Clec12a একটি কোলিটোজেনিক কমেন্সালের প্রসারণকে সীমাবদ্ধ করার সময় প্রদাহকে টেম্পার করে

সারসংক্ষেপ

মাইক্রোবায়োটার নিয়ন্ত্রণ অন্ত্রের স্বাস্থ্যের জন্য গুরুত্বপূর্ণ তবুও সহজাত অনাক্রম্যতা দ্বারা নিযুক্ত প্রক্রিয়াগুলি অস্পষ্ট থাকে। এখানে আমরা দেখাই যে সি-টাইপ-লেক্টিন রিসেপ্টরের ইঁদুরের ঘাটতি, Clec12a গুরুতর কোলাইটিস তৈরি করেছিল, যা মাইক্রোবায়োটার উপর নির্ভরশীল ছিল। জীবাণু-মুক্ত ইঁদুরের মধ্যে ফেকাল-মাইক্রোবায়োটা ট্রান্সপ্লান্টেশন (এফএমটি) অধ্যয়ন প্রকাশ করে যে Clec12a-/- ইঁদুরের মধ্যে গঠিত কোলিটোজেনিক মাইক্রোবায়োটা যেগুলি গ্রাম-পজিটিভ জীব, ফেকালিবাকুলাম ইঁদুরের প্রসারণ দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল। বন্য ধরনের ইঁদুরের কোলাইটিসকে আরও খারাপ করার জন্য F. rodentium-এর চিকিৎসা যথেষ্ট ছিল। অন্ত্রের মধ্যে ম্যাক্রোফেজগুলি Clec12a এর সর্বোচ্চ মাত্রা প্রকাশ করে। Clec12a-/- ম্যাক্রোফেজে সাইটোকাইন এবং সিকোয়েন্সিং বিশ্লেষণ উচ্চতর প্রদাহ প্রকাশ করেছে কিন্তু ফ্যাগোসাইটোসিসের সাথে যুক্ত জিনগুলির একটি উল্লেখযোগ্য হ্রাস। প্রকৃতপক্ষে, Clec12a-/- ম্যাক্রোফেজগুলি এফ. রোডেন্টিয়াম গ্রহণ করার ক্ষমতায় প্রতিবন্ধী। Purified Clec12a এর গ্রাম-পজিটিভ জীব যেমন F. rodentium-এর সাথে উচ্চতর বাঁধাই ছিল। এইভাবে, আমাদের ডেটা Clec12a কে প্রকাশ্য প্রদাহ ছাড়াই সম্ভাব্য ক্ষতিকারক কমেন্সালের প্রসারণ নিয়ন্ত্রণ করার জন্য একটি সহজাত ইমিউন নজরদারি প্রক্রিয়া হিসাবে চিহ্নিত করে।

পুরুষদের জন্য cistanche উপকারিতা-প্রতিরোধ ক্ষমতা শক্তিশালী করে

ভূমিকা

মাইক্রোবায়োটার গঠন এবং কার্যকারিতা স্তন্যপায়ী প্রাণীর স্বাস্থ্য এবং রোগের উপর গভীর প্রভাব ফেলতে পারে (ফ্যাসারেলা এট আল।, 2021)। এটি প্রদাহজনক অন্ত্রের রোগের (IBD) জন্য ভালভাবে নথিভুক্ত করা হয়েছে, যেখানে IBD-এর বেশিরভাগ মাউস মডেলগুলি মাইক্রোবায়োটা রচনার পরিবর্তনের জন্য সংবেদনশীল (Gkouskou et al., 2014)। মাইক্রোবায়োটা স্থিতিশীলতাকে প্রভাবিত করে এবং নির্দেশ করে এমন কারণগুলি বোঝা গুরুত্বপূর্ণ কারণ মাইক্রোবায়োটা-ভিত্তিক থেরাপি তৈরি করা হয়েছে (শর্মা এট আল।, 2020; সোরবারা এবং পামের, 2022)। মাইক্রোবায়োটা ডায়েট, ওষুধ এবং ইমিউন সিস্টেম সহ একাধিক প্যারামিটার দ্বারা প্রভাবিত হয়। সাম্প্রতিক বছরগুলিতে, অভিযোজিত ইমিউন উপাদানগুলি, বিশেষ করে আইজিএ, মাইক্রোবায়োটা রচনাকে প্রভাবিত করতে দেখা গেছে (নাকাজিমা এট আল।, 2018; ওকাই এট আল।, 2016; ইয়াং এবং পাম, 2020)। যাইহোক, কিভাবে নির্দিষ্ট সহজাত ইমিউন রিসেপ্টর হোমিওস্ট্যাটিক মাইক্রোবায়োটা রচনাকে প্রভাবিত করে সে সম্পর্কে কম জানা যায়।

অটোফ্যাজি প্রোটিন ATG16L1 (ক্যাডওয়েল এট আল।, 2008; লিউ এট আল।, 2015; রিওক্স এট আল।, 2007, ট্রুকোম 2007; ওয়েলস 2007; ওয়েলস এট আল।, 2007; অটোফ্যাজি প্রোটিন ATG16L1 সহ IBD-এর জন্য গুরুত্বপূর্ণ ঝুঁকিপূর্ণ অ্যালিল। ) ATG16L1T300A পলিমরফিজম সহ ব্যক্তিদের মধ্যে মাইলয়েড জিনের অভিব্যক্তির পরিবর্তনের অন্বেষণে একটি সাম্প্রতিক গবেষণায়, ইনহিবিটরি সি-টাইপ লেকটিন রিসেপ্টর (CLR), Clec12a, এই কোষগুলিতে উল্লেখযোগ্যভাবে দমন করা হয়েছে বলে চিহ্নিত করা হয়েছিল (Begun et al., 2015)। এই একই গবেষণায় দেখা গেছে যে Clec12a অটোফ্যাজি পথের সাথে সংযোগের মাধ্যমে প্যাথোজেনিক সংক্রমণের প্রতিরক্ষায় কাজ করে। এই তথ্যগুলি পরামর্শ দেয় যে IBD আক্রান্ত ব্যক্তিদের মধ্যে Clec12a ডাউনরেগুলেশন রোগের তীব্রতা এবং/অথবা বিকাশকে প্রভাবিত করতে পারে। এই প্রমাণ থাকা সত্ত্বেও, কোলাইটিসের সময় Clec12a দ্বারা প্রয়োগ করা ইমিউন রেগুলেশন মেকানিজম সম্পর্কে খুব কমই জানা যায়।

সি-টাইপ লেকটিন হল দ্রবণীয় বা ঝিল্লি-আবদ্ধ অণুর একটি বৈচিত্র্যময় গোষ্ঠী যা হোস্ট- বা মাইক্রোবিয়াল-উত্পন্ন, লিপিড, প্রোটিন এবং কার্বোহাইড্রেট উভয়কেই আবদ্ধ করতে সক্ষম (ব্রাউন এট আল।, 2018)। Mincle (Clec4e) এবং Dectin-1 (Clec7a) হল দুটি CLR যা অন্ত্রের হোমিওস্ট্যাসিস বজায় রাখতে মাইক্রোবায়োটার নির্দিষ্ট সদস্যদের প্রভাবিত করে (Iliev et al., 2012; Martinez-Lopez et al., 2019)। যাইহোক, 1টিরও বেশি,000 বিভিন্ন সি-টাইপ লেকটিন, এই প্রোটিন পরিবারের মধ্যে অনেক কিছু আবিষ্কার করা বাকি আছে। Clec12a প্রাকৃতিক ঘাতক রিসেপ্টর পরিবারের অন্তর্গত এবং এটি একটি ইমিউন-টাইরোসিন ইনহিবিটরি মোটিফ (ITIM) ধারণ করে শুধুমাত্র দুটি সি-টাইপ লেকটিনের মধ্যে একটি যা প্রদাহজনক সংকেত পথকে সীমাবদ্ধ করতে সক্ষম (ব্রাউন এট আল।, 2018; মার্শাল এট আল।, 2004) . Clec12a ইউরিক অ্যাসিডকে স্বীকৃতি দেয় যা সেলুলার ক্ষতির সংকেত (নিউম্যান এট আল।, 2014)। Clec12a সহজাত ইমিউন কোষে সবচেয়ে বেশি প্রকাশ করা হয়, এবং নিউট্রোফিলে এটি সক্রিয়করণ কমাতে এবং ইউরিক অ্যাসিড স্বীকৃতির উপর প্রদাহজনক সাইটোকাইন উত্পাদন হ্রাস করতে কাজ করে (নিউম্যান এট আল।, 2014)। বিপরীতভাবে, Clec12a ভাইরাল সংক্রমণের প্রতিক্রিয়ায় একাধিক স্ক্লেরোসিসের একটি অটোইমিউন মডেল এবং সম্ভাব্য টাইপ I ইন্টারফেরন সংকেত চলাকালীন রক্ত-মস্তিষ্কের বাধা জুড়ে মনো-নিউক্লিয়ার ফ্যাগোসাইটস (MNPs) স্থানান্তরের অনুমতি দিয়ে প্রদাহকে উত্সাহ দেয় (লি এট আল।, 2019; সাগর আল। ., 2017)। Clec12a প্লাজমোডিয়াল পণ্য, হিমোজোইনকে চিনতেও সক্ষম, যা প্লাজমোডিয়াম সংক্রমণের পরে মস্তিষ্কে CD8+ T কোষ বৃদ্ধি করতে দেখা গেছে (Raulf et al., 2019)। এইভাবে, Clec12a অনাক্রম্যতা এবং অনন্য সিগন্যালিং ক্ষমতার বিভিন্ন ভূমিকা সহ একটি অপ্রত্যাশিত CLR প্রতিনিধিত্ব করে, তবুও অন্ত্রে এর ভূমিকা অজানা থেকে যায়।

cistanche tubulosa- ইমিউন সিস্টেম উন্নত

আমরা পূর্বে দেখিয়েছি যে নির্দিষ্ট অন্ত্রের ছত্রাক পিউরিন মেটাবোলাইট, ইউরিক অ্যাসিডকে প্ররোচিত করে কোলাইটিসকে বাড়িয়ে তোলে (চিয়ারো এট আল।, 2017)। অধিকন্তু, পিউরিন বিপাক সম্প্রতি মানুষের অন্ত্রের রোগের সাথে যুক্ত ছিল (ঝু এট আল।, 2019)। এই তথ্যগুলি সম্মিলিতভাবে পরামর্শ দেয় যে ইউরিক অ্যাসিড সনাক্তকরণ IBD এর সাথে প্রাসঙ্গিক হতে পারে। এর উপর ভিত্তি করে, আমরা অন্ত্রে Clec12a এর কার্যকারিতা অন্বেষণ করতে বের হয়েছি। আমরা দেখতে পেয়েছি যে Clec12a-এর ঘাটতি প্রাণীরা কোলাইটিসের জন্য অত্যন্ত সংবেদনশীল যা Clec12a-এর অনুপস্থিতিতে গঠিত মাইক্রোবায়োটা রচনার উপর নির্ভরশীল। WT জীবাণু-মুক্ত প্রাণীদের মধ্যে Clec12a-/- মাইক্রোবায়োটার এফএমটি কোলাইটিস বাড়ানোর জন্য যথেষ্ট ছিল এবং Clec12a-/- প্রাণীদের মধ্যে কোলিটোজেনিক মাইক্রোবায়োটা গঠন অভিযোজিত প্রতিরোধ ক্ষমতা থেকে স্বাধীন। প্রাসঙ্গিক জীবাণুগুলি সনাক্ত করতে যা কোলাইটিসকে আরও বাড়িয়ে তুলতে পারে, Clec12a-/- প্রাণীদের বিভিন্ন অ্যান্টিবায়োটিক দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং যেগুলি গ্রাম-পজিটিভ ব্যাকটেরিয়া রোগকে লক্ষ্য করে। 16S rDNA সিকোয়েন্সিং দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছে Faecalibaculum rodentium উল্লেখযোগ্যভাবে Clec12a-/- প্রাণীদের মধ্যে প্রচুর পরিমাণে এবং F. রডেন্টিয়ামের মৌখিক গ্যাভেজ WT প্রাণীদের রোগের প্যাথলজি বাড়াতে যথেষ্ট ছিল। Clec12a-/- প্রাণীদের ইমিউন প্রোফাইলিং কোলনে হোমিওস্ট্যাটিক মাইলয়েড কোষগুলির একটি উল্লেখযোগ্য হ্রাস প্রকাশ করেছে। এফ. রোডেন্টিয়াম-চিকিত্সা করা ম্যাক্রোফেজগুলির আরএনএ সিকোয়েন্সিং প্রকাশ করেছে যে Clec12a ফ্যাগোসাইটোসিসকে উৎসাহিত করে। যেহেতু Clec12a একাধিক লিগ্যান্ডকে আবদ্ধ করতে দেখানো হয়েছে, আমরা জিজ্ঞাসা করেছি যে Clec12a মাইক্রোবায়োটার বিভিন্ন সদস্যদের সাথে আবদ্ধ হবে কিনা। একটি Clec12a-Fc ফিউশন প্রোটিন ব্যবহার করে আমরা সনাক্ত করি যে Clec12a মাইক্রোবায়োটার গ্রাম-পজিটিভ সদস্যদের সাথে সবচেয়ে বেশি আবদ্ধ। সম্মিলিতভাবে এই ডেটাগুলি একটি মডেলের পরামর্শ দেয় যেখানে Clec12a প্রদাহজনক প্রতিক্রিয়া প্রতিরোধ করার সময় সরাসরি বাঁধাই এবং ফ্যাগোসাইটোসিসের মাধ্যমে মাইক্রোবায়োটার কোলিটোজেনিক সদস্যদের নিয়ন্ত্রণ করে। এমন পরিস্থিতিতে যেখানে Clec12a এক্সপ্রেশন হ্রাস পায়, গ্রাম-পজিটিভ প্যাথোবিয়নট প্রদাহকে প্রসারিত করতে এবং প্রচার করতে পারে। এইভাবে, আমাদের অধ্যয়নগুলি একটি স্বাস্থ্যকর মাইক্রোবায়োটার হোমিওস্ট্যাসিস এবং রক্ষণাবেক্ষণ নিশ্চিত করতে Clec12a কে একটি গুরুত্বপূর্ণ প্রদাহ দমনকারী হিসাবে চিহ্নিত করে।

ফলাফল

Clec12a-/- প্রাণীরা অভিযোজিত প্রতিরোধ ব্যবস্থা থেকে স্বাধীন কোলাইটিসের জন্য অত্যন্ত সংবেদনশীল

IBD আক্রান্ত ব্যক্তিদের মধ্যে Clec12a এক্সপ্রেশন হ্রাস করা হয়েছে এবং আমরা দেখিয়েছি যে Clec12a, ইউরিক অ্যাসিডের জন্য লিগান্ডগুলির একটির উত্পাদনকে ব্লক করা কোলাইটিসকে প্রশমিত করতে পারে (Begun et al., 2015; Chiaro et al., 2017; Liu et al. ., 2015)। যাইহোক, Clec12a এখনও কোলাইটিসের প্রাণীর মডেলগুলিতে অধ্যয়ন করা হয়নি। এই লক্ষ্যে, WT এবং Clec12a-/- C57BL/6 ইঁদুরকে তীব্র DSS কোলাইটিসের সাথে চ্যালেঞ্জ করা হয়েছিল। Clec12a-/- প্রাণীরা উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ওজন হারায়, ছোট কোলন প্রদর্শন করে এবং WT প্রাণীদের তুলনায় মলের মধ্যে প্রদাহজনক মার্কারের LCN2 উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি পেয়েছিল, যা আরও খারাপ প্রদাহ এবং রোগ নির্দেশ করে (চিত্র 1A-C)। এটিকে সমর্থন করে, হিস্টোলজিকাল বিশ্লেষণে WT (চিত্র 1D, E) এর তুলনায় Clec12a-/- প্রাণীদের এপিথেলিয়াল ক্ষতি, ক্রিপ্ট ক্ষয় এবং ইমিউন কোষের স্ফীতি বৃদ্ধি পেয়েছে। DSS কোলাইটিস মডেলের ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, CD4+ CD45RBhi কোষকে TCRb-/--তে স্থানান্তর করা; Clec12a-/- ডবল নকআউট ইঁদুরের কারণে সময়ের সাথে সাথে কম ওজন বৃদ্ধি পায় এবং TCRb-/- ইঁদুরে স্থানান্তরিত T কোষের তুলনায় ছোট কোলন (চিত্র 1F, G)। সম্মিলিতভাবে, এই ফলাফলগুলি দেখায় যে Clec12a হারানোর ফলে অন্ত্রের রোগ আরও খারাপ হয়।

Clec12a CD8+ টি কোষে খুব কম অভিব্যক্তি সহ সহজাত ইমিউন কোষের মধ্যে প্রকাশ করা হয় বলে জানা গেছে। তাই, Clec12a-/- প্রাণীদের মধ্যে পরিলক্ষিত খারাপ রোগের সাথে অভিযোজিত অনাক্রম্যতা জড়িত কিনা তা নির্ধারণ করার জন্য, Clec12a-/- প্রাণীদের টি এবং বি উভয় কোষ অপসারণের জন্য র্যাগ-/- প্রাণীদের মধ্যে ক্রস করা হয়েছিল। আবার, Clec12a-/- ডাব্লুটি প্রাণীদের তুলনায় পশুদের আরও খারাপ রোগ দেখা দেয় কারণ তারা WT নিয়ন্ত্রণের তুলনায় বেশি ওজন হারায় এবং কোলন ছোট ছিল (চিত্র 1H, I)। একইভাবে, Clec12a-/-; র‍্যাগ-/- নিয়ন্ত্রণের তুলনায় র‍্যাগ-/- অন্ত্রের রোগ আরও খারাপ হয়েছে এবং ওজন কমে গেছে এবং ডাব্লুটি এবং র‍্যাগ-/--এর তুলনায় ছোট কোলন ছিল Clec12a-/- (চিত্র 1H, I)। আমরা আগে রিপোর্ট করেছি যে S. cerevisiae-এর সাথে মৌখিক চিকিত্সা কোলাইটিসকে আরও খারাপ করতে ইউরিক অ্যাসিডের মাত্রা বাড়ায়। যাইহোক, WT বনাম Clec12a-/- প্রাণীদের মধ্যে সিরাম বা মলের ইউরিক অ্যাসিডের মাত্রার মধ্যে কোনো পার্থক্য পরিলক্ষিত হয়নি, পরামর্শ দেয় যে Clec12A-/--এ পরিলক্ষিত বর্ধিত রোগ ইউরিক অ্যাসিড বৃদ্ধির ফলে নয় (চিত্র S1)। এইভাবে, Clec12a-/- প্রাণীদের মধ্যে অবনতিশীল কোলাইটিসের বিকাশ পরিলক্ষিত হয় অভিযোজিত প্রতিরোধ ব্যবস্থা থেকে স্বাধীন।

cistanche tubulosa- ইমিউন সিস্টেম উন্নত

Cistanche Enhance Immunity পণ্য দেখতে এখানে ক্লিক করুন

【আরো জন্য জিজ্ঞাসা করুন】 ইমেল:cindy.xue@wecistanche.com / Whats অ্যাপ: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Clec12a-/- প্রাণীদের মধ্যে খারাপ কোলাইটিস মাইক্রোবায়োটার উপর নির্ভরশীল

