙ্গিত করে যে BHCP দ্বারা p-p65 এর বাধা ত্বকের পিগমেন্টেশন এবং UV এর বিরুদ্ধে কোলাজেন ধ্বংসের প্রতিরক্ষামূলক প্রভাবগুলিতে অবদান রাখতে পারে।
চিত্র 6. UV-প্ররোচিত Hs27 হিউম্যানফাইব্রোব্লাস্ট কোষে p-p65 (Ser536) এর অভিব্যক্তি স্তরের উপর BHCP-এর প্রভাব।
2.7। Hs27 কোষে MMP-এর অভিব্যক্তিতে BHCP-এর প্রভাব
এমএমপিগুলি ত্বকের বার্ধক্যে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। UV বিকিরণ MMPs [30,31] এর অভিব্যক্তিকে নিয়ন্ত্রণ করে ত্বকের সংযোজক টিস্যুগুলিকে পরিবর্তন করে। MMP-1 হল একটি কোলাজেন-পচনশীল এনজাইমেট যা টাইপ I প্রোকোলাজেন থেকে সংশ্লেষিত কোলাজেনের ভাঙ্গনকে ত্বরান্বিত করে। MMP-9 হল জেলটিন-পচনশীল এনজাইম যা MMP-1 দ্বারা কাটা কোলাজেন ফাইবারগুলিকে ভেঙে দেয়, বলিরেখার উত্পাদন এবং স্থিতিস্থাপকতা হ্রাস করে। UV আবেশের বিরুদ্ধে BHCP-এর অ্যান্টি-রিঙ্কেল প্রভাব পরীক্ষা করার জন্য, আমরা ওয়েস্টার্ন ব্লটিং দ্বারা MMP-1 এবং MMP-9 প্রোটিনের মাত্রা নির্ধারণ করেছি। অধিকন্তু, UV-প্ররোচিত কোষগুলি MMP-13-এর উল্লেখযোগ্যভাবে উন্নত স্তর দেখায়, যা MMP-1 [৩২] এর পরিবর্তে টাইপ I এবংIII কোলাজেনের অবক্ষয় শুরু করে। আমরা 1 এবং 10 μM এ BHCP এর সাথে UV-প্ররোচিত Hs27 কোষের চিকিত্সার পরে MMPs (MMP1, MMP9, MMP12, এবং MMP13) বৃদ্ধির তদন্ত করেছি। চিত্র 7-তে দেখানো হয়েছে, UV ইনডাকশনের পরে MMP-1, MMP-9, MMP-12, এবং MMP-13 এক্সপ্রেশনের মাত্রা বৃদ্ধি পেয়েছে; তবে, BHCP চিকিত্সা একটি ডোজে অভিব্যক্তি হ্রাস করেছে - নির্ভরশীল পদ্ধতি। আমাদের ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে বিএইচসিপি ইউভি এক্সপোজার দ্বারা প্ররোচিত এমএমপিগুলির অস্বাভাবিক উত্পাদন হ্রাস করে বলি গঠন প্রতিরোধে অবদান রাখতে পারে। এই ফলাফলগুলি বোঝায় যে BHCP কোলাজেন পচন রোধ করতে Hs27fibroblasts-এ MMP প্রকাশকে বাধা দেয় এবং এইভাবে বলি উৎপাদন। অতএব, বিএইচসিপি ত্বক-সম্পর্কিত রোগের প্রতিরোধক এবং চিকিত্সার ওষুধ হিসাবে ব্যবহারের সম্ভাবনা প্রদর্শন করে।
cistanche স্টেম সুবিধা
3. উপাদান এবং পদ্ধতি
3.1। রাসায়নিক এবং যন্ত্র
