একটি সহজাত প্যাথোজেন সেন্সিং কৌশল যাতে ব্যাকটেরিয়াল সারফেস প্রোটিনের সর্বব্যাপীকরণ জড়িত পার্ট 2

আলোচনা

মেটাজোয়ানরা সাইটোসোলিক হোমিওস্ট্যাসিস বজায় রাখতে, ক্ষতিগ্রস্থ প্রোটিন/অর্গানেলের জমা হওয়া রোধ করতে এবং আক্রমণকারী প্যাথোজেনগুলির বিরুদ্ধে রক্ষা করার জন্য একটি বহুমুখী প্রক্রিয়া হিসাবে সর্বব্যাপী ব্যবহার করে (40, 41)। বিভিন্ন ধরণের রোগজীবাণু এবং ক্ষতিগ্রস্ত প্রোটিনের বিভিন্ন সেটের সম্মুখীন হওয়ার কারণে, সাবস্ট্রেট স্বীকৃতি এবং পরবর্তী সর্বব্যাপীকরণের জন্য সাধারণ মোটিফগুলির সনাক্তকরণ সম্পদ অপ্টিমাইজেশনের জন্য একটি স্মার্ট কৌশল উপস্থাপন করে। প্রোটিওলাইসিসের জন্য নির্ধারিত ইউক্যারিওটিক কোষের প্রোটিনগুলি সাধারণত ত্রিপক্ষীয় ডিগ্রন মোটিফ (24) দ্বারা চিহ্নিত করা হয়।

অনাক্রম্যতা হল ব্যাকটেরিয়া, ভাইরাস এবং অন্যান্য ক্ষতিকারক পদার্থের প্রতিক্রিয়া সহ রোগের বিরুদ্ধে লড়াই করার শরীরের ক্ষমতা। যদি শরীরের রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা কমে যায়, তবে এটি রোগের আক্রমণের সাথে মোকাবিলা করার জন্য যথেষ্ট শক্তিশালী হবে না। গবেষণায় দেখা গেছে যে অপুষ্টি রোগ প্রতিরোধ ব্যবস্থার কার্যকারিতার উপর প্রভাব ফেলে, যা শরীরকে সংক্রমণ এবং রোগের জন্য আরও সংবেদনশীল করে তোলে। অনাক্রম্যতা বজায় রাখার জন্য প্রোটিন একটি গুরুত্বপূর্ণ উপাদান।

প্রোটিনগুলি অ্যামিনো অ্যাসিড দিয়ে তৈরি, যার মধ্যে কিছুকে অপরিহার্য অ্যামিনো অ্যাসিড বলা হয় কারণ সেগুলি অবশ্যই খাদ্য দ্বারা সরবরাহ করা উচিত এবং শরীর দ্বারা সংশ্লেষিত হতে পারে না। এই অত্যাবশ্যকীয় অ্যামিনো অ্যাসিডগুলির মধ্যে রয়েছে ট্রিপটোফান, লিউসিন, ফেনিল্যালানাইন, লাইসিন, আইসোলিউসিন, মেথিওনিন, ভ্যালাইন এবং হিস্টিডিন। শরীর যদি পর্যাপ্ত প্রয়োজনীয় অ্যামিনো অ্যাসিড না পায় তবে এটি প্রতিবন্ধী প্রোটিন বিপাকের দিকে পরিচালিত করতে পারে, যা ইমিউন সিস্টেমের কাজকে প্রভাবিত করতে পারে।

উপরন্তু, একটি উচ্চ মানের প্রোটিন গ্রহণ একটি স্বাভাবিক ইমিউন সিস্টেম এবং শরীরের ফাংশন বজায় রাখতে সাহায্য করে। যখন শরীরে প্রোটিনের অভাব হয়, তখন এটি একটি আপসহীন প্রতিরোধ ব্যবস্থার দিকে পরিচালিত করতে পারে এবং শরীর রোগের জন্য বেশি সংবেদনশীল হয়। মানবদেহে দীর্ঘদিন প্রোটিনের অভাব থাকলে তা রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতার দীর্ঘমেয়াদি ক্ষতির কারণ হতে পারে, যা মানুষকে বিভিন্ন রোগে আক্রান্ত করে তোলে।

