Cistanche Tubulosa অ্যাপোপটোসিস এবং গ্লিয়াল সেল-ডিরিভড নিউরোট্রফিক ফ্যাক্টর নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে ডোপামিনার্জিক নিউরনকে রক্ষা করে: ভিভো এবং ইন ভিট্রো-Ⅰ

ভূমিকা

পারকিনসন্স ডিজিজ (PD) হল একটি সাধারণ নিউরোডিজেনারেটিভ রোগ যা বয়স্ক ব্যক্তিদের মধ্যে ঘটে যা অবক্ষয়ের কারণে সাবস্ট্যান্টিয়া নিগ্রা (SN) এ ডোপামিনার্জিক নিউরনের ক্ষতির প্যাথলজিকাল প্রকাশের সাথে ঘটে। রোগের তীব্রতা SN-তে ডোপামিন (DA) নিউরোনাল কোষের ক্ষতির সাথে সম্পর্কযুক্ত, যা এই দৃষ্টিভঙ্গির সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ যে নিউরোডিজেনারেটিভকোন উপসর্গ দেখা দেওয়ার আগে প্রক্রিয়াটি বহু বছর ধরে অগ্রসর হয় (Sawle এবং Myers, 1993) রোগের প্রগতিশীল প্রকৃতি অন্তর্নিহিত নিউরোডিজেনারেটিভ প্রক্রিয়াকে অবরুদ্ধ করে থেরাপিউটিক হস্তক্ষেপের জন্য আকর্ষণীয় সম্ভাবনার পরামর্শ দেয়। DA নিউরন বেঁচে থাকার জন্য থেরাপি-প্ররোচিত শক্তিশালী এবং নিউরোট্রফিক ফ্যাক্টরগুলির নির্দিষ্ট ক্রিয়াগুলির অনুসন্ধান তাই যথেষ্ট আগ্রহের বিষয়।

ডোপামিনার্জিক নিউরন PHGS75% ECH 30% অ্যাক্ট 12% সুরক্ষার জন্য ন্যাচারাল সিস্টানচে টিউবুলোসা

নিউরোট্রফিক ফ্যাক্টর হল প্রয়োজনীয় প্রোটিন, যার মধ্যে রয়েছে নার্ভ গ্রোথ ফ্যাক্টর (এনজিএফ), ব্রেন-ডিরাইভড নিউরোট্রফিক ফ্যাক্টর (বিডিএনএফ), এবং গ্লিয়াল সেল-ডিরাইভড নিউরোট্রফিক ফ্যাক্টর (জিডিএনএফ), যা স্নায়ুর বৃদ্ধি, স্নায়বিক বিকাশ, অ্যাক্সোনাল গাইডেন্স এবং নিউরোনাল ফাংশনকে উৎসাহিত করে। ডোপামিনার্জিক নিউরনগুলির মেরামতকে রক্ষা করে এবং প্রচার করে এমন সমস্ত নিউরোট্রফিক কারণগুলির মধ্যে, জিডিএনএফের সবচেয়ে শক্তিশালী প্রভাব রয়েছে (হং এট আল।, 2008; রাঙ্গাসামি এট আল।, 2010; অ্যালেন এট আল।, 2013)। জিডিএনএফকে ভিট্রোতে ডিএ নিউরনগুলিতে শক্তিশালী নিউরোট্রফিক প্রভাব থাকতে দেখা গেছে (লিন এট আল।, 1993) এবং ভিভোতে নিউরোপ্রোটেক্টিভ প্রভাব প্রয়োগ করতে। জিডিএনএফকে ইঁদুরের অস্ত্রোপচার- বা টক্সিন-প্ররোচিত অ্যাক্সোটমি (বেক এট আল।, 1995; কিয়র্নস এবং গ্যাশ, 1995; সাউয়ার এট আল।, 1995) এবং আংশিকভাবে পরেও ক্ষত-প্ররোচিত কোষের মৃত্যুর হাত থেকে নিগ্রাল ডিএ নিউরনগুলিকে উদ্ধার করতে দেখানো হয়েছে। এর পদ্ধতিগত প্রশাসনএন-মিথাইল-4-ফিনাইল-1,2,3,6-টেট্রাহাইড্রোপাইরিডিন (এমপিটিপি)ইঁদুরের মধ্যে (Tomac et al., 1995)। নিউরোনাল অ্যাপোপটোসিসের বর্ধিত ঘটনা এবং নিউরোট্রফিক ফ্যাক্টরগুলির প্রতিরক্ষামূলক প্রভাব হ্রাস করা, সম্ভাব্য বিভিন্ন প্যাথলজিকাল কারণের দ্বারা ট্রিগার করা, ডোপামিনার্জিক নিউরনের অবক্ষয়কে বোঝায় (হোল্ডেন এট আল।, 2006)।

