পডোসাইটে CD73 ওভার এক্সপ্রেশন: মানুষের কিডনি রোগে পডোসাইট ইনজুরির একটি নভেল মার্কার
Feb 26, 2022
বিমূর্ত:CD73 পাথওয়ে বিভিন্ন রোগের সেটিংসে একটি গুরুত্বপূর্ণ অ্যান্টি-ইনফ্ল্যামেটরি মেকানিজম। মাউস মডেলের পর্যবেক্ষণগুলি পরামর্শ দিয়েছে যে CD73 এর একটি প্রতিরক্ষামূলক ভূমিকা থাকতে পারেকিডনি ক্ষতি; যাইহোক, মানুষের মধ্যে এর ভূমিকার কোন প্রত্যক্ষ প্রমাণ নেইকিডনীর রোগতারিখ পর্যন্ত বর্ণনা করা হয়েছে। এখানে, আমরা অনুমান করেছি যে মানুষের মধ্যে পডোসাইট আঘাতকিডনি রোগCD73 এক্সপ্রেশনকে পরিবর্তন করে যা পডোসাইটোপ্যাথি রোগ নির্ণয়কে সহজতর করতে পারে। আমরা CD73 এর অভিব্যক্তি এবং এর কার্যকরীভাবে গুরুত্বপূর্ণ লক্ষ্যগুলির মধ্যে একটি, CC কেমোকাইন রিসেপ্টর টাইপ 2 (CCR2), থেকে পডোসাইটগুলিতে মূল্যায়ন করেছিকিডনিপডোসাইটোপ্যাথি (ফোকাল সেগমেন্টাল গ্লোমেরুলোস্ক্লেরোসিস (এফএসজিএস), মিনিমাল চেঞ্জ ডিজিজ (এমসিডি), মেমব্রানোস গ্লোমেরুলোনফ্রাইটিস (এমজিএন) এবং অ্যামাইলয়েডোসিস সহ 39 জন রোগীর বায়োপসি এবং একটি নিয়ন্ত্রণ গ্রুপ। প্রতিটি রোগের গ্রুপে পোডোসাইট CD73 এক্সপ্রেশন নিয়ন্ত্রণের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (p < 0৷{4}}{{10}}1–p=""><0.0001)। অধিকন্তু,="" cd73="" এবং="" ccr2="" এক্সপ্রেশনের="" মধ্যে="" একটি="" চিহ্নিত="" নেতিবাচক="" সম্পর্ক="" ছিল,="" যা="" ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি="" এবং="" ইমিউনোফ্লুরেসেন্স="" দ্বারা="" নিশ্চিত="" করা="" হয়েছে="" (পিয়ারসন="" r="−" 0.5068,="" p="0.0031;" পিয়ারসন="" r="−" 0.4705,="" p="0.0313," যথাক্রমে),="" এইভাবে="" cd73="" এর="" প্রতিরক্ষামূলক="" ভূমিকার="" পরামর্শ="">কিডনি আঘাত.অবশেষে, আমরা CD73 কে হিউম্যান পডোসাইটোপ্যাথির একটি অভিনব সম্ভাব্য ডায়গনিস্টিক মার্কার হিসাবে চিহ্নিত করি, বিশেষত MCD-এর যা হালকা মাইক্রোস্কোপি এবং ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি দ্বারা স্বীকৃত প্যাথলজিকাল বৈশিষ্ট্যগুলির অভাবের জন্য কুখ্যাত।
কীওয়ার্ড:পোডোসাইট; ন্যূনতম পরিবর্তন রোগ; CD73; CCR2;কিডনি আঘাত;রেচনজনিত ব্যর্থতা
ভূমিকা
সর্বব্যাপী অন্তঃকোষীয় শক্তির উত্স হিসাবে অ্যাডেনোসিন ট্রাইফসফেট (এটিপি) এর বিবর্তনীয় গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা তিন দশকেরও বেশি আগে একটি বিপ্লবী ধারণার সাথে আপডেট করা হয়েছে যে পিউরিনার্জিক সিস্টেমের সদস্যরা (এটিপি, অ্যাডেনোসিন ডাই- এবং ট্রাইফসফেট (এডিপি এবং এএমপি, যথাক্রমে) এছাড়াও সেলুলার মিথস্ক্রিয়া [ 1 , 2 ] মধ্যস্থতা করার জন্য বহিরাগত সংকেত সরবরাহ করতে পারে। এই ধারণাটি বোঝার দিকে পরিচালিত করে যে পিউরিনার্জিক সিস্টেম রিসেপ্টর এক্সপ্রেশন প্রোফাইলের মডুলেশন, সাইটোকাইন নিঃসরণ, প্রতিক্রিয়াশীল অক্সিজেন প্রজাতির (আরওএস) উৎপাদনের মাধ্যমে ইমিউন প্রতিক্রিয়া গঠনে অংশগ্রহণ করে। অন্তঃকোষীয় প্যাথোজেন হজম [৩–৭]। বহিঃকোষী ATP CD39 (ecto-nucleosidtriphosphate diphosphohydrolase 1) এর মাধ্যমে ADP এবং AMP-তে রূপান্তর/ডিফসফোরিলেশনের মধ্য দিয়ে যায় এবং অবশেষে, AMP CD73 দ্বারা অ্যাডেনোসিনে অবনমিত হয় (এক্টোনিউক্লে) CD73 ঝিল্লি-বাউন্ড বা দ্রবণীয় আকারে উপস্থিত হতে পারে। ঝিল্লির আকারে একটি ডাইমার-কাঠামো রয়েছে যা দুটি অভিন্ন 70 kD সাবইউনিটের সাথে আবদ্ধ থাকে সি-টার্মিনাল সেরিন এবং গ্লাইকোসিলফসফ্যাটিডিল ইনোসিটল (জিপিআই) [9] এর মধ্যে একটি লিঙ্কের মাধ্যমে প্লাজমা ঝিল্লি। লক্ষণীয়, CD39 সাবস্ট্রেট ATP এবং ADP CD73 [ 9 – 11 ] এর প্রতিযোগীতামূলক প্রতিরোধক বলে মনে হয়। CD73 এক্সপ্রেশন এইভাবে এক্সট্রা সেলুলার স্পেসে অ্যাডেনোসিন লেভেল টিউন করার গুরুত্বপূর্ণ পথ উপস্থাপন করে। CD73 একটি কোষ বা অঙ্গ নির্দিষ্ট অণু নয়; লিউকোসাইট, এন্ডোথেলিয়াম, এপিথেলিয়াল বা বিভিন্ন অঙ্গের মেসেনকাইমাল কোষে এর প্রকাশ (কিডনি, ফুসফুস, যকৃত, কোলন, মস্তিষ্ক এবং হৃদয়) এবং স্টেম কোষগুলি ভালভাবে নথিভুক্ত করা হয়েছে [ 12 - 14 ]। লিভার ইস্কেমিয়া-জনিত আঘাতে নাইট্রিক অক্সাইড (NO)-সংশ্লেষণ পথের মাধ্যমে অ্যাডেনোসিনের একটি প্রতিরক্ষামূলক ভূমিকা প্রথম পেরাল্টা এট আল দ্বারা রিপোর্ট করা হয়েছিল। [ 15 ] এই তথ্যগুলির সাথে সামঞ্জস্য রেখে, এর ক্রিয়াটি ফুসফুসের তীব্র ক্ষতি, অ্যালোগ্রাফ্ট এয়ারওয়ে প্রত্যাখ্যান, তীব্র গ্রাফ্ট-বনাম-হোস্ট ডিজিজ এবং সেপসিস [4,16-19] কমানোর জন্য দেখানো হয়েছে।