অতএব, একটি সুষম খাদ্য এবং সঠিক ব্যায়াম হল প্রোটিন গ্রহণ বজায় রাখার চাবিকাঠি। মাংস, মুরগি, মাছ, মটরশুটি, ডিম, দুগ্ধজাত দ্রব্য, শস্য, বাদাম এবং বীজের মতো প্রোটিন সমৃদ্ধ খাবার খেয়ে মানুষ তাদের শরীরের প্রোটিনের চাহিদা পূরণ করতে পারে। এছাড়াও, পরিমিত ব্যায়াম শরীরের প্রোটিনের চাহিদা এবং শোষণ দক্ষতা বাড়াতে পারে। একটি সুষম এবং বৈচিত্র্যময় খাদ্য এবং একটি স্বাস্থ্যকর জীবনধারা অনাক্রম্যতা বজায় রাখার, শরীরকে সুস্থ ও স্থিতিশীল রাখার এবং রোগের আক্রমণকে প্রতিরোধ করার চাবিকাঠি। এই দৃষ্টিকোণ থেকে, আমাদের রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা উন্নত করতে হবে। Cistanche উল্লেখযোগ্যভাবে অনাক্রম্যতা উন্নত করতে পারে কারণ মাংসের পলিস্যাকারাইডগুলি মানুষের ইমিউন সিস্টেমের ইমিউন প্রতিক্রিয়া নিয়ন্ত্রণ করতে পারে, ইমিউন কোষের স্ট্রেস ক্ষমতা উন্নত করতে পারে এবং ইমিউন কোষের অনাক্রম্যতা বাড়াতে পারে। ব্যাকটেরিয়াঘটিত প্রভাব।

cistanche deserticola সম্পূরক ক্লিক করুন

এটি আমাদের অনুরূপ মোটিফগুলি প্যাথোজেন পৃষ্ঠগুলিতে পাওয়া যেতে পারে কিনা তা অন্বেষণ করতে প্ররোচিত করেছিল, যেখানে তারা সাবস্ট্রেট স্বীকৃতির জন্য একটি প্রক্সি হিসাবে কাজ করতে পারে। এখানে, আমরা দেখাই যে হোস্ট ইউবিকুইটিন লিগাসেস ফাইলোজেনেটিকভাবে স্বতন্ত্র প্যাথোজেনগুলি বোঝার জন্য অনুরূপ আণবিক স্বাক্ষর ব্যবহার করে। সাধারণ আণবিক নিদর্শন/মোটিফস (PAMPs) এর মাধ্যমে প্যাথোজেন স্বীকৃতি সহজাত অনাক্রম্যতার একটি ভাল বৈশিষ্ট্যযুক্ত বৈশিষ্ট্য (42)। আমাদের ফলাফলগুলি পরামর্শ দেয় যে ব্যাকটেরিয়া পৃষ্ঠের প্রোটিনের মধ্যে ডিগ্রন-সদৃশ ক্রমগুলি অন্তঃকোষীয় প্যাথোজেন নজরদারি প্রদানের জন্য PAMP-এর সমতুল্যভাবে কাজ করে। আন্তঃকোষীয় রোগজীবাণুগুলির বিরুদ্ধে নির্দেশিত একটি শক্তিশালী CD8 প্রতিক্রিয়া প্ররোচিত করতে প্রধান হিস্টোকম্প্যাটিবিলিটি কমপ্লেক্স I-তে মাইক্রোবিয়াল প্রোটিন অ্যান্টিজেনগুলির উপস্থাপনার জন্য হোস্ট দ্বারা এই পদ্ধতিটি আরও কাজে লাগানো যেতে পারে।