সি. টিউবুলোসা হল একটি ভেষজ ওষুধ যা সিস্তানচে গণের বিভিন্ন উদ্ভিদ থেকে উদ্ভূত। এটি কিডনি ঘাটতি সিন্ড্রোমের জন্য একটি প্রধান থেরাপিউটিক বিকল্প যা ঐতিহ্যগত চীনা ওষুধে (TCM) এন্ড্রোজেন হরমোনের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত। আজ অবধি, সি. টিউবুলোসার উপর প্রচুর ক্লিনিকাল এবং মৌলিক গবেষণায় নিউরোডিজেনারেটিভ রোগের কার্যকলাপ দেখানো হয়েছে। পিডি চিকিত্সায় TCM কিডনি-টোনিফাইং প্রেসক্রিপশনগুলির সনাক্তকরণ এইভাবে PD-এর জন্য একটি বিকল্প ক্লিনিকাল চিকিত্সা প্রদান করতে পারে।Echinacoside (ECH)ঔষধি ভেষজ সি. টিউবুলোসাতে পাওয়া একটি প্রধান জৈব সক্রিয় উপাদান। গবেষণায় Cistanche এবং ECH এর গ্লাইকোসাইডের থেরাপিউটিক প্রভাব দেখানো হয়েছে,ভার্বাসকোসাইড(VER), এবং icariin (ICA) on Alzheimer's disease (AD), PD, এবং অন্যান্য ভাস্কুলার ডিমেনশিয়া রোগীদের (Urano and Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014)। উ এট আল। (2014) পরামর্শ দিয়েছে যে C. টিউবুলোসা নির্যাস যাতে যথেষ্ট ECH এবং অ্যাক্টিওসাইড রয়েছে তা অ্যামাইলয়েড জমা ব্লক করে এবং কোলিনার্জিক এবং হিপোক্যাম্পাল ডোপামিনার্জিক নিউরোনাল ফাংশনকে বিপরীত করার মাধ্যমে A -42 দ্বারা সৃষ্ট জ্ঞানীয় কর্মহীনতাকে প্রশমিত করেছে। তাও এট আল। (2015) পাওয়া গেছেফেনাইলিথানয়েড গ্লাইকোসাইডC. tubulosa থেকে (Ph Gs-Ct) ইঁদুরের মডেলের মস্তিষ্কের টিস্যুতে AQP4 এর প্রোটিন এবং mRNA এক্সপ্রেশন হ্রাস করে উচ্চ-উচ্চতা সেরিব্রাল এডিমা প্রতিরোধ করে।

ন্যাচারাল সিস্টানচে টিউবুলোসা এক্সট্র্যাক্ট স্ন্যাকস স্মৃতিশক্তি উন্নত করে PHGS75% ECH 30% ACT 12%

পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে সি. টিউবুলোসা, এপিমিডিয়াম এবং রাইজোমা পলিগোনাটির তিনটি উপাদান সহ চীনা ভেষজ যৌগগুলি ডোপামিনার্জিক নিউরনের ক্ষতি হ্রাস করে এবং নিউরোট্রফিক ফ্যাক্টরগুলির প্রকাশকে নিয়ন্ত্রণ করে ডোপামিনের মাত্রা বৃদ্ধি করে (Wu et al., 2013)। এইভাবে, সি. টিউবুলোসা-প্ররোচিত নিউরোপ্রোটেক্টিভ প্রভাবগুলি দীর্ঘস্থায়ী কিনা এবং জিডিএনএফ প্রশাসনের দ্বারা নিগ্রাল ডিএ নিউরনগুলির উদ্ধার কতটা পিডি প্রাণীদের লক্ষণবিদ্যার জন্য প্রাসঙ্গিকতার মোটরিক আচরণের উল্লেখযোগ্য সংরক্ষণ বহন করতে পারে তা এখনও জানা যায়নি। এই গবেষণায় একটি TCM কিডনি-টোনিফাইং রেসিপি ব্যবহার করা হয়েছে, সি. টিউবুলোসা ন্যানোপাউডার, যা চীনে একটি জাতীয় পেটেন্ট (পেটেন্ট নম্বর: 2011103028541) পেয়েছে এবং পূর্বে PD-তে একটি নির্দিষ্ট থেরাপিউটিক প্রভাব দেখিয়েছে। তাই বর্তমান অধ্যয়নটি সি. টিউবুলোসা চিকিত্সার নিউরোপ্রোটেক্টিভ এবং পুনর্জন্মগত প্রভাবগুলি পরীক্ষা করার জন্য এবং MES23.5 কোষ এবং আচরণগত নির্দিষ্ট ইঁদুরের অ্যাপোপটোসিস এবং জিডিএনএফ-এর নিয়ন্ত্রণের তদন্ত করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছিল, যেমন টার্গেট পরীক্ষার ব্যাটারি দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল। .