কোলাইটিস আংশিকভাবে মাইক্রোবায়োটার সংমিশ্রণে পরিবর্তনের দ্বারা চালিত হয় বলে জানা যায় (কুবিনাক এট আল।, 2015; রে এবং ডিটেল, 2015)। Clec12a-/- প্রাণীরা একটি মাইক্রোবায়োটা রাখে যা খারাপ কোলাইটিসকে উন্নীত করে তা নির্ধারণ করতে, WT বা Clec12a-/- ইঁদুর থেকে জীবাণু-মুক্ত WT প্রাণীতে FMTs করা হয়েছিল। প্রতিস্থাপনের চার সপ্তাহ পরে, অর্ধেক প্রাণী একসাথে রাখা হয়েছিল, বাকি অর্ধেক আলাদাভাবে রাখা হয়েছিল। তীব্র DSS কোলাইটিস তখন প্রতিটি গ্রুপে প্ররোচিত হয়েছিল (চিত্র 2A)। যে প্রাণীগুলি একটি Clec12a-/- FMT পেয়েছে এবং সহ-হাউজ করা প্রাণীগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ওজন (চিত্র 2B) হারিয়েছে এবং WT ইঁদুর থেকে FMT প্রাপ্ত প্রাণীদের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে ছোট কোলন (চিত্র 2C) ছিল। অধিকন্তু, হিস্টোলজিকাল বিশ্লেষণে Clec12a-/- মাইক্রোবায়োটা (চিত্র 2D, E) দিয়ে প্রতিস্থাপনের পরে বৃহত্তর এপিথেলিয়াল ক্ষতি এবং প্রদাহজনক প্রবাহ প্রকাশ করা হয়েছে। ব্রে-কারটিস (PERMANOVA, p=0.0001), ওজনহীন (PERMANOVA, p=0.0062), এবং ওজনযুক্ত- ব্যবহার করে 16S rRNA জিন সিকোয়েন্সিং দ্বারা নির্ধারিত গোষ্ঠীগুলির মধ্যে প্রতিষ্ঠিত মাইক্রোবিয়াল সম্প্রদায়গুলি আলাদা ছিল। ইউনিফ্রাক দূরত্ব (PERMANOVA, p=0.0001)। প্রতিটি এফএমটি জিনোটাইপ (চিত্র 2 এফএইচ) থেকে জীবাণুর অধিগ্রহণকে নির্দেশ করে একই মেট্রিক্স দ্বারা সহ-হাউসড প্রাণীদের মধ্যে-গোষ্ঠীর মধ্যে মাইক্রোবায়োটার বৈষম্য সবচেয়ে বেশি ছিল। এই তথ্যগুলি নির্দেশ করে যে Clec12a-/- প্রাণীদের মধ্যে খারাপ হওয়া কোলাইটিস Clec12a-এর অনুপস্থিতিতে সমৃদ্ধ নির্দিষ্ট জীবাণু দ্বারা চালিত হয়; এবং এই জীবাণুগুলি একটি কোলিটোজেনিক ফেনোটাইপের প্রভাবশালী চালক হয়ে ওঠে, এমনকি একটি প্রতিষ্ঠিত WT মাইক্রোবায়োটার উপস্থিতিতেও।

Clec12a-/- প্রাণীদের মধ্যে গঠিত মাইক্রোবায়োটা গঠন অভিযোজিত প্রতিরোধ ক্ষমতা থেকে স্বাধীন

মাইক্রোবায়োটার গঠন নির্ধারণের জন্য ইমিউন সিস্টেম গুরুত্বপূর্ণ। এফএমটি পরীক্ষায় ইঙ্গিত দেওয়া হয়েছে যে Clec12a-/- মাইক্রোবায়োটার সংমিশ্রণে একটি পরিবর্তনের দিকে নিয়ে যায় যা খারাপ কোলাইটিসের বিকাশকে উৎসাহিত করে। আমরা প্রথমে নির্ণয় করতে চেয়েছিলাম যে ক্লেক 12a-/- ইমিউন কম্পার্টমেন্টের মধ্যে ঘাটতি অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটা পুনরায় আকার দিতে সক্ষম কিনা। এই লক্ষ্যে, WT বা Clec12a-/- ইঁদুর থেকে অস্থি মজ্জাকে প্রাণঘাতী ইরেডিয়েটেড WT SPF প্রাপক ইঁদুরে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল যাতে মাইক্রোবায়োটা মানিক করার জন্য একটি 8-সপ্তাহের ইমিউন পুনর্গঠন সময়কাল (চিত্র 3A)। এই সময়ের মধ্যে, প্রতিস্থাপিত ইমিউন সিস্টেমের প্রাপকের মধ্যে বিকাশের সময় থাকে, যা মাইক্রোবায়োটার গঠনকে ভিন্নভাবে আকার দেয়। এই ইমিউন ভাস্কর্যের ফলে মাইক্রোবায়োটায় প্রোকোলিটোজেনিক পরিবর্তন হয়েছে কিনা তা নির্ধারণ করতে, আমরা WT বা Clec12a-/- কাইমেরিক মাউস এবং প্ররোচিত DSS কোলাইটিস (চিত্র 3A) থেকে মল ব্যবহার করে FMTs করেছি। ওজন কমানোর ক্ষেত্রে (চিত্র 3B) কোনো উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন না হলেও, Clec12a-/- থেকে এফএমটি প্রাপ্ত প্রাণীদের কোলনগুলি WT ইঁদুর (চিত্র 3C) থেকে এফএমটি গ্রহণকারী প্রাণীদের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে ছোট ছিল, যা আরও খারাপ রোগ নির্দেশ করে। অধিকন্তু, যখন WT এবং Clec12a-/- FMT প্রাপকদের সহবাস করা হয়েছিল, তখন WT FMT (চিত্র 3C) প্রাপ্ত প্রাণীদের তুলনায় কোলনগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে ছোট ছিল। এইভাবে, হেমাটোপয়েটিক কম্পার্টমেন্টের মধ্যে Clec12a-/- ঘাটতি একটি প্রভাবশালী কোলিটোজেনিক মাইক্রোবায়োটা গঠনের দিকে পরিচালিত করে।

Clec12a-/- প্রাণীদের মধ্যে কোলিটোজেনিক মাইক্রোবায়োটা গঠনের জন্য অভিযোজিত প্রতিরোধ ব্যবস্থা যে সরবরাহযোগ্য তা আরও সমর্থন করার জন্য, আমরা Rag-/- বা Rag-/- থেকে মল ব্যবহার করে একটি FMT করেছি; Clec12a-/- - পূর্বে বর্ণিত হিসাবে। যে প্রাণীরা রাগ-/- পেয়েছে; Clec12a-/- FMT বেশি ওজন হারিয়েছে এবং র্যাগ-/- প্রাণীদের থেকে FMT প্রাপ্ত প্রাণীদের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে ছোট কোলন ছিল, তাছাড়া সহ-হাউজ করা প্রাণীদেরও খারাপ রোগ দেখা দিয়েছে (চিত্র 3D, E)। এই তথ্যগুলি দেখায় যে সহজাত ইমিউন সিস্টেমের মধ্যে Clec12a ঘাটতি কোলাইটিসকে উত্তেজিত করতে সক্ষম একটি মাইক্রোবায়োটা গঠনের জন্য যথেষ্ট।

Clec12a Faecalibaculum rodentium এর প্রসারণকে দমন করে

আমরা Clec12a-/- প্রাণীদের মধ্যে রোগ চালিত প্রাসঙ্গিক জীব সনাক্ত করতে বিভিন্ন অ্যান্টিবায়োটিকের একটি সিরিজ ব্যবহার করেছি। প্রথমত, এরিথ্রোমাইসিন, অ্যাম্পিসিলিন, নিওমাইসিন এবং জেন্টামাইসিন অন্তর্ভুক্ত ব্রড-স্পেকট্রাম অ্যান্টিবায়োটিকের একটি শক্তিশালী ককটেল দিয়ে চিকিত্সা, Clec12a-/- এবং WT প্রাণী উভয়ের মধ্যে রোগের তীব্রতা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করে, যা পরামর্শ দেয় যে মাইক্রোবায়োটার ব্যাকটেরিয়া জনসংখ্যা রোগের জন্য প্রাসঙ্গিক ছিল ( চিত্র 4A; চিত্র S2)। এরপরে, অনন্য ব্যাকটেরিয়া ট্যাক্সাকে লক্ষ্য করে বিভিন্ন অ্যান্টিবায়োটিক ব্যবহার করে কোন ব্যাকটেরিয়া জনসংখ্যা রোগের জন্য সবচেয়ে প্রাসঙ্গিক ছিল তা আমরা আরও সংকুচিত করেছি। বিশেষত, আমরা জেন্টামাইসিন, গ্রাম-নেগেটিভ ব্যাকটেরিয়াকে লক্ষ্য করে একটি অ্যামিনোগ্লাইকোসাইড এবং সেফালোথিন, একটি সেফালোস্পোরিন যা প্রাথমিকভাবে গ্রাম-পজিটিভ ব্যাকটেরিয়াকে লক্ষ্য করে নির্বাচন করেছি। এই ওষুধগুলি DSS কোলাইটিসের সময় Clec12a-/- প্রাণীদের দেওয়া হয়েছিল। যদিও জেন্টামাইসিনের সাথে চিকিত্সা রোগের তীব্রতায় কোন পার্থক্য করেনি, যে সমস্ত প্রাণী সেফালোথিন পেয়েছিল তাদের ওজন বজায় রেখেছিল এবং উপহাস করা প্রাণীদের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে দীর্ঘ কোলন ছিল (চিত্র 4B, C), যা নির্দেশ করে যে গ্রাম-পজিটিভ জীবগুলি Clec12a-/- মাইক্রোবায়োটা খেলার মধ্যে বসবাস করে। রোগের প্যাথলজি বাড়াতে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা।

আমরা পরবর্তীতে SPF WT এবং Clec12a-/- মল-এর 16S rRNA জিন সিকোয়েন্সিং করেছি যাতে মাইক্রোবায়োটাতে কম্পোজিশনাল পরিবর্তনগুলি প্রোফাইল করা যায়। WT এবং Clec12a-/- প্রাণীগুলি যথাক্রমে নন-ফাইলোজেনেটিক এবং ফাইলোজেনেটিক প্রাচুর্য-ভারযুক্ত মেট্রিক্স, ব্রে-কারটিস এবং ওজনযুক্ত-ইউনিফ্র্যাক উভয়ের দ্বারা উল্লেখযোগ্যভাবে আলাদাভাবে ক্লাস্টার করা হয়েছে (চিত্র S3A-C)। আলফা বৈচিত্র্যের পরিমাপ সমৃদ্ধির (পর্যবেক্ষিত বৈশিষ্ট্য) কোন উল্লেখযোগ্য পার্থক্য প্রকাশ করেনি, যা নির্দেশ করে যে Clec12a-/- বেশি প্রজাতির আশ্রয় নেয়নি (চিত্র 4D)। যাইহোক, Clec12a-এর অনুপস্থিতিতে সমতা এবং শ্যানন বৈচিত্র্য সূচকগুলি বৃদ্ধি করা হয়েছিল যা নির্দেশ করে যে Clec12a-/- ইঁদুরগুলিতে ব্যাকটেরিয়ার আনুপাতিক বন্টন পরিবর্তিত হয়েছিল (চিত্র 4E, F) এবং আরও সমর্থন করে যে Clec12a অন্ত্রের মধ্যে মাইক্রোবায়োটা গঠন নিয়ন্ত্রণের জন্য গুরুত্বপূর্ণ।

মাইক্রোবায়োম (ANCOM) এর সংমিশ্রণ বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে, ASVs (অ্যামপ্লিকন সিকোয়েন্স ভেরিয়েন্ট) এর মধ্যে বিচ্ছিন্নভাবে প্রচুর, একটি ASV Faecalibaculum জেনাসে (Erysipelotrichaceae পরিবার) শ্রেণীবদ্ধ, ক্লেক12a-/- মল-এর মধ্যে WT-এর তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে প্রসারিত হয়েছিল। 4G, H)। আমাদের বিশ্লেষণ থেকে ASV প্রতিনিধি ক্রম ব্যবহার করে BLAST ব্যাকটেরিয়া Faecalibaculum rodentium থেকে অনুক্রমের 100% পরিচয় নির্দেশ করে। এই তথ্যগুলি প্রমাণ দেয় যে Clec12a-/- প্রাণীর গ্রাম-পজিটিভ ব্যাকটেরিয়া কোলিটোজেনিক ফেনোটাইপের জন্য দায়ী, এবং বিশেষত গ্রাম-পজিটিভ জীব, F. রডেন্টিয়ামকে আরও খারাপ রোগে জড়িত করে।

এর উপর ভিত্তি করে, আমরা অনুমানটি পরীক্ষা করেছি যে F. rodentium কোলাইটিসকে বাড়িয়ে তুলতে পারে। আমরা WT SPF প্রাণীদের 1 x 108 CFU দিয়ে প্রাক-চিকিৎসা করেছি মৌখিক গ্যাভেজ দ্বারা লাইভ বা স্থির F. রডেন্টিয়ামের এবং F. রোডেন্টিয়াম উপনিবেশের উচ্চ মাত্রা নিশ্চিত করার জন্য DSS-এর তীব্র মডেলের সময় প্রতিদিন চিকিত্সা অব্যাহত রেখেছি। যে প্রাণীরা জীবিত এবং স্থায়ী F. rodentium উভয়ই পেয়েছে তারা বেশি ওজন হারিয়েছে এবং যানবাহন দ্বারা চিকিত্সা করা প্রাণীদের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে ছোট কোলন ছিল (চিত্র 4I, J), ইঙ্গিত করে যে F. রডেন্টিয়ামের বর্ধিত মাত্রা রোগকে আরও খারাপ করতে পারে।

Clec12a ফ্যাগোসাইটোসিস বাড়ানোর সময় ম্যাক্রোফেজ প্রদাহজনক প্রতিক্রিয়া সীমাবদ্ধ করে

রোগের অনুপস্থিতিতে Clec12a সেলুলার এক্সপ্রেশনকে সংজ্ঞায়িত করতে, আমরা বহু-রঙের প্রবাহ সাইটোমেট্রি ব্যবহার করে ল্যামিনা প্রোপ্রিয়া (এলপি) এ সহজাত এবং অভিযোজিত প্রতিরোধক কোষগুলিকে প্রোফাইল করেছি। পূর্ববর্তী প্রতিবেদনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, Clec12a প্রধানত লিম্ফোসাইট (চিত্র 5A) (Han et al., 2004; Pyz et al., 2008; Sobanov et al., 2001) এর উপর সামান্য থেকে কোন অভিব্যক্তি সহ মাইলয়েড বংশের মধ্যে সীমাবদ্ধ। অন্ত্রের নিউট্রোফিল, ম্যাক্রোফেজ এবং ডেনড্রাইটিক কোষগুলি Clec12a এক্সপ্রেশনের (চিত্র S4A) অনুরূপ স্তর প্রদর্শন করে, যখন ম্যাক্রোফেজগুলির মধ্যে Clec12a (চিত্র 5A) প্রকাশ করে অন্ত্রের টিস্যুর মধ্যে কোষের সর্বাধিক শতাংশ ছিল। ক্লাসিক্যাল অ্যাক্টিভেশনের মাধ্যমে প্রদাহকে উন্নীত করার জন্য ম্যাক্রোফেজগুলির দ্বৈত ভূমিকা দেওয়া কিন্তু টিস্যু ক্ষতির প্রতিক্রিয়া হিসাবে প্রতিকারমূলক প্রক্রিয়া শুরু করার জন্য, আমরা জিজ্ঞাসা করেছি কিভাবে Clec12a কোলাইটিসের সময় এই দ্বিধাবিভক্তিকে প্রভাবিত করতে পারে। যদিও ম্যাক্রোফেজগুলি বেশ বৈচিত্র্যময়, সেগুলিকে যথাক্রমে CD38 এবং EGR2 প্রকাশের মাধ্যমে M1 প্রদাহজনক এবং M2 রিপারেটিভ ম্যাক্রোফেজে ভাগ করা যেতে পারে। আমরা দেখাই যে Clec12a-/- প্রাণীরা কোলাইটিসের সময় কোলনিক এলপিতে M1 ম্যাক্রোফেজ বৃদ্ধি করেছে এবং M2 ম্যাক্রোফেজ হ্রাস করেছে (চিত্র 5 বি, সি, চিত্র S4B)। এই তথ্যগুলি নির্দেশ করে যে Clec12a অন্ত্রে ম্যাক্রোফেজ প্রতিক্রিয়াগুলি নিয়ন্ত্রণ করে।

Clec12a কীভাবে মাইক্রোবিয়াল লিগ্যান্ডের প্রতিক্রিয়ায় ম্যাক্রোফেজ জীববিজ্ঞানকে প্রভাবিত করে তা আরও ভালভাবে বোঝার জন্য, WT বা Clec12a-/- থেকে বিচ্ছিন্ন অস্থি মজ্জা থেকে প্রাপ্ত ম্যাক্রোফেজ (BMDMs) LPS, Pam3CysK এবং Flagellin সহ বিভিন্ন সাধারণ মাইক্রোবিয়াল লিগ্যান্ডের সাথে চিকিত্সা করা হয়েছিল। এই সমস্ত নমুনাগুলিতে সাইটোকাইন বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। পরীক্ষিত অনেক সাইটোকাইন এই অবস্থার অধীনে প্ররোচিত হয়নি, তবে, MCP-1, IL-27, IFN-b, TNF-a, এবং IL-6 এই সংস্কৃতিগুলিতে ধারাবাহিকভাবে সনাক্ত করা হয়েছিল ( চিত্র 5D)। Clec12a-/- অনেক মাইক্রোবিয়াল লিগান্ডের প্রতিক্রিয়ায় BMDM-এ এই সাইটোকাইনগুলির উল্লেখযোগ্যভাবে উচ্চতর অভিব্যক্তি ছিল এবং TLR2 অ্যাগোনিস্ট Pam3CysK-এর প্রতিক্রিয়ায় সবচেয়ে বড় ডিফারেনশিয়াল প্রতিক্রিয়া দেখা গেছে। এই ডেটা জীবাণুমুক্ত প্রদাহের সময় প্রদাহজনক প্রতিক্রিয়া টেম্পারিং করার ক্ষেত্রে Clec12a এর পরিচিত ভূমিকার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ (নিউম্যান এট আল।, 2014)।

cistanche উদ্ভিদ-বৃদ্ধি প্রতিরোধ ক্ষমতা

RNA-seq WT বা Clec12a-/- থেকে BMDM-এ সঞ্চালিত হয়েছিল F. rodentium-এর সাথে চিকিত্সা করা হয়েছিল কিভাবে Clec12a এই নির্দিষ্ট ব্যাকটেরিয়া জীবের প্রতি এই কোষগুলির প্রতিক্রিয়া নিয়ন্ত্রণ করে। আমরা WT BMDM-এর সাথে যানবাহন নিয়ন্ত্রণের উপর F. rodentium-এর সংস্পর্শে আসা Clec12a-/- BMDM-এর তুলনা করে ডিফারেনশিয়াল প্রতিক্রিয়া মূল্যায়ন করেছি। ভিন্নভাবে প্রকাশিত জিনগুলির সমৃদ্ধকরণ বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে Clec12a ঘাটতি ম্যাক্রোফেজগুলি F. rodentium (চিত্র S5A) এর সাথে চ্যালেঞ্জ করার সময় কোষ চক্র নিয়ন্ত্রণের মধ্যে জড়িত জিনের উল্লেখযোগ্য বৃদ্ধি পেয়েছে। কোষ চক্র অভ্যন্তরীণভাবে ফ্যাগোসাইটোসিসের সাথে যুক্ত এবং ফ্যাগোসাইটোসিস এবং প্রদাহজনক প্রতিক্রিয়া (চিত্র 5E) (লুও এট আল।, 2005) এর সাথে যুক্ত জিনের উল্লেখযোগ্য হ্রাসও ছিল। Clec12a এবং সালমোনেলার ​​উপর সাম্প্রতিক একটি গবেষণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, এই তথ্যগুলি থেকে বোঝা যায় যে সাধারণ অন্ত্রের বাসিন্দা F. rodentium (Begun et al., 2015) এর প্রতিক্রিয়ায় Clec12a এর অনুপস্থিতিতে ফ্যাগোসাইটোসিস ত্রুটিপূর্ণ। এটি পরীক্ষা করার জন্য, পেরিটোনিয়াল ম্যাক্রোফেজগুলি WT এবং Clec12a-/- প্রাণীদের থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং Sybr®-সবুজ লেবেলযুক্ত F. rodentium-এর সাথে সহ-সংস্কৃতি করা হয়েছিল। Clec12a-/- ম্যাক্রোফেজে কোষ প্রতি উল্লেখযোগ্যভাবে কম জীবাণু ছিল (চিত্র 5F, G; চিত্র S5B), যা নির্দেশ করে যে Clec12a ঘাটতি কম জীবের গ্রহণের দিকে পরিচালিত করে এবং RNA-seq ডেটাসেটে কমে যাওয়া ফ্যাগোসাইটোসিসের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। সম্মিলিতভাবে, এই তথ্যগুলি দেখায় যে Clec12a ম্যাক্রোফেজ ব্যাকটেরিয়া গ্রহণের প্রচার করার সময় সাধারণ মাইক্রোবিয়াল লিগ্যান্ডগুলিতে প্রকাশ্য প্রদাহজনক প্রতিক্রিয়াগুলি হ্রাস করার দ্বৈত ভূমিকা পালন করে।