হোস্ট ডিফেন্সের জন্য প্যাথোজেনগুলির ইউবিকুইটিন-মধ্যস্থতা সনাক্তকরণের সম্ভাব্য গুরুত্ব আরও হাইলাইট করা হয়েছে মিউট্যান্ট এসপিএন-এ সনাক্ত করা উল্লেখযোগ্য অবশিষ্ট সর্বব্যাধিকরণ দ্বারা যা BgaA এবং PspA উভয়েরই অভাব রয়েছে। এটি ইঙ্গিত দেয় যে ইউবিকুইটিন মেশিনের আরও, অজ্ঞাত সাবস্ট্রেট রয়েছে, যার ফলে অপ্রয়োজনীয়তা শক্তিশালী প্যাথোজেন বাধা নিশ্চিত করে। উল্লেখযোগ্যভাবে, ডিগ্রন মোটিফ এবং ব্যাকটেরিয়ার জন্য এর গুরুত্ব সম্পর্কে কিছু তাৎক্ষণিক প্রশ্ন (একটি স্বীকৃত ইউনিট ছাড়া) একটি আকর্ষণীয় বিবর্তনীয় কোণ প্রদান করে।

ডিগ্রন মোটিফটি ভিভোতে সরবরাহযোগ্য, এবং যদি কিছু হয়, মোটিফটি পরিবর্তন করা বা মুছে ফেলার ফলে অন্তঃকোষীয় অধ্যবসায় উন্নত হয় যার ফলে ভাইরুলেন্স বৃদ্ধি পায়। এটি আমাদের ফলাফল দ্বারা প্রমাণিত হয় যে ডিগ্রন মোটিফের মিউটেশনটি SPN সেরোটাইপ 19F-এর মতো ইউবিকুইটিন-মধ্যস্থিত স্বীকৃতি এড়াতে প্যাথোজেন দ্বারা ব্যবহার করা যেতে পারে। যাইহোক, বেশিরভাগ SPN সেরোটাইপ জুড়ে BgaA-তে ডিগ্রন মোটিফের সংরক্ষিত প্রকৃতি হোস্টের জন্য কম প্রাণঘাতী হওয়ার জন্য ব্যাকটেরিয়া দ্বারা গৃহীত পাল্টা কৌশলের ইঙ্গিত দিতে পারে।

এটি প্যাথোজেনকে তার দখলযোগ্য আবাসস্থল বাড়ানোর সুযোগ প্রদান করতে পারে। একইসঙ্গে, ব্যাকটেরিয়া পৃষ্ঠের সর্বব্যাপীকরণ বা ডিগ্রন মোটিফে নিঃসৃত প্রোটিন তাদের কার্যকরীভাবে সংশোধিত করতে পারে যাতে চূড়ান্ত সুবিধার জন্য হোস্টের প্রতিক্রিয়াকে স্যাঁতসেঁতে বা পুনঃওয়ায়ার করতে পারে (43)। অতএব, ইউক্যারিওটিক-সদৃশ কার্যকরী ডোমেন বা মোটিফের উপস্থিতি বা অনুপস্থিতি (যেমন ডিগ্রন) একটি প্যাথোজেনিক কুলুঙ্গির উপর নির্ভরশীল হতে পারে এবং হোস্ট ইমিউন প্রতিক্রিয়া এড়াতে বা সংশোধন করার জন্য অভিযোজিত হতে পারে।

গুয়ানিলেট বাইন্ডিং প্রোটিন জড়িত একটি অনুরূপ প্যাথোজেন সেন্সিং প্রক্রিয়া ব্যাকটেরিয়া ক্লিয়ারেন্সেও জড়িত; যাইহোক, সর্বব্যাপী হওয়ার বিপরীতে, তাদের ভূমিকা গ্রাম-নেতিবাচক প্যাথোজেনের মধ্যে সীমাবদ্ধ বলে জানা গেছে (44-47)। গ্রাম উৎপত্তি নির্বিশেষে সর্বব্যাপীকরণ প্যাথোজেনকে লক্ষ্য করে, উদাহরণস্বরূপ, লিস্টেরিয়া এসপিপিকে লক্ষ্য করার জন্য RNF213 নথিভুক্ত করা হয়েছে। LPS (48) এর অনুপস্থিতি নির্বিশেষে। আমরা, তাই, SPN-এর বিরুদ্ধেও এর অ্যান্টিমাইক্রোবিয়াল অ্যাকশনের সম্ভাবনা বাদ দিই না।

