Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides H22 হেপাটোসেলুলার কার্সিনোমা কোষে বাহ্যিক এবং অভ্যন্তরীণ সিগন্যালিং পাথওয়ের মাধ্যমে অ্যাপোপটোসিসকে প্ররোচিত করে

যোগাযোগ: অড্রে হু হোয়াটসঅ্যাপ/এইচপি: 0086 13880143964 ইমেল:audrey.hu@wecistanche.com

পেংফেই ইউয়ান, জিনিউ লি, আদিলা আইপিয়ার, ই ইয়াং, লিজি জিয়া, সিনহুই ওয়াং, ইজি লি এবং জিনিয়াও লি

বিমূর্ত

পটভূমি:Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight হল একটি ঐতিহ্যবাহী চীনা ওষুধ যা Tamarix উদ্ভিদের শিকড়কে পরজীবী করে এবং পুরুষ পুরুষত্বহীনতা, বন্ধ্যাত্ব, শরীরের দুর্বলতা এবং টনিক হিসেবে ব্যবহার করা হয়। যাইহোক, হেপাটোসেলুলার কার্সিনোমার উপর এর টিউমারের প্রভাব এখনও অধরা। এখানে, আমরা এর অ্যান্টিটিউমার প্রভাব তদন্ত করেছিC. টিউবুলোসা ফেনাইলেথানয়েড গ্লাইকোসাইড(CTPG) H22 হেপাটোসেলুলার কার্সিনোমা কোষে ভিট্রো এবং ভিভো উভয় ক্ষেত্রে এবং এর প্রক্রিয়া। পদ্ধতি: H22 কোষের রূপবিদ্যা, কার্যক্ষমতা, অ্যাপোপটোসিস, কোষ চক্র এবং মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেন পটেনশিয়াল (Δψm) যথাক্রমে ইনভার্টেড মাইক্রোস্কোপি, এমটিটি অ্যাস এবং ফ্লো সাইটোমেট্রি দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। অ্যাপোপটোসিস পাথওয়েতে প্রোটিনের অভিব্যক্তি এবং সক্রিয়করণ ওয়েস্টার্ন ব্লট দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল। পুরুষ কুনমিং ইঁদুর ব্যবহার করে প্রতিষ্ঠিত টিউমার মাউস মডেলে ভিভো অ্যান্টিটিউমার প্রভাব মূল্যায়ন করা হয়েছিল। ফলাফল: CTPG চিকিত্সা ডোজ- এবং সময়-নির্ভর পদ্ধতিতে H22 কোষের বৃদ্ধিকে উল্লেখযোগ্যভাবে দমন করে, যা G0/G1 এবং G2/M পর্যায়ে বর্ধিত অ্যাপোপটোসিস এবং কোষ চক্র গ্রেপ্তারের সাথে সম্পর্কিত ছিল। অধিকন্তু, CTPG-চিকিত্সা করা H22 কোষগুলিতে ক্রোমোসোমাল ঘনীভবন পরিলক্ষিত হয়েছিল। CTPG চিকিত্সা উল্লেখযোগ্যভাবে Bax/ Bcl-2 অনুপাত বাড়িয়েছে, Δψm কমিয়েছে, এবং সাইটোক্রোম c-এর মুক্তিকে উন্নত করেছে। ক্লিভড ক্যাসপেস-8 এবং ক্যাসপেস-9 উভয় বাহ্যিক এবং অভ্যন্তরীণ সিগন্যালিং পাথওয়েতে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি করা হয়েছিল যে ক্রমানুসারে সক্রিয় ক্যাসপেস-7 এবং -3 PARP ক্লিভ করার জন্য। অবশেষে, CTPG (সিস্তানচেটিউবুলোসাphenylethanoid glycosides) ইঁদুরের H22 কোষের বৃদ্ধিকে বাধা দেয় এবং টিউমার ইঁদুরের বেঁচে থাকার হার উন্নত করে। উপসংহার: এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে CTPG বহিরাগত এবং অভ্যন্তরীণ অ্যাপোপটোসিস উভয় পথের মাধ্যমে H22 কোষের বৃদ্ধিকে দমন করেছে।