Clec12a গ্রাম-পজিটিভ কমেন্সালের সাথে অগ্রাধিকারমূলকভাবে আবদ্ধ করে

যেহেতু ফ্যাগোসাইটোসিস শুরু হয় জীবাণুর আবদ্ধতার মাধ্যমে অভ্যন্তরীণকরণ এবং হত্যার মাধ্যমে, আমরা অনুমান করেছিলাম যে Clec12a মাইক্রোবায়োটার নির্দিষ্ট সদস্যদের সাথে আবদ্ধ করতে সক্ষম ছিল, যেমন F. রডেন্টিয়াম। এই সম্ভাবনাকে মোকাবেলা করার জন্য, মুরিন Clec12a এর এক্সট্রা সেলুলার বাইন্ডিং ডোমেন এবং মানব IgG1 (Clec12a-Fc) এর Fc অংশ ধারণকারী একটি ফিউশন প্রোটিন তৈরি করা হয়েছিল (চিত্র 6A) (ম্যাগ্লিনাও এট আল।, 2014; নিউম্যান এট আল।, 2014; রাউল এট আল।, 2019)। প্রোটিনটি বিশুদ্ধ করা হয়েছিল এবং বিভিন্ন গ্রাম-পজিটিভ এবং গ্রাম-নেগেটিভ ব্যাকটেরিয়াগুলির একটি প্যানেলের সাথে আবদ্ধ হওয়ার জন্য স্ক্রীন করা হয়েছিল যা হোমিওস্ট্যাটিক অন্ত্রের মধ্যে উপস্থিত বলে পরিচিত, যার মধ্যে রয়েছে F. rodentium, Roseburia spp., Bifidobacteria animalis, Akkermansia muciniphila, Bacteriodes uniformis, এবং ছত্রাক কমেন্সাল ক্যান্ডিডা অ্যালবিকান, প্রবাহ সাইটোমেট্রি দ্বারা। সালমোনেলা এন্টারিকাকেও অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল কারণ পূর্ববর্তী গবেষণায় ইঙ্গিত দেওয়া হয়েছিল যে Clec12a কোষে S. enterica প্রবেশের সাথে যুক্ত হতে পারে (Begun et al., 2015)। Clec12a বিভিন্ন ফিলোজেনেটিকভাবে স্বতন্ত্র ব্যাকটেরিয়া সহ বিভিন্ন ডিগ্রীতে আবদ্ধ, যার মধ্যে রয়েছে F. rodentium, কিন্তু ছত্রাক নয়, C. albicans (চিত্র 6B)। Clec12a গ্রাম-পজিটিভ জীবাণুর সাথে সবচেয়ে বেশি আবদ্ধ F. rodentium এবং Lachnospiraceae পরিবারের সদস্য Roseburia sp., এবং B. animalis, B. uniformis, এবং S. enterica (চিত্র 6B) এর সাথে সবচেয়ে কম মিথস্ক্রিয়া করেছে, যা নির্দেশ করে Clec12a পারে গ্রাম-পজিটিভ জীবের জন্য অগ্রাধিকার সহ মাইক্রোবায়োটার নির্দিষ্ট সদস্যদের সাথে আবদ্ধ। আমাদের ডেটা একসাথে নেওয়া Clec12a কে অন্ত্রের মাইক্রোবিয়াল সম্প্রদায়ের জরিপ করার জন্য ইমিউন সিস্টেম দ্বারা নিযুক্ত একটি প্রক্রিয়া হিসাবে চিহ্নিত করে এবং প্রচুর গ্রাম-পজিটিভ জীবাণুর প্রকাশ্য প্রদাহজনক প্রতিক্রিয়া রোধ করার সাথে সাথে সরাসরি বাঁধাই এবং ফ্যাগোসাইটোসিসের মাধ্যমে মাইক্রোবায়োটা ছাঁটাই করে যা অন্ত্রের স্বাস্থ্য বজায় রাখার জন্য গুরুত্বপূর্ণ।

আলোচনা

অন্ত্রের মধ্যে হোমিওস্ট্যাসিসের জন্য ক্ষতিকারক প্রদাহ শুরু না করে কমেন্সাল জীবাণুগুলিকে সীমাবদ্ধ করার প্রক্রিয়া প্রয়োজন (ম্যাকফারসন এট আল।, 2000)। IgA, সাম্প্রতিক বছরগুলিতে, অন্ত্রের অনাক্রম্যতা মাইক্রোবায়োটার উপর নিয়ন্ত্রণ প্রয়োগ করতে পারে এমন একটি গুরুত্বপূর্ণ উপায় হিসাবে আবির্ভূত হয়েছে (Pabst and Slack, 2020)। প্রকৃতপক্ষে, IgA সরাসরি জীবাণু এবং/অথবা তাদের পণ্যগুলির সাথে আবদ্ধ করতে এবং প্রোটো-টাইপিক্যাল প্রদাহের আবেশ ছাড়াই অন্ত্র থেকে তাদের নির্মূল করতে সক্ষম। এই দ্বৈত বৈশিষ্ট্যের অধিকারী অন্যান্য ইমিউন অণুগুলি আজ পর্যন্ত অধ্যয়ন করা হয়নি। সি-টাইপ লেকটিনগুলি বিভিন্ন ধরণের প্রোটিন নিয়ে গঠিত যা মাইক্রোবিয়াল এবং হোস্ট পণ্যগুলি থেকে বিভিন্ন ধরণের প্রোটিন, কার্বোহাইড্রেট এবং লিপিড অণুকে চিনতে পারে (ব্রাউন এট আল।, 2018; ড্রুইন এট আল।, 2020)। যাইহোক, অন্ত্রের অনাক্রম্যতা এবং মাইক্রোবায়োটার প্রেক্ষাপটে কিছু অধ্যয়ন করা হয়েছে (ইলিভ এট আল।, 2012; মার্টিনেজ-লোপেজ এট আল।, 2019)। এইভাবে, আমাদের জানামতে, এটিই প্রথম প্রদর্শন যে Clec12a ঘাটতি মাইক্রোবায়োটার গঠনকে পরিবর্তন করে যা রোগের তীব্রতা চালায়।

cistanche বেনিফিট-ইমিউন সিস্টেমকে শক্তিশালী করে

Clec12a মোনোসোডিয়াম ইউরেট (এমএসইউ) বা ইউরিক অ্যাসিডের স্বীকৃতির প্রেক্ষাপটে মূলত অধ্যয়ন করা হয়েছে, যা প্রায়শই সেলুলার মৃত্যুর একটি ইঙ্গিত (কোনো এট আল।, 2010; নিউম্যান এট আল।, 2014)। ইউরিক অ্যাসিড NLRP3 ইনফ্ল্যামাসোমের মাধ্যমে প্রদাহজনক প্রতিক্রিয়া সক্রিয় করতে সক্ষম, এইভাবে, কোষের মৃত্যুর সময় টিস্যু ধ্বংস প্রতিরোধ করার জন্য, এই প্রদাহকে নিয়ন্ত্রণ করতে হবে (মার্টিনন এট আল।, 2006)। Clec12a Syk সিগন্যালিংয়ের ডাউনরেগুলেশনের মাধ্যমে এই প্রদাহজনক প্রতিক্রিয়ার ভারসাম্য বজায় রাখতে দেখানো হয়েছিল (মার্শাল এট আল।, 2004)। এর সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ, জীবাণুমুক্ত প্রদাহের একটি মডেল এবং আর্থ্রাইটিসের একটি অটোইনফ্ল্যামেটরি মডেলে Clec12a মুছে ফেলার ফলে বর্ধিত নিউট্রোফিল অ্যাক্টিভেশন এবং রোগ আরও খারাপ হয়, যার ফলে Clec12a একটি গুরুত্বপূর্ণ প্রদাহজনক ব্রেক তৈরি করে (Redelinghuys et al., 2016)। যাইহোক, অতি সম্প্রতি Clec12a ভাইরাল সংক্রমণের প্রতিক্রিয়া হিসাবে টাইপ I ইন্টারফেরন সংকেত বাড়ানোর জন্য এবং অ্যান্টিব্যাকটেরিয়াল অটোফ্যাজি পথের মাধ্যমে সালমোনেলা গ্রহণের মধ্যস্থতা করার জন্যও প্রদর্শিত হয়েছিল (বেগুন এট আল।, 2015; লি এট আল।, 2019)। এটি প্রমাণ করে যে Clec12a শুধুমাত্র প্রদাহ সীমাবদ্ধ করার জন্য কাজ করে না, বরং, প্রেক্ষাপটের উপর নির্ভর করে বিভিন্ন ভূমিকা পালন করতে পারে। অন্ত্র আলাদা যে রোগের অনুপস্থিতিতেও প্রচুর সংখ্যক ইমিউন কোষ রয়েছে। এটি মাইক্রোবায়োটার উপস্থিতির কারণে, যা রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা বিকাশের নির্দেশ দিতে এবং প্যাথোজেনিক জীবের উপনিবেশ রোধে গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। মাইক্রোবায়োটা TLR দ্বারা সনাক্ত করা একই পৃষ্ঠের নিদর্শন ধারণ করে যা প্যাথোজেনগুলিকেও চিনতে পারে, এবং সেইজন্য অন্ত্রের ইমিউন সিস্টেমের অবশ্যই এই বিদেশী জীবের প্রদাহকে নিয়ন্ত্রণ করার জন্য কঠোর নিয়ন্ত্রক ব্যবস্থা থাকতে হবে (ব্লান্ডার এট আল।, 2017)।

আমরা মূলত Clec12a-তে আগ্রহী হয়েছিলাম কারণ আমরা শনাক্ত করেছি যে একটি অন্ত্রের ছত্রাক, Saccharomyces cerevisiae ইউরিক অ্যাসিডকে কোলাইটিসকে খারাপ করতে প্ররোচিত করে (Chiaro et al., 2017)। তদুপরি, অন্যান্য গবেষণায় চিহ্নিত করা হয়েছে যে মাইক্রোবায়োটা পিউরিন বিপাকের আবেশের মাধ্যমে অন্ত্রের রোগকে প্রভাবিত করতে পারে, যার মধ্যে স্তন্যপায়ী প্রাণীর শেষ পণ্যটি হল ইউরিক অ্যাসিড (ঝু এট আল।, 2019)। এই তথ্যগুলি পরামর্শ দেয় যে ইউরিক অ্যাসিড বোঝার প্রক্রিয়া, যেমন Clec12a, অন্ত্রের হোমিওস্ট্যাসিসকে প্রভাবিত করতে পারে। যাইহোক, আমরা সিরাম বা মলে ইউরিক অ্যাসিডের মাত্রায় কোনো পরিবর্তন লক্ষ্য করিনি, যা নির্দেশ করে যে Clec12a-/- প্রাণীর রোগের তীব্রতা বৃদ্ধি ইউরিক অ্যাসিড দ্বারা চালিত হয়নি। যাইহোক, Clec12a-/--এ কোলাইটিসের বর্ধিত তীব্রতা মাইক্রোবায়োটার সংমিশ্রণ দ্বারা চালিত হয়। এইভাবে, আমাদের ডেটার উপর ভিত্তি করে Clec12a-/--এর অভিব্যক্তি হ্রাস IBD রোগীদের মধ্যে মাইক্রোবায়োটার গঠনকে প্রভাবিত করতে পারে (Jason L. Kubinak, 2015; Rehman et al., 2011; Vijay Kumar et al., 2010)। মজার বিষয় হল, আমরা দেখতে পেয়েছি যে গ্রাম-পজিটিভ জীবকে লক্ষ্য করে অ্যান্টিবায়োটিকগুলি Clec12a-/- প্রাণীদের মধ্যে কোলাইটিসের তীব্রতা কমাতে সক্ষম হয়েছিল। এটি বেশ কয়েকটি প্রতিবেদনের বিপরীতে যা অন্ত্রের প্রদাহের সময় প্রসারিত গ্রাম-নেতিবাচক Enterobacteriaceae সনাক্ত করেছে, এইভাবে, এটি এমন কয়েকটি গবেষণার মধ্যে একটি যা গ্রাম-পজিটিভ জীবের সম্প্রসারণ সনাক্ত করেছে যা কোলাইটিস বিকাশের সাথে যুক্ত। যদিও, সম্ভবত এই মডেলে কোলাইটিসের তীব্রতাকে প্রভাবিত করার একমাত্র জীব নয়, Clec12a-/- প্রাণীদের মধ্যে F. rodentium-এর নাটকীয় প্রসারণ লক্ষ্য করা গেছে। F. rodentium হল Firmicutes (Bacillota) phyla (Chang et al., 2015) এর একটি গ্রাম-পজিটিভ, অক্সিডেস এবং ক্যাটালেস-নেগেটিভ সদস্য। এমনকি ডব্লিউটি ইঁদুরের সাথে প্রতিদিন এফ. রোডেন্টিয়ামের প্রবর্তন কোলাইটিস বাড়ায়, এটি সমর্থন করে যে অন্ত্রের মধ্যে এফ. রডেন্টিয়ামের প্রসারিত মাত্রা ক্ষতিকারক এবং সম্ভবত ক্লেক12a-/-তে কোলাইটিস তীব্রতাকে চালিত করে। সাম্প্রতিক একটি প্রতিবেদনে প্রমাণিত হয়েছে যে এফ. রোডেন্টিয়াম এপিথেলিয়াল টার্নওভার বাড়াতে পারে এবং এপিথেলিয়ার মধ্যে এনজাইমের অভিব্যক্তিকে দমন করতে পারে যা প্রদাহজনক প্রতিক্রিয়াকে নিয়ন্ত্রণ করে এবং এইভাবে আমরা যে খারাপ রোগটি দেখতে পাই যখন এফ. রোডেন্টিয়াম অন্ত্রে প্রসারিত হয় (কাও এট আল।, 2022)। যেহেতু মানুষ F. rodentium (Zagato et al., 2020) এর অনুরূপ একটি জীবের সাথে উপনিবেশিত, তাই পরবর্তী গবেষণায় কোলাইটিস সম্পর্কিত মানব শারীরবৃত্তির দিকগুলির উপর এই F. রডেন্টিয়াম-সদৃশ ব্যাকটেরিয়াগুলির প্রভাব ব্যাখ্যা করা উচিত।

সহজাত ইমিউন কোষগুলির মধ্যে Clec12a-এর ভূমিকাকে সমর্থন করে, আমরা লক্ষ্য করেছি যে Clec12a-/- প্রাণীদের মধ্যে কোলিটোজেনিক মাইক্রোবায়োটা এখনও গঠিত হয় যাদের একটি অভিযোজিত প্রতিরোধ ব্যবস্থা নেই। Clec12a প্রকাশকারী অন্ত্রের মধ্যে সর্বাধিক শতাংশ কোষগুলি ম্যাক্রোফেজ যা আমাদের এই কোষগুলিতে Clec12a ফাংশনের উপর ফোকাস করতে পরিচালিত করে। পূর্ববর্তী গবেষণায় প্রমাণিত হয়েছে যে Clec12a ভাইরাল সংক্রমণের প্রতিক্রিয়ায় টাইপ I ইন্টারফেরন উৎপাদনের একটি গুরুত্বপূর্ণ মধ্যস্থতাকারী (লি এট আল।, 2019)। যাইহোক, কিভাবে Clec12a ব্যাকটেরিয়া লিগান্ডের বিস্তৃত বর্ণালীর প্রতিক্রিয়াকে প্রভাবিত করে তা মূল্যায়ন করা হয়নি; এটি অন্ত্রে অত্যন্ত প্রাসঙ্গিক যেখানে প্রচুর পরিমাণে TLR লিগ্যান্ড রয়েছে। এখানে, আমরা দেখাই যে Clec12a অন্ত্রে ম্যাক্রোফেজ প্রতিক্রিয়া মেজাজ করে এবং মাইক্রোবায়োটার প্রতিক্রিয়ায় হোমিওস্ট্যাসিস নিশ্চিত করার জন্য সম্ভাব্য কাজ করে। F. rodentium এর সাথে ইনকিউবেট করা ম্যাক্রোফেজগুলির RNA-seq হাইলাইট করেছে যে Clec12a এর ঘাটতি এই কমেন্সাল ব্যাকটেরিয়াগুলির প্রতিক্রিয়া হিসাবে কোষ চক্র এবং ফ্যাগোসাইটোসিস ত্রুটির দিকে পরিচালিত করে। সাম্প্রতিক একটি সমীক্ষায় দেখা গেছে যে Clec12a-/- ম্যাক্রোফেজগুলি সালমোনেলার ​​প্রতিক্রিয়ায় অটোফ্যাজি হ্রাস করেছে (বেগুন এট আল।, 2015)। আমাদের ডেটা প্রশংসা করে এবং এই ফলাফলগুলিকে প্রসারিত করে যে Clec12a ফাংশনগুলি অ-আক্রমণকারী কমেন্সাল জীবগুলিকে নিয়ন্ত্রণ করতেও অন্তর্ভুক্ত করে। এফ. রোডেন্টিয়াম অন্যদের দ্বারা এপিথেলিয়াল জীববিজ্ঞানকে প্রভাবিত করার জন্য দেখানো হয়েছে, যা পরামর্শ দেয় যে এফ. রডেন্টিয়াম হোস্টের কাছাকাছি থাকে এবং তাই প্রতিরোধ ব্যবস্থা দ্বারা শক্তভাবে নিয়ন্ত্রণ করা আবশ্যক। আমাদের ডেটা সমর্থন করে যে Clec12a ফ্যাগোসাইটোসিস নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে F. rodentium নিয়ন্ত্রণ করে। ফাগোসাইটোসিস একটি লিগ্যান্ড বা জীবাণুর শারীরিক আবদ্ধতার মাধ্যমে শুরু হয় এবং সি-টাইপ লেকটিন একাধিক লিগ্যান্ডের সাথে যুক্ত হতে পারে, যা আমাদের পরীক্ষা করতে পরিচালিত করে যে Clec12a সরাসরি অন্ত্রে বসবাসকারী ব্যাকটেরিয়ার সাথে যুক্ত হতে পারে কিনা। মজার বিষয় হল, Clec12a গ্রাম-পজিটিভ জীবাণুর সাথে সবচেয়ে বেশি আবদ্ধ F. rodentium এবং Roseburia এবং গ্রাম-নেতিবাচক জীব A. muciniphila এবং B. uniformis-এর সাথে অনেক কম এবং C. albicans-এর সাথে একেবারেই নয়। এই তথ্যটি দেখায় যে Clec12a এর মাইক্রোবায়োটার নির্দিষ্ট সদস্যদের আবদ্ধ করার প্রবণতা রয়েছে। এটি আমাদের এমন একটি মডেল তৈরি করতে দেয় যেখানে Clec12a এবং পরবর্তী ফ্যাগোসাইটোসিসের সাথে জড়িত থাকা মাইক্রোবায়োটার নির্দিষ্ট সদস্যদের নিয়ন্ত্রণ করতে পারে এবং তাদের সম্প্রসারণের সম্ভাব্য ক্ষতিকর প্রভাব রোধ করতে পারে। এটি Clec12a এর দ্বৈত ফাংশনকে হাইলাইট করে যা মাইক্রোবিয়াল লিগান্ডের বিরুদ্ধে প্রদাহকে নিয়ন্ত্রণ করতে পারে এবং মাইক্রোবায়োটার নির্দিষ্ট সদস্যদের সনাক্ত ও নিয়ন্ত্রণ করতে পারে। এইভাবে, Clec12a গ্যাস্ট্রোইনটেস্টাইনাল ট্র্যাক্টের মধ্যে হোমিওস্ট্যাসিস নিশ্চিত করার জন্য সহজাত ইমিউন সিস্টেম নিযুক্ত একটি অনন্য উপায় উপস্থাপন করে।

চিত্রে কিংবদন্তী

চিত্র 1. Clec12a অভিযোজিত ইমিউন সিস্টেম থেকে স্বাধীন অন্ত্রের রোগ প্রতিরোধ করে

(A) কোলাইটিসের তীব্রতা মূল্যায়ন করার জন্য WT বা Clec12a-/- C57BL/6 নির্দিষ্ট প্যাথোজেন-মুক্ত (SPF) ইঁদুরকে 2.5% ডেক্সট্রান সোডিয়াম সালফেট (DSS) অ্যাড লিবিটাম দিয়ে 7 দিনের জন্য পানীয় জলে চিকিত্সা করা হয়েছিল। শতকরা ওজন হ্রাস দৈনিক মূল্যায়ন করা হয়েছিল। গড় +/- SEM, দ্বি-মুখী ANOVA এবং Śídák এর একাধিক তুলনা পরীক্ষা ব্যবহার করে তিনটি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে ডেটা সংগ্রহ করা হয়।