উপকরণ এবং পদ্ধতিসমূহ

উপকরণ, বিকারক, এবং সরঞ্জাম

সি. টিউবুলোসা বেইজিং টং রেন ট্যাং গ্রুপ, কোং, লিমিটেড, বেইজিং, চীন থেকে কেনা হয়েছিল। ECH, VER, এবং ICA এসেছে ন্যাশনাল ইনস্টিটিউট ফর ফুড অ্যান্ড ড্রাগ কন্ট্রোল, চীন থেকে। MES23.5 ডোপামিনার্জিক নিউরোনাল সেল লাইনটি ছিল প্রফেসর বিয়াও চেন, নিউরোবায়োলজির ল্যাবরেটরি, ক্যাপিটাল মেডিকেল ইউনিভার্সিটি, বেইজিং, চীনের কাছ থেকে একটি উপহার। Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (লাইসেন্স নম্বর: SCXK2012-0002), সাংহাই, চীন থেকে পঞ্চাশটি C57BL/6 পুরুষ ইঁদুর (প্রত্যেকটির ওজন 20-25 গ্রাম) কেনা হয়েছিল৷

এমপিপি+, এমটিটি, এবং গ্লুটামিন সিগমা-অলড্রিচ (কার্লসব্যাড, সিএ, ইউএসএ) থেকে কেনা হয়েছিল; DMEM/F12 মিডিয়াম এবং ফেটাল বোভাইন সিরাম Gibco কোং থেকে কেনা হয়েছিল (লাইফ টেকনোলজিস, কার্লসব্যাড, CA, USA); এবং এমপিটিপি, ডিএ স্ট্যান্ডার্ড এবং হোমোভানিলিক অ্যাসিড (এইচভিএ) স্ট্যান্ডার্ড সিগমা-অলড্রিচ (কার্লসব্যাড, সিএ, ইউএসএ) থেকে কেনা হয়েছিল। -অ্যাক্টিন, ব্যাক্স, বিসিএল 2, জিডিএনএফ, জিডিএনএফ ফ্যামিলি রিসেপ্টর আলফা (জিএফআর 1) এবং রেট অ্যান্টিবডিগুলি সেল সিগন্যালিং টেকনোলজি, ইনকর্পোরেটেড (বেভারলি, এমএ, ইউএসএ) থেকে কেনা হয়েছিল; 3,3'-ডায়ামিনোবেনজিডাইন (ডিএবি) স্টেনিং রিএজেন্ট কিটটি ফুঝো মাইক্সিন বায়োটেক লিমিটেড (ফুজিয়ান, চীন) থেকে কেনা হয়েছিল; এবং এসডিএস-পেজ জেল নমুনা প্রস্তুতি কিট, অতি সংবেদনশীল বর্ধিত কেমিলুমিনেসেন্স (ইসিএল) সনাক্তকরণ কিট এবং বিসিনকোনিনিক অ্যাসিড (বিসিএ) অ্যাস বেয়োটাইম ইনস্টিটিউট অফ বায়োটেকনোলজি (বেইজিং, চীন) থেকে কেনা হয়েছিল।

এই গবেষণায় নিম্নলিখিত যন্ত্র ব্যবহার করা হয়েছে: ELX800 মাইক্রোপ্লেট রিডার (Bio Tek Winooski, VT, USA); CO2 ইনকিউবেটর (Heraeus, Hanau, Germany); জেল DOC 2000 জেল ইমেজিং অ্যানালাইসিস সিস্টেম, ইলেক্ট্রোফোরেসিস সেল এবং ইলেক্ট্রোফোরেসিস ট্যাঙ্ক (বায়ো-রাড, হারকিউলিস, CA, USA); DU-650 প্রোটিন বিশ্লেষক (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA); 5417R হাই-স্পিড রেফ্রিজারেটেড সেন্ট্রিফিউজ (এপেনডর্ফ, হামবুর্গ, জার্মানি); SXQM ডুয়াল প্ল্যানেটারি বল মিল (চাংশা, টেনকান পাউডার টেকনোলজি কোং, লিমিটেড, হুনান, চীন); MM400 মিক্সার মিল (Retsch GmbH, Haan, Germany); Agilent 1200 হাই-পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); পাওয়ারপ্যাক বেসিক ইলেক্ট্রোফোরেসিস, পাওয়ারপ্যাক বেসিক ট্রান্সমেমব্রেন ট্রান্সফার সিস্টেম, ইউনিভার্সাল হুড II কেমিলুমিনেসেন্স ইমেজার, S1000 থার্মাল সাইক্লার আরএনএ রিভার্স ট্রান্সক্রিপশন সিস্টেম (বায়ো-র্যাড); Motic Med 6.0 টিস্যু এবং সেল ইমেজ বিশ্লেষণ সিস্টেম (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, China)।