পটভূমি

লিভার ক্যান্সার ক্যান্সারের ঘটনাগুলির জন্য ষষ্ঠ এবং বিশ্বব্যাপী ক্যান্সারের মৃত্যুর জন্য চতুর্থ স্থানে রয়েছে। অধিকন্তু, এটি ক্যান্সারের ঘটনাগুলির জন্য চতুর্থ এবং কম আর্থসামাজিক সূচক সহ দেশগুলিতে ক্যান্সারের মৃত্যুর জন্য প্রথম স্থানে রয়েছে [1]। চীনে, লিভার ক্যান্সার 2015 সালে ক্যান্সারজনিত মৃত্যুর তৃতীয় প্রধান কারণ। প্রাথমিক লিভার ক্যান্সারের 90 শতাংশেরও বেশি বিশ্বে হেপাটোসেলুলার কার্সিনোমা (HCC) [3]। বর্তমানে, এইচসিসি থেরাপির প্রধান বিকল্প হল হেপাটিক রিসেকশন। যাইহোক, এইচসিসি আক্রান্ত 30 শতাংশেরও কম রোগী নিরাময়মূলক হেপাটিক রিসেকশনের মাপকাঠি পূরণ করে, এবং উচ্চ পুনরাবৃত্তি হারের কারণে সামগ্রিক 5- বছরের বেঁচে থাকার হার এখনও 35-50 শতাংশের মতো কম [৪, ৫ ]। মধ্যবর্তী থেকে উন্নত HCC রোগীদের জন্য চিকিত্সার বিকল্পগুলির প্রাপ্যতা খুব সীমিত। সোরাফেনিব, একটি আণবিকভাবে লক্ষ্যযুক্ত ওষুধ, এফডিএ দ্বারা উন্নত HCC-এর প্রথম-সারির চিকিত্সা হিসাবে অনুমোদিত হয়েছে। যাইহোক, সোরাফেনিব শুধুমাত্র 3 মাস বেঁচে থাকার সময়কে দীর্ঘায়িত করে এবং প্রতিক্রিয়া হার 4 শতাংশের কম [6, 7]। এইচসিসির বিরুদ্ধে নতুন ওষুধ বা কৌশল তৈরি করা জরুরি। ঐতিহ্যগত চীনা ওষুধ (টিসিএম) একা বা অন্যান্য কৌশলগুলির সাথে একত্রে এইচসিসির চিকিত্সার জন্য ব্যবহার করা হয়েছে এবং দীর্ঘকাল বেঁচে থাকার সময়, উন্নত জীবন মানের, প্রতিকূল প্রতিক্রিয়া হ্রাস এবং আরও [8, 9] সহ ক্লিনিকাল সুবিধাগুলি দেখানো হয়েছে।সিস্তানচে, এক ধরনের TCM, বিভিন্ন জৈবিক ফাংশন আছে, যেমনঅ্যান্টি-অক্সিডেশন, অ্যান্টি-প্রদাহ, অ্যান্টি-এজিং,এবং নিউরোপ্রোটেকশন [10, 11]। Phenylethanoid glycosides প্রধান সক্রিয় উপাদান হিসাবে বিবেচিত হয়েছেসিস্তানচে, যার মধ্যে অ্যান্টি-অক্সিডেশন, অ্যান্টি-ইনফ্লেমেশন, হেপাটোপ্রোটেকশন এবং নিউরোপ্রোটেকশন সহ বিভিন্ন ক্রিয়াকলাপ রয়েছে [12-15]। আমাদের গ্রুপ এমনটি জানিয়েছেCistanche tubulosa phenylethanoid glycosides(CTPG) মেলানোমা B16-F10 কোষে অ্যাপোপটোসিস প্ররোচিত করতে পারে এবং ইঁদুরের টিউমারের বৃদ্ধিকে বাধা দিতে পারে [16]। এই গবেষণায়, আমরা ভিট্রো এবং ভিভো উভয় ক্ষেত্রেই এইচসিসি এইচ 22 কোষে সিটিপিজির অ্যান্টিটিউমার প্রভাব পরিমাপ করেছি এবং এর প্রক্রিয়াগুলি তদন্ত করেছি। আমরা দেখতে পেয়েছি যে CTPG বহিরাগত এবং অভ্যন্তরীণ উভয় সিগন্যালিং পথের মাধ্যমে H22 কোষে অ্যাপোপটোসিস প্ররোচিত করেছে এবং ইঁদুরের H22 টিউমারের বৃদ্ধিকে দমন করেছে।

পদ্ধতি

সেল লাইন

মাউস H22 হেপাটোসেলুলার কার্সিনোমা কোষগুলি জিনজিয়াং কী ল্যাবরেটরি অফ বায়োলজিক্যাল রিসোর্সেস অ্যান্ড জেনেটিক ইঞ্জিনিয়ারিং, জিনজিয়াং ইউনিভার্সিটি (উরুমকি, জিনজিয়াং, চীন) থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল এবং RPMI 1640 মাঝারি (Gibco) 100 U/ml পেনিসিল এবং 100 মিলি পেনিসিল দিয়ে পরিপূরক করা হয়েছিল। স্ট্রেপ্টোমাইসিন, এবং 5 শতাংশ CO2 এর আর্দ্র বায়ুমণ্ডলে 37 ডিগ্রিতে 10 শতাংশ তাপ-নিষ্ক্রিয় ভ্রূণের বোভাইন সিরাম (Gibco)।