CISTANCHE কিডনি/রেনাল ব্যর্থতার উন্নতি ঘটাবে
বেশ কয়েকটি মাউস মডেলে বিশ্বাসযোগ্যভাবে দেখানো হয়েছে, CD73 টিউবুলো-গ্লোমেরুলার মিথস্ক্রিয়ায় অংশগ্রহণ করতে পারেকিডনি. CD73-ইস্কেমিয়া-রিপারফিউশন ক্ষতির সময় টিউবুলার উৎপত্তির ATP থেকে CD73 দ্বারা প্রাপ্ত অ্যাডেনোসিনের মধ্যস্থতাকারী প্রজন্মকে নিউট্রোফিলের প্রভাবক ফাংশনকে বাধা দেওয়ার মাধ্যমে প্রদাহকে কমানোর জন্য দেখানো হয়েছে [20]। অধিকন্তু, CD73-ঘাটতি ইঁদুরগুলি অটোইমিউন প্রদাহ দেখায় যা পডোসাইট এবং এন্ডোথেলিয়াল ফেনস্ট্রেশনের সংখ্যা হ্রাস [ 21 ] দ্বারা অনুষঙ্গী হয়। এই ঘটনাটি টিউমার নেক্রোসিস ফ্যাক্টর (TNF)-আলফা বা কেমোকাইন CXC মোটিফ লিগ্যান্ড 2 (CXCL-2) এর মতো প্রো-ইনফ্ল্যামেটরি সাইটোকাইনের সিরাম স্তরের বৃদ্ধির সাথে যুক্ত ছিল। মানুষের সেটিং একিডনীর রোগ,এটি অনুমান করা হয়েছে যে পডোসাইটের ক্ষতি সম্ভবত প্যাথলজিক উদ্দীপকের সেলুলার প্রতিক্রিয়ার অভিযোজিত এবং ধ্বংসাত্মক প্রক্রিয়াগুলির মিশ্রণকে প্রতিনিধিত্ব করে, অগত্যা ইন ভিট্রো বা প্রাণী মডেল থেকে প্রকাশিত পর্যবেক্ষণগুলিকে প্রতিফলিত করে না। পডোসাইট ইনজুরির ইটিওলজি যান্ত্রিক স্ট্রেস (গ্লোমেরুলার হাইপারফিল্ট্রেশন), অক্সিডেটিভ স্ট্রেস (যেমন হাইপারটেনসিভ বা ডায়াবেটিক নেফ্রোপ্যাথি, বিষাক্ত আঘাত, প্রদাহজনক কোষের অনুপ্রবেশ বা ন্যূনতম পরিবর্তন রোগের প্রাণীর মডেল) থেকে ইমিউনোলজিক স্ট্রেস (যেমন, ইমিউন কমপ্লেক্স এবং পরিপূরক মধ্যস্থিত ক্ষতি) থেকে পরিবর্তিত হয়। গ্লোমেরুলোনফ্রাইটিসের সময়) [ 22 ]। গ্লোমেরুলোনফ্রাইটিসের প্রদাহজনক সেটিং পডোসাইটকে বিভিন্ন সাইটোকাইন সংশ্লেষণ করতে উদ্দীপিত করতে পারে, সম্ভাব্যভাবে CC কেমোকাইন রিসেপ্টর 2 (CCR2) মধ্যস্থতা সংকেতের মাধ্যমে। এখনও, মানুষের মধ্যে CD73 এর ভূমিকা সম্পর্কে খুব কমই জানা যায়কিডনীর রোগ, বিশেষ করে দীর্ঘস্থায়ী প্রদাহ এবং পডোসাইটের আঘাতের সেটিংয়ে।
বর্তমান গবেষণায়, আমরা অনুমান করেছি যে CD73 মানুষের গ্লোমেরুলার রোগের প্যাথোজেনেসিসে ভূমিকা পালন করে এবং মানুষের মধ্যে পডোসাইট CD73 এক্সপ্রেশন বিশ্লেষণ করে।কিডনিপডোসাইটোপ্যাথি-সম্পর্কিত প্যাথলজি রোগীদের বায়োপসি। আমরা প্রমাণ করি যে CD73-এর পডোসাইট পৃষ্ঠের অভিব্যক্তি হল একটি নির্ভরযোগ্য মার্কার অফপোডোসাইটেডামেজ, এইভাবে ন্যূনতম পরিবর্তন রোগে (MCD) CD73-এর ডায়গনিস্টিক মানকে সমর্থন করে। তদুপরি, আমরা পডোসাইট সিসিআর 2 এবং সিডি 73 এক্সপ্রেশনের মধ্যে একটি নেতিবাচক পারস্পরিক সম্পর্কের প্রতিবেদন করি, পরামর্শ দেয় যে সিডি 73 এর অত্যধিক এক্সপ্রেশন গ্লোমেরুলার ক্ষতের জন্য একটি অভিযোজিত প্রতিক্রিয়া উপস্থাপন করে।
ফলাফল
পডোসাইট ড্যামেজের ক্লিনিকাল ডেটা এবং আল্ট্রাস্ট্রাকচারাল ইমেজিংসারণী 1 বয়স, লিঙ্গ, ক্রিয়েটিনিন এবং মোট প্রোটিনুরিয়া মান সম্পর্কিত গবেষণায় অন্তর্ভুক্ত কেসগুলির ক্লিনিকাল উপস্থাপনার রূপরেখা দেয়। সমস্ত FSGS রোগীদের একটি প্রাথমিক NOS (অন্যথায় নির্দিষ্ট করা হয়নি) ফর্ম ছিল। 12 MGN রোগীর মধ্যে, 5 জন ফসফোলিপেস A2 রিসেপ্টর (PLA2R)-পজিটিভ (42 শতাংশ)। অ্যামাইলয়েডোসিস গ্রুপে, 2 জন রোগীর AA-amyloidosis (16.7 শতাংশ) এবং 10 AL-amyloidosis (83.3 শতাংশ); 2 জন রোগীর মধ্যে AL-amyloidosis লাইট চেইন কাপ্পা স্পষ্ট ছিল (20 শতাংশ) এবং 8 জন ল্যাম্বডা (AL-amyloidosis গ্রুপের 80 শতাংশ) এর জন্য ইতিবাচক ছিল। এমসিডি, এফএসজিএস, এমজিএন এবং অ্যামাইলয়েডোসিসের সমস্ত রোগীদের মধ্যে, ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি (চিত্র 1) দ্বারা পডোসাইটের ক্ষতি স্পষ্টভাবে সনাক্ত করা হয়েছিল।