একটি প্যাথোজেনিক পৃষ্ঠকে আন্তঃচেইন মিথস্ক্রিয়া (41) সহ বিভিন্ন E3 ligases দ্বারা একাধিক চেইন প্রকারের সাথে সর্বব্যাপী করা যেতে পারে। বিশেষ করে, Mtb-এর ক্ষেত্রে Smurf1, এবং Parkin কে K48 এবং K63 চেইন টাইপ গঠন করতে প্রমাণিত হয়েছে যেগুলি প্যাথোজেনকে (12) অবনমিত করার জন্য সিনারজিস্টিকভাবে কাজ করে। K48 সর্বব্যাপীকরণের যান্ত্রিক ভূমিকা বোঝা এবং সংক্রমণের পরিস্থিতিতে জড়িত E3 ligases এখনও অধ্যয়ন করা হয়েছে। STm-এর ক্ষেত্রে, একটি একক E3 ligase ARIH1 কে K48 ইউবিকুইটিন চেইন সহ সাইটোসোলিক STm লক্ষ্য করার জন্য চিত্রিত করা হয়েছে যা সিস্টেম থেকে তাদের নির্মূলের দিকে নিয়ে যায় (15)। আমাদের এবং অন্যদের অনুসন্ধানের উপর ভিত্তি করে, কে48-ইউবি-লেবেলযুক্ত প্যাথোজেনগুলি প্রোটিসোমাল যন্ত্রপাতির সাথে যুক্ত থাকার সময় শেষ পর্যন্ত অবনমিত হয়।

যাইহোক, এই গবেষণায় K48-বিশেষ ব্যাকটেরিয়া পৃষ্ঠের প্রোটিনের অলঙ্করণ দেখায়। কিছু প্যাথোজেন সক্রিয়ভাবে তাদের পৃষ্ঠের প্রোটিনগুলিকে পরিবর্তন করতে পরিচিত, তাদের সর্বব্যাপীকরণ এবং পরবর্তী হত্যা থেকে রক্ষা করে, এইভাবে ইউবিকুইটিন সাবস্ট্রেটের পৃষ্ঠ স্থানীয়করণের তাত্পর্যকে জোর দেয় (10)। উপরন্তু, একাধিক বাধ্যতামূলক অন্তঃকোষীয় রোগজীবাণু ইউবিকুইটিন-মধ্যস্থ ক্লিয়ারেন্স এড়ানোর জন্য নিজেদেরকে, বা নিয়ন্ত্রক উপাদানগুলিকে হোস্ট করার কৌশলগুলি বিকশিত করেছে (5)। একত্রে, এই ফলাফলগুলি হোস্ট প্রতিরক্ষার কেন্দ্রীয় একটি মৌলিক আন্তঃকোষীয় প্যাথোজেন সেন্সিং প্রক্রিয়া হিসাবে ইউবিকুইটিন-মধ্যস্থতাযুক্ত অ্যালার্ম উত্তেজনার গুরুত্বকে আন্ডারস্কোর করে।

আমাদের গবেষণায় SCF E3 ligase-এর কেন্দ্রীয় ভূমিকা, বিশেষত FBXW7-এর সাথে, ব্যাকটেরিয়া সর্বজনীনতা বৃদ্ধিকারী প্যাথোজেন অবক্ষয়ের ক্ষেত্রে আরও প্রদর্শন করেছে। FBXW7-এ হেটেরোজাইগাস মিউটেশন, বিশেষ করে R505C (সাবস্ট্রেট রিকগনিশন পকেটে একটি গুরুত্বপূর্ণ অবশিষ্টাংশ) বৈকল্পিক, মানুষের মধ্যে একাধিক কার্সিনোমা এবং লিম্ফোসাইটিক লিউকেমিয়া ট্রিগার করে (49, 50)। একটি সাম্প্রতিক সমগোত্র-ভিত্তিক সমীক্ষায় ইঙ্গিত দেওয়া হয়েছে যে দীর্ঘস্থায়ী লিম্ফোসাইটিক লিউকেমিয়া (সিএলএল) রোগীদের প্রায় 43 শতাংশ ব্যাকটেরিয়া নিউমোনিয়া এবং সেপসিসে আক্রান্ত হয়, তারপরে ছত্রাক সংক্রমণ (51)।