এমটিটি পরীক্ষা

CTPG Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. (Hetian, Xinjiang, China) থেকে ক্রয় করা হয়েছিল এবং CTPG-এর প্রধান যৌগগুলি উচ্চ-পারফরম্যান্স লিকুইড ক্রোমাটোগ্রাফি দ্বারা যোগ্য এবং পরিমাপ করা হয়েছিল [16]। কোষের কার্যক্ষমতা মূল্যায়ন করা হয়েছিল 3- (4, 5-ডাইমেথাইলথিয়াজল-2-yl)-2, 5-ডিফেনিল্টেট্রাজোলিয়াম ব্রোমাইড (এমটিটি) (সিগমা, সেন্ট লুইস, এমও , USA) পরীক্ষা। H22 কোষগুলিকে 2 × 1 ঘনত্বে 96-কূপ প্লেটগুলিতে টিকা দেওয়া হয়েছিল0100 ul মাঝারি প্রতি কূপে 4 কোষে এবং 37 ডিগ্রিতে সংষ্কৃত করা হয়েছিল। 24 ঘন্টা পরে, কোষগুলিকে যথাক্রমে 24, 48 এবং 72 ঘন্টার জন্য CTPG (0, 100, 200, 300 এবং 400 ug/ml) বা 0.3 শতাংশ DMSO (400 ug/ml CTPG এর সমান) এর বিভিন্ন ঘনত্বের সাথে চিকিত্সা করা হয়েছিল। . 7 মিনিটের জন্য 1000 rpm-এ সেন্ট্রিফিউগেশনের পরে, সুপারনাট্যান্টটি বাতিল করা হয়েছিল এবং প্রতিটি কূপে 100 ul MTT দ্রবণ (PBS-এ 5 mg/ml) যোগ করা হয়েছিল। প্লেটগুলি 4 ঘন্টার জন্য 37 ডিগ্রীতে ইনকিউবেট করা হয়েছিল এবং গঠিত ফর্মাজান স্ফটিকগুলিকে দ্রবীভূত করার জন্য 100 উল DMSO যোগ করা হয়েছিল। OD490 মানগুলি একটি 96- ওয়েল মাইক্রোপ্লেট রিডার (বায়ো-রাড ল্যাবরেটরিজ, CA, USA) দ্বারা সনাক্ত করা হয়েছিল৷ কোষের কার্যকারিতা সূত্র অনুসারে গণনা করা হয়েছিল: কোষের কার্যকারিতা ( শতাংশ )=(ODtreated/ODuntreated) × 100 শতাংশ।

অ্যাপোপটোসিস সনাক্তকরণ

H22 কোষগুলিকে CTPG এর বিভিন্ন ঘনত্ব (0, 100, 200, 300, এবং 400 ug/ml) বা 0.3 শতাংশ DMSO 24 ঘন্টার জন্য চিকিত্সা করা হয়েছিল, এবং তারপর Annexin V FITC/ দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড (পিআই) অ্যাপোপটোসিস সনাক্তকরণ কিট (ইয়েসেন, চীন)। নমুনাগুলি ফ্লো সাইটোমেট্রি (BD FACSCalibur, USA) দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেন সম্ভাব্য সনাক্তকরণ

H22 কোষগুলিকে 24 ঘন্টার জন্য CTPG (0, 200, এবং 400 ug/ml) এর বিভিন্ন ঘনত্বের সাথে চিকিত্সা করা হয়েছিল, এবং তারপর 20 এর জন্য ঝিল্লি-ভেদ্য JC-1 রঞ্জক (Beyotime, China) দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল 37 ডিগ্রিতে মিনিট JC-1 বাফার দিয়ে দুবার ধোয়ার পর, নমুনাগুলিকে 300 ul JC-1 বাফার দিয়ে পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং ফ্লো সাইটোমেট্রি (BD FACSCalibur, USA) দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল৷

কোষ চক্রের বিশ্লেষণ

H22 কোষগুলিকে 60 মিমি কালচার ডিশে ইনোকুলেশন করা হয়েছিল এবং CTPG এর বিভিন্ন ঘনত্ব (0, 100, 200, 300 এবং 400 ug/ml) বা 0.3 শতাংশ DMSO দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল 24 ঘন্টা। সমস্ত কোষ সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং পিবিএস দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। কোষগুলিকে 2 ঘন্টার জন্য −20 ডিগ্রিতে 70 শতাংশ বরফ-ঠান্ডা ইথানলে স্থির করা হয়েছিল এবং পিবিএস দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল, তারপর 300 উল প্রোপিডিয়াম আয়োডাইড/আরএনএস স্টেনিং বাফারে (বিডি বায়োসায়েন্সেস) পুনরায় স্থগিত করা হয়েছিল। ঘরের তাপমাত্রায় 10 মিনিটের পরে, ফ্লো সাইটোমেট্রি (BD FACSCalibur, USA) দ্বারা নমুনা সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং ModFit LT 3.0 সফ্টওয়্যার দিয়ে সেল চক্র বন্টন বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