চিত্র 1. প্রাথমিক এবং মাধ্যমিক পডোসাইট ক্ষতির আল্ট্রাস্ট্রাকচারাল ইমেজ। (ক) এমসিডি-র ক্ষেত্রে পাদদেশের প্রসেস প্রত্যাহার সহ গ্লোমেরুলার বেসমেন্ট মেমব্রেনে (তীর) পডোসাইট বডির বিস্তার। (খ) প্রাথমিক এফএসজিএস সহ রোগীর মধ্যে বিস্তৃত পডোসাইট ফুট প্রসেস ইফেসমেন্ট (তীর) এবং সাইটোপ্লাজমিক ভ্যাকুয়ালাইজেশন (স্টার)। (গ) প্রাথমিক ঝিল্লিযুক্ত গ্লোমেরুলোনেফ্রাইটিসে অন্তর্নিহিত এপিমেমব্রানাস ইলেক্ট্রন-ঘন উপাদান (তারকা) সহ পাদদেশের ক্ষত প্রক্রিয়া (তীর), ভ্যাকুয়ালাইজেশন এবং বিশিষ্ট অর্গানেল (ডাবল তীর)। ( d ) AL- amyloidosis (lambda) রোগীর মধ্যে পরপর পডোসাইট বিচ্ছিন্নতা (অপরিবর্তনীয় পডোসাইট ক্ষতির চিহ্ন হিসাবে) সহ অ্যামাইলয়েড-ফাইব্রিলস (দুই-মাথা তীর) এর সাবপিথেলিয়াল জমে। সমস্ত ইলেক্ট্রন মাইক্রোগ্রাফ 4000 × বিবর্ধনে উপস্থাপিত হয়। সন্নিবেশ—সংশ্লিষ্ট হালকা মাইক্রোস্কোপি ফটোমাইক্রোগ্রাফ (40 × /0.65 NA; স্কেল বারের আকার: 50 µm in (a,c,d) এবং 100 µm in (b); PAS-staining)।
CD73 এর সারফেস এক্সপ্রেশন মানুষের কিডনি রোগে পডোসাইট ইনজুরির সাথে সম্পর্কিত
পডোসাইটগুলি শারীরবৃত্তীয় সেটিংয়ে CD73 প্রকাশ করে কিনা তা অন্বেষণ করতে এবং CD73 অভিব্যক্তির CD73 উদাসীন রোগের সেটিংস সম্পর্কিত টপোডোসাইটেডামেজের প্যাটার্ন মূল্যায়ন করতে, CD73 এক্সপ্রেশনের মিউনোহিস্টোকেমিক্যাল বিশ্লেষণ। আল্ট্রাস্ট্রাকচারাল অ্যানালাইসিস নিশ্চিত করেছে যে পডোসাইটের ক্ষতিকে সাইটোস্কেলিটাল অনিয়ম হিসাবে অন্তত পায়ের প্রসেস ইফেসমেন্ট (চিত্র 1)। পডোসাইট ক্ষত ছাড়া আমাদের নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ গোষ্ঠীতে, একটি অভ্যন্তরীণ নিয়ন্ত্রণ (পেরিটুবুলার কৈশিক) যা সাধারণত ইতিবাচক দাগ দেয় (চিত্র 2) এর ইতিবাচকতা সত্ত্বেও CD73 এর কোনও উল্লেখযোগ্য পডোসাইট অভিব্যক্তি সনাক্ত করা যায়নি। অন্যদিকে, পডোসাইট ড্যামেজ গ্রুপ (MCD, FSGS, MGN এবং amyloidosis) পডোসাইট CD73 (p < 0৷{1{{20}}}}-এর="" পরিসংখ্যানগতভাবে="" অত্যন্ত="" গুরুত্বপূর্ণ="" আপগ্র্যুলেশন="" দেখিয়েছে।="" 001);="" নেতিবাচক="" নিয়ন্ত্রণের="" সাথে="" একক="" সত্তার="" তুলনা="" করার="" সময়ও="" উল্লেখযোগ্য="" বৃদ্ধি="" সামঞ্জস্যপূর্ণ="" ছিল="" (p="" অন্তত=""><0.001)। মজার="" বিষয়="" হল,="" এমসিডি="" গ্রুপে="" cd73="" আপগ্র্যুলেশনের="" পরিমাণ="" কম="" ছিল,="" যদিও="" শুধুমাত্র="" mgn="" নমুনার="" তুলনায়="" উল্লেখযোগ্যভাবে="" কম="" (p="0.0043)" (চিত্র="" 2)।="" পডোসাইট="" ড্যামেজ="" গ্রুপে,="" বাইনারি="" (নেফ্রোটিক/নন-নেফ্রোটিক)="" বা="" পরিমাণগত="" (g/24="" h)="" স্তরে="" (spearman="" r="−" 0.0807,="" p="0" অর্ধ-পরিমাণগত="" cd73="" স্কোর="" এবং="" প্রোটিনুরিয়ার="" মধ্যে="" কোনও="" সম্পর্ক="" ছিল="" না="" .6302="" এবং="" স্পিয়ারম্যান="" r="−" 0.076,="" p="0.6497," যথাক্রমে;="" চিত্র="" 3a)।="" সামগ্রিকভাবে,="" cd73="" স্কোর="" এবং="" ক্রিয়েটিনিন="" স্তরের="" মধ্যে="" কোন="" সম্পর্ক="" ছিল="" না="" (স্পিয়ারম্যান="" r="0.0722," p="0.6259;" চিত্র="" 3b)।="" উপরন্তু,="" আমরা="" cd73="" এক্সপ্রেশন="" এবং="" হাইপারটেনশন="" (স্পিয়ারম্যান="" r="−" 0.03024,="" p="0.8384)" বা="" ডায়াবেটিস="" মেলিটাস="" (স্পিয়ারম্যান="" r="−" 0.1784,="" p="" {4)="" এর="" মধ্যে="" উল্লেখযোগ্য="" পারস্পরিক="" সম্পর্ক="" সনাক্ত="" করতে="" পারিনি="">
মানুষের গ্লোমেরুলার ডিজিজে পডোসাইট-ডিরাইভড CD73-এর আপগ্র্যুলেশন নেতিবাচকভাবে CCR2 রিসেপ্টরের অভিব্যক্তির সাথে সম্পর্কযুক্ত এবং নেফ্রিন এবং পোডোসিন এক্সপ্রেশনের সাথে সম্পর্ক রাখে নাস্টেম সেল মডেলে CD73 ওভার এক্সপ্রেশনের পরে ম্যাক্রোফেজ CCR2 এক্সপ্রেশনের ডাউনরেগুলেশন সম্পর্কিত প্রকাশিত ডেটার প্রশংসা করে, আমরা অনুমান করেছি যে পডোসাইট ইনজুরির সময় CD73 এর আপগ্র্যুলেশন প্রো-ইনফ্ল্যামেটরি সিসিআর 2 এর অভিব্যক্তির সাথে বিপরীতভাবে সম্পর্কযুক্ত এবং ইমিউনোহিস্টোকেমিক্যাল সিসিআর 2 বিশ্লেষণ করে। কন্ট্রোল গ্রুপে, একই নমুনাগুলিতে CD73 স্বাক্ষরের তুলনায় উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছাড়াই CCR2-এর কোন বা শুধুমাত্র হালকা অভিব্যক্তি সনাক্ত করা যায়নি। বিপরীতে, পডোসাইট-ড্যামেজ বায়োপসি থেকে বেশিরভাগ নমুনায় পৃষ্ঠের CCR2 (এখনও বিভিন্ন তীব্রতা) এর বেশিরভাগ উল্লেখযোগ্য আপ-প্রিগুলেশন দেখা যায় এবং নিয়ন্ত্রণ গ্রুপের তুলনায় সাধারণত আপ-রেগুলেটেড ছিল (p=0.0206; পরিপূরক চিত্র S1)। রোগের গ্রুপগুলি এই বিষয়ে একে অপরের থেকে উল্লেখযোগ্যভাবে আলাদা ছিল না।