(বি) কোরবানির সময় নির্দেশিত পশুদের কোলন দৈর্ঘ্য (সেমি) পরিমাপ করা হয়েছিল। একটি স্ক্যাটার প্লট হল গড় +/- SEM, একটি জোড়াবিহীন টি-পরীক্ষা ব্যবহার করে তিনটি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে ডেটা সংগ্রহ করা হয়। প্রতিটি পয়েন্ট একটি মাউস প্রতিনিধিত্ব করে

(C) নির্দেশিত প্রাণীদের ফেকাল লিপোক্যালিন-2 (ng/mL) প্রদাহের রিডআউট হিসাবে পরিমাপ করা হয়েছিল। বার গ্রাফ হল গড় +/- SEM, একটি জোড়াবিহীন টি-পরীক্ষা ব্যবহার করে দুটি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে ডেটা সংগ্রহ করা হয়। প্রতিটি পয়েন্ট একটি মাউস প্রতিনিধিত্ব করে

(ডি) প্রতিনিধি এইচএন্ডই ডিএসএস-প্ররোচিত কোলাইটিসের পরে নির্দেশিত প্রাণীদের থেকে কোলন অংশে দাগ দেয়।

(ই) নির্দেশিত প্রাণীদের জন্য হিস্টোলজি স্কোরগুলি কোলন বিভাগ থেকে তৈরি করা হয়েছিল

(D)। বার গ্রাফ হল গড় +/- SEM, একটি জোড়াবিহীন টি-পরীক্ষা ব্যবহার করে তুলনা করে। প্রতিটি পয়েন্ট একটি মাউস প্রতিনিধিত্ব করে।

(এফ) কোলাইটিসের টি কোষ স্থানান্তর মডেলটি দীর্ঘস্থায়ী কোলাইটিস মূল্যায়নের জন্য সম্পাদিত হয়েছিল। TCRb-/- এবং Clec12a-/- ;TCRb-/- পশুদের ওজন সাপ্তাহিক পরিমাপ করা হয়েছিল। গ্রাফটি পরীক্ষা জুড়ে নির্দেশিত প্রাণীদের শতকরা ওজন হ্রাস চিত্রিত করে। গড় +/- SEM, 2-ওয়ে ANOVA-এর সাথে তুলনা করে।

(G) কোরবানির সময় (I) থেকে নির্দেশিত প্রাণীদের উপনিবেশের দৈর্ঘ্য পরিমাপ করা হয়েছিল। বার গ্রাফ হল গড় +/- SEM, একটি জোড়াবিহীন টি-পরীক্ষা ব্যবহার করে তুলনা করে। প্রতিটি পয়েন্ট একটি মাউস প্রতিনিধিত্ব করে।

(H) WT, Clec12a-/- , Rag-/- বা Rag-/- ;Clec12a-/- C57BL/6 SPF ইঁদুরগুলি তীব্র কোলাইটিসের জন্য মূল্যায়ন করা হয়েছিল। নির্দেশিত প্রাণীদের 7 দিনের জন্য 2.5% DSS অ্যাড লিবিটাম সরবরাহ করা হয়েছিল। শতকরা ওজন হ্রাস দৈনিক মূল্যায়ন করা হয়েছিল। গড় +/- SEM, ডেটা দুটি স্বাধীন পরীক্ষার প্রতিনিধি। দ্বিমুখী ANOVA এবং Śídák এর একাধিক তুলনা পরীক্ষা।

(I) কোরবানির সময় নির্দেশিত পশুদের কোলন দৈর্ঘ্য (সেমি) পরিমাপ করা হয়েছিল। বার গ্রাফ হল গড় +/- SEM, ডেটা হল দুটি স্বাধীন পরীক্ষা-নিরীক্ষার প্রতিনিধি যা জোড়াবিহীন টি-পরীক্ষা ব্যবহার করে। প্রতিটি পয়েন্ট একটি মাউস উপস্থাপন করে * p < 0৷{5}}5; ** p < 0৷{9}}1; *** p < 0.001; **** p < 0.0001

চিত্র 2. একটি Clec12a-/- প্রাণীদের মধ্যে গঠিত মাইক্রোবায়োটা আরও খারাপ কোলাইটিস সৃষ্টি করে

ক) ফেকাল মাইক্রোবায়োটা ট্রান্সপ্ল্যান্ট (এফএমটি) ডাব্লুটি বা ক্লেক 12 এ প্রাণীদের থেকে জীবাণু-মুক্ত ডাব্লুটি ইঁদুরে মল সুপারনাট্যান্ট স্থানান্তর করে সঞ্চালিত হয়েছিল। মাইক্রোবায়োটাগুলিকে চার সপ্তাহের জন্য একত্রিত করার অনুমতি দেওয়া হয়েছিল, তারপরে, WTFMT ইঁদুরের অর্ধেক এবং Clec12a-/-FMT ইঁদুরের অর্ধেক একসাথে রাখা হয়েছিল এবং আরও চার সপ্তাহ মেশানোর অনুমতি দেওয়া হয়েছিল। সমস্ত গোষ্ঠী তখন তাদের পানীয় জলে 2.5% DSS অ্যাড লিবিটাম পেয়েছে এবং 7 তম দিনে বলি দেওয়া হয়েছিল।

খ) নির্দেশিত পশুদের শতকরা ওজন হ্রাস প্রতিদিন মূল্যায়ন করা হয়েছিল। গ্রাফটি বোঝায় +/- SEM, দ্বি-মুখী ANOVA এবং Śídák এর একাধিক তুলনা পরীক্ষা ব্যবহার করে দুটি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে ডেটা সংগ্রহ করা হয়।

গ) কোরবানির সময় নির্দেশিত প্রাণী থেকে কোলন দৈর্ঘ্য (সেমি) পরিমাপ করা হয়েছিল। একটি স্ক্যাটার প্লট হল গড় +/- SEM, Dunnett মাল্টিপল কম্প্যারিসন টেস্টের সাথে সাধারণ ওয়ান-ওয়ে আনোভা ব্যবহার করে তুলনা করে। প্রতিটি পয়েন্ট একটি মাউস প্রতিনিধিত্ব করে।

ডি) প্রতিনিধি এইচএন্ডই এফএমটি এবং ডিএসএস-প্ররোচিত কোলাইটিসের পরে নির্দেশিত প্রাণীদের কোলন অংশে দাগ দেয়।

ই) হিস্টোলজি স্কোরগুলি (ডি) তে কোলন বিভাগ থেকে তৈরি হয়েছিল। বার গ্রাফ হল গড় +/- SEM, একটি জোড়াবিহীন টি-পরীক্ষা ব্যবহার করে তুলনা করে। প্রতিটি পয়েন্ট একটি মাউস প্রতিনিধিত্ব করে।

F) WTFMT, Clec12a-/- FMT, বা সহ-হাউসড প্রাণীর 16S rRNA জিন সিকোয়েন্সিং থেকে ওজনযুক্ত ইউনিফ্রাক দূরত্ব। বক্স এবং হুইস্কার প্লটগুলি সমস্ত পয়েন্ট দেখাচ্ছে (জোড়াভাবে দূরত্বের তুলনা) এবং একটি ক্রুস্কাল-ওয়ালিস পরীক্ষা ব্যবহার করে তুলনা করা হয়েছে।

ছ) WTFMT, Clec12a-/- FMT, বা সহ-হাউসড প্রাণীর 16S rRNA জিন সিকোয়েন্সিং থেকে ওজনহীন ইউনিফ্রাক দূরত্ব। বক্স এবং হুইস্কার প্লটগুলি সমস্ত পয়েন্ট দেখাচ্ছে (জোড়াভাবে দূরত্বের তুলনা) এবং একটি ক্রুস্কাল-ওয়ালিস পরীক্ষা ব্যবহার করে তুলনা করা হয়েছে।

জ) WTFMT, Clec12a-/- FMT, বা সহ-হাউসড প্রাণীর 16S rRNA জিন সিকোয়েন্সিং থেকে ব্রে-কারটিস দূরত্ব। বক্স এবং হুইস্কার প্লটগুলি সমস্ত পয়েন্ট দেখাচ্ছে (জোড়াভাবে দূরত্বের তুলনা) এবং একটি ক্রুস্কাল-ওয়ালিস পরীক্ষা ব্যবহার করে তুলনা করা হয়েছে।

চিত্র 3: Clec12a-/- প্রাণীদের মধ্যে গঠিত মাইক্রোবায়োটা গঠন অভিযোজিত প্রতিরোধ ক্ষমতা থেকে স্বাধীন

ক) পরবর্তী FMT সহ অস্থি মজ্জা পুনর্গঠন দেখানো পরিকল্পিত চিত্র। C57Bl/6 WT ইঁদুরকে মারাত্মকভাবে বিকিরণ করা হয়েছিল এবং WT বা Clec12a-/- অস্থি মজ্জা দিয়ে পুনর্গঠন করা হয়েছিল। 8 সপ্তাহ পরে, এই ইঁদুরগুলি থেকে মল নেওয়া হয়েছিল এবং (A) তে ব্যাখ্যা করা অনুসারে WT জীবাণু-মুক্ত ইঁদুরে স্থানান্তরিত হয়েছিল। প্রাথমিকভাবে পুনর্গঠিত কাইমেরিক প্রাণীদের তখন তাদের পানীয় জলে 2.5% ডিএসএস অ্যাড লিবিটাম সরবরাহ করা হয়েছিল।

খ) (F) থেকে FMT ইঁদুরের শতকরা ওজন হ্রাস প্রতিদিন মূল্যায়ন করা হয়েছিল। গড় +/- SEM, দ্বি-মুখী ANOVA এবং Tukey একাধিক তুলনা পরীক্ষা ব্যবহার করে।

গ) কোরবানির সময় নির্দেশিত প্রাণী থেকে কোলন দৈর্ঘ্য (সেমি) পরিমাপ করা হয়েছিল। একটি স্ক্যাটার প্লট হল গড় +/- SEM, জোড়াবিহীন টি-টেস্ট। প্রতিটি পয়েন্ট একটি মাউস প্রতিনিধিত্ব করে

ঘ) মাইক্রোবিয়াল শেপিং এবং কোলাইটিসের তীব্রতার উপর অভিযোজিত ইমিউন সিস্টেমের ভূমিকা মূল্যায়নের জন্য FMTগুলি রাগ-/- বা র্যাগ-/- থেকে মল সুপারনাট্যান্ট স্থানান্তর করে সঞ্চালিত হয়েছিল; Clec12a-/- SPF প্রাণীকে WT জীবাণুমুক্ত ইঁদুরে যেমন (A) বর্ণনা করা হয়েছে। ইঁদুরকে 7 দিনের জন্য 2.5% ডিএসএস দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। শতকরা ওজন হ্রাস দৈনিক মূল্যায়ন করা হয়েছিল। গ্রাফ হল গড় +/- SEM, দ্বিমুখী ANOVA এবং Tukey একাধিক তুলনা পরীক্ষা ব্যবহার করে।

ই) কোলন দৈর্ঘ্য (সেমি) নির্দেশিত প্রাণী থেকে (F) কোরবানির সময় পরিমাপ করা হয়েছিল। গড় +/-, সাধারণ একমুখী ANOVA এবং Dunnet একাধিক তুলনা পরীক্ষা ব্যবহার করে তুলনা SEM। প্রতিটি পয়েন্ট একটি মাউস প্রতিনিধিত্ব করে। * p < 0৷{5}}৫; ** p < 0৷{9}}1; *** p < 0.001; **** p < 0.0001

চিত্র 4. Clec12a Faecalibaculum rodents এর বিস্তার সীমিত করে, একটি জীবাণু যা কোলাইটিসকে আরও খারাপ করে

A) WT বা Clec12a-/- C57BL/6 SPF ইঁদুরকে একটি অ্যান্টিবায়োটিক ককটেল (A) (নিওমাইসিন, জেন্টামাইসিন, অ্যাম্পিসিলিন, এরিথ্রোমাইসিন), সেফালোথিন, বা জেন্টামাইসিন (বি, সি) 0 ঘনত্বে দেওয়া হয়েছিল। 5g/L চৌদ্দ দিনের জন্য। সাত দিন পর কোরবানি পর্যন্ত পশুদের পানীয় জলে ২.৫% ডিএসএস দেওয়া হয়। নির্দেশিত প্রাণী থেকে কোলন দৈর্ঘ্য (সেমি) কোরবানির সময় পরিমাপ করা হয়েছিল। একটি স্ক্যাটার প্লট হল গড় +/- SEM, জোড়াবিহীন টি-টেস্ট। প্রতিটি পয়েন্ট একটি মাউস প্রতিনিধিত্ব করে।

খ) নির্দেশিত পশুদের শতকরা ওজন হ্রাস প্রতিদিন মূল্যায়ন করা হয়েছিল। গ্রাফ হল গড় +/- SEM, দ্বিমুখী ANOVA এবং Tukey একাধিক তুলনা পরীক্ষা ব্যবহার করে

গ) কোরবানির সময় পরিমাপকৃত নির্দেশিত পশুদের কোলন দৈর্ঘ্য (সেমি)। একটি স্ক্যাটার প্লট হল গড় +/- SEM, জোড়াবিহীন টি-টেস্ট। প্রতিটি পয়েন্ট একটি মাউস প্রতিনিধিত্ব করে।

ঘ) WT বা Clec12a-/- মল, 16S rRNA সিকোয়েন্সিং আলফা বৈচিত্র্য থেকে পর্যবেক্ষণ করা বৈশিষ্ট্য। মান +/- SEM, মান-হুইটনি পরীক্ষা ব্যবহার করে তুলনা করে।

E) WT বা Clec12a-/- মল থেকে Pielou Evenness, 16S rRNA সিকোয়েন্সিং আলফা বৈচিত্র্য। মান +/- SEM, মান-হুইটনি পরীক্ষা ব্যবহার করে তুলনা করে।

F) মান-হুইটনি পরীক্ষা ব্যবহার করে তুলনা করে শ্যানন এনট্রপি গড় +/- SEM।

ছ) WT এবং Clec12a-/- মল থেকে ANCOM বিশ্লেষণ। শ্রেণীবিন্যাস নাম হল জিনোম ট্যাক্সোনমি ডেটাবেস (GTDB) ব্যবহার করে ASV-এর সেরা শ্রেণীবিভাগ।

জ) ফ্যাকালিবাকুলাম রোডেন্টিয়াম ASV-এর আপেক্ষিক প্রাচুর্য। মান হুইটনি * পি < {{0}} ব্যবহার করে তুলনা করা হয়েছে৷{4}}৫; ** পি < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001

I) C57Bl/6 WT SPF ইঁদুরকে তিন দিনের জন্য মৌখিক গ্যাভেজ দ্বারা F. rodentium-এর 1x108 CFU দিয়ে পূর্ব-চিকিত্সা করা হয়েছিল। তারপরে প্রাণীরা 7 দিনের জন্য তাদের পানীয় জলে 2.5% ডিএসএস পেয়েছিল এবং এফ. রোডেন্টিয়ামের দৈনিক গ্যাভেজ পেতে থাকে। শতকরা ওজন হ্রাস দৈনিক মূল্যায়ন করা হয়েছিল। গড় +/- SEM, ডেটা দ্বি-মুখী ANOVA এবং Tukey মাল্টিপল তুলনা পরীক্ষা ব্যবহার করে চারটি পৃথক পরীক্ষায় একত্রিত করা হয়।

J) কোরবানির সময় নির্দেশিত পশুদের কোলন দৈর্ঘ্য (সেমি) পরিমাপ করা হয়েছিল। বার গ্রাফ হল গড় +/- SEM, ডানেট মাল্টিপল কারেকশন টেস্টের সাথে অর্ডিনারি ওয়ান-ওয়ে আনোভা ব্যবহার করে চারটি আলাদা পরীক্ষা থেকে ডেটা সংগ্রহ করা হয়। প্রতিটি পয়েন্ট একটি মাউস প্রতিনিধিত্ব করে। * p < 0৷{5}}৫; ** p < 0৷{9}}1; *** p < 0.001; **** p < 0.0001

চিত্র 5. Clec12a প্রদাহ সীমিত করে এবং ম্যাক্রোফেজে ফ্যাগোসাইটোসিস প্রচার করে।

ক) ইমিউনোফেনোটাইপিং WT এবং Clec12a-/- প্রাণীদের কলোনিক ল্যামিনা প্রোপ্রিয়া (সিএলপি) থেকে বিচ্ছিন্ন কোষগুলিতে প্রবাহ সাইটোমেট্রির মাধ্যমে সঞ্চালিত হয়েছিল। হিটম্যাপ সহজাত এবং অভিযোজিত ইমিউন কোষগুলিতে Clec12a এক্সপ্রেশনের ফ্রিকোয়েন্সি দেখায়

খ) বার গ্রাফ নির্দেশিত প্রাণীদের cLP থেকে প্রি-গেট, CD38+ কোষের (M1 ম্যাক্রোফেজ) ফ্রিকোয়েন্সি দেখায়। গড় +/- SEM, তুলনাবিহীন টি-পরীক্ষা ব্যবহার করে। প্রতিটি পয়েন্ট একটি মাউস প্রতিনিধিত্ব করে।

গ) বার গ্রাফ নির্দেশিত প্রাণীদের cLP থেকে প্রি-গেট, EGR2+ কোষের (M2 ম্যাক্রোফেজ) ফ্রিকোয়েন্সি দেখায়। গড় +/- SEM, তুলনাবিহীন টি-পরীক্ষা ব্যবহার করে। প্রতিটি পয়েন্ট একটি মাউস প্রতিনিধিত্ব করে।

D) WT এবং Clec12a-/- লম্বা হাড় থেকে BMDM সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং M-CSF (20ng/mL) এর উপস্থিতিতে 7 দিনের জন্য সংস্কৃতি করা হয়েছিল। 8 তম দিনে BMDMগুলি 24 ঘন্টার জন্য LPS (100ng/mL), MDP (10mg/mL), Pam3cysk (1mg/mL), অথবা, Flagellin (1mg/mL) দিয়ে স্পন্দিত হয়েছিল। সাইটোকাইন উত্পাদনের জন্য মিডিয়া সংগ্রহ এবং পরীক্ষা করা হয়েছিল। তাপ মানচিত্রটি WT এর উপর Clec12a-/- থেকে নির্দেশিত সাইটোকাইনগুলির Log2 ভাঁজ পরিবর্তন দেখায়।

ঙ) WT এবং Clec12a-/- ইঁদুরের BMDMগুলিকে (A) হিসাবে বিচ্ছিন্ন এবং সংষ্কৃত করা হয়েছিল এবং তারপর 24 ঘন্টার জন্য 10 এর MOI এ F. রডেন্টিয়ামের সাথে সহ-সংস্কৃতি করা হয়েছিল। বিএমডিএম ধুয়ে ফেলার পরে, আরএনএ সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং আরএনএ সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য প্রস্তুত করা হয়েছিল। Clec12a-/- এর মধ্যে সমৃদ্ধ শীর্ষ 10টি সরলীকৃত GO টার্ম (জৈবিক প্রক্রিয়া) বিভাগ নিম্ননিয়ন্ত্রিত

F) পেরিটোনিয়াল ম্যাক্রোফেজগুলিকে WT এবং Clec12a-/- ইঁদুর থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং তারপরে ফ্যাগোসাইটোসিস মূল্যায়ন করার জন্য Sybr সবুজ-দাগযুক্ত F. rodentium দিয়ে cocultured করা হয়েছিল। বাম: WT ম্যাক্রোফেজ। ডানদিকে: Clec12a-/- ম্যাক্রোফেজ। ব্রাইটফিল্ড (বাম কলাম), ফ্লুরোসেন্স (মাঝের কলাম) এবং মার্জ করা (ডান কলাম) থেকে প্রতিনিধি চিত্রগুলি চিত্রিত করা হয়েছে৷ হলুদ তীরচিহ্নগুলি ম্যাক্রোফেজ দ্বারা আবৃত এফ. রোডেন্টিয়াম কোষের উদাহরণ নির্দেশ করে। স্কেল বার=20 µm। ছবি দুটি পৃথক পরীক্ষার প্রতিনিধি।

G) বার গ্রাফ প্রতি কোষে জীব দেখায়, যেমনটি (F) এ দেখা যায়। 250টি WT কোষ এবং 269 Clec12a-/- কোষ প্রতি কোষে F. রডেন্টিয়ামের পরিমাণ পরিমাপ করতে গণনা করা হয়েছিল।

চিত্র 6: Clec12a সরাসরি মাইক্রোবায়োটার নির্দিষ্ট সদস্যদের সাথে আবদ্ধ হয়।

ক) Clec12a-মানুষের IgG1-Fc ফিউশন প্রোটিন বা খালি ভেক্টর (শুধুমাত্র Fc অংশ) বি) হিস্টোগ্রাম অফ ফ্লো সাইটোমেট্রিক বিশ্লেষণ যা বিভিন্ন ব্যাকটেরিয়া বা C. অ্যালবিক্যানের সাথে Clec12a-Fc-এর ডিফারেনশিয়াল বাইন্ডিং প্রতিনিধিত্ব করে।

