Cistanche Tubulosa থেকে Chalcone Synthase এর ক্লোনিং, কার্যকরী সনাক্তকরণ এবং প্রকাশ বিশ্লেষণ

বিমূর্ত: উদ্দেশ্য

এর ফাংশন অধ্যয়ন করতেCistanche tubulosa থেকে chalcone synthaseএবং সাদা, লাল এবং বেগুনি ফুলে CtCHS জিনের এক্সপ্রেশন প্যাটার্ন।

পদ্ধতিCtCHS জিনটি RT-PCR দ্বারা ক্লোন করা হয়েছিল এবং বায়োইনফরমেটিক্স বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। পিইটি-28এ-সিটিএইচএস প্লাজমিড আইপিটিজি দ্বারা প্রোটিন অভিব্যক্তি প্ররোচিত করার জন্য এসচেরিচিয়া কোলাইতে স্থানান্তরিত হয়েছিল। CtCHS রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিনটি সাবস্ট্রেট p-coumaroyl CoA এবং malonyl CoA দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল এবং পণ্যগুলি HPLC এবং MS দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল। pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS প্লাজমিড CtCHS প্রোটিনের উপকোষীয় স্থানীয়করণ পর্যবেক্ষণ করতে অ্যারাবিডোপসিস থালিয়ানার প্রোটোপ্লাস্টে স্থানান্তরিত হয়েছিল। তিনটি রঙের সি. টিউবুলোসার ফুলে সিটিএইচএস জিনের এক্সপ্রেশন প্যাটার্নটি কিউআরটি-পিসিআর দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল।

ফলাফলএকটি CtCHS জিন ক্লোন করা হয়েছিল। ওপেন রিডিং ফ্রেমের (ORF) দৈর্ঘ্য ছিল 1173 bp, এনকোডিং 390 অ্যামিনো অ্যাসিড, এবং প্রোটিনের আণবিক ওজন ছিল 42 8000।

30% ইচিনাকোসাইড এবং 12% অ্যাকটিওসাইড সহ জৈব সিস্টানচে নির্যাস

CtCHS-এ অনুঘটক অবশিষ্টাংশ রয়েছে Cys164, His303, Asn336, যেগুলি চ্যালকোন সিন্থেসে সংরক্ষিত ছিল। CtCHS প্রোটিন E. coli তে প্রকাশ করা হয়েছিল এবং রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিন পেতে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। CtCHS প্রোটিন p-coumaroyl CoA এবং malonyl CoA কে নারিনজেনিন চ্যালকোন তৈরি করতে অনুঘটক করতে পারে। সিটিসিএইচএস প্রোটিন মূলত সাইটোপ্লাজমে স্থানীয়করণ করা হয়েছিল। CtCHS জিনটি বেগুনি এবং লাল ফুলে অত্যন্ত প্রকাশ করা হয়েছিল এবং আপেক্ষিক অভিব্যক্তির মাত্রা ছিল যথাক্রমে সাদা ফুলের তুলনায় 8.44 এবং 3.21 গুণ বেশি।

উপসংহার সি. টিউবুলোসার ফুল থেকে একটি CtCHS জিন ক্লোন করা হয়েছিল এবং প্রোটিন প্রকাশ করা হয়েছিল। CtCHS প্রোটিনের chalcone synthase ফাংশন আছে, এবং CtCHS জিনের অভিব্যক্তি গাঢ় ফুলে বেশি, যা ইঙ্গিত করে যে CtCHS জিন C. tubulosa-এর ফুলের রঙ নিয়ন্ত্রণ করতে পারে, যা C-এর ফুলের রঙের নিয়ন্ত্রণ প্রক্রিয়ার উপর আরও গবেষণার ভিত্তি তৈরি করে। টিউবুলোসা

মূল শব্দ: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; চ্যালকোন সিন্থেস; এনজাইম কার্যকলাপ বিশ্লেষণ; উপকোষীয় স্থানীয়করণ; অভিব্যক্তি বিশ্লেষণ

Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT হল Pyreal উদ্ভিদ, যা প্রাকৃতিকভাবে দক্ষিণ জিনজিয়াং [1] জিনজিয়াং এর হেতিয়ান এলাকায় বিতরণ করা হয় [2]। পাইপ ফুলের ঔষধি গুণ বেশি। এর মাংসের ডালপালা "এর 2020 সংস্করণের অন্যতম উত্সচাইনিজ ফার্মাকোপিয়া"। [৩] পাইপ ফুলের কর্ডোনাস মাংসের ডালপালা নিয়ে গবেষণা বেড়েছে, কিন্তু এর ফুল নিয়ে তুলনামূলকভাবে কম জৈবিক গবেষণা হয়েছে। পাইপ ফুলের ফুল ফোটার সময়কাল এপ্রিল থেকে মে [৪], প্রধানত সাদা রঙের তিনটি রঙ থাকে। , লাল এবং বেগুনি রঙে সমৃদ্ধ, তবে তাদের ফুলের রঙ নিয়ন্ত্রণের পদ্ধতিগুলি পাপড়ির টিস্যুর গঠন, রঙ্গক এবং নিয়ন্ত্রণের সাথে সম্পর্কিত নয়। এবং জিনগত কারণগুলি [৫] উদ্ভিদের ফুলের রঙ্গক প্রধানত তিনটি শ্রেণীতে অন্তর্ভুক্ত করে: ফ্ল্যাভোনয়েড, ক্যারোটিন এবং রঙ, ফ্ল্যাভোনয়েডের ধরন এবং বিষয়বস্তু অনেক গাছের রঙকে প্রভাবিত করে Paeonia Lactiflora Pall এর তিনটি জাত হিসাবে।

এটি সাদা হিসাবে প্রদর্শিত হয়, এবং রঙের প্রধান রঙটি লাল রঙের রঙ ধারণ করে এবং সুন্দর সক্ষমতা ফুলগুলিকে বেগুনি -লাল [8] হিসাবে উপস্থিত করে। ফুলের রঙ অনেক শোভাময় উদ্ভিদের একটি গুরুত্বপূর্ণ বৈশিষ্ট্য এবং এটি গোলাপী পোকামাকড়কে আকর্ষণ করার মূল কারণও। গবেষণায় দেখা গেছে যে এটি পাস করা হয়েছে পোকামাকড়ের দর্শনের সর্বোচ্চ ফ্রিকোয়েন্সি হল গভীর বেগুনি সিস্টানচে উদ্ভিদ [10]। টিউব ফুল cistanosaurus ফুলে cistanoids এর সিন্থেটিক জেনেটিক গবেষণার উপর জৈবিক গবেষণার জন্য, এটি টিউব ফুল কর্ডন রঙ নিয়ন্ত্রণ প্রক্রিয়া পরিষ্কার করার জন্য সহায়ক, জেনেটিক ইঞ্জিনিয়ারিং প্রযুক্তির রঙের উন্নতির জন্য তাত্ত্বিক ভিত্তি প্রদান, এর সমৃদ্ধ রং প্রচার করা, দেখার বৃদ্ধি, অ্যাপ্লিকেশন সুযোগ প্রসারিত.