আমরা CD73 এবং CCR2 এর প্রকাশের তীব্রতার মধ্যে একটি সম্ভাব্য পারস্পরিক সম্পর্ক বিশ্লেষণ করেছি। প্রকৃতপক্ষে, পডোসাইট-ইনজুরি বায়োপসি কোহর্ট থেকে CD73 এবং CCR2 স্কোর তুলনা করে, একটি চিহ্নিত নেতিবাচক সম্পর্ক লক্ষ্য করা যেতে পারে (স্পিয়ারম্যান r=− 0.4821, p=0৷{18} }052), (চিত্র 4)। উল্লেখ্য, CD73-পজিটিভ পডোসাইট সহ গ্লোমেরুলি শুধুমাত্র পডোসাইটেই নয়, প্যারিটাল এপিথেলিয়াল কোষের মতো আশেপাশের কোষগুলিতেও সিসিআর২ এক্সপ্রেশন কম দেখায় (চিত্র 4)। কনফোকাল মাইক্রোস্কোপি (স্পিয়ারম্যান r=− 0.4478, p=0.0282), (চিত্র 5) দ্বারা ক্ষতিগ্রস্ত পডোসাইটগুলিতে CD73/CCR2-এর জন্য ইমিউনোফ্লুরোসেন্ট কো-স্টেইনিংয়ের মূল্যায়নের মাধ্যমে বিপরীত পারস্পরিক সম্পর্ক নিশ্চিত করা হয়েছিল। CD73 ইতিবাচকতা এবং (ক্ষতি) পডোসাইট-নির্দিষ্ট প্রোটিন অভিব্যক্তির মধ্যে চূড়ান্ত সম্পর্ককে মোকাবেলা করার জন্য, আমরা নেফ্রিন এবং পডোসিনের জন্য অতিরিক্ত ইমিউনোফ্লো রিসেন্ট স্টেনিংস সঞ্চালিত করেছি এবং নিয়ন্ত্রণে তাদের এক্সপ্রেশন প্যাটার্ন, এমসিডি এবং এফএসজিএস গ্রুপের (চিত্র 6a) পাশাপাশি কো-স্টেইনিং মূল্যায়ন করেছি। পডোসাইট ক্ষত সহ নমুনাগুলিতে CD73 সহ (চিত্র 6b–e)। আমরা একদিকে পডোসিন বা নেফ্রিন এক্সপ্রেশনের গড় ফ্লুরোসেন্স তীব্রতা এবং অন্য দিকে CD73 এর গড় অভিব্যক্তির মধ্যে উল্লেখযোগ্য পারস্পরিক সম্পর্ক সনাক্ত করতে পারিনি (n=39, স্পিয়ারম্যান r=0.212, p {{33} }.1948 পডোসিনের জন্য এবং n=60, স্পিয়ারম্যান r=0.01906, p=0.8851 নেফ্রিনের জন্য)।
আলোচনা
আমরা এখানে প্রথমবারের মতো মানুষের আহত পডোসাইটের পৃষ্ঠে CD73 এর অভিব্যক্তি বর্ণনা করছিমূত্রাশয় - সম্বন্ধীয় ব্যাধি. বিশ্লেষণ করছেরেনালএমসিডি, এফএসজিএস, এমজিএন এবং অ্যামাইলয়েডোসিসের মতো বিশিষ্ট পডোসাইট ক্ষতিগ্রস্থ রোগীদের বায়োপসি, আমরা নিয়ন্ত্রণের তুলনায় এই গোষ্ঠীগুলির প্রতিটিতে পডোসাইট সিডি 73 এক্সপ্রেশনের উল্লেখযোগ্য আপগ্রেশন রিপোর্ট করি।কিডনি,পডোসাইট ক্ষতির etiology থেকে স্বাধীন। তদুপরি, আমরা পডোসাইট-ক্ষতি গোষ্ঠীর পডোসাইট দ্বারা CD73 এবং CCR2 এক্সপ্রেশনের মধ্যে একটি বিপরীত পারস্পরিক সম্পর্কের প্রতিবেদন করি। বুস্টেড পডোসাইট-নির্দিষ্ট CCR2 ডায়াবেটিসের মধ্যস্থতা করতে দেখানো হয়েছেকিডনি আঘাতইঁদুরে [২৩]। উপরন্তু, FSGS-এর একটি Adriamycin-প্ররোচিত মুরিন মডেলে CCR2 অবরোধ প্রোটিনুরিয়া এবং গ্লোমেরুলার আঘাত [24] কমাতে রিপোর্ট করা হয়েছে। Lee et al.-এর একটি সাম্প্রতিক সমীক্ষা—এছাড়াও একটি মাউস মডেল ব্যবহার করে—ইঙ্গিত করে যে CCR2 হ্রাস অক্সিডেটিভ স্ট্রেস এবং লিপিড জমার অবরোধের মাধ্যমে স্থূলতা-প্ররোচিত অ্যালবুমিনুরিয়াকে প্রশমিত করতে পারে [25]। প্রকৃতপক্ষে, মিউরিন পেরিকার্ডিয়াল টিস্যু থেকে মেসেনকাইমাল স্টেম সেল (এমএসসি) নিযুক্ত একটি ইন ভিট্রো সিস্টেমে, এটি দেখানো হয়েছে যে সিডি73-অতিরিক্ত MSCগুলি প্রদাহ-বিরোধী কার্যকলাপের মাধ্যমে প্রতিকারমূলক প্রক্রিয়াগুলি নির্দেশ করে, অন্যান্য কারণগুলির মধ্যেও সিসিআর-এর বাধার কারণে73- {9}ইতিবাচক ম্যাক্রোফেজ অনুপ্রবেশ [ 13 ]। সুতরাং, আমাদের ফলাফল এবং প্রকাশিত তথ্যের আলোকে, এটা অনুমান করতে প্রলুব্ধ হয় যে পডোসাইট দ্বারা CD73 অভিব্যক্তি প্রতিরক্ষামূলক কাজ করতে পারেকিডনি আঘাত, সম্ভবত পাথওয়ের মাধ্যমে যা CCR2 কমিয়ে দেয়। CCR2 সিগন্যালিং ম্যাক্রোফেজ আনুগত্য এবং সক্রিয়করণের সাথে ঘনিষ্ঠভাবে সম্পর্কিত [26, 27]। যেহেতু ম্যাক্রোফেজগুলি পডোসাইটোপ্যাথি-সম্পর্কিত প্যাথোজেনেসিসকে প্রভাবিত করতে পারেকিডনি রোগ(প্রাথমিক MGN এর মত, যেখানে CD68 প্লাস, CCR2 প্লাস ম্যাক্রোফেজের অনুপ্রবেশ শেষ পর্যায়ের একটি উল্লেখযোগ্য সূচক হিসাবে স্বীকৃত হয়েছেরেচনজনিত ব্যর্থতা[ ২৮ ]), মনোসাইট/ম্যাক্রোফেজ বিষয়বস্তু, উৎপত্তি (অনুপ্রবেশকারী বনাম বাসিন্দা), অ্যাক্টিভেশন প্রোফাইল (M1-প্রোইনফ্ল্যামেটরি বনাম M2-বিকল্পভাবে সক্রিয়) এবং মানুষের মধ্যে CD73 অভিব্যক্তির মধ্যে সংযোগের আরও অধ্যয়নকিডনীর রোগমুরিন মডেল থেকে পূর্ববর্তী তথ্যের সাথে আমাদের ফলাফলের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ পরীক্ষা করা প্রয়োজন।