Hoechst 33,258 staining

H22 কোষের নিউক্লিয়াসের রূপগত পরিবর্তনগুলি ঝিল্লি-ভেদ্য ডিএনএ-বাইন্ডিং ডাই হোচেস্ট 33,258 স্টেনিং দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। H22 কোষগুলিকে একটি 6-কূপ প্লেটে 1 × 1 এর ঘনত্বে05 কোষ/কূপে 2 মিলি মিডিয়ামে বীজ দেওয়া হয়েছিল। 60 শতাংশ ~ 70 শতাংশ সঙ্গমের পরে, কোষগুলিকে 24 ঘন্টার জন্য CTPG (0, 100, 200, 300 এবং 400 ug/ml) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। কোষগুলিকে 10 মিনিটের জন্য 4 ডিগ্রিতে 4 শতাংশ বরফ-ঠান্ডা প্যারাফর্মালডিহাইড দিয়ে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং স্থির করা হয়েছিল। পিবিএস দিয়ে ধোয়ার পরে, কোষগুলি 10 মিনিটের জন্য 4 ডিগ্রিতে Hoechst 33,258 (Beyotime, China) দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল। নমুনাগুলি একটি উল্টানো ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ (নিকন ইক্লিপস টি-ই, জাপান) দ্বারা পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।

পশ্চিম ফোঁটার

অ্যান্টি-ক্যাসপেস-3, অ্যান্টি-ক্লিভড ক্যাসপেস-3, অ্যান্টি-বিসিএল-2, এবং অ্যান্টি-ব্যাক্স কেনা হয়েছিল Beyotime Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China) থেকে। অ্যান্টি-ক্যাসপেস-7, অ্যান্টি-ক্লিভড-ক্যাসপেস-7, অ্যান্টি-ক্যাসপেস-8, অ্যান্টি-ক্লিভড-ক্যাসপেস-8, অ্যান্টি-ক্যাসপেস-9, অ্যান্টি -ক্লিভড-ক্যাস্পেস-9, অ্যান্টি-PARP, অ্যান্টি-ক্লিভড PARP, অ্যান্টি-মাউস IgG-HRP, এবং অ্যান্টি-র্যাবিট IgG-HRP সেল সিগন্যালিং প্রযুক্তি থেকে কেনা হয়েছিল৷ অ্যান্টি- -অ্যাক্টিন বেইজিং কমউইন বায়োটেক কোং লিমিটেড (বেইজিং, চীন) থেকে কেনা হয়েছিল।

H22 কোষগুলি 24 ঘন্টার জন্য CTPG (0, 100, 200, 300 এবং 400 ug/ml) বা 0.3 শতাংশ DMSO এর বিভিন্ন ঘনত্বের সাথে চিকিত্সা করা হয়েছিল। বরফের উপর 30 মিনিটের জন্য সেল লাইসিস সলিউশন RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) এর সাথে কোষগুলি সংগ্রহ এবং লাইজ করা হয়েছিল। সুপারন্যাট্যান্ট সংগ্রহের জন্য নমুনাগুলি (12,000 g 15 মিনিটের জন্য 4 ডিগ্রিতে) কাটা হয়েছিল এবং প্রোটিনের ঘনত্ব বিসিএ কিট (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, ইউএসএ) দ্বারা পরিমাপ করা হয়েছিল। প্রতিটি নমুনায় সমান পরিমাণ প্রোটিন 12 শতাংশ SDS-PAGE দ্বারা বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং PVDF মেমব্রেনে (বায়োশার্প, চীন) স্থানান্তরিত হয়েছিল। টিবিএসটি বাফারের সাথে ব্লক করার পরে 5 শতাংশ ননফ্যাট দুধ রয়েছে, ঝিল্লিগুলি যথাক্রমে সংশ্লিষ্ট প্রাথমিক অ্যান্টিবডি এবং সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলি হর্সরাডিশ পারক্সিডেস (এইচআরপি) এর সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল। টিবিএসটি দিয়ে ধোয়ার পর, ইসিএল অ্যাসে কিট (বিয়োটাইম, চীন) দ্বারা লক্ষ্য প্রোটিন সনাক্ত করা হয়েছিল।

প্রাণী এবং নৈতিকতা বিবৃতি

এনিম্যাল ল্যাবরেটরি সেন্টার, জিনজিয়াং মেডিকেল ইউনিভার্সিটি (উরুমকি, জিনজিয়াং, চীন) থেকে 6-8 সপ্তাহ বয়সী পুরুষ কুনমিং ইঁদুর কেনা হয়েছিল। ইঁদুরগুলিকে জিনজিয়াং বিশ্ববিদ্যালয়ের একটি আদর্শ তাপমাত্রা-নিয়ন্ত্রিত, হালকা-চক্রযুক্ত প্রাণী সুবিধায় রাখা হয়েছিল। জিনজিয়াং ইউনিভার্সিটির অ্যানিমাল কেয়ার অ্যান্ড ইউজ কমিটির নির্দেশিকা অনুসারে সমস্ত প্রাণী অধ্যয়ন করা হয়েছিল। প্রোটোকলটি জিনজিয়াং ইউনিভার্সিটির জিনজিয়াং কী ল্যাবরেটরি অফ বায়োলজিক্যাল রিসোর্সেস অ্যান্ড জেনেটিক ইঞ্জিনিয়ারিং (BRGE-AE001) এর এথিক্স অফ অ্যানিমাল এক্সপেরিমেন্টস কমিটি দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল।