পরিপূরক চিত্র কিংবদন্তি

পরিপূরক চিত্র 1. Clec12a এর অনুপস্থিতি ইউরিক অ্যাসিডের মাত্রা ব্যাহত করে না।

ক) নির্দেশিত প্রাণীদের সিরাম ইউরিক অ্যাসিড (µM) WT এবং Clec12a-/- C57Bl/6 ইঁদুরের মধ্যে পিউরিন বিপাক মূল্যায়নের জন্য পরিমাপ করা হয়েছিল। স্ক্যাটার প্লট হল গড় +/- SEM, একটি জোড়াবিহীন টি-পরীক্ষা ব্যবহার করে তিনটি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে ডেটা সংগ্রহ করা হয়। প্রতিটি পয়েন্ট একটি মাউস প্রতিনিধিত্ব করে।

খ) নির্দেশিত প্রাণীদের ফিকাল ইউরিক অ্যাসিড (µM) WT এবং Clec12a-/- C57Bl/6 ইঁদুরের মধ্যে ইউরিক অ্যাসিডের অন্ত্রের নির্গমন মূল্যায়ন করার জন্য পরিমাপ করা হয়েছিল। স্ক্যাটার প্লট হল গড় +/- SEM, একটি জোড়াবিহীন টি-পরীক্ষা ব্যবহার করে তিনটি স্বাধীন পরীক্ষা থেকে ডেটা সংগ্রহ করা হয়। প্রতিটি পয়েন্ট একটি মাউস প্রতিনিধিত্ব করে।

পরিপূরক চিত্র 2. WT এবং Clec12a-/- মাইক্রোবায়োটাস ডিফারেনশিয়াল ডিজিজ চালায়

নিওমাইসিন, জেন্টামাইসিন, অ্যাম্পিসিলিন এবং এরিথ্রোমাইসিন সমন্বিত একটি অ্যান্টিবায়োটিক ককটেল দিয়ে চিকিত্সা করা WT এবং Clec12a-/- পশুদের শতকরা ওজন হ্রাস।

পরিপূরক চিত্র 3. মাইক্রোবায়োটা রচনা Clec12a দ্বারা প্রভাবিত হয়।

ক) Bray-Curtis দূরত্বের উপর ভিত্তি করে প্রথম 3 টি অক্ষের PCoA প্লটগুলি সামগ্রিক মাইক্রোবায়োটা সম্পর্ক এবং সংশ্লিষ্ট বক্স এবং হুইকার প্লটগুলি প্রতিটি গ্রুপের মধ্যে বৈষম্য পরিমাপ করে এবং মান-হুইটনি পরীক্ষার সাথে তুলনা করে।

খ) ওজনযুক্ত ইউনিফ্রাক দূরত্বের উপর ভিত্তি করে পিসিওএ প্লট এবং অনুরূপ বাক্স এবং হুইকার প্লটগুলি অ-জোড়া মান-হুইটনি পরীক্ষা ব্যবহার করে তুলনা করে গ্রুপের মধ্যে বৈষম্য পরিমাপ করে।

C) WT বনাম Clec12a-/- ফেকাল মাইক্রোবায়োটা ব্রে-কারটিস এবং ওজনযুক্ত ইউনিফ্রাক দূরত্বের জন্য PERMANOVA পরীক্ষার ফলাফল দেখানো টেবিল।

পরিপূরক চিত্র 4: ম্যাক্রোফেজে Clec12a প্রদাহকে সীমাবদ্ধ করে।

ক) বেহালা প্লটগুলি (A) তে দেখানো ইমিউন কোষগুলির জ্যামিতিক গড় ফ্লুরোসেন্ট তীব্রতা (MFI) চিত্রিত করে৷ গড় +/- SEM, একাধিক তুলনার জন্য Dunn এর সংশোধন সহ Kruskal-ওয়ালিস পরীক্ষা। অক্ষরগুলি উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্ন গোষ্ঠীগুলিকে নির্দেশ করে৷

B) DSS কোলাইটিসের পরে WT এর cLP বা Clec12a-/- ইঁদুর থেকে M1 এবং M2 ম্যাক্রোফেজের প্রতিনিধি প্রবাহ সাইটোমেট্রি প্লট। সেলগুলি লাইভ, CD45+, Ly6C-, CD11b+, MHCII+, এবং CD64+-এ প্রি-গেট করা আছে৷ চিত্র 5A থেকে

পরিপূরক চিত্র 5. Clec12a কোষ চক্র নিয়ন্ত্রণকে স্থিতিশীল করে এবং ম্যাক্রোফেজে ফ্যাগোসাইটোসিস নিয়ন্ত্রণ করে।

ক) এফ. রোডেন্টিয়ামের প্রতিক্রিয়ায় WT-এর তুলনায় Clec12a-/- আপ-নিয়ন্ত্রিত জিনের মধ্যে সমৃদ্ধ শীর্ষ 10টি সরলীকৃত GO শব্দ (জৈবিক প্রক্রিয়া) বিভাগ। WT থেকে BMDM এবং Clec12a-/- F. rodentium-এর সাথে সহ-সংস্কৃতিকৃত ইঁদুরগুলিকে চিত্র 7A-এর মতো বিচ্ছিন্ন এবং বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

B) Peritoneal macrophages were prepared as described and co-cultured with Sybr®-green stained F. rodentium. Bacteria cells were counted inside macrophages. >200টি ম্যাক্রোফেজ গণনা করা হয়েছিল। বার গ্রাফটি কূপ জুড়ে গণনা এবং প্রভাবের ধারাবাহিকতা দেখাতে 4টি পৃথক কূপ থেকে F. রোডেন্টিয়ামের গড় সংখ্যা দেখায়। গড় +/- SEM তুলনাবিহীন টি-টেস্ট ব্যবহার করে।

স্বীকৃতি

এই প্রকল্পের জন্য Clec12a-/- প্রাণী সরবরাহ করার জন্য আমরা গর্ডন ব্রাউনকে ধন্যবাদ জানাতে চাই। এই কাজটি হেলেন হে হুইটনি ফাউন্ডেশন (KSO), ইউটাহ ইউনিভার্সিটি অফ এনআরএসএ মাইক্রোবিয়াল প্যাথোজেনেসিস T32 ট্রেনিং গ্রান্ট (KSO), একটি CCFA সিনিয়র রিসার্চ অ্যাওয়ার্ড (JLR), NIDDK R01DK124336, NIDDK R01124317 এবং NCCAM R0124317 এবং NCCAM R0124317 এবং এনসিসিএএম 1324317 এবং এনসিসিএএম-এর দ্বারা সমর্থিত ছিল। জুনিয়র ফাউন্ডেশন (জেএলআর), এনএসএফ ক্যারিয়ার অ্যাওয়ার্ড (আইওএস-1253278) (জেএলআর), বিজ্ঞান ও প্রকৌশলে প্যাকার্ড ফেলোশিপ (জেএলআর), প্যাথোজেনেসিস অ্যাওয়ার্ডে বুরোস ওয়েলকাম ইনভেস্টিগেটর (জেএলআর), আমেরিকান অ্যাজমা ফাউন্ডেশন (জেএলআর), মার্গোলিস ফাউন্ডেশন (জেএলআর), একটি এমএস সোসাইটি সেন্টার অনুদান (জেএলআর), এবং ডাব্লুএম কেক ফাউন্ডেশন (জেএলআর) এনআইএইচ নিউ ইনোভেটর অ্যাওয়ার্ড DP2GM111099-01 (RMO), NHLBI R00HL102228-05 ( RMO), একটি আমেরিকান ক্যান্সার সোসাইটি রিসার্চ গ্রান্ট (RMO), একটি Kimmel Scholar Award (RMO), R01AG047956 (RMO), এবং NIAID R01AI141202 (ASI)। এই কাজটি অ্যাওয়ার্ড নম্বর 5P30CA042014-24-এর মাধ্যমে ন্যাশনাল ক্যান্সার ইনস্টিটিউট ছাড়াও ইউটা ফ্লো সাইটোমেট্রি ফ্যাসিলিটি বিশ্ববিদ্যালয় দ্বারা সমর্থিত ছিল। উটাহ বিশ্ববিদ্যালয়ের উচ্চ-পারফরম্যান্স কম্পিউটিং কেন্দ্রের সহায়তা এবং সংস্থানগুলি কৃতজ্ঞতার সাথে স্বীকৃত।

লেখক অবদান

টিআরসি অধ্যয়নটি ধারণ করতে সাহায্য করেছিল, বেশিরভাগ মাউস এবং ইমিউনোলজি পরীক্ষাগুলি সঞ্চালিত করেছিল, ডেটাগুলিকে একত্রে পরিসংখ্যানে রেখেছিল এবং পাণ্ডুলিপি লিখতে সাহায্য করেছিল। RB জীবাণু-মুক্ত পরীক্ষা-নিরীক্ষা সেট আপ করে এবং সমস্ত জীবাণু-মুক্ত প্রাণী বজায় রাখে। ইমিউনোলজি অন্ত্রের ল্যামিনা প্রোপ্রিয়া পরীক্ষায় ESV সাহায্য করেছে। KSO ইঁদুর ফসলের সাথে সাহায্য করেছে এবং অন্তর্দৃষ্টি এবং দিকনির্দেশ প্রদান করেছে। KMB মাউসের ফসল কাটা এবং ফ্লো সাইটোমেট্রিতে সাহায্য করেছে। MCN মাউসের ফসল কাটাতে সাহায্য করেছে। ডব্লিউভি ফিউশন প্রোটিন এবং পরিশোধনের জন্য গঠন তৈরিতে সহায়তা প্রদান করেছে। টিজে ফ্যাগোসাইটোসিস অ্যাসেসের সাথে সহায়তা প্রদান করেছে। জেএইচ ফ্যাগোসাইটোসিস মাইক্রোস্কোপি স্লাইড বিশ্লেষণ করেছে। এমএইচ ফিউশন প্রোটিন পরিশোধন এবং ব্যবহারে সহায়তা প্রদান করে। KAK ব্যাকটেরিয়া আইসোলেট প্রদান করে। ROC ইমিউনোলজি দক্ষতা এবং অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করেছে। ডব্লিউজেডএস জৈব তথ্যবিজ্ঞানের বিশ্লেষণ সম্পাদিত অধ্যয়নটি ধারণা করতে সাহায্য করেছিল, চিত্র তৈরি এবং পরিসংখ্যানে সাহায্য করেছিল এবং পাণ্ডুলিপি লিখতে সাহায্য করেছিল। JLR গর্ভধারণ করতে এবং অধ্যয়ন পরিচালনা করতে সাহায্য করেছিল, পরীক্ষামূলক নকশা এবং ফলাফলগুলি পর্যবেক্ষণ করেছিল, সংগঠিত সহযোগী এবং বিকারকদের, অধ্যয়নের জন্য তহবিল সংগ্রহ করেছিল এবং পাণ্ডুলিপি লিখতে সাহায্য করেছিল।

পদ্ধতি

মাউস স্ট্রেন

এখানে ব্যবহৃত সমস্ত মাউস লাইন একটি C57BL/6 পটভূমিতে ছিল। Clec12a-/- ইঁদুরগুলি দয়া করে গর্ডন ব্রাউন (মেডিকেল রিসার্চ কাউন্সিল সেন্টার ফর মেডিকেল মাইকোলজি, ইউনিভার্সিটি অফ এক্সেটার) দ্বারা সরবরাহ করা হয়েছিল এবং তাদের পূর্বে বর্ণিত প্রোটোকল অনুসারে জিনোটাইপ ছিল (Redelinghuys, et al. 2016)। Rag2-/- এবং TCRb-/- (Jackson Laboratories, 002118) জ্যাকসন ল্যাবরেটরিজ থেকে প্রাপ্ত করা হয়েছিল এবং আমাদের মাউস কলোনিতে কয়েক প্রজন্ম ধরে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল৷ ভিভো কোলাইটিস পরীক্ষা-নিরীক্ষার জন্য 8 থেকে 12- সপ্তাহ বয়সী লিঙ্গ-মিলিত ইঁদুর ব্যবহার করা হয়েছিল। পুরুষ এবং মহিলা উভয় ইঁদুর ব্যবহার করা হয়েছিল। ইঁদুরগুলি নির্দিষ্ট প্যাথোজেন-মুক্ত অবস্থায় রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল।

ব্যাকটেরিয়া এবং ছত্রাকের স্ট্রেন

নিম্নলিখিত জীবগুলি ডিএসএমজেড-জার্মান কালেকশন অফ মাইক্রোঅর্গানিজম অ্যান্ড সেল কালচারস জিএমবিএইচ থেকে অর্জিত হয়েছিল: ফেকালিবাকুলাম রোডেন্টিয়াম (DSM# 103405); আকারম্যানসিয়া মিউসিনোফিলিয়া ডিএসএমজেড (ডিএসএম# 26127); বিফিডোব্যাকটেরিয়াম অ্যানিমেলিস DSMZ (DSM# 26074)। ব্যাকটেরয়েড ইউনিফর্মিস আমেরিকান টাইপ কালচার কালেকশন (ATCC® 8492™) থেকে অর্জিত হয়েছিল। একটি রোজবুরিয়া sp (স্ট্রেন উপাধি JLR.KK002) শ্যাডলারের আগরে C57BL/6 ইঁদুর থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল যা একটি স্পোর প্রাক্তন-সমৃদ্ধ মাইক্রোবায়োটাকে আশ্রয় করে। স্পোর প্রাক্তন সমৃদ্ধকরণ পূর্বে বর্ণিত হিসাবে সম্পাদিত হয়েছিল এবং JLR.KK002কে মল থেকে বিচ্ছিন্ন করার আগে এই মাইক্রোবায়োটা দিয়ে একাধিক প্রজন্মের জন্য ইঁদুরগুলিকে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল (Browne et al., 2016)। আমরা পিসিআর-এম্পলিফাইড এবং স্যাঞ্জার 16S rRNA জিনকে সিকোয়েন্স করেছি এবং তারপর এটিকে সিলভা অ্যাক্ট পরিষেবা এবং সিলভা ডাটাবেসের সাথে শ্রেণীবদ্ধ করেছি (প্রুয়েস এট আল।, 2012)। সালমোনেলা টাইফিমুরিমাম ST2 স্ট্রেন ব্যবহার করা হয়েছিল। Candida albicans স্ট্রেন sc5314 ব্যবহার করা হয়েছিল। PhyLo11b সিন্থেটিক সম্প্রদায়ে ব্যবহৃত ব্যাকটেরিয়াল স্ট্রেনগুলি নীচে বর্ণিত হয়েছে।

ডিএসএস-প্ররোচিত পরীক্ষামূলক কোলাইটিস

কোলাইটিস 7 দিনের জন্য পানীয় জলে 2.5% বা 3% (w/v) 36,000-50,000MW ডেক্সট্রান সোডিয়াম সালফেট (DSS) (MP বায়োমেডিকেলস) যোগ করার সাথে প্ররোচিত হয়েছিল। শরীরের ওজন, মলের সামঞ্জস্য এবং মল রক্তের পরিবর্তনের মাধ্যমে প্রতিদিন কোলাইটিসের তীব্রতা পর্যবেক্ষণ করা হয়। মনোসাইট উদ্ধার পরীক্ষার জন্য সমস্ত ইঁদুর 5 দিনের জন্য 2.5% ডিএসএস পেয়েছে, তারপরে নিয়মিত জল দেওয়া হয়েছিল; ওজন পর্যবেক্ষণ 10 দিন পর্যন্ত চলতে থাকে যখন পশু কাটা হয়। 20% এর বেশি ওজন হ্রাসের তীব্রতা সীমা তীব্রতা থ্রেশহোল্ড হিসাবে আরোপ করা হয়েছিল। পরীক্ষামূলক শেষ পয়েন্টে, এমএলএন এবং কোলন সরানো হয়েছিল। দৈর্ঘ্য নির্ধারণ করতে সেকাম থেকে মলদ্বার পর্যন্ত কোলন পরিমাপ করা হয়েছিল। তারপরে টিস্যুগুলি হিস্টোলজি, আরএনএ নিষ্কাশন বা প্রবাহ সাইটোমেট্রিক বিশ্লেষণের জন্য প্রক্রিয়া করা হয়েছিল।

কোলন হিস্টোলজি এবং স্কোরিং

Colons were fixed within histology cassettes O/N at RT in 10% buffered formalin phosphate solution after removal of fecal contents and then transferred to 70% EtOH at 4 C until staining. Sectioning and H&E staining were done at the HCI Biorepository and Molecular Pathology Resource core in the ARUP-operated Research Histology division. Colon scoring was done in a blinded manner with the following rubric scales: percentage of colon crypt loss (0.5 (5%) - 7 (>75%)), crypt loss severity (1 (partial loss) – 5 (full loss)) and inflammatory aggregates (1 (1-3) – 3 (>7)).

লিপোক্যালিন-2 (এলসিএন-2) এলিসা

প্রোটোকল প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল (ফিশার সায়েন্টিফিক ডিওয়াই1857-05) অনুযায়ী সম্পাদিত হয়েছিল। সংক্ষেপে, HBSS 1X-এ 100mg/mL ঘনত্বে মল সংগ্রহ, ওজন করা এবং ম্যাশ করা হয়েছিল। বড় ধ্বংসাবশেষ অপসারণের জন্য নমুনাগুলি 5 মিনিটের জন্য 50 xg এ কাটা হয়েছিল। তারপরে সুপারনাট্যান্টটিকে সরিয়ে একটি নতুন টিউবে স্থাপন করা হয় এবং 8000 xg-এ 5 মিনিটের জন্য পেলেট ব্যাকটেরিয়া তৈরি করা হয়। এই সুপারনাট্যান্টটি তখন প্রাণীদের অসুস্থতা অনুসারে পাতলা করা হয়েছিল কিন্তু সাধারণত 1:100- 500 (স্বাস্থ্যকর) – 1:500-1000 (DSS-চিকিত্সা করা) থেকে পরিবর্তিত হয়। ইউরিক অ্যাসিড পরিমাপ ইউরিক অ্যাসিডের ঘনত্ব প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে সঞ্চালিত হয়েছিল (Invitrogen™ Amplex™ Red Uric/Uricase কার্যকলাপ অ্যাস কিট, cat# A22181)। সংক্ষেপে, WT বা Clec12a-/- ইঁদুর থেকে কার্ডিয়াক পাংচার দ্বারা সোনার শীর্ষ সিরাম বিভাজক টিউবে রক্ত ​​সংগ্রহ করা হয়েছিল। টিউবগুলিকে 30 মিনিটের জন্য জমাট বাঁধতে দেওয়া হয়েছিল এবং তারপরে 10 মিনিটের জন্য 1300 xg এ কাটতে দেওয়া হয়েছিল। সিরামটি সরানো হয়েছিল এবং 1.5ml Eppendorf টিউবে স্থাপন করা হয়েছিল, ফ্ল্যাশ হিমায়িত করা হয়েছিল, এবং পরীক্ষা না হওয়া পর্যন্ত -80 ডিগ্রি সেলসিয়াসে সংরক্ষণ করা হয়েছিল৷ ফেকাল ইউরিক অ্যাসিড WT এবং Clec12-/- ইঁদুর থেকে তাজা মল ছোঁয়া প্রাপ্ত করে সঞ্চালিত হয়েছিল। পেলেটগুলি ওজন করা হয়েছিল এবং রেকর্ড করা হয়েছিল এবং তারপরে 1x প্রতিক্রিয়া বাফারের 1mL এ ম্যাশ করা হয়েছিল। ফিজিক্যাল ম্যাশিংয়ের পরে, বড় ধ্বংসাবশেষ অপসারণের জন্য 5 মিনিটের জন্য টিউবগুলি 50 xg এ কাটা হয়েছিল। অবশিষ্ট মল স্লারি ইউরিক অ্যাসিডের জন্য পরীক্ষা করা হয়েছিল।