প্রস্তুতিগ. টিউবুলোসান্যানোপাউডার

সি. টিউবুলোসার ওজন করা হয়েছিল, তারপর শুদ্ধ এবং ডিহাইড্রেট করা হয়েছিল। প্রচলিত পালভারাইজেশনের পরে, সি. টিউবুলোসা সূক্ষ্ম পাউডার একটি 200-জাল চালনি দিয়ে এবং ফ্রিজে শুকানো হয়েছিল। সি. টিউবুলোসা ন্যানোপাউডার প্রস্তুত করতে একটি তাপমাত্রা-নিয়ন্ত্রিত ভ্যাকুয়াম এবং উচ্চ-শক্তি বল মিল ব্যবহার করা হয়েছিল। প্রথমত, কাঁচা সি. টিউবুলোসা ন্যানোপাউডার একটি ভ্যাকুয়াম বল-মিলিং ট্যাঙ্কে স্থাপন করা হয়েছিল যা কার্বাইড গ্রাইন্ডিং বল দিয়ে লোড করা হয়েছিল। গ্রাইন্ডিং বল এবং সি. টিউবুলোসা ন্যানোপাউডারের মধ্যে অনুপাত 15:1 থেকে 5:1 পর্যন্ত। একটি সূক্ষ্ম পাউডার পেতে, উচ্চ-শক্তি বল মিলের গতি এবং সময়কাল যথাক্রমে 300 rpm এবং 20 মিনিটে সেট করা হয়েছিল। ন্যানোস্কেল সামগ্রীর প্রক্রিয়াকরণের জন্য সূক্ষ্ম পাউডারটি ওজন করা হয়েছিল এবং 25/s এর ফ্রিকোয়েন্সি এবং তিনটি পুনরাবৃত্তির জন্য 20s এর দোলন সহ মিক্সার মিলে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল। PBS একটি 25 mg/mL স্টক দ্রবণ দ্রবীভূত করতে এবং প্রস্তুত করতে ব্যবহার করা হয়েছিল, তারপরে 30 মিনিটের আল্ট্রাসোনিকেশন, অটোক্লেভিং এবং অবশেষে −20◦C তাপমাত্রায় স্টোরেজ করা হয়েছিল।

এর সক্রিয় উপাদানের গুণমান নিয়ন্ত্রণগ. টিউবুলোসাHPLC দ্বারা

ECH এবং VER-তে ফিলার হিসাবে অক্টাডেসিলসিলেন-বন্ডেড সিলিকা সহ গ্রেডিয়েন্ট ইলিউশন রয়েছে, মোবাইল ফেজ A হিসাবে মিথানল এবং মোবাইল ফেজ B হিসাবে 0.1% ফর্মিক অ্যাসিড দ্রবণ রয়েছে। সনাক্তকরণ তরঙ্গদৈর্ঘ্য ছিল 330 nm। আইসিএ-তে গ্রেডিয়েন্ট ইলিউশন ছিল অক্টাডেসিলসিলেন-বন্ডেড সিলিকা ফিলার হিসেবে এবং অ্যাসিটোনিট্রিল-ওয়াটার (30:70) মোবাইল ফেজ হিসেবে। সনাক্তকরণ তরঙ্গদৈর্ঘ্য ছিল 270 এনএম। পরীক্ষার জন্য নমুনা, নিয়ন্ত্রণ এবং নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ প্রতিটি 10 ​​μL হিসাবে পরিমাপ করা হয়েছিল।