এর বায়োসিন্থেটিক পথফ্ল্যাভোনয়েডদিয়ে শুরু হয়phenylpropanoid পথ. ফেনাইল্যালানাইন প্রথমে ফেনিল্যালানাইন অ্যামোনিয়ালাইজ (PAL) এর ক্রিয়ায় সিনামিক অ্যাসিডে রূপান্তরিত হয় এবং সিনামিক অ্যাসিড সিনামিক অ্যাসিড দ্বারা হাইড্রোক্সিলেটেড হয় 4-। এনজাইম (সিনামিক অ্যাসিড-4-হাইড্রোক্সিলেস, C4H) এবং 4-কউমারেট কোএনজাইম এ লিগেস (4-কউমারেট কোএনজাইম এ লিগেজ, 4সিএল) 4-কুমারয়ল-কোএ তৈরির প্রতিক্রিয়াকে অনুঘটক করে [১১]। 4- coumaroyl-CoA এর একটি অণু এবং ম্যালোনাইল-CoA এর তিনটি অণু চ্যালকোন সিন্থেস (CHS) দ্বারা নারিনজেনিন চ্যালকোন তৈরি করতে অনুঘটক হয়, যারফ্ল্যাভোনয়েড যৌগ.চ্যালকোন আইসোমেরেজ, ফ্ল্যাভানোন-3-হাইড্রোক্সিলেজ, ডাইহাইড্রোফ্ল্যাভোনল 4-রিডাক্টেস, ইত্যাদির মৌলিক কঙ্কাল আইসোফ্ল্যাভোনস, ফ্ল্যাভোনল, অ্যান্থোসায়ানিন ইত্যাদির মতো বিভিন্ন ধরনের ফ্ল্যাভোনয়েড তৈরি করে। [১২]। ফ্ল্যাভোনয়েড বায়োসিন্থেটিক পথের মূল এনজাইম হিসাবে, সিএইচএস উদ্ভিদে ফ্ল্যাভোনয়েডের বিষয়বস্তু নিয়ন্ত্রণ করে এবং উদ্ভিদের ফুলের রঙ নিয়ন্ত্রণে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে [১৩]। উদাহরণস্বরূপ, জেন্টিয়ানা স্ক্যাব্রা বাঞ্জ সিএইচএস-এর পোস্ট-ট্রান্সক্রিপশনাল জিন সাইলেন্সিং অ্যান্থোসায়ানিনগুলির জৈব সংশ্লেষণকে বাধা দিতে পারে এবং করোলা লোবগুলির নির্দিষ্ট সাদা করার কারণ হতে পারে [14]। অ্যাক্টিনিডিয়া এরিয়ানথা বেন্থের সিএইচএস জিন সাইলেন্সিং। সিএইচএস পাপড়িতে অ্যান্থোসায়ানিনের পরিমাণ হ্রাস করে এবং লাল পাপড়ির রঙ হালকা হয়ে যায় [১৫]। অতএব, এই গবেষণায়, Cistanche deserticola ফুল থেকে একটি CtCHS জিন ক্লোন করা হয়েছিল, এবং CtCHS-এর কার্যকারিতা অন্বেষণ করার জন্য এটিতে বায়োইনফরমেটিক্স বিশ্লেষণ, প্রোক্যারিওটিক এক্সপ্রেশন এবং পরিশোধন, এনজাইম কার্যকলাপ বিশ্লেষণ, উপকোষীয় স্থানীয়করণ বিশ্লেষণ এবং এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। প্রোটিন এবং CtCHS জিনের এক্সপ্রেশন প্যাটার্ন প্রাথমিকভাবে CtCHS এবং Cistanche deserticola ফুলের রঙের মধ্যে সম্পর্ক অন্বেষণ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল, যা Cistanche deserticola ফুলের রঙের নিয়ন্ত্রক প্রক্রিয়ার অধ্যয়নের ভিত্তি স্থাপন করেছিল।