মাশরুম টাইরোসিনেজ (EC 1.14.18.1), -MSH, L-tyrosine, 3,4-ডাইহাইড্রোক্সিফেনিল্যালানিন (L-DOPA), ডাইমিথাইল সালফক্সাইড (DMSO), এবং কোজিক অ্যাসিড সিগমা-অলড্রিচ (সেন্ট লুইস,) থেকে কেনা হয়েছিল MO, USA)। Dulbecco-এর পরিবর্তিত ঈগলের মাধ্যম (DMEM), ভ্রূণের বোভাইন সিরাম, স্ট্রেপ্টোমাইসিন এবং অ্যামফোটেরিসিনগুলি Gibco Life Technologies Inc. (Carlsbad, CA, USA) থেকে কেনা হয়েছে। MITF,CREB, p-CREB, p-p65 (Ser536), p65, টাইরোসিনেজ, MMP-1, MMP-9, MMP-12, MMP-13, TFIIB-এর বিরুদ্ধে অ্যান্টিবডি , এবং -অ্যাক্টিনগুলি সান্তা ক্রুজ বায়োটেকনোলজি (সান্তা ক্রুজ, CA, USA) থেকে কেনা হয়েছে৷ মিলিপুর কর্পোরেশন (বেডফোর্ড, এমএ, ইউএসএ) থেকে পলিভিনিলিডিন ডিফ্লুরাইড (পিভিডিএফ) ঝিল্লি প্রাপ্ত হয়েছিল। টিস্যু সংস্কৃতির জন্য জীবাণুমুক্ত প্লাস্টিক গুদাম SPL ল্যাবওয়্যার (সিউল, কোরিয়া) থেকে কেনা হয়েছিল। UV লাইটসোর্স ক্রসলিংকার 800 সিরিজ (UVP, CA, USA) 6 ল্যাম্প ইউনিট (8 ওয়াট/ল্যাম্প) দ্বারা সরবরাহ করা হয়েছিল। সিলিকা জেলএফ-এ পাতলা-স্তর ক্রোমাটোগ্রাফি এবং সিলিকা জেল 60 (জাল 230–400) সঞ্চালিত হয়েছিল{{27} }মার্ক মিলিপুর (ডার্মস্ট্যাড, জার্মানি) থেকে প্রিকোটেড প্লেট। NMR স্পেকট্রা ভেরিয়ান ইউনিটি INOVA 400 (1H এর জন্য 400 MHz, 13C এর জন্য 100 MHz) এবং Varian Unity AS 500 (500 MHz ফর 1H) যন্ত্র ব্যবহার করে রেকর্ড করা হয়েছে। রাসায়নিক পরিবর্তনের মান (δ) সংশ্লিষ্ট অবশিষ্ট দ্রাবক বা ডিউরেটেড পিকস (DMSO-এর জন্য δH 2.50 এবং δC 39.51) উল্লেখ করে রিপোর্ট করা হয়। কম-রেজোলিউশন ভর স্পেকট্রোমেট্রি ডেটা একটি এক্সপ্রেশন CMS ভর স্পেকট্রোমিটার (Advion, Ithaca, NY, USA) দিয়ে প্রাপ্ত হয়েছিল।
3.2। মাশরুম টাইরোসিনেজ ইনহিবিশন অ্যাস
জুং এট আল দ্বারা বর্ণিত পদ্ধতির উপর ভিত্তি করে মাশরুম টাইরোসিনেজ ইনহিবিটরি অ্যাক্টিভিটি এল-টাইরোসিন এবং এল-ডোপিএ অ্যাসবস্ট্রেট উভয় ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল। [২৩]। সংক্ষেপে, 190 μL টাইরোসিনেজ এনজাইম (1000 ইউ মাশরুম টাইরোসিনেজ বাফারের সাথে মিশ্রিত, 1 মিমি এল-টাইরোসিন এবং এল-ডোপা দ্রবণ সহ) যোগ করা হয়েছিল, যৌগগুলির উপস্থিতি বা অনুপস্থিতিতে (চূড়ান্ত ঘনত্ব 1 থেকে 20 μM পর্যন্ত, দ্রবীভূত হয়) 100 শতাংশ DMSO), একটি 96-ওয়েল প্লেটের প্রতিটি কূপে, 200 μL এর চূড়ান্ত ভলিউম প্রদান করতে। প্লেটটি 37 ◦C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। একটি মাইক্রোপ্লেট রিডার (TECAN, সালজবার্গ, অস্ট্রিয়া) ব্যবহার করে 492 এনএম-এ শোষণ পরিমাপ করে টাইরোসিনেজ কার্যকলাপ পরিমাপ করা হয়েছিল এবং নিম্নলিখিত সমীকরণ থেকে শতাংশ বাধা (শতাংশ) প্রাপ্ত হয়েছিল:
শতাংশ প্রতিবন্ধকতা=(Ac − As)/Ac × 100 (1)