টিউমার মাউস স্টাডি

টিউমার মাউস মডেলের আনয়নের জন্য, পুরুষ কুনমিং ইঁদুরকে 1 × 10100 ul PBS-এ 6 H22 কোষ দিয়ে ডান দিকের অংশে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। 3 দিন পরে, ইঁদুরগুলি এলোমেলোভাবে 3 টি গ্রুপে বিভক্ত হয়েছিল (7 ইঁদুর/গোষ্ঠী)। কন্ট্রোল গ্রুপটিকে টিউমারের চারপাশে 0.1 মিলি ডিএমএসও সাবকিউটেনিওস ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। CTPG-200 এবং CTPG- 400 গোষ্ঠীগুলিকে টিউমারের চারপাশে 0.1 মিলি ডিএমএসওতে 200 বা 400 মিলিগ্রাম/কেজি CTPG দিয়ে সাবকুটেনিয়াস ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। 21 দিন পর্যন্ত প্রতি 2 দিনে ইঁদুরের চিকিত্সা করা হয়েছিল। টিউমারের আকার 25 দিন পর্যন্ত ক্যালিপার ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল এবং টিউমারের পরিমাণ সূত্র অনুসারে গণনা করা হয়েছিল: টিউমারের পরিমাণ (mm3 )=(দৈর্ঘ্য×প্রস্থ2 )/2। 25 দিন পর, এই গবেষণা শেষ না হওয়া পর্যন্ত প্রতিদিন টিউমার ইঁদুরের বেঁচে থাকা পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল।

পরিসংখ্যান সংক্রান্ত বিশ্লেষণ

পরিসংখ্যানগত তাত্পর্য চিকিত্সা এবং নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীর মধ্যে বৈচিত্র্যের একমুখী বিশ্লেষণ দ্বারা গণনা করা হয়েছিল। সমস্ত ডেটা গড় ± স্ট্যান্ডার্ড বিচ্যুতি (SD) হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছিল। p < 0.05="" পরিসংখ্যানগতভাবে="" তাৎপর্যপূর্ণ="" বলে="" বিবেচিত="">

ফলাফল

CTPG ভিট্রোতে H22 কোষের কার্যক্ষমতা হ্রাস করেছে

HCC-তে CTPG-এর অ্যান্টিটিউমার প্রভাব অন্বেষণ করার জন্য, H22 কোষগুলিকে ভিট্রোতে CTPG (0, 100, 200, 300, এবং 400 ug/ml) এর বিভিন্ন ঘনত্বের সাথে চিকিত্সা করা হয়েছিল। 24 ঘন্টা পরে, একটি উল্টানো মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে H22 কোষের আকারবিদ্যা পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। আমরা দেখতে পেলাম যে CTPG চিকিত্সার মাধ্যমে H22 কোষের রূপবিদ্যা নাটকীয়ভাবে পরিবর্তিত হয়েছে। CTPG ঘনত্ব বৃদ্ধির সাথে, কোষগুলি ছোট এবং বৃত্তাকার হয়ে ওঠে এবং কোষের সংখ্যাও ব্যাপকভাবে হ্রাস পায় (চিত্র 1a)। এমটিটি অ্যাস যথাক্রমে 24, 48 এবং 72 ঘন্টার জন্য সিটিপিজি চিকিত্সার পরে H22 কোষগুলির কার্যকারিতা বিশ্লেষণ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। CTPG ডোজ-নির্ভর এবং সময়-নির্ভর পদ্ধতিতে H22 কোষের কার্যকারিতা উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করেছে (চিত্র 1বি)। 300 ug/ml-এ CTPG সবচেয়ে ভালো প্রতিরোধের হারে পৌঁছেছে (চিত্র 1c)। H22 কোষের জন্য CTPG-এর IC50-এর মান হল 24 ঘণ্টায় 236 ug/ml এবং 48 h-এ 169.8 ug/ml।