1 উপকরণ এবং যন্ত্র

1.1 উপকরণ

2018 সালের মে মাসে ইউতিয়ান কাউন্টি, হোটান প্রিফেকচার, জিনজিয়াং থেকে সিস্তানচে টিউবরোসা ফুল সংগ্রহ করা হয়েছিল। নমুনা নেওয়ার সময় এলোমেলো নীতি অনুসরণ করা হয়েছিল, এবং ভাল শারীরবৃত্তীয় অবস্থা এবং সামঞ্জস্যপূর্ণ উদ্ভিদ উচ্চতা সহ সিস্তানচে টিউবরোসা ফুল নির্বাচন করা হয়েছিল। পিকিং ইউনিভার্সিটি স্কুল অফ ফার্মেসির অধ্যাপক তু পেংফেই দ্বারা সাদা, লাল এবং বেগুনি রঙের তিনটি ফুলের রঙের সিস্তানচে মরুভূমির তিনটি স্ট্রেন নেওয়া হয়েছে এবং সিস্তানচে টিউবুলোসা (শেঙ্ক) উইট হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছে। এগুলি দ্রুত তরল নাইট্রোজেনে হিমায়িত করা হয়েছিল, শুকনো বরফের উপর সংরক্ষণ করা হয়েছিল এবং বেইজিংয়ে নিয়ে যাওয়া হয়েছিল। E. coli DH5 রাসায়নিকভাবে সক্ষম কোষগুলি নানজিং নোভেজান বায়োটেকনোলজি কোং, লিমিটেড থেকে কেনা হয়েছিল এবং ই. কোলি বিএল21 (DE3) রাসায়নিকভাবে সক্ষম কোষগুলি বেইজিং কোয়ানশিজিন বায়োটেকনোলজি কোং লিমিটেড থেকে কেনা হয়েছিল; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP ভেক্টরটি উহান ট্রান্সডাকশন বায়োলজি ল্যাবরেটরি কোং লিমিটেড থেকে কেনা হয়েছিল। ম্যালোনিল-কোএ সিগমা কোম্পানি, 4-কুমারয়ল-কোএ, নারিনজেনিন থেকে কেনা হয়েছিল -চ্যালকোন কেনা হয়েছিল সাংহাই ইউয়ানি বায়োটেকনোলজি কোং, লিমিটেড থেকে এবং নারিনজেনিন কেনা হয়েছিল সাংহাই ম্যাকলিন বায়োকেমিক্যাল টেকনোলজি কোং লিমিটেড থেকে।

1.2 যন্ত্র

Nanodrop 2000C স্পেকট্রোফটোমিটার (থার্মো ফিশার কোম্পানি, USA); গ্রেডিয়েন্ট পিসিআর যন্ত্র (এপেনডর্ফ কোম্পানি, জার্মানি); CFX 96 ফ্লুরোসেন্স কোয়ান্টিটেটিভ PCR যন্ত্র, UVP জেল ইমেজার, জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস যন্ত্র, প্রোটিন ইলেক্ট্রোফোরেসিস যন্ত্র (BioRad Company, USA); EnSpire

মাইক্রোপ্লেট রিডার (PerkinElmer কোম্পানি, USA); ধ্রুবক তাপমাত্রার ইনকিউবেটর (সাংহাই জিংহং এক্সপেরিমেন্টাল ইকুইপমেন্ট কোং লিমিটেড); DHZ-D বড়-ক্ষমতা সম্পন্ন পূর্ণ-তাপমাত্রা অসিলেটর (তাইকাং পরীক্ষামূলক সরঞ্জাম কারখানা); THZ-82একটি জল স্নানের ধ্রুবক তাপমাত্রার অসিলেটর ( জিয়াংসু কেক্সি ইন্সট্রুমেন্ট কোং লিমিটেড); AIRTECH আল্ট্রা-ক্লিন ওয়ার্কবেঞ্চ (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); উচ্চ চাপ বাষ্প নির্বীজনকারী (TOMY কোম্পানি, জাপান); মিলি কিউ বিশুদ্ধ জলের যন্ত্র (মিলিপুর, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র); LC-20একটি উচ্চ-দক্ষ তরল ফেজ ক্রোমাটোগ্রাফ (শিমাদজু কোম্পানি, জাপান); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap উচ্চ-রেজোলিউশন ভর স্পেকট্রোমেট্রি (থার্মো ফিশার কোম্পানি, USA); FV1200 লেজার কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ (অলিম্পাস কোম্পানি, জাপান)।

2 পরীক্ষামূলক পদ্ধতি

2.1 আরএনএ নিষ্কাশন এবং সিডিএনএ সংশ্লেষণ। Cistanche deserticola ফুল তরল নাইট্রোজেন মধ্যে মাটি এবং তারপর RNA নিষ্কাশন পরীক্ষা অধীন ছিল.