যেখানে Ac হল নিয়ন্ত্রণের শোষণ এবং As হল নমুনার শোষণ। IC50 মানগুলি লগ-রৈখিক বক্ররেখা এবং তাদের সমীকরণ থেকে গণনা করা হয়েছিল। তিনটি নির্ধারণের গড় ফলাফল দেখানো হয়েছে। কোজিক অ্যাসিড একটি ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।
3.3। টাইরোসিনেজ ইনহিবিশনের গতিগত বিশ্লেষণ
গতিগত প্রক্রিয়া নির্ধারণের জন্য, দুটি গতি পদ্ধতি (লাইনওয়েভার-বার্ক এবং ডিক্সন প্লট) পরিপূরকভাবে ব্যবহার করা হয়েছিল [21,22,33]। লাইনওয়েভার-বার্ক ডাবল পারস্পরিক প্লট (1/এনজাইম বেগ (1/V) বনাম 1/সাবস্ট্রেট ঘনত্ব (1/[S])) এর জন্য, বাধার ধরনটি এল-টাইরোসিনের বিভিন্ন ঘনত্ব নির্ধারণ করে (1, 2, এবং 4 মিমি) এবং এল-ডোপা (0.5, 1, এবং 2 মিমি) বিএইচসিপি-এর বিভিন্ন ঘনত্বের উপস্থিতিতে সাবস্ট্রেট হিসাবে। BHCP এর ঘনত্ব নিম্নরূপ ছিল:0, 0.5, 1.{{20}, এবং 2.{24}} L-টাইরোসিনের জন্য μM; এবং L-DOPA-এর জন্য 0, 2.5, 5, এবং 10 μM। ডিক্সন প্লট হল একটি গ্রাফিকাল পদ্ধতি (1/এনজাইম বেগ (1/V) এর প্লট ইনহিবিটর ঘনত্ব (I) এর বিরুদ্ধে) এনজাইম ইনহিবিশনের ধরন নির্ধারণের জন্য এবং এনজাইম-ইনহিবিটর কমপ্লেক্সের জন্য ডিসোসিয়েশন কনস্ট্যান্ট বা Ki নির্ধারণ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। 1, 2, এবং 4 মিমি এবং {{40}, 0.5, 1 এ এল-টাইরোসিন সাবস্ট্রেটের উপস্থিতিতে বাধার ডিক্সন প্লট (একক পারস্পরিক প্লট) প্রাপ্ত হয়েছিল৷ {47}}, এবং 2৷{49}} BHCP-এর জন্য μM; এবং L-ডোপাসাবস্ট্রেট {{50}}.5, 1৷{56}}, এবং 2.0 মিমি এবং BHCP এর জন্য 0, 2.5, 5.0, এবং 10.0 μM।
cistanche উদ্ভিদএকটি টাইরোসিনেজ ইনহিবিটার।
3.4। সেল লাইন এবং সেল সংস্কৃতি
মুরিন বি 16 এফ 10 মেলানোমা কোষগুলি কোরিয়ান সেল লাইন ব্যাংক থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। হিউম্যানস্কিন ফাইব্রোব্লাস্ট সেল লাইন Hs27 আমেরিকান টাইপ কালচার কালেকশন (ATCC, Manassas, VA, USA) থেকে কেনা হয়েছিল। এই কোষগুলি DMEM-এ রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল 10 শতাংশ ভ্রূণ বোভিনিসারাম, 100 U/mL পেনিসিলিন এবং 100 mg/mL স্ট্রেপ্টোমাইসিন একটি আর্দ্র 5 শতাংশ CO2 ইনকিউবেটোরেট 37 ◦C এর সাথে। 100 মিমি ডিশে ডার্মাল ফাইব্রোব্লাস্টগুলিকে বিএইচসিপি দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং সিরাম-মুক্ত ডিএমইএম (ইউভি লাইট সোর্স, ইউভিপি) তে 50 এমজে/সেমি 2 ইউভির সংস্পর্শে এসেছে। Hs27 কোষগুলিকে 70-80 শতাংশ সঙ্গমে 100 মিমি ব্যাসের প্লেটে সংস্কৃত করা হয়েছিল এবং প্যাসেজ নম্বর 5 এবং 15 এর মধ্যে ব্যবহার করা হয়েছিল।