সেল কালচার এবং MPP এর কার্যকারিতা পরিমাপের জন্য MTT অ্যাস+- চিকিত্সা কোষ

MES23.5 কোষগুলিকে 5% ভ্রূণ বাছুরের সিরাম, 1% গ্লুটামিন, 2% 50× সাটোর দ্রবণ এবং 2% পেনিসিলিন/স্ট্রেপ্টোমাইসিন সহ DMEM/F12 মিডিয়াম দিয়ে টিকা দেওয়া হয়েছিল। তারা একটি 5% CO2 ইনকিউবেটরে স্যাচুরেটেড আর্দ্রতা সহ 37◦C তাপমাত্রায় সেদ্ধ করা হয়েছিল। কোষগুলিকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং 0.25% ট্রিপসিন দিয়ে পাস করা হয়েছিল এবং কোষের সাসপেনশন লগারিদমিক বৃদ্ধির পর্যায়ে সংগ্রহ করা হয়েছিল। 1 × 105 ঘনত্বের বিচ্ছিন্ন কোষগুলিকে পলিলাইসিন-কোটেড 96-ওয়েল প্লেটে বীজ দেওয়া হয়েছিল, তারপরে বিভিন্ন চূড়ান্ত ঘনত্ব (6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 এবং 800 μmol/L) যোগ করা হয়েছিল ) MPP+ মিডিয়ার। MES23.5 কোষগুলি যেগুলি 24 ঘন্টা এবং 48 ঘন্টার জন্য স্বাভাবিক সংস্কৃতি মাধ্যমের সাথে ইনকিউবেট করা হয়েছিল সেগুলি ইন ভিট্রো পরীক্ষায় নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। বিভিন্ন চিকিত্সা গোষ্ঠীর কোষগুলি 4 ঘন্টার জন্য এমটিটি রিএজেন্ট দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। কূপের দ্রবণটি পরবর্তীতে বাতিল করা হয় এবং 150 μL DMSO যোগ করা হয় এবং 10 মিনিটের জন্য দোলা দেওয়া হয়। 570 এনএম তরঙ্গদৈর্ঘ্যে প্রতিটি নমুনার শোষণ একটি স্বয়ংক্রিয় মাইক্রোপ্লেট রিডার ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল। কোষের কার্যক্ষমতার শতাংশ (%)=মানে পরীক্ষামূলক গোষ্ঠীর শোষণ/নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর গড় শোষণ × 100%।

MPP+ মাধ্যমের প্রাসঙ্গিক ঘনত্ব MES23.5 কোষে 24-ঘন্টা চিকিত্সার জন্য যোগ করা হয়েছিল যেটি ভিট্রো সংস্কৃতির জন্য একই পদ্ধতি ব্যবহার করে। চিকিত্সার পরে, কূপে দ্রবণটি ফেলে দেওয়া হয়েছিল। C. টিউবুলোসা ন্যানোপাউডারের বিভিন্ন ঘনত্ব (10, 50, 100, 200, 250, 500, এবং 1000 µg/mL) সম্বলিত মিডিয়া বিভিন্ন কূপের MES23.5 কোষে যোগ করা হয়েছিল এবং 24 ঘন্টা এবং 48 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করার জন্য রেখে দেওয়া হয়েছিল। MES23.5 কোষগুলি যেগুলি 24 ঘন্টা এবং 48 ঘন্টার জন্য স্বাভাবিক সংস্কৃতি মাধ্যমের সাথে ইনকিউবেট করা হয়েছিল সেগুলি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। MES23.5 কোষগুলি যেগুলি MPP+ মাধ্যম দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল সেগুলি যানবাহন হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। প্রতিটি নমুনার জন্য পরিমাপ তিন প্রতিলিপিতে করা হয়েছিল। কোষের কার্যকারিতা গণনা করতে সংশ্লিষ্ট চিকিত্সা এবং নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর শোষণ পরিমাপ করা হয়েছিল।

ন্যাচারাল সিস্টানচে টিউবুলোসা এক্সট্র্যাক্ট অ্যান্টি ফ্যাটিগ PHGS75% ECH 30% অ্যাক্ট 12%