টি-সেল স্থানান্তর পরীক্ষামূলক কোলাইটিস

WT প্লীহাগুলিকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং RPMI তে 10% ভ্রূণের বোভাইন সিরাম, পেনিসিলিন এবং স্ট্রেপ্টোমাইসিন ধারণকারী ম্যাশ করা হয়েছিল। কোষগুলিকে বিচ্ছিন্ন করার জন্য কোষগুলি 367 xg এ কাটা হয়েছিল। ফলস্বরূপ পেলেটটি 1x RBC লাইসিস বাফারে 5 মিনিটের জন্য অন্ধকারে, ঘরের তাপমাত্রায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল। ফলস্বরূপ শ্বেত রক্তকণিকাগুলিকে সিডি4+ টি-কোষকে বিচ্ছিন্ন করার জন্য একটি মিলটেনি সিডি4+ MACS কলামের মধ্য দিয়ে প্রেরণ করা হয়েছিল। টি-কোষগুলিকে তখন সিডি 4 এবং সিডিআরবি দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল এবং এফএসিএস আরিয়া ফিউশনে (বিডি বায়োসায়েন্সেস) সাজানো হয়েছিল। CD4+ CDRBhi কোষগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং TCRb-/- বা TCRb-/--তে পরিচালিত হয়েছিল; Clec12a-/- ইঁদুর ইন্ট্রাপেরিটোনলি (আইপি)। প্রতিটি মাউস 5 x 105 সেল পেয়েছে। ওজন হ্রাস মূল্যায়ন করে কোলাইটিসের তীব্রতা এবং বিকাশ সাপ্তাহিক পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। পরীক্ষামূলক শেষ পয়েন্টে, এমএলএন এবং কোলনগুলি সরানো হয়েছিল এবং রোগের তীব্রতা নির্ণয়ের জন্য সেকাম থেকে মলদ্বার পর্যন্ত কোলনগুলি পরিমাপ করা হয়েছিল।

কলোনিক ল্যামিনা প্রোপ্রিয়া থেকে লিউকোসাইটের বিচ্ছিন্নতা

সংযুক্ত ceca সহ মুরিন কোলন সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং বরফের উপরে 6-কূপ প্লেটে 1X PBS-এ স্থাপন করা হয়েছিল। যেকোন দৃশ্যত অবশিষ্ট চর্বি এবং সংযোগকারী টিস্যু অপসারণ করা হয়েছিল এবং সেকামটি কোলন থেকে কেটে ফেলা হয়েছিল। কোলনগুলি খোলা ছিল এবং শ্লেষ্মা এবং মলগুলিকে 6-ওয়েল প্লেটে ফিরিয়ে দেওয়ার আগে কোলন থেকে সাবধানে সরানো হয়েছিল। একবার সমস্ত কোলন স্প্লে এবং স্ক্র্যাপ করা হয়ে গেলে, প্রতিটি কোলন একটি রেজার ব্লেড ব্যবহার করে একটি পেট্রি ডিশের ঢাকনায় কাটা হয় এবং একটি পৃথক 50 মিলি টিউবে স্থাপন করা হয়। 10 মিলি প্রি-ওয়ার্মড ডিসোসিয়েশন দ্রবণ (1X HBSS w/o Ca+ এবং Mg+, 1.5 mM DTT, 10 mM HEPES, এবং 30 mM EDTA) যোগ করা হয়েছিল এবং টিউবগুলি সংক্ষিপ্তভাবে ঘূর্ণায়মান হয়েছিল। কোলনগুলি প্রায় 25 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। 37 ডিগ্রীতে 150 rpm এ কাঁপুনি যতক্ষণ না আইইসি বিচ্ছেদ থেকে সমাধানগুলি মেঘলা হয়। নমুনাগুলিকে 3X ঝাঁকানো হয়েছিল এবং 15 সেকেন্ডের জন্য ঘূর্ণায়মান করা হয়েছিল তারপর IEC-এর মতো অ-প্রতিরোধী কোষগুলিকে অপসারণের জন্য একটি 50 মিলি শঙ্কুতে 100 মিলিমিটার ফিল্টার ঢেলে দেওয়া হয়েছিল এবং ফিল্টারগুলিকে 2 মিলি বরফ-ঠান্ডা 1X পিবিএস দিয়ে সংক্ষেপে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। অবশিষ্ট টিস্যু ফোর্সেপ দিয়ে ফিল্টারে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং একটি নতুন 50 মিলি শঙ্কুতে স্থানান্তরিত হয়েছিল। 15 মিলি প্রাক-উষ্ণ হজম দ্রবণ (Ca+ এবং Mg সহ 1X HBSS, 5% FBS, 50 U/ml Dispase II [Millipor-Sigma, cat # 4942078001], 0.5 mg/ml DNAse I [Worthington Biochemical, cat # LS12]000 এবং 0.5 mg/mL Collagenase D [মিলিপুর-সিগমা, বিড়াল # 11088866001]) যোগ করা হয়েছিল, নমুনাগুলি সংক্ষিপ্তভাবে ঘূর্ণায়মান করা হয়েছিল এবং পরবর্তীতে 45 ​​মিনিটের জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল। 37 ডিগ্রীতে 150 আরপিএম-এ কাঁপতে বা সমাধানটি মেঘলা না হওয়া পর্যন্ত। তারপরে নমুনাগুলি 3X ঝাঁকুনি দেওয়া হয়েছিল এবং 15 সেকেন্ডের জন্য ঘূর্ণায়মান হয়েছিল। অবশিষ্ট অনাক্রম্য সিএলপি কোষগুলি সংগ্রহ করার জন্য, পরিপাক টিস্যুটি 10 ​​মিলি 1এক্স পিবিএস ধারণকারী 50 মিলি শঙ্কুযুক্ত টিউবে 40 মিলিমিটার ফিল্টারে ঢেলে দেওয়া হয়েছিল। নমুনাগুলি পরে ধুয়ে ফেলা হয় এবং 2 মিলি বরফ-ঠাণ্ডা 1X পিবিএস দিয়ে ফিল্টার করা হয় এবং 4 ডিগ্রিতে 10 মিনিটের জন্য 800 xg এ ঘূর্ণন করা হয়। এরপরে, সুপারনাট্যান্টটি সরানো হয়েছিল এবং ভ্যাকুয়াম দিয়ে ফেলে দেওয়া হয়েছিল। তারপরে কোষগুলি সম্পূর্ণ RPMI এর 500 মিলিলিটারে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং ট্রিপ্যান ব্লু এক্সক্লুশন স্টেনিং দিয়ে গণনা করা হয়েছিল।

ফ্লো সাইটোমেট্রি

সিএলপি থেকে বিচ্ছিন্ন লিউকোসাইটগুলি অন্ধকারে RT এ 10 মিনিটের জন্য জম্বি ডাই 510 (AmCyan) ব্যবহার করে কার্যকারিতার জন্য দাগ দেওয়া হয়েছিল। নমুনাগুলি তখন অন্ধকারে 4 ডিগ্রিতে 20 মিনিটের জন্য CD-16/32 দিয়ে Fc রিসেপ্টর ব্লক করা হয়েছিল৷ 367 xg-এ 5 মিনিটের জন্য ঘোরার পর ডিকানটেড কোষগুলি 4 ডিগ্রিতে অন্ধকারে 30 মিনিটের জন্য দাগ ছিল। সমস্ত অ্যান্টিবডি 1:250 এর পাতলা করে ব্যবহার করা হয়েছিল যদি না অন্যথায় উল্লেখ করা হয়। Myleloid প্যানেলে CD45-BV421, CD11b-PerCpCy5.5, MHCII-BV605, CD64-BV711, CX3CR1-BV785, Ly6C-FITC, CD38-পিই Cy7, Ly6G-CF-594, Clec12a-PE (1:500), EGR2-APC (অন্তঃকোষীয়, 1:50)। T কোষগুলি দ্বারা আলাদা করা হয়েছিল: Zombie dye 510 (AmCyan), CD45-BV421, CD3e-BV711, CD4-FITC, Foxp3-APC (অন্তঃকোষীয় 1:50), IL{{ 50} PE (অন্তঃকোষীয় 1:50), IFN-g (BV605) (অন্তঃকোষীয় 1:50), RORgt-PE610 (অন্তঃকোষীয় 1:50), IL-17A-BV785 (অন্তঃকোষীয় 1:50)। দাগ দেওয়ার পরে, কলাম বাফার (1X HBSS w/o Ca2+, Mg2+ এবং HEPES, EDTA, FBS) দিয়ে প্রতিটি 5 মিনিটের জন্য কোষগুলি 2 বার ধোয়া হয়েছিল৷ কোষগুলিকে 2% PFA দিয়ে O/N স্থির করা হয়েছিল যদি কোনও অন্তঃকোষীয় দাগের প্রয়োজন না হয় এবং তারপর ফ্লো সাইটোমিটারে চালানোর আগে কলাম বাফার 2X এ ধুয়ে ফেলা হয়। আন্তঃকোষীয় স্টেনিং প্রয়োজন হলে, FoxP3 / ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর স্টেনিং বাফার কিট (টনবো বায়োসায়েন্স) এবং প্রোটোকল অনুসরণ করা হয়েছিল। তারপরে সমস্ত নমুনাগুলি 300 ul কলাম বাফারে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং UltraComp eBeads (ThermoFisher Scientific) দিয়ে ক্ষতিপূরণ দেওয়ার পরে এবং একক দাগ নিয়ন্ত্রণ ব্যবহার করার পরে একটি BD LSR Fortessa-তে চালানো হয়েছিল।

আইজিএ স্টেনিং ব্যাকটেরিয়া

HBSS w/ Ca2+ এবং Mg2+-এ 100 মিলিগ্রাম মল প্রতি mL HBSS এর ঘনত্বে ম্যাশ করে ব্যাকটেরিয়াগুলিকে মল থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। বড় ধ্বংসাবশেষ অপসারণের জন্য 5 মিনিটের জন্য ম্যাশড মল 50 xg এ কাটা হয়। সুপারনাট্যান্টটি সরিয়ে একটি নতুন টিউবে স্থাপন করা হয়েছিল। তারপরে এটিকে 8000 xg এ 5 মিনিটের জন্য পেলেট ব্যাকটেরিয়া তৈরি করা হয়েছিল। সুপারনাট্যান্ট অপসারণ করা হয়েছিল এবং HBSS w/ Ca2+ এবং Mg2+-এ ছুরিগুলি ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। অবশেষে, 100mg/mL এর ঘনত্বে HBSS-এ পেলেটগুলি পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল, এবং এর 10uL একটি 96-ওয়েল প্লেটে স্থাপন করা হয়েছিল এবং HBSS w/ Ca2+ এবং Mg2+ সহ ব্লক করা হয়েছিল RT-এ 20 মিনিটের জন্য 10% FBS। তারপরে 100uL অ্যান্টি-আইজিএ (PE) সরাসরি নমুনায় যোগ করা হয়েছিল এবং অন্ধকারে 4 সেন্টিগ্রেডে 30 মিনিটের জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল। তারপরে কোষগুলিকে 2x HBSS+FBS সলিউশনে ধুয়ে শেষ করে HBSS+1x Sybr®-সবুজে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয় এবং RT-এ অন্ধকারে 20 মিনিটের জন্য সেবন করার অনুমতি দেওয়া হয়। তারপরে নমুনাগুলি সরাসরি ফ্লো সাইটোমিটারে পড়া হয়েছিল।

অস্থি মজ্জা বিচ্ছিন্নতা

পূর্বে বর্ণিত হিসাবে অস্থি মজ্জা বিচ্ছিন্ন ছিল। সংক্ষেপে, C57Bl/6 ওয়াইল্ড টাইপ বা Clec12a-/- প্রাণী থেকে লম্বা হাড় বের করে একটি কাগজের তোয়ালে দিয়ে আলতোভাবে ঘষে পরিষ্কার করা হয়। পশুদের প্রক্রিয়াকরণের সময় পরিষ্কার হাড়গুলি বরফের উপর রাখা হয়েছিল। মজ্জা উন্মুক্ত করার জন্য হাড়ের প্রান্তগুলি সামান্য কাটা ছিল। হাড়টি একটি 0.5 মিলি এপেনডর্ফ টিউবে ঢোকানো হয়েছিল (উন্মুক্ত প্রান্তটি নীচের দিকে মুখ করে) যা একটি 18 গ্রাম সুই দিয়ে ছিদ্র করা হয়েছিল। এই 0.5mL Eppendorf টিউবটিকে তারপর একটি 1.5mL Eppendorf টিউবের ভিতরে রাখা হয়েছিল এবং 13,000 x g এ 1 মিনিটের জন্য কাটা হয়েছিল৷ অস্থি মজ্জার মধ্য দিয়ে কাটা হয়েছিল তখন RBC-lysed, RBC-lysis বাফার (Biolegend) ব্যবহার করে প্রস্তুতকারকের সুপারিশ অনুসারে। আরবিসি লাইসিসের পরে, কোষগুলি সম্পূর্ণ ডালবেকোর মডিফাইড ঈগল মিডিয়াম (DMEM)-তে পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল: 10% FBS, 1mg/mL Pen/Strep, HEPES 10mM, 1x অ-প্রয়োজনীয় অ্যামিনো অ্যাসিড, সোডিয়াম পাইরুভেট 1mM। তারপরে কোষগুলিকে 367 xg এ পাঁচ মিনিটের জন্য পেলেট কোষে কাটানো হয়েছিল। বিচ্ছিন্ন কোষগুলি তখন বিএমডিএম বিকাশ করতে বা মনোসাইটকে আরও বিচ্ছিন্ন করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।

অস্থি মজ্জা থেকে প্রাপ্ত ম্যাক্রোফেজ

লিউকোসাইটগুলি অস্থি মজ্জার বিচ্ছিন্নতা থেকে বিচ্ছিন্ন ছিল, সম্পূর্ণ ডিএমইএম-এ স্থগিত করা হয়েছিল এবং হিমোসাইটোমিটারে ট্রিপ্যান ব্লু এক্সক্লুশন স্টেনিংয়ের মাধ্যমে গণনা করা হয়েছিল। কোষগুলি টিস্যু কালচার-চিকিত্সা করা 10 সেমি ডিশের উপর 5-8 x 106 কোষ/প্লেটের 10 মিলি সম্পূর্ণ মিডিয়া + M-CSF (20ng/mL) ঘনত্বে প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল। M-CSF সহ ফ্রেশ মিডিয়া, বর্তমান মিডিয়াতে 4 এবং 7 দিনে যোগ করা হয়েছিল৷ সম্পূর্ণ আলাদা বিএমডিএমগুলি পরীক্ষামূলক ব্যবহারের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল 7-9 দিনের মধ্যে৷

মনোসাইট বিচ্ছিন্নতা

পূর্বে বর্ণিত হিসাবে WT এবং Clec12a-/- প্রাণী থেকে অস্থি মজ্জা সংগ্রহ করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে মনোসাইটগুলিকে মনোসাইট আইসোলেশন কিট (বিএম), একটি মাউস (মিল্টেনি বায়োটেক) এবং একটি এলএস ম্যাকস কলাম দিয়ে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল।

F. rodentium BMDM সহ-সংস্কৃতি এবং RNAseq

F. রডেন্টিয়াম কালচারগুলি OD 600nm দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল (1 OD 600nm=1 x 10^8 কোষ/mL ব্যবহার করে), 2x জীবাণুমুক্ত পিবিএসে ধুয়ে, এবং 1 x 106 কোষ/mL সম্পূর্ণরূপে পৃথকীকৃত BMDM-এর সাথে সহ-সংস্কৃতি করা হয়েছিল। ওয়েল টিস্যু কালচার প্লেটে 6- 10 এর MOI। 24 ঘন্টা সহ-সংস্কৃতির পরে, মিডিয়া সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং পরবর্তী ব্যবহার না হওয়া পর্যন্ত -20 C-এ সংরক্ষণ করা হয়েছিল। বিএমডিএমগুলি ঠান্ডা, জীবাণুমুক্ত পিবিএস, 2x দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। Qiazol (Qiagen cat# 79306) RNA-স্থিরকরণ বিকারক, তারপর প্রতিটি কূপে সরাসরি যোগ করা হয়। কূপগুলিকে একটি সেল স্ক্র্যাপার দিয়ে 1.5টি এপেনডর্ফ টিউবে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং RNA নিষ্কাশন পর্যন্ত -20 ডিগ্রিতে হিমায়িত করা হয়েছিল। আরএনএ নিষ্কাশন একটি ডাইরেক্ট-জোল আরএনএ মিনিপ্রেপ কিট (জাইমো রিসার্চ ক্যাট# R2070) ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল, প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে এবং সিকোয়েন্সিং লাইব্রেরিগুলি হান্টসম্যান ক্যান্সার ইনস্টিটিউট হাই-থ্রুপুট জিনোমিক্স কোর সুবিধা দ্বারা প্রস্তুত করা হয়েছিল। নমুনাগুলি থেকে rRNA হ্রাস করার জন্য মোট আরএনএকে প্রথমে NEBNext rRNA Depletion kit v2 (NEB, cat# E7400) দিয়ে হাইব্রিডাইজ করা হয়েছিল। ইলুমিনার (NEB, cat# E7760L) জন্য NEBNext Ultra II ডিরেকশনাল RNA লাইব্রেরি প্রিপ কিট ব্যবহার করে আটকে থাকা RNA সিকোয়েন্সিং লাইব্রেরিগুলি প্রস্তুত করা হয়েছিল। একটি D1000 স্ক্রিনটেপ অ্যাসে (Agilent, cat# 5067-5582 এবং 5067-5583) ব্যবহার করে একটি Agilent Technologies 4150 TapeStation-এ বিশুদ্ধ লাইব্রেরিগুলি যোগ্য ছিল৷ কাপা বায়োসিস্টেম কাপা লাইব্রেরি কোয়ান্ট কিট (Roche, cat#07960140001) ব্যবহার করে অ্যাডাপ্টার-সংশোধিত অণুগুলির মোলারিটি পরিমাণগত পিসিআর দ্বারা সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল। ইলুমিনা সিকোয়েন্স বিশ্লেষণের প্রস্তুতির জন্য পৃথক লাইব্রেরিগুলিকে 5 nM-এ স্বাভাবিক করা হয়েছিল এবং একটি NovaSeq 6000-এ পেয়ারড-এন্ড 150-সাইকেল সিকোয়েন্সিং রান সহ সিকোয়েন্স করা হয়েছিল৷

সাইটোকাইন বিশ্লেষণ

বিএমডিএম পূর্বে বর্ণিত হিসাবে বিচ্ছিন্ন এবং বড় হয়েছিল। সম্পূর্ণ আলাদা বিএমডিএমগুলিকে 1 x 105 কোষে/কূপ 12-টিস্যু কালচার প্লেটে প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল। BMDM 100ng/mL LPS দিয়ে উদ্দীপিত হয়েছিল; 1 ug/mL Pam3Cysk; বা 1ug/mL ফ্ল্যাজেলিন। কোষগুলিকে 24 ঘন্টার জন্য উদ্দীপিত করা হয়েছিল, মিডিয়া সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং বিশ্লেষণের জন্য -20 C এ সংরক্ষণ করা হয়েছিল। সাইটোকাইনগুলি LEGENDplex™ মাউস ইনফ্লামেশন প্যানেল (13-plex) (বায়োলজেন্ড, বিড়াল# 740150) দিয়ে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। LEGENDplex™ ডেটা বিশ্লেষণ সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