একটি কিট ব্যবহার করে মোট RNA বের করা হয়েছিল (Norgen, Cat 17200), RNA ঘনত্ব এবং গুণমান NanoDrop 2000C দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল, এবং 1.8 এবং 2.1 এর মধ্যে একটি A260/A280 অনুপাত সহ RNA নমুনাগুলি cDNA এর বিপরীত প্রতিলিপি সংশ্লেষণের জন্য নির্বাচন করা হয়েছিল। এম-এমএলভি রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেস (প্রোমেগা, এম170বি) সিডিএনএ-তে যোগ্য মোট আরএনএ বিপরীত-প্রতিলিপি করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। পরীক্ষামূলক অপারেশন নির্দেশাবলী অনুযায়ী সঞ্চালিত হয়েছিল।

2.2 CtCHS জিনের ক্লোনিং

আমাদের গবেষণা গোষ্ঠীর Cistanche deserticola ফুল ট্রান্সক্রিপ্টোম ডেটার উপর ভিত্তি করে [16], একটি সম্পূর্ণ খোলা পড়ার ফ্রেম সহ একটি CtCHS স্ক্রীন করা হয়েছিল, এবং SnapGene সফ্টওয়্যারটি জিন ক্রম (সারণী 1) এর উপর ভিত্তি করে নির্দিষ্ট প্রাইমার ডিজাইন করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। পিসিআর পরিবর্ধন একটি টেমপ্লেট হিসাবে Cistanche deserticola ফুল cDNA ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল। পরিবর্ধন ব্যবস্থা ছিল 2×ফান্টা ম্যাক্স বাফার 25 μL, dNTP মিক্স (10 mmol/L) 1 μL, আপস্ট্রিম এবং ডাউনস্ট্রিম প্রাইমার (10 μmol/L) 2 μL প্রতিটি, cDNA 2 μL, ফান্টা ম্যাক্স সুপার- ফিডেলিটি

DNA পলিমারেজ 1 μL, ddH2O 17 μL। প্রতিক্রিয়া শর্ত ছিল: 3 মিনিটের জন্য 95 ডিগ্রীতে প্রাক-বিকৃতকরণ; 15 সেকেন্ডের জন্য 95 ডিগ্রীতে বিকৃতকরণের 25 চক্র, 15 সেকেন্ডের জন্য 55 ডিগ্রীতে অ্যানিলিং এবং 1 মিনিটের জন্য 72 ডিগ্রীতে এক্সটেনশন; এবং 5 মিনিটের জন্য 72 ডিগ্রিতে প্রতিক্রিয়া এক্সটেনশন। পিসিআর পণ্যটি 1% অ্যাগারোজ জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল, এবং জেল পুনরুদ্ধারের জন্য ডিএনএ বিশুদ্ধকরণ কিট (নোভিজান, ক্যাট ডিসি301-01) ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং তারপরে উদ্ধার হওয়া ডিএনএ দ্রুত ক্লোনিং কিট (নোভিজান, ক্যাট) দ্বারা বিশুদ্ধ করা হয়েছিল সি601-01)। ডিএনএ খণ্ডটি pCE2 TA/Blunt-Zero ভেক্টরের সাথে বন্ধন করা হয়েছিল, Escherichia coli DH5 সক্ষম কোষে রূপান্তরিত হয়েছিল এবং 37 ডিগ্রিতে রাতারাতি চাষ করার পরে, একক ক্লোন স্ট্রেন নির্বাচন করা হয়েছিল এবং সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য কোম্পানির কাছে পাঠানো হয়েছিল।