TH এক্সপ্রেশন ইমিউনোসাইটোকেমিস্ট্রি দ্বারা পরিমাপ করা হয়

যখন সি. টিউবুলোসা ন্যানোপাউডার ছিল 100, 200, এবং 250 μg/ml, কোষ বেঁচে থাকার হার উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পায় (চিত্র 2G)। এইভাবে, পরবর্তী পরীক্ষাগুলিতে, আমরা তিনটি ঘনত্ব পরীক্ষা করেছি: নিম্ন-ডোজ, মধ্য-ডোজ এবং উচ্চ-ডোজ গ্রুপ। প্রতিটি সি. টিউবুলোসা গ্রুপের জন্য তিনটি প্রতিলিপি পরীক্ষা করা হয়েছিল। জীবাণুমুক্ত, পলিলাইসিন-কোটেড কভারস্লিপগুলিকে 6-ওয়েল প্লেটে রাখা হয়েছিল৷ এরপরে, প্রতিটি কূপে 5 × 104 কোষ বীজ করা হয়েছিল এবং 24 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল। প্রচলিত তাজা মাধ্যমটিকে স্বাভাবিক নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীতে প্রতিস্থাপিত করা হয়েছিল এবং 100 μmol/L MPP+ মাধ্যমের চূড়ান্ত ঘনত্বকে 24 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করার জন্য অবশিষ্ট চিকিত্সা গ্রুপগুলিতে প্রতিস্থাপন করা হয়েছিল। প্রচলিত তাজা মিডিয়া তখন স্বাভাবিক নিয়ন্ত্রণ এবং যানবাহন গোষ্ঠীতে প্রতিস্থাপিত হয় এবং 100, 200, এবং 250 μg/mL C এর চূড়ান্ত ঘনত্ব। টিউবুলোসা ন্যানোপাউডার কম, মাঝারি- এবং উচ্চ-ডোজে 24 ঘন্টার জন্য কোষের সাথে ইনকিউব করা হয়। সি. টিউবুলোসা চিকিত্সা গ্রুপ, যথাক্রমে। বিভিন্ন গোষ্ঠীর MES23.5 কোষগুলি PBS-এ সুপারন্যাট্যান্ট অপসারণের জন্য তিনবার ধুয়ে 15 মিনিটের জন্য 4% প্যারাফর্মালডিহাইডে আরও স্থির করা হয়েছিল। পিবিএস দিয়ে ধোয়ার পরে, কোষগুলিকে পেরোক্সিডেস ব্লকার দিয়ে 37◦C তাপমাত্রায় 30 মিনিটের জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল এবং তারপরে পিবিএস দিয়ে আবার ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল। একটি 0.2% ট্রাইটন এক্স-100 দ্রবণ 10 মিনিটের জন্য কোষের ব্যাপ্তিকরণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল, তারপরে পিবিএস দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। প্রতিটি নমুনায় সাধারণ ছাগলের সিরাম যোগ করা হয়েছিল এবং 30 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউব করা হয়েছিল। তারপরে সাধারণ ছাগলের সিরামটি সরানো হয়েছিল এবং PBS-তে 1:400 মিশ্রিত প্রাথমিক অ্যান্টিবডি প্রতিটি নমুনায় যোগ করা হয়েছিল এবং রাতারাতি 4◦C তাপমাত্রায় ইনকিউব করা হয়েছিল। নেতিবাচক কন্ট্রোল গ্রুপের কোষগুলি রাতারাতি 4◦C তাপমাত্রায় পিবিএস দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। পিবিএস দিয়ে ধোয়ার পরে, কোষগুলিকে 20 মিনিটের জন্য 37◦C তাপমাত্রায় আর্দ্রতা চেম্বারে বায়োটিন-লেবেলযুক্ত সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। তারপরে প্রতিটি নমুনা পিবিএস-এ ধুয়ে 20 মিনিটের জন্য 37◦C তাপমাত্রায় হর্সরাডিশ পেরোক্সিডেস-স্ট্রেপ্টাভিডিন কনজুগেটস (ওয়ার্কিং সলিউশন সি) দিয়ে লেবেল করা হয়েছিল। পিবিএস দিয়ে ধোয়ার পরে, কোষগুলি প্রায় 1-10 মিনিটের জন্য অন্ধকারে ডিএবি বিকারক দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল এবং হালকা মাইক্রোস্কোপির অধীনে একটি বাদামী রঙের বিকাশ পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। তারপরে প্রতিটি নমুনা 1-2 মিনিটের জন্য পাতিত জলে দুবার ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল এবং নিউক্লিয়াসকে 0.5-1 মিনিটের জন্য হেমাটোক্সিলিন দ্রবণ দিয়ে পাল্টা স্টেইন করা হয়েছিল। প্রতিটি নমুনা জলে পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে ধুয়ে ফেলার পরে, কোষগুলিকে পার্থক্যের জন্য 1% হাইড্রোক্লোরিক অ্যাসিড অ্যালকোহল এবং 1% জলীয় অ্যামোনিয়াতে ডুবিয়ে দেওয়া হয়েছিল, তারপরে জলে কোষগুলিকে পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। প্রতিটি নমুনা থেকে কোষগুলি তখন 2 মিনিটের জন্য 70% ইথানল, 2 মিনিটের জন্য 80% ইথানল, 2 মিনিটের জন্য 90% ইথানল, দুবার 2 মিনিটের জন্য 95% ইথানল এবং 2 মিনিটের জন্য 2 বার 100% ইথানলে পানিশূন্য করা হয়েছিল। কোষগুলিকে তখন 2 মিনিটের জন্য জাইলিন দ্রবণে দুবার নিমজ্জিত করা হয়েছিল এবং নিরপেক্ষ রেজিন সহ একটি কাচের স্লাইডে মাউন্ট করা হয়েছিল। হালকা মাইক্রোস্কোপির অধীনে, প্রতিটি নমুনা বাদামী কণার তীব্রতা দ্বারা নির্দেশিত ডোপামিনার্জিক নিউরনে নির্বাচিত প্রোটিনের অভিব্যক্তি নির্ধারণ করতে এবং গড় ধূসর মান দ্বারা প্রোটিনের সামগ্রীকে আধা-পরিমাণ করতে 5-10টি কার্যকর ভিজ্যুয়াল ফিল্ডের ইমেজ ক্যাপচারিং এবং এলোমেলো নির্বাচন করে। .