একটি প্রদাহজনক মাইক্রোমিলিউতে যা হাইপোক্সিয়ায় দেখা যায়, ইসকেমিয়া-রিপারফিউশন বা অটোইমিউন টিস্যু ক্ষতিগ্রস্ত একাধিক কোষ পিউরিনার্জিক সিগন্যালিং সিস্টেমের সদস্যদের মুক্তি দেয়, প্রধানত প্রো-ইনফ্ল্যামেটরি ATP বা ADP আকারে [ 29, 30]। এই সেটিংসে, ইক্টো-নিউক্লিওটিডেস সিডি 73 এবং প্রোডাক্টডেনোসাইন গুরুত্বপূর্ণ ফ্যাক্টরগুলির প্রতিরোধ ক্ষমতা নিয়ন্ত্রণ এবং নীরবতা। প্রাণীর মডেলগুলিতে, CD73 প্রতিরক্ষামূলক হিসাবে দেখানো হয়েছেকিডনিইসকেমিয়া রিপারফিউশন ইনজুরি এবং এর ঘাটতি পডোসাইট ডিসফাংশনকে প্ররোচিত করে, যা অটোইমিউন প্রদাহের দিকে পরিচালিত করে এবংকিডনীর রোগ[21, 31]। ইসকেমিয়া রিপারফিউশন-আঘাত ব্যবহার করে ভিভো পরীক্ষায় অন্যান্য মাউসগুলি প্রক্সিমাল টিউবুলার এপিথেলিয়াল কোষ দ্বারা প্রকাশিত CD73 এর গুরুত্বপূর্ণ অ্যান্টি-ইনফ্ল্যামেটরি প্রভাব প্রকাশ করেছে এবং এর মধ্যে এর গুরুত্বপূর্ণ ক্রিয়াকিডনিঅ্যাডেনোসিন-এন্ডোথেলিয়াল অ্যাডোরা 2 বি রিসেপ্টর সিগন্যালিং [20,32] এর মাধ্যমে ডায়াবেটিক নেফ্রোপ্যাথির সময় সুরক্ষা। পোডোসাইটোপ্যাথি হল গ্লোমেরুলার ক্ষতগুলির সবচেয়ে ঘন ঘন গ্রুপ যা প্রোটিন-ইউরিয়ার দিকে পরিচালিত করে। এমসিডি, একটি প্রোটোটাইপ 'প্রাথমিক' পডোসাইটোপ্যাথি, হল নেফ্রোটিক প্রোটিনুরিয়ার সবচেয়ে সাধারণ কারণ 1 বছরের > বয়স [33, 34]। MCD-এর প্যাথোজেনেসিসের বর্তমান অনুমানগুলি পডোসাইট-গ্লোমেরুলার বেসমেন্ট মেমব্রেনের অখণ্ডতা [ 35 – 38 ] ব্যাহত করার ক্ষেত্রে সাইটোকাইনস এবং অন্যান্য ইমিউন মধ্যস্থতাকারীদের একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকার পরামর্শ দেয়। হালকা মাইক্রোস্কোপিতে দৃশ্যমান পরিবর্তনের অনুপস্থিতি এবং গুরুতর প্রোটিনুরিয়ার মধ্যে পার্থক্য হল MCD-এর বৈশিষ্ট্য; ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি দ্বারা পডোসাইটের ক্ষতির আল্ট্রাস্ট্রাকচারাল প্রমাণ এইভাবে এমসিডি নির্ণয়ের জন্য আজ পর্যন্ত একটি শর্ত নয়। এই ডায়গনিস্টিক অ্যালগরিদম এই বিষয়ে আরও প্রথম-লাইন ডায়াগনস্টিক সরঞ্জামগুলির তাত্পর্যকে জোর দেয়। CD73 এক্সপ্রেশনের পরীক্ষা, বিশেষ করে ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপির সীমিত প্রাপ্যতার সেটিংয়ে, এইভাবে গ্লোমেরুলার (অর্থাৎ, পডোসাইটোপ্যাথিক) এবং এক্সট্রাগ্লোমেরুলার (যেমন, টিউবুলার বা প্যারাপ্রোটিনেমিক) প্রোটিনিউরিয়া উত্সের মধ্যে পার্থক্য করতে সাহায্য করতে পারে। আমাদের গবেষণায় ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি এবং ইমিউনোফ্লুরেসেন্সের মধ্যে তুলনা পরবর্তীটির পক্ষে কথা বলবে।
CISTANCHE কিডনি/রেনাল রোগের উন্নতি ঘটাবে
বেশ কয়েকটি প্রকাশনা দৃঢ়ভাবে নথিভুক্ত করেছে বিচ্ছিন্ন বন্টন এবং পডোসাইট-নির্দিষ্ট প্রোটিনের ক্ষতিকিডনীর রোগসেটিংস যা পডোসাইটের আঘাত এবং প্রোটিনুরিয়া অন্তর্ভুক্ত করে, যেমনটি সম্প্রতি পর্যালোচনা করা হয়েছে [৩৯]। আমাদের গবেষণায়, পডোসাইট-ক্ষতি গ্রুপের মধ্যে, আমরা পডোসিন/নেফ্রিন ফ্লুরোসেন্সের তীব্রতা এবং CD73 এক্সপ্রেশনের তীব্রতার মধ্যে একটি উল্লেখযোগ্য সম্পর্ক সনাক্ত করতে পারিনি। যাইহোক, নির্দিষ্ট সীমাবদ্ধতা পডোসিন/নেফ্রিন বনাম CD73 পরিসংখ্যানগত ডেটার প্যাথোফিজিওলজিকাল ব্যাখ্যাকে বাধা দেয়। প্রথমত, ফ্লুরোসেন্স তীব্রতার মূল্যায়নের জন্য আমরা কনফোকাল মাইক্রোস্কোপির প্রযুক্তিগত বিবর্ধন এবং রেজোলিউশন ক্ষমতা ব্যবহার করে পডোসাইট নির্বাচন করেছি। যদিও এই অবস্থাগুলি সহজেই পডোসাইটের দেহগুলি সনাক্ত করতে সক্ষম করে, প্রধান প্রক্রিয়াগুলি এবং বিশেষত পায়ের প্রক্রিয়াগুলি অস্পষ্ট থাকে, তাই সম্ভবত চিহ্নিত/বিশ্লেষণ করা হয় না। দ্বিতীয়ত, পুরো গ্লোমেরুলিতে CD73 এবং পডোসাইট-নির্দিষ্ট প্রোটিনের প্রকাশের মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্ককে ন্যায়সঙ্গত করা যায় না: যদিও এই স্তরে পডোসিন