এটি প্যাথোজেনগুলিকে বোঝা এবং নির্মূল করার জন্য FBXW7 মিউটেশন বহনকারী হোস্ট কোষগুলির বাতিল ক্ষমতার আমাদের পর্যবেক্ষণকে সমর্থন করে। আমাদের অনুসন্ধানগুলি, তাই, সিএলএল রোগীদের সংক্রমণের বর্ধিত ঝুঁকির একটি অপ্রত্যাশিত আণবিক ব্যাখ্যা প্রদান করে। E3 ligase জিনে জেনেটিক পলিমরফিজম এবং ব্যাকটেরিয়া সংক্রমণের সংবেদনশীলতার মধ্যে যোগসূত্র পারকিনসন্স রোগে আক্রান্ত রোগীদের দ্বারাও প্রমাণিত হয়, যারা টাইফয়েড জ্বর বা কুষ্ঠরোগে (14) ঝুঁকিপূর্ণ, ব্যাকটেরিয়া সংক্রমণের বিরুদ্ধে হোস্ট অনাক্রম্যতা এবং প্রধান রোগ প্রতিরোধে E3 লিগাসের উল্লেখযোগ্য অবদানের পরামর্শ দেয়। সেলুলার স্থির অবস্থার।

উপসংহারে, আমরা সাইটোসল-আবাসিক রোগজীবাণু সংবেদন করার একটি সর্বজনীন ভাষা ব্যাখ্যা করেছি যা পরবর্তী নির্মূলের জন্য অণুজীবগুলিকে চিনতে হোস্ট দ্বারা দক্ষতার সাথে প্রয়োগ করা যেতে পারে। সমষ্টিগতভাবে, এই ফলাফলগুলি প্রাথমিক সেলুলার ইমিউন প্রক্রিয়াগুলি বোঝার উপর আলোকপাত করে, যা অ্যান্টিব্যাকটেরিয়াল অনাক্রম্যতাকে তীব্র করার জন্য ব্যবহার করা যেতে পারে।

উপকরণ এবং পদ্ধতিসমূহ

সেল সংস্কৃতি

উভয় মানুষের ফুসফুসের অ্যালভিওলার কার্সিনোমা (টাইপ II নিউমোসাইট) সেল লাইন A549 [আমেরিকান টাইপ কালচার কালেকশন (ATCC) নং। CCL185)] এবং সার্ভিকাল অ্যাডেনোকার্সিনোমা সেল লাইন HeLa (ATCC নং CRM-CCL-2) Dulbecco-এর পরিবর্তিত ঈগলস মিডিয়ামে (DMEM; HiMedia) 10 শতাংশ ভ্রূণের বোভাইন সিরাম (Gibco) এবং 537 ডিগ্রিতে পরিপূরক করা হয়েছিল। CO2 শতাংশ।

ব্যাকটেরিয়া স্ট্রেন এবং বৃদ্ধি শর্ত

SPN (R6, serotype 2, Tim J. Mitchell, University of Burmingham, United Kingdom) থেকে গিফট করা হয়েছে টড-হেউইট ব্রোথের সাথে সম্পূরক 1.5 শতাংশ খামির নির্যাস 37 ডিগ্রিতে 5 শতাংশ CO2। নিম্নোক্ত অ্যান্টিবায়োটিকগুলি যখন প্রয়োজন হয় তখন SPN সংস্কৃতি বৃদ্ধির জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল: কানামাইসিন (200 ug/ml), স্পেকটিনোমাইসিন (100 ug/ml), এবং ক্লোরামফেনিকল (4.5 ug/ml)। 0.4 OD600 এর নয়শ মাইক্রোলিটার (600 nm-এ অপটিক্যাল ঘনত্ব) বর্ধিত SPN কালচারকে 80 শতাংশ জীবাণুমুক্ত গ্লিসারল (32 শতাংশ চূড়ান্ত গ্লিসারল ঘনত্ব) 600 ul এর সাথে মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং একটি −80 ডিগ্রি ডিপ ফ্রিজারে সংরক্ষণ করা হয়েছিল। এই গ্লিসারল স্টকগুলি সমস্ত পরীক্ষার জন্য প্রাথমিক ইনোকুলাম হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।