16s rRNA জিন সিকোয়েন্সিং

মল ছুরি বা ileal বিষয়বস্তু পৃথক ইঁদুর থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং অবিলম্বে 2mL স্ক্রু ক্যাপ টিউবে 250 মিলিগ্রাম 0.15 মিমি গারনেট পুঁতির সাথে {{0}} ডিগ্রিতে হিমায়িত করা হয়েছিল (MoBio, cat# {{5) }})। প্রতি কিট নির্দেশাবলী অনুযায়ী পাওয়ার ফেকাল ডিএনএ আইসোলেশন কিট (MoBio বা QIAGEN) ব্যবহার করে ডিএনএ বের করা হয়েছিল এবং একটি মিনি-বিড-বিটার 16 (বায়োস্পেক পণ্য) এ 4 ডিগ্রিতে 1 মিনিটের পুঁতি বিট করার 2টি চক্র অন্তর্ভুক্ত ছিল। 16S rRNA জিনের V3 এবং V4 অঞ্চলগুলিকে একটি একক রাউন্ড পিসিআর ব্যবহার করে প্রাইমার ব্যবহার করে বিবর্ধিত করা হয়েছিল যাতে V3/4 অঞ্চল 16S rRNA জিন টার্গেটিং সিকোয়েন্স ছিল (বর্ণিত 3' থেকে 5'), একটি 2-নিউক্লিওটাইড প্যাড অনুসরণ করা হয়েছিল ইলুমিনা প্রাইমার সিকোয়েন্স, একটি 8- নিউক্লিওটাইড ইনডেক্স সিকোয়েন্স এবং বাকি ইলুমিনা অ্যাডাপ্টার সিকোয়েন্স। V3/4 16S- টার্গেটিং সিকোয়েন্সগুলি তাকাহাশি (তাকাহাশি এট আল।, 2014) থেকে নেওয়া হয়েছিল এবং সূচকগুলি কোজিচ (কোজিচ এট আল।, 2013) থেকে নেওয়া হয়েছিল। ব্যবহৃত সম্পূর্ণ অলিগোনিউক্লিওটাইড সিকোয়েন্সগুলি ছিল (Xs দ্বারা নির্দেশিত সূচকগুলি): Prok16SV34_এর জন্য: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACXXXXXXXACACTCTTTCCCTACGACGCTC TTCCGATCTTGCCTACGGGNBGCASCAG; Prok16SV34_Rev: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCTGCGACTACNVGGGTATCTAATCC. পিসিআর সাইক্লিং শর্তগুলি নিম্নরূপ ছিল: 2 মিনিটের জন্য 98 ডিগ্রি প্রাথমিক বিকৃতকরণ; 20 সেকেন্ড 98 ডিগ্রী ডিনাচুরেশনের 26 সাইকেল, 20 সেকেন্ড 51.5 ডিগ্রী অ্যানাল, 20 সেকেন্ড 72 ডিগ্রী এক্সটেনশন; এবং 2 মিনিটের জন্য একটি একক চূড়ান্ত 72 ডিগ্রি এক্সটেনশন। প্রতিটি পিসিআর (প্রতিটি নমুনার জন্য তিন প্রতিলিপিতে সম্পাদিত) Q5 হাই-ফিডেলিটি 2X মাস্টার মিক্স (NEB, cat# M0492L), প্রতিটি প্রাইমারের 5 pmol এবং 50 ng টেমপ্লেট DNA ব্যবহার করে 25 ul ভলিউমে করা হয়েছিল। পরিবর্ধনের পরে, প্রতিটি নমুনা থেকে ট্রিপ্লিকেট পিসিআরগুলি পুল করা হয়েছিল, অ্যামপ্লিফিকেশন নিশ্চিত করতে একটি অ্যাগারোজ জেলে 5 উল চালানো হয়েছিল, এবং অবশিষ্ট ভলিউম Axygen AxyPrep MAG PCR ক্লিনআপ পুঁতি (Corning, cat# MAG-PCR-CL{{53) ব্যবহার করে পরিষ্কার করা হয়েছিল }}) 62.5% জলে মিশ্রিত করা হয় যাতে যে কোনও প্রাইমার ডাইমার ভালভাবে অপসারণ করা যায় যা অগ্রাধিকারমূলকভাবে অনুক্রম করা হবে। মিশ্রিত পুঁতিগুলি পিসিআর প্রতিক্রিয়াগুলির 1.8X ভলিউমে যুক্ত করা হয়েছিল, প্রস্তুতকারকের নির্দেশিকা অনুসারে পরিষ্কার করা হয়েছিল এবং 25 ul 10 মিমি ট্রিস-সিএল, পিএইচ 8.0 দিয়ে পরিষ্কার করা অ্যামপ্লিকনগুলি পরিষ্কার করা হয়েছিল। মাইক্রোপ্লেট রিডারে পিকো গ্রিন ডিএসডিএনএ অ্যাস (থার্মোফিশার, বিড়াল #P11495) দিয়ে অ্যামপ্লিকনগুলি পরিমাপ করা হয়েছিল এবং তারপরে পরিষ্কার এবং সূচীকৃত পৃথক সিকোয়েন্সিং লাইব্রেরিগুলিকে সমানভাবে মাল্টিপ্লেক্স করা হয়েছিল (এনজি ডিএনএ দ্বারা) এবং একটি ইলুমিনা মিসেক যন্ত্রে সিকোয়েন্স করা হয়েছিল। হান্টসম্যান ক্যান্সার ইনস্টিটিউটের হাই-থ্রুপুট জিনোমিক্স শেয়ার্ড রিসোর্স সুবিধায় 300 সাইকেল মোড।

সিকোয়েন্স ডেটার বায়োইনফরমেটিক্স প্রক্রিয়াকরণ

16S rRNA জিন কাঁচা রিডগুলিকে ডিমাল্টিপ্লেক্স করা হয়েছিল যাতে আমরা পূর্বে বর্ণনা করেছি (স্টিফেনস এট আল।, 2021) হিসাবে QIIME2 ফ্রেমওয়ার্কের মধ্যে প্রক্রিয়া করা এবং বিশ্লেষণ করা হয়। সংক্ষেপে, demultiplexed এবং কোয়ালিটি-ফিল্টার করা সিকোয়েন্সগুলি প্রথমে Cutadapt প্লাগইন দিয়ে প্রাইমার এবং লিঙ্কার সিকোয়েন্সের ছাঁটা করা হয়েছিল, তারপর DADA2 দিয়ে ডিনোইস করা হয়েছিল (Callahan et al., 2016; Martin, 2011)। GTDB রেফারেন্স সেট (রিলিজ৮৯) এর বিপরীতে বর্ধিত V3/4 অঞ্চলে ছাঁটাই করা এবং ফিট-ক্ল্যাসিফায়ার-নেইভ-বেইস পদ্ধতির (বোকুলিচ এট আল। , 2018; পার্কস এট আল।, 2018; পেড্রেগোসা এট আল।, 2011)। বৈচিত্র্যের মেট্রিক্স, দূরত্ব, এবং পারমানোভা দ্বারা বিটা বৈচিত্র্যের গ্রুপিংয়ের পরিসংখ্যানগত তাত্পর্য QIIME2 (এন্ডারসন, 2001) এর মধ্যে গণনা করা হয়েছিল।

BMDM-এর RNA-seq-এর জন্য, কাঁচা পাঠগুলি প্রথমে মানসম্পন্ন এবং অ্যাডাপ্টার-ট্রিম করা হয়েছিল ট্রিম গ্যালোর ব্যবহার করে তারপরে GRCm38 (mm10) (Patro et al., 2{{ অ্যাসেম্বলি থেকে ট্রান্সক্রিপ্টোমের বিপরীতে সালমন ব্যবহার করে ট্রান্সক্রিপ্ট সংখ্যাগুলি পরিমাপ করা হয়েছিল) 16}}17)। টাইম প্যাকেজ ব্যবহার করে ট্রান্সক্রিপ্ট স্তরের পরিমাপগুলি R-এ পড়া হয়েছিল এবং ডিজাইন সূত্র '~ জিনোটাইপ + ট্রিটমেন্ট + জিনোটাইপ: ট্রিটমেন্ট' (লাভ এট আল।, 2014; লাভ এট আল।, 2020)। এফ. রোডেন্টিয়ামের ভিন্ন প্রতিক্রিয়াগুলি গাড়ির নিয়ন্ত্রণ-চিকিত্সা করা কোষগুলির উপর জীবন্ত এফ. রোডেন্টিয়াম চিকিত্সার প্রতি প্রতিটি জিনোটাইপের প্রতিক্রিয়ার মধ্যে পার্থক্য উপস্থাপন করে। উল্লেখযোগ্যভাবে ভিন্নভাবে প্রকাশ করা জিনগুলিকে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল যেগুলি একটি সামঞ্জস্যপূর্ণ p-মান <0.05 এবং log2 ভাঁজ-পরিবর্তন > |0.58| (1.5 ভাঁজ-পরিবর্তন)। উল্লেখযোগ্যভাবে ডাউন-নিয়ন্ত্রিত এবং আপ-নিয়ন্ত্রিত জিন তালিকাগুলি জিও শব্দের অপ্রয়োজনীয়তা কমাতে এবং মূল জৈবিক প্রক্রিয়াগুলি সনাক্ত করার জন্য সহজীকরণ ফাংশন সহ ক্লাস্টারপ্রোফাইলার প্যাকেজ ব্যবহার করে জিন অন্টোলজি (জিও) পদে সমৃদ্ধির জন্য পরীক্ষা করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল (S, 2020; Wu et al ., 2021)।

F. rodentium DSS চ্যালেঞ্জ

F. rodentium পূর্বে বর্ণিত হিসাবে জন্মানো হয়েছিল এবং 1 x 109 CFU/mL জীবাণুমুক্ত পিবিএসে পরিমাপ করা হয়েছিল। F. rodentium স্থির করা হয়েছিল প্রথমে 2x জীবাণুমুক্ত পিবিএসে ধুয়ে এবং তারপর 1mL 10% Fomalin-PBS-এ 10 মিনিটের জন্য পুনরায় সাসপেন্ড করে। মৌখিক গ্যাভেজের জন্য প্রস্তুত করার জন্য কোষগুলিকে আরও দুইবার 10mL জীবাণুমুক্ত পিবিএসে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। অ-স্থিরগুলিকে স্থির কোষের মতো ধুয়ে ফেলা হয় এবং গ্যাভেজ পর্যন্ত বরফের উপর রাখা হয়। WT C57BL/6 SPF ইঁদুর মৌখিকভাবে 100uL দ্রবণ দিয়ে পরীক্ষা করা হয়েছিল যাতে হয় একা PBS (যানবাহন), F. rodentium (লাইভ), অথবা F. rodentium (স্থির) -3 থেকে 10 দিন পর্যন্ত। প্রাণীদের 3.0% দেওয়া হয়েছিল ডিএসএস দিনে 0-7; তাজা DSS জল প্রতি অন্য দিন প্রতিস্থাপিত হয়. 20% এর বেশি ওজন হ্রাসের তীব্রতা সীমা তীব্রতা থ্রেশহোল্ড হিসাবে আরোপ করা হয়েছিল। পরীক্ষামূলক শেষ পয়েন্টে, এমএলএন এবং কোলন সরানো হয়েছিল। দৈর্ঘ্য নির্ধারণ করতে সেকাম থেকে মলদ্বার পর্যন্ত কোলন পরিমাপ করা হয়েছিল। তারপরে টিস্যুগুলি হিস্টোলজি, আরএনএ নিষ্কাশন বা প্রবাহ সাইটোমেট্রিক বিশ্লেষণের জন্য প্রক্রিয়া করা হয়েছিল।

ফাগোসাইটোসিস পরীক্ষা

পেরিটোনিয়াল ম্যাক্রোফেজগুলিকে পেরিটোনিয়াল গহ্বরে 5 মিলিলিটার জীবাণুমুক্ত পিবিএস ইনজেকশন দিয়ে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। প্রতি কয়েক সেকেন্ডে গহ্বরে থাকাকালীন পিবিএস মৃদুভাবে উত্তেজিত হয়েছিল। 2 মিনিটের পরে, PBS একটি 28 গেজ সুই ব্যবহার করে প্রত্যাহার করা হয়েছিল এবং ঠান্ডা সম্পূর্ণ DMEM-এ বিতরণ করা হয়েছিল। কোষগুলি 367 xg এ কাটা হয়েছিল এবং সম্পূর্ণ মিডিয়াতে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। তারপরে কোষগুলিকে হিমোসাইটোমিটার দিয়ে গণনা করা হয়েছিল এবং 2.5 x 105 কোষ/mL ঘনত্বে 12-ওয়েল টিস্যু কালচার প্লেটে প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল। কোষগুলিকে রাতারাতি মেনে চলতে দেওয়া হয়েছিল। পরের দিন, কূপগুলি আলতোভাবে ঘূর্ণায়মান হয়ে মিশে গিয়েছিল এবং মিডিয়া আকাঙ্ক্ষিত হয়েছিল। অনুগত কোষগুলি তারপরে 500uL ঠান্ডা, জীবাণুমুক্ত, পিবিএস দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। 10-এর একটি MOI-তে F. rodentium ধারণকারী পূর্ব-উষ্ণ সম্পূর্ণ DMEM তারপর অনুগত (ম্যাক্রোফেজ) যোগ করা হয়েছিল। তারপরে প্লেটগুলিকে 200 xg-এ, ঘরের তাপমাত্রায় তিন মিনিটের জন্য আলতো করে কাটা হয়েছিল এবং তারপরে 90 মিনিটের জন্য স্ট্যান্ডার্ড সেল কালচার অবস্থার (37 C, 5% CO2) অধীনে ইনকিউব করা হয়েছিল। F. rodentium শুধুমাত্র RNA সিকোয়েন্সিংয়ের জন্য BMDM-এর সহ-সংস্কৃতির জন্য বর্ণিত হিসাবে প্রস্তুত করা হয়েছিল, ধোয়ার পরে, কোষগুলিকে 1x Sybr® সবুজ (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3), RT-এ 20 মিনিটের জন্য পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল। ব্যাকটেরিয়া কোষগুলিকে 4000 rpm-এ 5 মিনিটের জন্য সম্পূর্ণ ডিএমইএম দিয়ে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং পেরিটোনিয়াল ম্যাক্রোফেজের জন্য পূর্ব-উষ্ণ করা হয়েছিল। 90 মিনিটের সহ-সংস্কৃতির পরে, মিডিয়াকে উচ্চাকাঙ্ক্ষী করা হয়েছিল এবং কোষগুলিকে ঠান্ডা, জীবাণুমুক্ত, পিবিএস দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। Sybr® সবুজ দাগযুক্ত F. রডেন্টিয়ামযুক্ত অনুগত কোষগুলিকে 2% প্যারাফর্মালডিহাইড (PFA) দিয়ে 10 মিনিটের জন্য স্থির করা হয়েছিল। পিএফএ অ্যাসপিরেটেড ছিল এবং জীবাণুমুক্ত পিবিএস কোষে স্থাপন করা হয়েছিল। কোষগুলি তখন এফ. রোডেন্টিয়ামের ফ্যাগোসাইটোসিসের জন্য চিত্রিত হয়েছিল

ম্যাক্রোফেজ ইমেজ বিশ্লেষণ

এফ. রোডেন্টিয়াম-চিকিত্সাকৃত ম্যাক্রোফেজ সংস্কৃতির ব্রাইটফিল্ড এবং ফ্লুরোসেন্স ছবিগুলি একটি EVOS m7000 ইমেজিং সিস্টেম (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ওয়াল্টহাম, এমএ) ব্যবহার করে নেওয়া হয়েছিল। প্রতিটি সংস্কৃতির জন্য তিন থেকে পাঁচটি পৃথক এলোমেলো চিত্র নেওয়া হয়েছিল, যা ত্রিগুণে বাহিত হয়েছিল।

Images were blinded and quantified using the software Fiji (Schindelin et al., 2012). Individual bacteria and macrophages were easily distinguished based on size. The total number of bacteria that were associated with (touching or overlapping with) single macrophages was quantified for a randomized subset of cells within the image. Equal numbers of cells were quantified between genotypes (n>200).

CLEC12A-Fc ফিউশন প্রোটিন নির্মাণ কnd শুদ্ধিকরণচালু

C57Bl/6 WT SPF অস্থি মজ্জা থেকে বিচ্ছিন্ন সাদা রক্ত ​​​​কোষ থেকে PCR দ্বারা Clec12a মাউসের বহির্মুখী ডোমেনগুলিকে এনকোড করা সিডিএনএগুলিকে প্রশস্ত করা হয়েছিল এবং সিকোয়েন্সিং দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল। সিডিএনএগুলিকে মানব IgG1-Fc অভিব্যক্তি ভেক্টর pFuse-hIgG1- Fc2 (ইনভিভোজেন) এর C টার্মিনাসে যুক্ত করা হয়েছিল। Clec12a বা খালি ভেক্টর সম্বলিত নির্মাণগুলি DMEM +10% FBS এবং পেন/স্ট্রেপ (1mg/mL) দিয়ে সংষ্কৃত Lx293 কোষে স্থানান্তরিত হয়েছিল। গোপন ফিউশন প্রোটিনগুলি স্থানান্তরের পরে মিডিয়া 24-48 থেকে সংগ্রহ করা হয়েছিল৷ ধ্বংসাবশেষ/মৃত কোষ অপসারণের জন্য মিডিয়া 367 xg এ 5 মিনিটের জন্য ঘোরানো হয়েছিল, এবং ব্যবহার না হওয়া পর্যন্ত সুপারনাট্যান্টটি -20 সেন্টিগ্রেডে হিমায়িত ছিল। Clec12a-Fc বা Fc-শুধুমাত্র ফিউশন প্রোটিনগুলিকে Pierce™ ক্লাসিক ম্যাগনেটিক আইপি/কো-আইপি কিট (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ক্যাটালগ নম্বর: 88804) দিয়ে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল, Pierce™ BCA প্রোটিন অ্যাসে কিট (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক ক্যাটালগ 232 নম্বর:) দিয়ে পরিমাপ করা হয়েছিল। এবং antiClec12a অ্যান্টিবডি (Novus Biologicals NBP2-27346SS) ব্যবহার করে ওয়েস্টার্ন ব্লট দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছে।

Clec12a-Fc-বাইন্ডিং অ্যাস

HBSS w/ Ca2+ এবং Mg2+-এ বিশুদ্ধ কনস্ট্রাক্টগুলিকে 0.4 mg/mL তে পাতলা করা হয়েছিল৷ ব্যাকটেরিয়া তাদের নিজ নিজ মিডিয়া এবং বায়বীয় অবস্থায় জন্মায় এবং OD 600nm দ্বারা স্বাভাবিক করা হয়। ব্যাকটেরিয়াগুলিকে HBSS w/ Ca2+ এবং Mg2+ দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং RT এ 20 মিনিটের জন্য HBSS w/ Ca2+ এবং Mg2+ +10% FBS দিয়ে ব্লক করা হয়েছিল৷ সমস্ত স্টেনিং পদ্ধতি বায়ুমণ্ডলীয় অবস্থার অধীনে সঞ্চালিত হয়েছিল। 1 x 107 ব্যাকটেরিয়া কোষগুলি একটি বৃত্তাকার নীচে 96-কূপ প্লেটে স্থাপন করা হয়েছিল, 3,000 xg এ কাটা হয়েছিল এবং ডিকান্ট করা হয়েছিল। 50uL কনস্ট্রাক্টগুলি ব্যাকটেরিয়া কোষের উপর স্থাপন করা হয়েছিল, আলতো করে মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং 1 ঘন্টার জন্য 4 সেন্টিগ্রেডে ইনকিউব করা হয়েছিল। ব্যাকটেরিয়া কোষগুলি HBSS w/ Ca2+ এবং Mg2+ + 10% FBS, 2x দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। 50uL ছাগল অ্যান্টি-হিউম্যান Fc (PE) (ইবায়োসায়েন্স ক্যাটালগ # 12-4998-82) কোষে যোগ করা হয়েছিল এবং অন্ধকারে 1 ঘন্টার জন্য 4 সেন্টিগ্রেডে ইনকিউব করা হয়েছিল। তারপরে কোষগুলিকে আগের মতো ধুয়ে HBSS w/ Ca2+ এবং Mg2+-এ 1x Sybr® সবুজ (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3) রাখা হয়। কোষগুলিকে অন্ধকারে 20 মিনিটের জন্য RT-এ ইনকিউবেট করা হয়েছিল এবং অবিলম্বে একটি বিডি এলএসআর ফোর্টেসা ফ্লো সাইটোমিটারে পড়া হয়েছিল।

বিকিরণ এবং অস্থি মজ্জা পুনর্গঠন

পূর্বে বর্ণিত হিসাবে WT এবং Clec12a-/- প্রাণী থেকে অস্থি মজ্জা সংগ্রহ করা হয়েছিল। প্রাপ্ত প্রাপক ইঁদুরগুলিকে 50দিনে 0 র‌্যাড দিয়ে প্রাণঘাতী বিকিরণ করা হয়েছিল -1, তারপরে 0 তে 400টি র‌্যাড দেওয়া হয়েছিল৷ শেষ বিকিরণের চার ঘন্টা পরে, প্রাপক ইঁদুরগুলিকে আইসোফ্লুরেন অ্যানাস্থেটিজেশনের অধীনে রাখা হয়েছিল এবং 100uL বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল৷ জীবাণুমুক্ত PBS (1 x 108 সেল/mL) স্থগিত অস্থি মজ্জা কোষগুলি একটি 28.5 গেজ সুচের মাধ্যমে রেট্রো-অরবিটাল স্পেসে বিতরণ করা হয়েছিল। আমরা মাইক্রোবায়োটাতে আগ্রহী ছিলাম এইভাবে প্রাণীদের অ্যান্টিবায়োটিকগুলিতে স্থাপন করা হয়নি এবং 8 সপ্তাহ পরে জিএফ প্রাণীদের মধ্যে মাইক্রোবায়োটা স্থানান্তরের জন্য মল ছুরি সংগ্রহ করা হয়েছিল।

তথ্যসূত্র

অ্যান্ডারসন, এমজে (2001)। বৈচিত্র্যের অ-প্যারামেট্রিক মাল্টিভেরিয়েট বিশ্লেষণের জন্য একটি নতুন পদ্ধতি। অস্ট্রাল ইকোল। 26, 32-46। DOI 10.1111/j৷{6}}.2001.01070.pp.x

Begun, J., Lassen, KG, Jijon, HB, Baxt, LA, Goel, G., Heath, RJ, Ng, A., Tam, JM, Kuo, SY, Villablanca, EJ, et al. (2015)। ক্রোনের রোগের ঝুঁকির বৈকল্পিকের সমন্বিত জিনোমিক্স

অ্যান্টিব্যাকটেরিয়াল অটোফ্যাজিতে CLEC12A-এর ভূমিকা চিহ্নিত করে। সেল প্রতিনিধি 11, 1905-1918। 10.1016/j.celrep.2015.05.045।

Blander, JM, Longman, RS, Iliev, ID, Sonnenberg, GF, এবং Artis, D. (2017)। হোস্টের সাথে মাইক্রোবায়োটার মিথস্ক্রিয়া দ্বারা প্রদাহ নিয়ন্ত্রণ। নাট। ইমিউনল। 18, 851-860। 10.1038/ni.3780।

Bokulich, NA, Kaehler, BD, Rideout, JR, Dillon, M., Bolyen, E., Knight, R., Huttley, GA, এবং Caporaso, JG (2018)। QIIME 2 ''sq2- ফিচার-ক্লাসিফায়ার প্লাগইন দিয়ে মার্কার-জিন অ্যামপ্লিকন সিকোয়েন্সের ট্যাক্সোনমিক শ্রেণীবিভাগ অপ্টিমাইজ করা। মাইক্রোবায়োম 6. ARTN 90 10.1186/s40168-018-0470-z.