এবং নেফ্রিনের মূল্যায়ন বৈধ হবে (যেহেতু এটি অনুমান করা যুক্তিসঙ্গত যে অন্য কোনও গ্লোমেরুলার কোষ এই প্রোটিনগুলিকে প্রকাশ করে না) এটি হতে পারে না। CD73 এর জন্য দাবি করা হয়েছে যা আংশিকভাবে অন্তত এন্ডোথেলিয়াল কোষ দ্বারা প্রকাশ করা হয়। তৃতীয়ত, পডোসাইট ইনজুরির স্বাধীন চিহ্নিতকারী হিসেবে গড় ফ্লুরোসেন্স তীব্রতার মূল্যায়ন সন্দেহজনক, কারণ এটি গ্লোমেরুলাসের মধ্যে পডোসিন এবং নেফ্রিনের প্যাথলজিকাল, দানাদার বন্টন প্যাটার্নকে কভার করে না, যা আমরা চিত্র 6-এ স্পষ্টভাবে লক্ষ্য করতে পারি। তাই, আমরা অনিচ্ছুক। আমাদের বিশ্লেষণে সিডি73-পোডোসিন এবং সিডি73-নেফ্রিন পারস্পরিক সম্পর্কের অনুপস্থিতিকে এই মার্কারগুলির ভিন্নতর আণবিক পথের জন্য দায়ী করা। এই সিগন্যালিং ক্যাসকেডগুলির মধ্যে চূড়ান্ত হস্তক্ষেপ অন্বেষণ করার জন্য আরও পডোসাইট ইন ভিট্রো এবং প্রাণী অধ্যয়ন প্রয়োজন।
একসাথে নেওয়া, আমাদের অধ্যয়নের প্রধান সীমাবদ্ধতা হিসাবে ছোট নমুনার আকারকে স্বীকৃতি দিয়ে, আমরা এখানে আহত পডোসাইট দ্বারা সামঞ্জস্যপূর্ণ CD73 অত্যধিক এক্সপ্রেশন প্রদর্শন করি এবং পডোসাইটোপ্যাথির একটি অভিনব ডায়গনিস্টিক মার্কার হিসাবে CD73 সুপারিশ করি। ন্যূনতম পরিবর্তনের রোগে, আমাদের ফলাফলগুলি ক্ষতিগ্রস্থ পডোসাইট সনাক্ত করতে সাহায্য করতে পারে এবং এর ফলে একটি কম সময়- এবং খরচ-সাপেক্ষ ডায়গনিস্টিক প্রক্রিয়া হয়। এছাড়াও, আমাদের ফলাফলগুলি মুরিন পরীক্ষামূলক পদ্ধতির প্রকাশিত ডেটার সাথে সঙ্গতিপূর্ণ হয় এবং মানুষের মধ্যে CD73 এবং CCR2 এর মধ্যে একটি প্রতিরক্ষামূলক মিথস্ক্রিয়া প্রস্তাব করে।কিডনীর রোগ. মানুষের মধ্যে CD73 সিগন্যালিংয়ের প্রক্রিয়া মোকাবেলার জন্য বৃহত্তর রোগীর দলগুলির সাথে আরও মাল্টিসেন্টার অধ্যয়ন প্রয়োজনকিডনিরোগ এবং এর প্রাগনোস্টিক মান। একইভাবে, রোগের তীব্রতা এবং CD73 এক্সপ্রেশনের মধ্যে একটি সম্ভাব্য সম্পর্ক স্থাপনের জন্য বৃহত্তর সমগোত্রীয় সংখ্যার প্রয়োজন হবে।
উপাদান এবং পদ্ধতি
স্টাডি কোহর্ট1 জানুয়ারী 2018 থেকে 31 ডিসেম্বর 2019 এর মধ্যে হাইডেলবার্গ বিশ্ববিদ্যালয়ের ইউনিভার্সিটি হসপিটাল ম্যানহেইমে 49টি ভিন্ন রোগীর এই গবেষণায় অন্তর্ভুক্ত মোট 49টি বায়োপসি নির্ণয় করা হয়েছে। আরও নির্বাচনের মানদণ্ড ছিল একটি প্রতিনিধিত্বমূলক বায়োপসি যা ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি এবং ইএম, পর্যাপ্ত ক্লিনিকাল তথ্য, পরিষ্কার-কাট ডায়াগনোসিস এবং এই অধ্যয়নের জন্য পর্যাপ্ত উপাদান সহ ট্রিপল-ডায়াগনস্টিকস সম্পাদন করার সম্ভাবনা রয়েছে। সমস্ত রোগী প্রাপ্তবয়স্ক এবং ককেশীয় ছিল। তদন্তগুলি বিভিন্ন ইটিওলজির পডোসাইট ইনজুরিতে আক্রান্ত রোগীদের 39টি বায়োপসি সংযুক্ত করেছে (প্রাথমিক ফোকাল সেগমেন্টাল গ্লোমেরুলোস্ক্লেরোসিস-এফএসজিএস-এর রোগীদের থেকে 7টি বায়োপসি; 8টি ন্যূনতম পরিবর্তনের রোগ-এমসিডি; 12টি ঝিল্লিযুক্ত গ্লোমেরুলোনফ্রাইটিস রোগীদের থেকে-এমজিএন রোগীদের থেকে 12টি বায়োপসি)। নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ ছিলকিডনিপডোসাইট ক্ষত ছাড়া এবং প্রোটিনুরিয়া ছাড়া 10 জন রোগীর বায়োপসি (হালকা নেফ্রোস্ক্লেরোসিস সহ 6 রোগী, ইন্টারস্টিশিয়াল নেফ্রাইটিস সহ 2 রোগী এবং প্যাথলজিকাল পরিবর্তন ছাড়া 2 রোগী)। উপরের সমস্ত বায়োপসিগুলি পডোসাইট সিডি 73 এক্সপ্রেশনের বিশ্লেষণে অন্তর্ভুক্ত ছিল; CCR2 এর জন্য, অ-স্ক্লেরোটিক গ্লোমেরুলির অপর্যাপ্ত সংখ্যক প্যারাফিন বিভাগগুলি বাদ দেওয়ার পরে (<5), we="" performed="" analysis="" of="" surface="" expression="" and="" of="" correlation="" with="" cd73="" signature="" in="" 6="" samples="" from="" fsgs,="" 8="" from="" mcd,="" 10="" from="" mgn="" and="" 8="" from="" the="" amyloidosis="" group.="" in="" the="" ccr2="" analysis,="" the="" control="" group="" consisted="" of="" 6="" biopsies.="" relevant="" clinical="" data="" were="" collected="" from="" electronic="" medical="" records="" (table="" 1).="" informed="" consent="" was="" waived="" because="" of="" the="" retrospective="" nature="" of="" the="" study,="" because="" of="" the="" fact="" that="" anonymous="" clinical="" data="" were="" used="" for="" analysis="" and="" because="" the="" study="" was="" performed="" on="" already="" existing="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" after="" completing="" the="" diagnostic="" process,="" as="" approved="" by="" the="" ethic="" committee="" of="" the="" university="" medical="" centre="" mannheim,="" university="" of="" heidelberg="" (reference="" number:="">