ফ্লো সাইটোমেট্রি দ্বারা পরিমাপিত MES23.5 কোষের অ্যাপোপটোসিস হার

অনুগত কোষগুলি একবার পিবিএস দিয়ে ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল। কোষ বিচ্ছিন্নতার জন্য, ঘরের তাপমাত্রায় উপযুক্ত পরিমাণে ইডিটিএ-মুক্ত ট্রিপসিন দ্রবণ যোগ করা হয়েছিল এবং অনুগত কোষগুলিকে বিচ্ছিন্ন করার অনুমতি দেওয়ার জন্য দ্রবণটি আলতো করে পাইপেটেড করা হয়েছিল। তারপরে ট্রিপসিনাইজেশন বন্ধ করতে একটি কোষ সংস্কৃতি মাধ্যম যুক্ত করা হয়েছিল। মিশ্রণটি একটি নতুন সেন্ট্রিফিউজ টিউবে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল এবং তারপর বিচ্ছিন্ন কোষগুলি সংগ্রহ করতে 1500 rpm এ 5 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। সুপারনাট্যান্ট বর্জন করার পরে, সেল পেলেটটি পিবিএস ব্যবহার করে আলতো করে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং কোষগুলি গণনা করা হয়েছিল। আনুমানিক 1 × 105 থেকে 5 × 105 পুনরুদ্ধার করা কোষগুলিকে 1500 rpm-এ 5 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং সুপারনাট্যান্ট বাতিল করা হয়েছিল। অ্যানেক্সিন ভি-এফআইটিসি বাইন্ডিং সলিউশনের পাঁচটি মাইক্রোলিটার সেল পেলেটে আলতোভাবে কোষগুলিকে পুনরায় সাসপেন্ড করতে যোগ করা হয়েছিল। অ্যানেক্সিন V-FITC এর আরও 5 μL যোগ করা হয়েছিল এবং পুঙ্খানুপুঙ্খভাবে মিশ্রিত করা হয়েছিল। প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড দ্রবণের পাঁচ মাইক্রোলিটার ফ্লো সাইটোমেট্রির কিছুক্ষণ আগে 10 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউব করে কোষের দাগের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল।