H22 কোষে CTPG প্ররোচিত অ্যাপোপটোসিস

H22 কোষের হ্রাসকৃত কার্যকারিতা অ্যাপোপটোসিসের আবেশ দ্বারা মধ্যস্থতা করা হয়েছে কিনা তা তদন্ত করতে, H22 কোষগুলিকে 24 ঘন্টার জন্য CTPG (0, 100, 200, 300, এবং 400 ug/ml) এর বিভিন্ন ঘনত্বের সাথে চিকিত্সা করা হয়েছিল এবং দাগ দেওয়া হয়েছিল। PI এবং Annexin V এর সাথে। ফ্লো সাইটোমেট্রি ফলাফল দেখিয়েছে যে CTPG ডোজ-নির্ভর পদ্ধতিতে (চিত্র 2a) H22 কোষের (প্রথম দিকে এবং শেষের অ্যাপোপটোসিস সহ) উল্লেখযোগ্যভাবে প্ররোচিত করেছে। যদিও CTPG-এর উচ্চ ডোজ H22 কোষের নেক্রোসিসকে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি করেছে, নেক্রোসিস H22 কোষের বৃদ্ধিকে বাধা দেওয়ার ক্ষেত্রে একটি গৌণ ভূমিকা পালন করে কারণ এর অনুপাত কম (8.3 শতাংশ) অ্যাপোপটোসিসের তুলনায় (52.6 শতাংশ)। আরও, CTPG চিকিত্সার পরে H22 কোষের মোট প্রোটিনগুলিকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং অ্যান্টি-অ্যাপোপ্টোটিক বি সেল লিম্ফোমা 2 (Bcl-2) এবং প্রো-অ্যাপোপ্টোটিক BCL-2-সংশ্লিষ্ট X প্রোটিন (Bax) এর অভিব্যক্তিগুলি সনাক্ত করা হয়েছিল পশ্চিম ফোঁটার. গ্রেস্কেল স্ক্যানিং ডেটা দেখিয়েছে যে Bax এবং Bcl-2-এর প্রকাশের মাত্রা যথাক্রমে বৃদ্ধি এবং হ্রাস পেয়েছে। Bax/Bcl-2 অনুপাত উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 2b)। এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে CTPG H22 কোষগুলিতে অ্যাপোপটোসিস প্ররোচিত করে।

CTPG H22 কোষে ক্রোমোসোমাল ঘনীভবন এবং কোষ চক্র গ্রেপ্তারে প্ররোচিত করে

এটি রিপোর্ট করা হয়েছে যে ওষুধ দ্বারা প্ররোচিত ডিএনএ ক্ষতি এবং কোষ চক্র গ্রেপ্তার টিউমার কোষের বৃদ্ধিকে বাধা দিতে পারে এবং টিউমার কোষগুলিতে অ্যাপোপটোসিস সৃষ্টি করতে পারে [17, 18]। 24 ঘন্টার জন্য CTPG চিকিত্সার পরে H22 কোষে নিউক্লিয়াসের আকারবিদ্যা সনাক্ত করতে, H22 কোষগুলি Hoechst 33,342 দ্বারা দাগ দেওয়া হয়েছিল এবং উল্টানো ফ্লুরোসেন্ট মাইক্রোস্কোপি ব্যবহার করে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। CTPG চিকিত্সা কোষগুলি নিউক্লিয়াসের উজ্জ্বল ঘনীভূত ক্রোমাটিনের ডোজ-নির্ভর বৃদ্ধি দেখায়, যখন চিকিত্সা না করা কোষগুলি একজাতীয়ভাবে দাগযুক্ত নিউক্লিয়াস (চিত্র 3a) দেখায়। H22 কোষে কোষ চক্র বন্টন 24 ঘন্টার জন্য CTPG চিকিত্সার পরে PI স্টেনিং দ্বারা আরও বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। চিত্র 3b তে দেখানো হয়েছে, CTPG চিকিত্সা উল্লেখযোগ্যভাবে G0/G1- এবং G2/M-ফেজ কোষগুলির অনুপাতকে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি করেছে এবং S-ফেজ কোষগুলির অনুপাতকে উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস করেছে, যা পরামর্শ দেয় যে CTPG প্ররোচিত G H22 কোষে 0/G1 এবং G2/M ফেজ গ্রেপ্তার। CTPG এর উচ্চ মাত্রা সাব G1 কোষের অনুপাতকে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি করেছে।

CTPG মাইটোকন্ড্রিয়াল ঝিল্লির সম্ভাব্যতা হ্রাস করেছে এবং সাইটোক্রোম সি-এর মুক্তি বাড়িয়েছে

মাইটোকন্ড্রিয়াল-নির্ভর পথ অ্যাপোপটোসিস আনয়নে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে [19, 20]। মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেন পটেনশিয়াল (Δψm) এর পরিবর্তনগুলি JC-1 স্টেনিং দ্বারা নিরীক্ষণ করা যেতে পারে JC-1 অ্যাগ্রিগেট (লাল ফ্লুরোসেন্স) Δψm [২১] হ্রাসের সাথে মনোমারে (সবুজ প্রতিপ্রভা) ভেঙে যেতে পারে। 24 ঘন্টার জন্য CTPG চিকিত্সার পরে, H22 কোষগুলি JC- 1 রঞ্জক দ্বারা দাগযুক্ত হয়েছিল। ফ্লো সাইটোমেট্রি ডেটা দেখায় যে FL-2 চ্যানেলে লাল প্রতিপ্রভ এবং FL-1 চ্যানেলে সবুজ প্রতিপ্রভ উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছে এবং CTPG চিকিত্সার সময় বৃদ্ধি পেয়েছে৷ PE− FITC প্লাস কোষের অনুপাত উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 4a), পরামর্শ দেয় যে CTPG H22 কোষে Δψm কমিয়েছে। এটি বর্ধিত Bax/Bcl-2 অনুপাতের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। ফলস্বরূপ, আমরা লক্ষ্য করেছি যে CTPG চিকিত্সার (চিত্র 4b) উপর সাইটোক্রোম সি-এর মুক্তি উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে। এই ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে CTPG একটি মাইটোকন্ড্রিয়াল-নির্ভর (অভ্যন্তরীণ) পথের মাধ্যমে আংশিকভাবে H22 কোষগুলিতে অ্যাপোপটোসিসকে প্ররোচিত করতে পারে।