হিস্টোলজি, ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি, ইমিউনোফ্লোরেসেন্স এবং ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি1 µ m সিরিয়াল বিভাগগুলি প্যারাফিন-এম্বেডেড করা হয়েছিলকিডনিবায়োপসি এবং হিমাটক্সিলিন/ইওসিন (এইচ/ই), পর্যায়ক্রমিক অ্যাসিড-শিফ (পিএএস), ম্যাসনের ট্রাইক্রোম স্টেনিং এবং ডায়াগনস্টিক উদ্দেশ্যে স্ট্যান্ডার্ড রুটিন ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি দিয়ে দাগযুক্ত। ফরমালিন-ফিক্সড প্যারাফিন এমবেডেড বায়োপসিগুলির ইমিউনোহিস্টো-রাসায়নিক এবং ইমিউনোফ্লুরোসেন্ট স্টেনিং খরগোশের অ্যান্টি-হিউম্যান CD73 মনোক্লোনাল অ্যান্টিবডি (ক্লোন D7F9A, সেল সিগন্যালিং, ফ্রাঙ্কফুর্ট অ্যাম মেইন, জার্মানি) এবং মাউস মনোক্লোনাল অ্যান্টি-হিউম্যান CCR2 (; Abcam, Cambridge, UK), খরগোশের পলিক্লোনাল অ্যান্টি-হিউম্যান অ্যান্টিবডি টু নেফ্রিন (Abcam, Cambridge, UK) এবং খরগোশ অ্যান্টি-হিউম্যান পডোসিন অ্যান্টিবডি (Sigma, Saint Louis, MO, USA), প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে। ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি দ্বারা পডোসাইট সিডি 73 এক্সপ্রেশনের বিশ্লেষণে সমস্ত বায়োপসি অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল; CCR2 এর জন্য, অ-স্ক্লেরোটিক গ্লোমেরুলির অপর্যাপ্ত সংখ্যক প্যারাফিন বিভাগ (<5) were="" excluded.="" to="" minimize="" the="" noise,="" antibody="" optimization="" for="" immunohistochemistry="" was="" performed="" using="" control="" (tonsil)="" tissue.="" the="" tissue="" sections="" were="" stained="" with="" dako="" real="" detection="" system="" alkaline="" phosphatase/red="" rabbit/mouse="" kit="" (agilent,="" santa="" clara,="" ca,="" usa)="" and="" avidin/biotin="" blocking="" kit="" (vector="" laboratories,="" burlingame,="" ca,="" usa).="" antigen="" retrieval="" was="" performed="" for="" 20="" min="" using="" dako="" target="" retrieval="" solution="" (equivalent="" citrate="" buffer,="" ph="" 6.0).="" primary="" antibodies="" were="" incubated="" for="" 60="" min="" in="" dako="" antibody="" diluent="" with="" 2%="" dry="" milk="" at="" 37="" ◦="" c="" and="" detected="" using="" the="" dako="" real="" link,="" biotinylated="" secondary="" antibodies="" (included="" in="" the="" kit),="" and="" dako="" real="" streptavidin="" alkaline="" phosphatase="" (ap).="" the="" reaction="" was="" visualized="" by="" a="" red="" chromogen="" (included="" in="" the="" kit).="" the="" slides="" were="" counterstained="" with="" hematoxylin,="" dehydrated,="" mounted="" using="" aquatex="" (merck,="" darmstadt,="" germany)="" and="" cover-slipped.="" for="" immunofluorescence,="" ccr2/cd73="" co-expression="" was="" evaluated="" in="" total="" of="" 22="" podocytes="" from="" all="" podocyte="" lesion="" groups.