জন্য ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণভিট্রোতে

কোষগুলিকে একটি সাধারণ গ্রুপে বিভক্ত করা হয়েছিল, এমপিপি + চিকিত্সা গ্রুপ, কম ডোজগ. টিউবুলোসাচিকিত্সা গ্রুপ, মাঝারি-ডোজ সি. টিউবুলোসা চিকিত্সা গ্রুপ, এবং উচ্চ-ডোজ সি. টিউবুলোসা চিকিত্সা গ্রুপ। Bcl2 এবং Bax এর অভিব্যক্তি প্রতিটিতে পরিমাপ করা হয়েছিল। কোষ সংগ্রহের আগে প্রতিটি গ্রুপে মডেলিং এবং চিকিত্সার জন্য 6-কূপ প্লেটে মোট 1 × 10প্রতি কূপের 5টি কোষ ব্যবহার করা হয়েছিল। RIPA বাফার, প্রোটেজ ইনহিবিটর এবং ফসফেটেজ ইনহিবিটর সমন্বিত একটি মিশ্র লাইসেট, বরফের উপর 30 মিনিটের জন্য কোষগুলিকে লাইজ করার জন্য যোগ করা হয়েছিল। সেন্ট্রিফিউগেশনের পরে, প্রোটিন বিশ্লেষণের জন্য সুপারনাট্যান্ট ব্যবহার করা হয়েছিল। মোট প্রোটিন একটি বিসিএ অ্যাস ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল এবং 10% SDS-PAGE দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল। পৃথক করা প্রোটিনগুলিকে একটি ঝিল্লিতে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল এবং 2 ঘন্টার জন্য ঘরের তাপমাত্রায় 5% স্কিম মিল্ক-ব্লকিং বাফার দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। তারপরে ঝিল্লিটি প্রাথমিক অ্যান্টিবডিতে (Bcl-2 0.34 mg/ml, Bax 0.11 mg/ml, 1:200 dilution) 4◦C তাপমাত্রায় রাতারাতি ইনকিউব করা হয়েছিল। একটি ধোয়ার ধাপের পরে, ঝিল্লিটিকে একটি সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (0.5 মিলিগ্রাম/মিলি, 1:5000 ডিলিউশন) 4◦C তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য এবং তারপরে প্রচলিত বিকাশের জন্য 2 মিনিটের জন্য ECL ডেভেলপারে ইনকিউব করা হয়েছিল। প্রোটিন এক্সপ্রেশনের আধা-পরিমাণগত বিশ্লেষণের জন্য কোয়ান্টিটি ওয়ান সফ্টওয়্যার ব্যবহার করা হয়েছিল।

ন্যাচারাল সিস্টানচে টিউবুলোসা ফর অ্যান্টি ফ্যাটিগু প্রটেক্ট লিভার PHGS75% ECH 30% ACT 12%

পরীক্ষামূলক প্রাণী মডেলিং এবং ওষুধ প্রশাসন

পঞ্চাশটি নির্দিষ্ট-প্যাথোজেন-মুক্ত 8-সপ্তাহ-বয়সী পুরুষ ইঁদুরকে এলোমেলোভাবে পাঁচটি গ্রুপে বিভক্ত করা হয়েছিল: একটি সাধারণ গ্রুপ, MPTP চিকিত্সা গ্রুপ (যান), লো-ডোজ সি. টিউবুলোসা ট্রিটমেন্ট গ্রুপ, মাঝারি ডোজ সি. টিউবুলোসা চিকিত্সা গ্রুপ, এবং উচ্চ-ডোজ সি. টিউবুলোসা চিকিত্সা গ্রুপ। প্রাণীদের 20-22◦C তাপমাত্রায় খাবার এবং জলের বিনামূল্যে প্রবেশাধিকারের সাথে রাখা হয়েছিল। সাধারণ গ্রুপের ইঁদুরগুলিকে টানা সাত দিন ধরে সমান পরিমাণে সাধারণ স্যালাইনের সাথে ইন্ট্রাপেরিটোনলি ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। অন্যান্য চিকিত্সা গ্রুপের ইঁদুরগুলিকে গাড়ি স্থাপনের জন্য টানা সাত দিন MPTP (30 mg/kg/d) দিয়ে ইন্ট্রাপেরিটোনলি ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল।

পিডি মডেলিংয়ের সময়, কম-ডোজ, মাঝারি-ডোজ, এবং উচ্চ-ডোজ সি. টিউবুলোসা ট্রিটমেন্ট গ্রুপের ইঁদুরগুলিকে ইন্ট্রাগাস্ট্রিকভাবে 4 g/kg/d, 8 g/kg/d, এবং 16 g/ এর সমতুল্য ক্লিনিকাল ভলিউম দেওয়া হয়েছিল। কেজি/ডিC. টিউবুলোসা ন্যানোপাউডার, যথাক্রমে, টানা 14 দিনের জন্য। নিয়ন্ত্রণ এবং যানবাহন গোষ্ঠীর ইঁদুরগুলিকে টানা 14 দিন ধরে সাধারণ স্যালাইনের সমান পরিমাণে ইনট্রাগাস্ট্রিকভাবে পরিচালিত হয়েছিল। সমস্ত পরীক্ষামূলক পদ্ধতি টিসিএমের ফুজিয়ান বিশ্ববিদ্যালয়ের নৈতিক কমিটি দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল এবং পরীক্ষাগার প্রাণীর ব্যবহার এবং যত্নের জন্য আন্তর্জাতিকভাবে স্বীকৃত নীতি অনুসারে সঞ্চালিত হয়েছিল। এই গবেষণায় পশুদের কষ্ট কমানোর জন্য সমস্ত প্রচেষ্টা করা হয়েছিল।