সারণী 1 প্রাইমার সিকোয়েন্স

2.3 বায়োইনফরমেটিক্স বিশ্লেষণ

প্রোটিন ভৌত এবং রাসায়নিক বৈশিষ্ট্য বিশ্লেষণ করতে ProtParam অনলাইন সফ্টওয়্যার ব্যবহার করুন; প্রোটিন হাইড্রোফিলিসিটি/হাইড্রোফোবিসিটি বিশ্লেষণ করতে প্রোট স্কেল অনলাইন টুল ব্যবহার করুন; প্রোটিন গৌণ কাঠামোর পূর্বাভাস দিতে অনলাইন টুল SOPMA ব্যবহার করুন; প্রোটিন তৃতীয় কাঠামোর পূর্বাভাস দিতে অনলাইন বিশ্লেষণ সফ্টওয়্যার SWISS-MODEL ব্যবহার করুন; অনলাইন সফ্টওয়্যার টিএমএইচএমএম ব্যবহার করুন প্রোটিনের ট্রান্সমেমব্রেন গঠনের পূর্বাভাস দিন; অন্যান্য প্রজাতির সিএইচএস অ্যামিনো অ্যাসিড সিকোয়েন্সের সাথে CtCHS-এর হোমোলজির তুলনা করতে DNAMAN সফ্টওয়্যার ব্যবহার করুন; একটি ফাইলোজেনেটিক ট্রি তৈরি করতে MEGA-X সফ্টওয়্যার ব্যবহার করুন, প্রতিবেশী-যোগদান (NJ) এবং পয়সন সংশোধন ব্যবহার করে বিবর্তনীয় দূরত্ব বুটস্ট্র্যাপ পদ্ধতি ব্যবহার করে গণনা করা হয়, এবং বুটস্ট্র্যাপের পুনরাবৃত্তির সংখ্যা 1000 বার।

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS আরও সনাক্তকরণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। তরল পর্যায়ের অবস্থা ছিল ওয়াটার অ্যাক্যুইটি UPLC BEH শিল্ড RP18 কলাম (100 মিমি × 3৷{31}} মিমি, 1.7 μm), কলাম তাপমাত্রা 40 ডিগ্রি , নারিনজেনিন , চ্যালকোন এবং নারিনজেনিন। নিয়ন্ত্রণ পদার্থের লোডিং ভলিউম 4 μL, এবং এনজাইম প্রতিক্রিয়া পণ্যের লোডিং ভলিউম 7 μL। জল (A)-এসিটোনিট্রিল (বি) মোবাইল ফেজ হিসাবে ব্যবহৃত হয়। ইলুশন গ্রেডিয়েন্ট হল: 0 থেকে 5 মিনিট, 30% B; 5 থেকে 15 মিনিট। , 30%~60% B; 15~20 মিনিট, 60%~100% B; 20~25 মিনিট, 100% B; 25~31 মিনিট, 100%~30% B. ভলিউমেট্রিক প্রবাহ হার 0.3 মিলি/মিনিট। ভর স্পেকট্রোমেট্রি শর্তগুলি হল ইলেক্ট্রোস্প্রে আয়ন উত্স, বাহক গ্যাস হিসাবে নাইট্রোজেন, আবরণ গ্যাসের চাপ 3.5 MPa, সহায়ক গ্যাসের চাপ 1.0 MPa, স্প্রে চাপ 3500 V, কৈশিক তাপমাত্রা 350 ডিগ্রি, সহায়ক গ্যাস গরম করার তাপমাত্রা 200 ডিগ্রি, ধনাত্মক এবং ঋণাত্মক আয়ন মোড। আয়ন পরিসর m/z হল 100-1500, সম্পূর্ণ MS রেজোলিউশন হল 35 000, dd-MS2 রেজোলিউশন হল 17 500, (N)