Bolyen, E., Rideout, JR, Dillon, MR, Bokulich, N., Abnet, CC, Al-Ghalith, GA, Alexander, H., Alm, EJ, Arumugam, M., Asnicar, F., et al. (2019)। QIIME 2 ব্যবহার করে প্রজননযোগ্য, ইন্টারেক্টিভ, স্কেলেবল, এবং এক্সটেনসিবল মাইক্রোবায়োম ডেটা সায়েন্স। বায়োটেকনোল। 37, 852-857। ১০.১০৩৮/সেকেন্ড41587-019-0209-9।

Brown, GD, Willment, JA, and Whitehead, L. (2018)। অনাক্রম্যতা এবং হোমিওস্টেসিসে সি-টাইপ লেকটিন। নাট। রেভ. ইমিউনল। 18, 374-389। 10.1038/s41577-018-0004-8।

Browne, HP, Forster, SC, Anonye, ​​BO, Kumar, N., Neville, BA, Stares, MD, Goulding, D., and Lawley, TD (2016)। 'অসংস্কৃতির' মানব মাইক্রোবায়োটার সংস্কৃতি অভিনব ট্যাক্সা এবং ব্যাপক স্পোরুলেশন প্রকাশ করে। প্রকৃতি 533, 543-+। 10.1038/প্রকৃতি17645।

Cadwell, K., Liu, JY, Brown, SL, Miyoshi, H., Loh, J., Lennerz, JK, Kishi, C., Kc, W., Carrero, JA, Hunt, S., et al. (2008)। মাউস এবং মানুষের অন্ত্রের প্যানেথ কোষে অটোফ্যাজি এবং অটোফ্যাজি জিন Atg16l1 এর জন্য একটি মূল ভূমিকা। প্রকৃতি 456, 259-263। 10.1038/Nature07416.

Callahan, BJ, McMurdie, PJ, Rosen, MJ, Han, AW, Johnson, AJA, and Holmes, SP (2016)। DADA2: ইলুমিনা অ্যামপ্লিকন ডেটা থেকে উচ্চ-রেজোলিউশনের নমুনা অনুমান। নাট। পদ্ধতি 13, 581-+। 10.1038/Nmeth.3869।

Cao, YG, Bae, S., Villarreal, J., Moy, M., Chun, E., Michaud, M., Lang, JK, Glickman, JN, Lobel, L., and Garrett, WS (2022)। ইওসিনোফিল-নির্ভর অন্ত্রের এপিথেলিয়াল হোমিওস্ট্যাসিস পরিচালনার জন্য ফ্যাকালিবাকুলাম রডেন্টিয়াম রেটনোইক অ্যাসিড সংকেতকে পুনরায় তৈরি করে। সেল হোস্ট এবং মাইক্রোব 30, 1295- 1310 e1298। 10.1016/j.chom.2022.07.015

Chang, DH, Rhee, MS, Ahn, S., Bang, BH, Oh, JE, Lee, HK, এবং Kim, BC (2015)। ফ্যাকালিবাকুলাম রোডেন্টিয়াম জেন। nov., sp. nov., একটি পরীক্ষাগার ইঁদুরের মল থেকে বিচ্ছিন্ন। অ্যান্টনি ভ্যান লিউয়েনহোক 108, 1309-1318। 10.1007/s10482-015-0583-3।

Chiaro, TR, Soto, R., Stephens, WZ, Kubinak, JL, Petersen, C., Gogokhia, L., Bell, R., Delgado, JC, Cox, J., Voth, W., et al. (2017)। অন্ত্রের মাইকোবিওটার একজন সদস্য হোস্ট পিউরিন বিপাককে নিয়ন্ত্রণ করে যা ইঁদুরের কোলাইটিসকে বাড়িয়ে দেয়। বিজ্ঞান অনুবাদ। মেড. 9,।

Drouin, M., Saenz, J., and Chiffoleau, E. (2020)। সি-টাইপ লেকটিন-জাতীয় রিসেপ্টর: কোষের মৃত্যুর অনাক্রম্যতায় মাথা বা লেজ। সামনে। ইমিউনল। 11. ARTN 251 10.3389/fimmu.2020.00251.

Fassarella, M., Blaak, EE, Penders, J., Nauta, A., Smidt, H., এবং Zoetendal, EG (2021)। অন্ত্রের মাইক্রোবায়োম স্থায়িত্ব এবং স্থিতিস্থাপকতা: অন্ত্রের স্বাস্থ্যকে সংশোধন করার জন্য বিরক্তির প্রতিক্রিয়া ব্যাখ্যা করা। অন্ত্র 70, 595-605। 10.1136/gutjnl-2020-321747.

Gkouskou, KK, Deligianni, C., Tsatsanis, C., এবং Eliopoulos, AG (2014)। প্রদাহজনক অন্ত্রের রোগের মাউস মডেলগুলিতে অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটা। সেলুলার এবং ইনফেকশন মাইক্রোবায়োলজি 4. ARTN 28 10.3389/fcimb.2014.00028.

Han, YM, Zhang, MH, Li, N., Chen, TY, Zhang, Y., Wan, T., এবং Cao, XT (2004)। KLRL1, একটি নভেল কিলার সেল লেকটিন-লাইক রিসেপ্টর, প্রাকৃতিক কিলার সেল সাইটোটক্সিসিটি বাধা দেয়। রক্ত 104, 2858-2866। DOI 10.1182/ব্লাড-2004-03-0878।

Iliev, ID, Funari, VA, Taylor, KD, Nguyen, Q., Reyes, CN, Strom, SP, Brown, J., Becker, CA, Fleshner, PR, Dubinsky, M., et al. (2012)। কমেন্সাল ছত্রাক এবং সি-টাইপ লেকটিন রিসেপ্টর ডেকটিন-1 এর মধ্যে মিথস্ক্রিয়া কোলাইটিসকে প্রভাবিত করে। বিজ্ঞান 336, 1314-1317। 10.1126/বিজ্ঞান.1221789।

জেসন এল. কুবিনাক, ডব্লিউজেডএস, রে সোটো, চ্যারিসে পিটারসেন, টাইসন চিয়ারো, লাশা গোগোখিয়া, রিকেশা বেল১, নাদিম জে. আজামি, জোসেফ এফ. পেট্রোসিনো, লিন্ডা মরিসন৪, ওয়েন কে. পোটস, পিটার ই জেনসেন, রায়ান এম ও' কনেল এবং জুন এল. রাউন্ড (2015)। MHC ভিন্নতা স্বতন্ত্র জীবাণু সম্প্রদায়ের ভাস্কর্য তৈরি করে যা অন্ত্রের সংক্রমণের সংবেদনশীলতা নিয়ন্ত্রণ করে। প্রকৃতি যোগাযোগ. 0.1038/ncomms9642।

Kono, H., Chen, CJ, Ontiveros, F., and Rock, KL (2010)। ইউরিক অ্যাসিড ইঁদুরের জীবাণুমুক্ত কোষের মৃত্যুতে তীব্র প্রদাহজনক প্রতিক্রিয়া প্রচার করে। জে ক্লিন। বিনিয়োগ করুন। 120, 1939-1949। 10.1172/Jci40124।

Kozich, JJ, Westcott, SL, Baxter, NT, Highlander, SK, and Schloss, PD (2013)। MiSeq ইলুমিনা সিকোয়েন্সিং প্ল্যাটফর্মে অ্যামপ্লিকন সিকোয়েন্স ডেটা বিশ্লেষণের জন্য একটি ডুয়াল-ইনডেক্স সিকোয়েন্সিং কৌশল এবং কিউরেশন পাইপলাইনের বিকাশ। ফলিত এবং পরিবেশগত মাইক্রোবায়োলজি 79, 5112-5120। 10.1128/Aem।{6}}।

Kubinak, JL, Petersen, C., Stephens, WZ, Soto, R., Bake, E., O'Connell, RM, and Round, JL (2015)। টি কোষে MyD88 সিগন্যালিং স্বাস্থ্যের উন্নতির জন্য মাইক্রোবায়োটার IgA- মধ্যস্থতা নিয়ন্ত্রণকে নির্দেশ করে। সেল হোস্ট মাইক্রোব 17, 153-163। 10.1016/j.chom.2014.12.009

লি, কে., নিউম্যান, কে., দুহান, ভি., নামিনেনি, এস., হ্যানসেন, এএল, ওয়ার্টেউইগ, টি., কুর্গিস, জেড., হোলম, সিকে, হেইকেনওয়াল্ডার, এম., ল্যাং, কেএস, এবং রুল্যান্ড, জে. (2019)। ইউরিক অ্যাসিড ক্রিস্টাল রিসেপ্টর Clec12A টাইপ I ইন্টারফেরন প্রতিক্রিয়ার সম্ভাবনা তৈরি করে। Proc Natl Acad Sci USA 116, 18544-18549। 10.1073/pnas.1821351116.

Liu, JZ, van Sommeren, S., Huang, H., Ng, SC, Alberts, R., Takahashi, A., Ripke, S., Lee, JC, Jostins, L., Shah, T., et al . (2015)। অ্যাসোসিয়েশন বিশ্লেষণগুলি প্রদাহজনক অন্ত্রের রোগের জন্য 38 টি সংবেদনশীলতা অবস্থান সনাক্ত করে এবং জনসংখ্যা জুড়ে ভাগ করা জেনেটিক ঝুঁকি হাইলাইট করে। নাট। জেনেট। 47, 979-986। 10.1038/ng.3359।

Love, MI, Huber, W., and Anders, S. (2014)। DESeq2 এর সাথে RNA-seq ডেটার জন্য ভাঁজ পরিবর্তন এবং বিচ্ছুরণের পরিমিত অনুমান। জিনোম বায়োল। 15. ARTN 550 10.1186/s13059-014-0550-8।

Love, MI, Soneson, C., Hickey, PF, Johnson, LK, Pierce, NT, Shepherd, L., Morgan, M., and Patro, R. (2020)। Tximeta: RNA-seq-এ মূল শনাক্তকরণের জন্য রেফারেন্স সিকোয়েন্স চেকসাম। Plos Computational Biology 16. ARTN e1007664 10.1371/journal.pcbi.1007664.

Luo, Y., Tucker, SC, এবং Casadevall, A. (2005)। Fc- এবং কমপ্লিমেন্ট-রিসেপ্টর অ্যাক্টিভেশন G1 থেকে SJ ইমিউনল পর্যন্ত ম্যাক্রোফেজ কোষের কোষ চক্রের অগ্রগতিকে উদ্দীপিত করে। 174, 7226- 7233। 10.4049/জিমুনোল.174.11.7226.

Macpherson, AJ, Gatto, D., Sainsbury, E., Harriman, GR, Hengartner, H., and Zinkernagel, RM (2000)। কমেন্সাল ব্যাকটেরিয়ায় অন্ত্রের মিউকোসাল আইজিএ প্রতিক্রিয়ার একটি আদিম টি সেল-স্বাধীন প্রক্রিয়া। বিজ্ঞান ২৮৮, 2222-+। DOI 10.1126/science.288.5474.2222.

Maglinao, M., Eriksson, M., Schlegel, MK, Zimmermann, S., Johannssen, T., Gotze, S., Seeberger, PH, এবং Lepenies, B. (2014)। সি-টাইপ লেকটিন রিসেপ্টর বাইন্ডিং কার্বোহাইড্রেট এবং সেল-নির্দিষ্ট টার্গেটিং এবং ইমিউন মড্যুলেশনের জন্য তাদের সম্ভাব্যতার জন্য স্ক্রীন করার একটি প্ল্যাটফর্ম। জার্নাল অফ কন্ট্রোলড রিলিজ 175, 36-42। 10.1016/j.jconrel.2013.12.011।

মার্শাল, এএসজে, উইলমেন্ট, জেএ, লিন, এইচএইচ, উইলিয়ামস, ডিএল, গর্ডন, এস, এবং ব্রাউন, জিডি (2004)। একটি নভেল হিউম্যান মাইলয়েড ইনহিবিটরি সি-টাইপ লেকটিন-লাইক রিসেপ্টর (MICL) সনাক্তকরণ এবং চরিত্রায়ন যা প্রধানত গ্রানুলোসাইট এবং মনোসাইটগুলিতে প্রকাশ করা হয়। জে. বিওল। কেম। 279, 14792-14802। 10.1074/jbc.M313127200।

মার্টিন, এম. (2011)। Cutadapt উচ্চ-থ্রুপুট সিকোয়েন্সিং রিড থেকে অ্যাডাপ্টার সিকোয়েন্সগুলি সরিয়ে দেয়। EMBNet.journal 17. মার্টিনেজ-লোপেজ, এম., ইবোরা, এস., কন্ডে-গারোসা, আর., মাস্ট্রেঞ্জেলো, এ., ড্যানে, সি., মান, ইআর, রিড, ডিএম, গাবোরিয়াউ-রাউথিয়াউ, ভি., চপাররো , M., Lorenzo, MP, et al. (2019)। ডেনড্রাইটিক কোষে মিনকেল-সিক অক্ষ দ্বারা মাইক্রোবায়োটা সেন্সিং ইন্টারলিউকিন-17 এবং -22 উৎপাদন নিয়ন্ত্রণ করে এবং অন্ত্রের বাধা অখণ্ডতা প্রচার করে। অনাক্রম্যতা 50, 446-461 e449. 10.1016/j.immuni.2018.12.020

মার্টিনন, এফ., পেট্রিলি, ভি., মেয়র, এ., টারদিভেল, এ., এবং শপ্প, জে. (2006)। গাউট-সম্পর্কিত ইউরিক অ্যাসিড স্ফটিক NALP3 প্রদাহকে সক্রিয় করে। প্রকৃতি 440, 237-241। 10.1038/Nature04516.

নাকাজিমা, এ., ভোগেলজাং, এ., মারুয়া, এম., মিয়াজিমা, এম., মুরাতা, এম., সন, এ., কুয়াহারা, টি., সুরুইয়ামা, টি., ইয়ামাদা, এস., মাতসুরা, এম., ইত্যাদি (2018)। IgA ব্যাকটেরিয়ার মধ্যে সিম্বিওসিস প্রচার করে অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটার গঠন এবং বিপাকীয় ফাংশন নিয়ন্ত্রণ করে। J. Exp. মেড. 215, 2019-2034। 10.1084/jem.20180427।

নিউম্যান, কে., কাস্টিনিরাস-ভিলারিনো, এম., হকেনডর্ফ, ইউ., হ্যানেসক্লেগার, এন., লেমির, এস., কুপকা, ডি., মেয়ারম্যান, এস., লেচ, এম., অ্যান্ডার্স, এইচজে, কুস্টার, বি. , et al. (2014)। Clec12a হল ইউরিক অ্যাসিড স্ফটিকগুলির জন্য একটি প্রতিরোধক রিসেপ্টর যা কোষের মৃত্যুর প্রতিক্রিয়া হিসাবে প্রদাহ নিয়ন্ত্রণ করে। অনাক্রম্যতা 40, 389-399। 10.1016/j.immuni.2013.12.015.

Okai, S., Usui, F., Yokota, S. Hori, IY, Hasegawa, M., Nakamura, T., Kurosawa, M., Okada, S., Yamamoto, K., Nishiyama, E., et আল (2016)। হাই-অ্যাফিনিটি মনোক্লোনাল আইজিএ অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটা নিয়ন্ত্রণ করে এবং ইঁদুরের কোলাইটিস প্রতিরোধ করে। Nat Microbiol 1, 16103. 10.1038/nmicrobiol.2016.103.

Pabst, O., এবং Slack, E. (2020)। আইজিএ এবং অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটা: নির্দিষ্ট হওয়ার গুরুত্ব। মিউকোসাল ইমিউনল। ১৩, 12-21। ১০.১০৩৮/সেকেন্ড41385-019-0227-4।

Parks, DH, Chuvochina, M., Waite, DW, Rinke, C., Skarshewski, A., Chaumeil, PA, এবং Hugenholtz, P. (2018)। জিনোম ফাইলোজেনির উপর ভিত্তি করে একটি প্রমিত ব্যাকটেরিয়া শ্রেণীবিন্যাস জীবনের গাছটিকে উল্লেখযোগ্যভাবে সংশোধন করে। নাট। বায়োটেকনোল। 36, 996-+। 10.1038/nbt.4229।

Patro, R., Duggal, G., Love, MI, Irizarry, RA, and Kingsford, C. (2017)। সালমন ট্রান্সক্রিপ্ট এক্সপ্রেশনের দ্রুত এবং পক্ষপাত-সচেতন পরিমাণ প্রদান করে। নাট। পদ্ধতি 14, 417-+। 10.1038/nmeth.4197।

Pedregosa, F., Varoquaux, G., Gramfort, A., Michel, V., Thirion, B., Grisel, O., Blondel, M., Prettenhofer, P., Weiss, R., Dubourg, V., ইত্যাদি (2011)। স্কিট-লার্ন: পাইথনে মেশিন লার্নিং। J Mach Learn Res 12, 2825-2830.

Pyz, E., Huysamen, C., Marshall, AS, Gordon, S., Taylor, PR, এবং Brown, GD (2008)। মুরিন MICL (CLEC12A) এর বৈশিষ্ট্য এবং একটি এন্ডোজেনাস লিগ্যান্ডের প্রমাণ। ইউরো. জে. ইমিউনল। 38, 1157-1163। 10.1002/eji.200738057।

Raulf, MK, Johannssen, T., Matthiesen, S., Neumann, K., Hachenberg, S., Mayer-Lambertz, S., Steinbeis, F., Hegermann, J., Seeberger, PH, Baumgartner, W., ইত্যাদি (2019)। সি-টাইপ লেক্টিন রিসেপ্টর CLEC12A প্লাজমোডিয়াল হিমোজোইনকে স্বীকৃতি দেয় এবং সেরিব্রাল ম্যালেরিয়া বিকাশে অবদান রাখে। কক্ষ প্রতিনিধি 28, 30-38 e35. 10.1016/j.celrep.2019.06.015।

Ray, A., এবং Dittel, BN (2015)। ইমিউনোডেফিসিয়েন্সি এবং কোলাইটিসের রোগের অনুপ্রবেশের কারণে অন্ত্রের মাইক্রোবায়োটায় ডিসবায়োসিসের মধ্যে আন্তঃসম্পর্ক। ইমিউনোলজি 146, 359-368। 10.1111/imm.12511।

Redelinghuys, P., Whitehead, L., Augello, A., Drummond, RA, Levesque, JM, Vautier, S., Reid, DM, Kerscher, B., Taylor, JA, Nigrovic, PA, et al. (2016)। MICL রিউমাটয়েড আর্থ্রাইটিসে প্রদাহ নিয়ন্ত্রণ করে। অ্যান. রিউম। ডিস. 75, 1386-1391। 10.1136/annrheumdis-2014-206644.