="" cd73="" was="" stained="" with="" alexa="" flour="" tm="" 488="" tyramide="" superboost="" tm="" kit,="" streptavidin="" (invitrogen,="" thermo="" fisher,="" waltham,="" ma,="" usa)="" using="" secondary="" biotinylated="" anti-mouse="" antibody="" (biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" secondary="" antibodies="" for="" the="" immunofluorescence="" were="" donkey="" anti-mouse="" cf="" 594="" and="" donkey="" anti-rabbit="" cf="" 594="" (both="" from="" biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" for="" electron="" microscopy,="" biopsies="" were="" post-fixed="" with="" 1%="" osmium="" tetroxide="" (roth,="" karlsruhe,="" germany),="" embedded="" in="" agar="" 100="" resin="" (agar="" scientific,="" stansted,="" uk),="" cut="" at90nm="" thickness="" andstained="" with1%="" uranylacetate(serva,="" heidelberg,="" germany).="" micro-graphs="" were="" taken="" on="" transmission="" electron="" microscope="" jem-1400="" (joel,="" freising,="">
CISTANCHE কিডনি/রেনাল ফাংশন উন্নত করবে
হালকা মাইক্রোস্কোপি এবং মরফোমেট্রিক বিশ্লেষণOlympus PlanCN 40 × /0.65 উদ্দেশ্য এবং মাইক্রোপয়েন্ট সফ্টওয়্যার (v.5 মে 2016; PreciPoint, Freising) সহ PreciPoint স্ক্যানিং মাইক্রোস্কোপ M8 ব্যবহার করে চিত্র অধিগ্রহণ এবং বিশ্লেষণ করা হয়েছিল , জার্মানি)। ইমিউনোহিস্টোকেমিক্যাল স্টেনিংয়ে পডোসাইট সিডি 73 পৃষ্ঠের অভিব্যক্তির আধা-মাত্রাগত মূল্যায়ন একটি 0-3 স্কোরিং স্কেল ব্যবহার করে মূল্যায়ন করা হয়েছিল (0-কোন অভিব্যক্তি নেই; 1-ফোকাল সেগমেন্টাল ইতিবাচকতা (<50% podocytes="" positive="" in=""><50% glomeruli);="" 2—focal="" global="" (="">50 শতাংশ পডোসাইট পজিটিভ ইন<50% glomeruli);="" 3—diffuse="" (any="" percentage="" of="" podocytes="" positive="" in="">50 শতাংশ গ্লোমেরুলি)। CD73 ইতিবাচক এবং নেতিবাচক পডোসাইটগুলি বায়োপসি-অভ্যন্তরীণ CCR2 পজিটিভ নিয়ন্ত্রণ অনুসারে একটি তীব্রতা-ভিত্তিক অর্ধ-পরিমাণগত স্কোরিং সিস্টেম ব্যবহার করে CCR2 সহ-অভিব্যক্তির জন্য বিশ্লেষণ করা হয়েছিল (0-কোনও অভিব্যক্তি, 1-দুর্বল অভিব্যক্তি, 2-মধ্যম অভিব্যক্তি এবং 3-শক্তিশালী অভিব্যক্তি- এন্ডোথেলিয়াম এবং অনুপ্রবেশকারী ইমিউন কোষ)। মূল্যায়ন দুটি প্যাথলজিস্ট (এসপি এবং জেডপি) দ্বারা অন্ধভাবে স্বাধীনভাবে সম্পাদিত হয়েছিল।
কনফোকাল মাইক্রোস্কোপিCD73 (Alexa Fluor 488), CCR2 (Alexa Fluor 594) এবং পডোসাইটের নিউক্লিয়াস (DAPI) এর ছবিগুলি অলিম্পাস FV1000 মোটরযুক্ত কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ একটি HeNem, 594 দিয়ে সজ্জিত করা হয়েছিল Argon 488 nm এবং একটি UV ডায়োড 405 nmlaser এবং photomultiplier tubes (PMTs) ফ্লুওভিউ সফ্টওয়্যার দ্বারা নিয়ন্ত্রিত, 60 × /1.35 UPlanSApo উদ্দেশ্য ব্যবহার করে। 512 × 512 পিক্সেল ফ্রেম এবং ওভারভিউয়ের জন্য 0.41 µm এবং উচ্চ রেজোলিউশনের জন্য 0.10 µm পিক্সেল আকারের 12-বিট চিত্রগুলি মাইক্রোস্কোপের সমস্ত সেটিংস ধ্রুবক রেখে অর্জিত হয়েছিল৷ ছবিগুলি আরও আধা-স্বয়ংক্রিয়ভাবে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল এবং একটি ইন-হাউস ডেভেলপ করা ImageJ ম্যাক্রো ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল (অ্যাক্সেসের তারিখ: 15 ডিসেম্বর 2020)। শীঘ্রই, চিত্রগুলি পৃথক পডোসাইটের জন্য ভাগ করা হয়েছিল, থ্রেশহোল্ড প্রয়োগ করা হয়েছিল এবং গড় তীব্রতা পরিমাপ করা হয়েছিল, পরিসংখ্যানগতভাবে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং প্লট করা হয়েছিল। সমস্ত চিত্রগুলি ধ্রুবক সেটিংসের সাথে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল এবং মার্জ করা চিত্রগুলিতে পৃথক চ্যানেলগুলির জন্য সমানভাবে রৈখিকভাবে সামঞ্জস্য করা একই ছদ্ম-রঙের সাথে প্রদর্শিত হয়েছিল
পরিসংখ্যানিক বিশ্লেষণগ্রাফপ্যাডপ্রিজমভি ব্যবহার করে পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ করা হয়েছে। 8.4.3 সফ্টওয়্যার (গ্রাফপ্যাড সফ্টওয়্যার, ইনক।, লা জোল্লা, CA, USA)। সমস্ত ডেটা গড় ± SEM হিসাবে রিপোর্ট করা হয়। পরিসংখ্যানগত পার্থক্যগুলি পেয়ারড বা আনপেয়ারড টি-টেস্টের পাশাপাশি পিয়ারসন পারস্পরিক সম্পর্ক বিশ্লেষণ ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল, যেমন নির্দেশিত হয়েছে।