3.5। কোষের কার্যকারিতা পরীক্ষা
EZ-Cytox কিট অ্যাস ব্যবহার করে কোষগুলির কার্যকারিতা মূল্যায়ন করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, B16F10 কোষ এবং Hs27ফাইব্রোব্লাস্টগুলিকে একটি 96-কূপ প্লেটে 1 × 104 কোষের ঘনত্বে/কূপে বীজ দেওয়া হয়েছিল এবং 24 ঘন্টার জন্য 37 ◦C-তে incubated করা হয়েছিল। কোষগুলিকে তাজা, সিরাম-মুক্ত DMEM খাওয়ানো হয়েছিল যাতে BHCP এর বিভিন্ন ঘনত্ব (0, 1, 2, 5, এবং 10 μM) থাকে এবং 24 এবং 48 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়। পরবর্তীকালে, প্রতিটি কূপে 10 μL EZ-Cytox দ্রবণ লোড করা হয়েছিল এবং কোষগুলি 2-4 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল। কোন চিকিত্সার অনুপস্থিতিতে কোষের শোষণ পরিমাপকে 100 শতাংশ কোষ বেঁচে থাকা হিসাবে গণ্য করা হয়েছিল। প্রতিটি চিকিত্সা জটিলভাবে সম্পাদিত হয়েছিল এবং প্রতিটি পরীক্ষা তিনবার পুনরাবৃত্তি হয়েছিল।
3.6। মেলানিন বিষয়বস্তু অ্যাস নির্ধারণ
B16F10 কোষে -MSH-প্ররোচিত মেলানোজেনেসিসে BHCP-এর প্রভাব সামান্য পরিবর্তন [34] সহ পূর্বে ব্যবহৃত পদ্ধতির উপর ভিত্তি করে ছিল। সংক্ষেপে, 6-কূপ প্লেটে B16F10 কোষ (5 × 104 কোষ/কূপ) 70-80 শতাংশ সঙ্গমে বৃদ্ধি পেতে দেওয়া হয়েছিল। তারপর কোষগুলিকে 24 ঘন্টার জন্য BHCP (1, 5, এবং 10 μM) বা কোজিক অ্যাসিড (5 মিমি) এর বিভিন্ন ঘনত্ব দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং তারপর 48 ঘন্টার জন্য -MSH (5 μM) দিয়ে উদ্দীপিত করা হয়েছিল। চিকিত্সার পরে, কোষগুলিকে বরফ-ঠান্ডা পিবিএস দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল, 1 ঘন্টার জন্য 60 ◦C তাপমাত্রায় DMSO (5 শতাংশ) সহ 90 μL 1 M NaOH দ্রবণে দ্রবীভূত করা হয়েছিল, এবং শোষণকে 405 nm-এ মাইক্রোপ্লেট স্পেকট্রোফোটোমিটার (TECAN, Salzburg) দিয়ে পরিমাপ করা হয়েছিল। , অস্ট্রিয়া)। পরীক্ষায় মেলানিনের পরিমাণ পরিমাপ করার জন্য, চিকিত্সা গোষ্ঠীতে বাধার হার সিন্থেটিক মেলানিনের পরিচিত ঘনত্বের শোষণ থেকে গণনা করা হয়েছিল, যা কোষের লাইসেটের সুপারনাট্যান্টে উপস্থিত মোট প্রোটিনের পরিমাণে সংশোধন করা হয়েছিল। অপরিশোধিত কোষগুলির শোষণ তিন প্রতিলিপিতে পরিমাপ করা হয়েছিল।
3.7। সেলুলার টাইরোসিনেস অ্যাকটিভিটি অ্যাস