CTPG ক্যাসপেস পাথওয়ে সক্রিয় করে এবং DNA মেরামত প্রতিরোধ করে

এরপরে, বহিরাগত এবং অভ্যন্তরীণ উভয় সিগন্যালিং পথের মাধ্যমে সিটিপিজি দ্বারা প্ররোচিত ক্যাসপেসের সক্রিয়করণ বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। 24 ঘন্টার জন্য CTPG চিকিত্সার পরে, মোট প্রোটিনগুলি H22 কোষ থেকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং ওয়েস্টার্ন ব্লট দ্বারা প্রো-এবং ক্লিভড-ক্যাসপেসের স্তরগুলি সনাক্ত করা হয়েছিল। চিকিত্সা না করা বা DMSO নিয়ন্ত্রণের সাথে তুলনা করে, CTPG চিকিত্সা উল্লেখযোগ্যভাবে শুধুমাত্র ক্লিভড ক্যাসপেসের স্তর -8 (বহির্মুখী পথ) নয় বরং ক্লিভড ক্যাসপেসের স্তর -9 (অভ্যন্তরীণ পথ) (চিত্র. 5)। ক্রমানুসারে, সক্রিয় ক্যাসপেস-8 এবং -9 ডাউনস্ট্রিম প্রো-ক্যাস্পেস-3 এবং -7 ক্লিভ করে যা চিত্র 5-এ পরিলক্ষিত হয়েছিল। সক্রিয় ক্যাসপেস-3 ডিএনএ ক্লিভ করে ডিএনএ মেরামত প্রতিরোধ করতে পলি (ADP-রাইবোজ) পলিমারেজ (PARP) এর এনজাইম মেরামত করুন এবং চিত্র 3a-তে দেখা গেছে ডিএনএ ক্ষতি রোধ করতে।

এই ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে CTPG বাহ্যিক এবং অভ্যন্তরীণ উভয় সিগন্যালিং পথের মাধ্যমে H22 কোষে অ্যাপোপটোসিস প্ররোচিত করে।

CTPG ভিভোতে H22 HCC এর বৃদ্ধিকে দমন করে এবং টিউমার মাউসের বেঁচে থাকার হারকে উন্নত করে

অবশেষে, এইচসিসি-তে সিটিপিজির অ্যান্টিটিউমার প্রভাবটি একটি টিউমার মাউস মডেলে মূল্যায়ন করা হয়েছিল, যা এইচ 22 কোষের সাবকুটেনিয়াস ইনজেকশন দ্বারা প্রতিষ্ঠিত হয়েছিল। H22 সেল ইনজেকশনের 3 দিন পরে, টিউমার ইঁদুরগুলি 8 বার সিটিপিজি দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। ইঁদুরের শরীরের ওজন এবং টিউমারের আকার নির্দেশিত সময় পয়েন্টগুলিতে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল। চিত্র 6a তে দেখানো হয়েছে, প্রতিটি গ্রুপের ইঁদুরের শরীরের ওজনে কোন উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নেই, এটি পরামর্শ দেয় যে CTPG এর নির্বাচিত ডোজগুলির কোন সুস্পষ্ট পার্শ্বপ্রতিক্রিয়া নেই। মজার বিষয় হল, 200 mg/kg এবং 400 mg/kg CTPG উভয়ের মাধ্যমে চিকিত্সা করা ইঁদুরের টিউমার বৃদ্ধি উল্লেখযোগ্যভাবে বাধাপ্রাপ্ত হয়েছিল (চিত্র 6b)। অধিকন্তু, CTPG চিকিত্সার দুটি ডোজ পরীক্ষা শেষে নিয়ন্ত্রণ গ্রুপ (0/7) এর তুলনায় টিউমার ইঁদুরের (3/7, 3/7) বেঁচে থাকার ব্যাপক উন্নতি করেছে (চিত্র 6b)। আমরা আরও দেখতে পেয়েছি যে CTPG ডোজ-নির্ভর পদ্ধতিতে (চিত্র 6c) পুরুষ কুনমিং ইঁদুর থেকে বিচ্ছিন্ন স্প্লেনোসাইটের বিস্তারকে উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি করেছে, এটি পরামর্শ দেয় যে CTPG-এর একটি ইমিউনোস্টিমুলেটরি প্রভাব রয়েছে।