CE/stepped nce 35, 60 এ সেট করা হয়েছে।

2.6 সিটিএইচএস প্রোটিনের উপকোষীয় স্থানীয়করণ

CtCHS ক্রম এবং নির্বিঘ্ন ক্লোনিংয়ের নীতির উপর ভিত্তি করে, Kpn Ⅰ এবং BamH Ⅰ এনজাইম কাটিয়া সাইট সহ প্রাইমারগুলি ডিজাইন করা হয়েছিল, এবং সংশ্লিষ্ট লক্ষ্য টুকরাগুলি PCR দ্বারা প্রশস্ত করা হয়েছিল। pCAMBIA1300-35S-GFP প্লাজমিড সীমাবদ্ধ এন্ডোনিউক্লিস Kpn Ⅰ এবং BamH Ⅰ দিয়ে হজম করা হয়েছিল, এবং লক্ষ্য টুকরা এবং ভেক্টরকে বিজোড় ক্লোনিং কিটের (নোভিজান, ক্যাট সি115-01) মাধ্যমে সংযুক্ত করা হয়েছিল, এবং তারপর স্থানান্তরিত করা হয়েছিল। E. coli DH5 সক্ষম কোষে। , সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য একক ক্লোন স্ট্রেন নির্বাচন করুন এবং সঠিক স্ট্রেন থেকে প্লাজমিড বের করুন। pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS এবং pCAMBIA 1300-35S-GFP প্লাজমিডগুলি PEG4000 ব্যবহার করে অ্যারাবিডোপসিস থালিয়ানা প্রোটোপ্লাস্টে রূপান্তরিত হয়েছিল এবং 8 থেকে 10 ঘন্টার জন্য কম আলোতে সংষ্কৃত হয়েছিল। CtCHS প্রোটিনের উপকোষীয় স্থানীয়করণ একটি লেজার কনফোকাল মাইক্রোস্কোপের অধীনে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।

2.7 CTCHS এক্সপ্রেশন প্যাটার্ন বিশ্লেষণ

CtCHS অনুক্রমের উপর ভিত্তি করে, ডিএনএএমএনকে অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স জিন হিসাবে এফ-বক্স সহ রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্স পরিমাণগত প্রাইমার ডিজাইন করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। প্রাইমার সিকোয়েন্সগুলি সারণী 1-এ দেখানো হয়েছে। বিভিন্ন রঙের সিস্তানচে মরুভূমির ফুলে CtCHS-এর আপেক্ষিক অভিব্যক্তি রিয়েল-টাইম ফ্লুরোসেন্স পরিমাণগত PCR দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল। SYBR গ্রিন ফ্লুরোসেন্ট ডাই পদ্ধতি, প্রতিক্রিয়া সিস্টেম দিয়ে পরিমাপ করতে TransStart Green qPCR সুপারমিক্স (পূর্ণ সোনা, AQ101-02) ব্যবহার করুন: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, আপস্ট্রিম এবং ডাউনস্ট্রিম প্রাইমার (10)

μmol/L) {{0}}.2 μL প্রতিটি, cDNA টেমপ্লেট 0.5 μL, নিউক্লিওটিডেস-মুক্ত জল 4.1 μL, প্রতিক্রিয়াটির জন্য একটি দ্বি-পদক্ষেপ পদ্ধতি ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং প্রতিক্রিয়া পদ্ধতিটি পদ্ধতির উপর ভিত্তি করে ছিল ডং জিয়ানজুয়ান এট আল [১৮]। প্রতিটি নমুনায় 3টি জৈবিক প্রতিলিপি রয়েছে এবং পরীক্ষাটি তিনবার পুনরাবৃত্তি হয়েছিল। এক্সেল টু 2 ব্যবহার করে পরীক্ষামূলক ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল

CtCHS এর আপেক্ষিক অভিব্যক্তি −ΔΔCt পদ্ধতি ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল, এবং গ্রাফপ্যাড প্রিজম 8 তাৎপর্য বিশ্লেষণ এবং হিস্টোগ্রাম আঁকার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।