সেলুলার টাইরোসিনেজ অ্যাকটিভিটি অ্যাস L-DOPA [35] এর অক্সিডেশনের হার পরিমাপ করে সঞ্চালিত হয়েছিল। 5 × 104/কোষের ঘনত্বের B16F10 কোষগুলিকে 6-কূপ থালাতে রাখা হয়েছিল এবং রাতারাতি সেঁকানো হয়েছিল৷ তারপর কোষগুলিকে 24 ঘন্টার জন্য BHCP (1, 5, এবং 10 μM) বা কোজিক অ্যাসিড (5 মিমি) এর বিভিন্ন ঘনত্ব দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং তারপর 48 ঘন্টার জন্য -MSH (5 μM) দিয়ে উদ্দীপিত করা হয়েছিল। কোষগুলিকে PBS দিয়ে ধুয়ে 100 μL 50 mM ফসফেট বাফার (pH 6.5), 0.1 mMphenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), এবং 1 শতাংশ Triton X-100 ধারণকারী একটি দ্রবণে লাইজ করা হয়েছিল। তারপরে, কোষগুলিকে একটি ডিপফ্রিজার মেশিনে (−80 ◦C) 30 মিনিটের জন্য স্থাপন করা হয়েছিল। কোষগুলিকে ডিফ্রোস্ট করার পরে, সেলুলার নির্যাসগুলিকে 12,000 rpm-এ 4 ◦C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা বিশুদ্ধ করা হয়েছিল৷ একটি 96-ওয়েল প্লেটে মোট 80 μL সুপারনাট্যান্ট এবং 20 μL ofL-DOPA (2 mg/mL) যোগ করা হয়েছিল, এবং 492 nm তরঙ্গদৈর্ঘ্যের শোষণ প্রতি 10 মিনিটে 37 ◦ এ 1 ঘন্টার মধ্যে পরিমাপ করা হয়েছিল একটি ELISA প্লেট রিডার সহ C (TECAN, Salzburg, Austria)।
3.8। Hs27 কোষের সাইটোসোলিক এবং পারমাণবিক নির্যাস প্রস্তুত করা
Hs27 কোষগুলি বরফ-ঠান্ডা পিবিএস দিয়ে ধুয়ে কাটা হয়েছিল। 10 mM Tris(pH 8.0), 1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.1 শতাংশ NP-40, এবং প্রোটিজ ইনহিবিটর সমন্বিত একটি বাফার সাইটোসোলিক ভগ্নাংশ নিষ্কাশনের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল 12 এ সেন্ট্রিফিউগেশন, 15 মিনিটের জন্য 4 ◦C এ rpm এবং পারমাণবিক ভগ্নাংশগুলি 10 মিমি ট্রিস, 50 মিমি কেসিএল, 100 মিমি NaCl, এবং প্রোটিস ইনহিবিটরযুক্ত একটি বাফার ব্যবহার করে পেলেট থেকে বের করা হয়েছিল, 30 মিনিটের জন্য ইনকিউবেটেড এবং তারপর পারমাণবিক ভগ্নাংশ পেতে 4 ◦C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য 13,000× g সেন্ট্রিফিউজ করা হয়।
3.9। পশ্চিমা শোষক
লাইসেটের নমুনাগুলি জেল-লোডিং বাফারে 10 মিনিটের জন্য সিদ্ধ করা হয়েছিল (125 মিমি ট্রিস-এইচসিএল, 4 শতাংশ সোডিয়ামডোডেসিল সালফেট (এসডিএস), 10 শতাংশ 2-মারকাপটোথেনল, এবং 0.2 শতাংশ ব্রোমোফেনল নীল; pH 6.8) 1:1 এর আয়তনের অনুপাতে। প্রতিটি নমুনার জন্য মোট প্রোটিন সমতুল্য এসডিএস-পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেলেলেক্ট্রফোরেসিস (পৃষ্ঠা) দ্বারা আলাদা