আলোচনা

টিসিএম দীর্ঘ ইতিহাস ধরে ক্যান্সার সহ বিভিন্ন রোগের চিকিৎসার জন্য ব্যবহৃত হয়ে আসছে। এটি রিপোর্ট করা হয়েছে যে টিসিএম অ্যান্টিটিউমার প্রভাব [22-25] প্রয়োগ করার জন্য বাহ্যিক (ডেথ রিসেপ্টর-মধ্যস্থতা) এবং অভ্যন্তরীণ (মাইটোকন্ড্রিয়া-নির্ভর) সিগন্যালিং পথের মাধ্যমে বিভিন্ন ধরণের টিউমার কোষে অ্যাপোপটোসিস প্ররোচিত করতে পারে। দুটি পথ যথাক্রমে ক্যাসপেস-8 এবং -9 সক্রিয় করতে পারে [24, 26]। এখানে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে CTPG উল্লেখযোগ্যভাবে অ্যাপোপটোসিস এবং কোষ চক্র গ্রেপ্তারের মাধ্যমে H22 কোষের বৃদ্ধিকে দমন করেছে। ক্লিভড ক্যাসপেসের স্তরগুলি-8 এবং -9 উল্লেখযোগ্যভাবে CTPG চিকিত্সার দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়েছিল, যা পরামর্শ দেয় যে বহিরাগত এবং অভ্যন্তরীণ সিগন্যালিং পথ উভয়ই অ্যাপোপটোসিস আনয়নের সাথে জড়িত ছিল। আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণায় দেখা গেছে যে CTPG মাইটোকন্ড্রিয়া-নির্ভর পথ দ্বারা মেলানোমা B16-F10 কোষে অ্যাপোপটোসিস প্ররোচিত করেছে যা ক্লিভড ক্যাসপেসের মাত্রা বাড়িয়েছে-9 কিন্তু ক্যাসপেস নয়-8 [16]। CTPG বিভিন্ন ধরনের টিউমার কোষে স্বতন্ত্র সিগন্যালিং পথ সক্রিয় করতে পারে।

মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেনের অখণ্ডতা ব্যাক্স এবং বিসিএল সহ BCL-2 প্রোটিন পরিবারের সদস্যদের দ্বারা শক্তভাবে নিয়ন্ত্রিত হয়-2 [27, 28]। Bax থেকে Bcl-2 অনুপাত মাইটোকন্ড্রিয়া-নির্ভর অ্যাপোপটোসিস পাথওয়েতে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে [২৯]। CTPG দ্বারা চিকিত্সা করা H22 কোষগুলিতে, Bax/Bcl-2 অনুপাত উল্লেখযোগ্যভাবে আপ-নিয়ন্ত্রিত ছিল, যা এই গবেষণায় Δψm হ্রাস এবং সাইটোক্রোম c প্রকাশের কারণ হতে পারে। ফলস্বরূপ, প্রো-ক্যাস্পেস-9 ক্লিভড এবং সক্রিয় করা হয়েছিল। অবশেষে, সক্রিয় ক্যাসপেসের সূচনাকারীরা-8 এবং -9 ডিএনএ মেরামত রোধ করতে PARP ক্লিভ করার জন্য ক্যাসপেসের নির্বাহককে সক্রিয় করে-3। একসাথে নেওয়া, এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে CTPG বহিরাগত এবং অভ্যন্তরীণ উভয় সিগন্যালিং পথের মাধ্যমে H22 কোষে অ্যাপোপটোসিস প্ররোচিত করেছে।

টিউমার মাউস মডেলে, CTPG উল্লেখযোগ্যভাবে H22 HCC-এর বৃদ্ধি দমন করেছে এবং টিউমার মাউসের বেঁচে থাকার ক্ষেত্রে ব্যাপক উন্নতি করেছে। মজার বিষয় হল, সিটিপিজি ডোজ-নির্ভরভাবে কুনমিং ইঁদুর থেকে স্প্লেনোসাইটের বিস্তারকে প্রচার করেছে, যা আমাদের পূর্ববর্তী গবেষণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ [16]।

এই ফলাফলগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে CTPG সরাসরি অ্যান্টিটিউমার প্রভাব এবং পরোক্ষ প্রতিরোধ ক্ষমতা বৃদ্ধি উভয়ের মাধ্যমে ইঁদুরের মধ্যে H22 HCC-এর বৃদ্ধিকে দমন করতে পারে।

উপসংহার

CTPG ভিট্রো এবং ভিভো উভয় ক্ষেত্রেই H22 কোষের বৃদ্ধি দমন করে এবং বাহ্যিক এবং অভ্যন্তরীণ উভয় সিগন্যালিং পথের মাধ্যমে H22 কোষে অ্যাপোপটোসিস প্ররোচিত করে। এই তথ্যগুলি নির্দেশ করে যে CTPG HCC এর চিকিত্সার জন্য একটি সম্ভাব্য প্রার্থী হতে পারে।