করা হয়েছিল অ্যাক্রিলামাইড জেল ব্যবহার করে লায়েমলি [৩৬] দ্বারা বর্ণিত পদ্ধতির উপর ভিত্তি করে এবং ওয়েট-ট্রান্সফার সিস্টেম ব্যবহার করে 80 V এ PVDF ঝিল্লিতে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল। ঝিল্লিটিকে অবিলম্বে 10 মিমি ট্রিস, পিএইচ 7.5, 100 এমএমএনএসিএল, এবং 0.1 শতাংশ টুইন-20-এ ব্লকিং বাফারে (5 শতাংশ ননফ্যাট দুধ) স্থাপন করা হয়েছিল। 25 ◦C তাপমাত্রায় 2 ঘন্টার জন্য অ-নির্দিষ্ট আবদ্ধতা রোধ করতে ব্লটগুলিকে ব্লক করা হয়েছিল। পরবর্তীকালে, ঝিল্লিগুলিকে একটি নির্দিষ্ট প্রাথমিক অ্যান্টিবডি দিয়ে 4 ◦C রাতারাতিতে ইনকিউবেশন করা হয়েছিল, তারপরে 25 ◦C-এর জন্য হর্সরাডিশ পেরোক্সিডেস-কনজুগেটেড সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউবেশন করা হয়েছিল। . প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে বর্ধিত কেমিলুমিনিসেন্স দ্বারা অ্যান্টিবডি লেবেলিং সনাক্ত করা হয়েছিল। প্রোটিনের পরিমাণ নির্ধারণ করা হয়েছিল Davinch-Chemi TM. Chemiluminescence ইমেজিং সিস্টেম CAS-400SM (Core Bio, Seoul, Korea) ব্যবহার করে। আণবিক ওজন নির্ধারণের জন্য প্রস্তিত প্রোটিন মার্কার ব্যবহার করা হয়েছিল।
3.10। পরিসংখ্যান সংক্রান্ত বিশ্লেষণ
সমস্ত ডেটা গড় ± SEM হিসাবে উপস্থাপিত হয় বনফেরোনি পোস্ট-হক পরীক্ষা দ্বারা অনুসরণ করা চিকিত্সাগুলির মধ্যে পার্থক্যগুলির জন্য ভ্যারিয়েন্সের (ANOVA) একমুখী বিশ্লেষণের মাধ্যমে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। < 0.05="" এর="" একটি="" মান="" পরিসংখ্যানগতভাবে="" তাৎপর্যপূর্ণ="" বলে="" বিবেচিত="">
4। উপসংহার
সংক্ষেপে, বর্তমান গবেষণার ফলাফলগুলি প্রমাণ করেছে যে টাইরোসিনেজ প্রতিরোধের মাধ্যমে বিএইচসিপির ত্বক-সাদা করার প্রভাব রয়েছে, যা -এমএসএইচ-প্ররোচিত B16F10 মেলানোসাইটগুলিতে মেলানিন জৈব সংশ্লেষণের জন্য একটি মূল এনজাইম। তদ্ব্যতীত, বিএইচসিপি UV-প্ররোচিত ফাইব্রোব্লাস্টগুলিতে এমএমপি প্রোটিনের মাত্রার অভিব্যক্তি হ্রাস করেছে, যার একটি অ্যান্টি-রিঙ্কেল প্রভাব রয়েছে বলে আশা করা হচ্ছে। প্রাণী এবং ক্লিনিকাল স্টাডির মাধ্যমে BHCP-এর ঝকঝকে এবং অ্যান্টি-রিঙ্কেল প্রভাব নিশ্চিত করার জন্য আরও গবেষণা প্রয়োজন। পরিশেষে, বিএইচসিপিকে সাদা করা এবং অ্যান্টি-রিঙ্কেল উভয়ই প্রভাব রয়েছে বলে শনাক্ত করা হয়েছিল, যা হাইপারপিগমেন্টেশন এবং কুঁচকানো রোগের জন্য থেরাপিউটিক এজেন্টগুলির বিকাশের সম্ভাবনা নির্দেশ করে।