Escherichia coli DH5 এবং STm (ATCC 14028) কালচারগুলি লুরিয়া-বারটানি ব্রোথে (LB) 37 ডিগ্রীতে কাঁপানো অবস্থায় (200 rpm) উত্থিত হয়েছিল এবং যখন প্রয়োজন হয়, নিম্নলিখিত অ্যান্টিবায়োটিকগুলি ব্যবহার করা হয়েছিল: কানামাইসিন (50) ug/ml), spectinomycin (100 ug/ml), ক্লোরামফেনিকল (20 ug/ml), এবং ampicillin (100 ug/ml)। সমস্ত সংক্রমণ পরীক্ষার জন্য, ব্যাকটেরিয়াগুলি OD600 ~ 0.4 পর্যন্ত বৃদ্ধি পেয়েছিল, তারপরে হোস্ট কোষগুলিকে সংক্রামিত করার আগে ফসফেট-বাফারযুক্ত স্যালাইনে (PBS) একই ঘনত্বে পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল।

পুটেটিভ ইউবিকুইটিন টার্গেট প্রোটিনের স্ক্রীনিং

এসটিএম এবং এসপিএন প্রোটোমে উপস্থিত সমস্ত পৃষ্ঠের প্রোটিনগুলি প্রথম প্রকাশিত সাহিত্য থেকে সনাক্ত করা হয়েছিল। ইউনিপ্রট থেকে পৃষ্ঠের প্রোটিনগুলির সম্পূর্ণ প্রোটিন ক্রমগুলি প্রাপ্ত হয়েছিল, যা তখন ডিগ্রন মোটিফগুলির উপস্থিতি সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। প্রকাশিত সাহিত্য (24, 52, 53) এবং ইউক্যারিওটিক লিনিয়ার মোটিফ ডেটাবেস থেকে 29টি পুটেটিভ ডিগ্রন মোটিফের একটি সেট তৈরি করা হয়েছিল। পাইথনের রেজেক্স মডিউলটি পৃষ্ঠের প্রোটিন সিকোয়েন্সে এই জাতীয় সমস্ত কিউরেটেড মোটিফের অবস্থান সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। প্রতিটি চিহ্নিত ডিগ্রন মোটিফের কাছাকাছি একটি লাইসিন অবশিষ্টাংশের (8 থেকে 14 অ্যামিনো অ্যাসিড অবশিষ্টাংশ) উপস্থিতি সনাক্ত করতে একটি রৈখিক অনুসন্ধান আরও সঞ্চালিত হয়েছিল। এই লাইসিন অবশিষ্টাংশটি ইউবিকুইটিন ময়েটির সংযুক্তি সাইট হিসাবে কাজ করে বলে মনে করা হয়। সর্বশেষ, শর্টলিস্ট করা প্রোটিন সিকোয়েন্সগুলিকে আইইউপিরেড (54) এ খাওয়ানো হয়েছিল, একটি প্রোটিন কাঠামোর পূর্বাভাস দেওয়ার সরঞ্জাম, ডিগ্রন মোটিফ এবং প্রক্সিমাল লাইসিনের মধ্যে একটি বিকৃত অঞ্চলের উপস্থিতি সনাক্ত করতে। ফলস্বরূপ প্রোটিনগুলি (SPN-এর জন্য BgaA এবং PspA এবং STm-এর জন্য RlpA) সর্বব্যাপী লক্ষ্য এবং প্যাথোজেন ক্লিয়ারেন্সে তাদের ভূমিকার ডিকোডিং হিসাবে মূল্যায়নের জন্য নির্বাচিত হয়েছিল।

ব্যাকটেরিয়া স্ট্রেন নির্মাণ

SPN এবং STm (টেবিল S2) উভয় ক্ষেত্রেই মিউট্যান্ট স্ট্রেন তৈরির জন্য একটি সন্নিবেশিত অ্যান্টিবায়োটিক ক্যাসেট বহনকারী জিন ফ্ল্যাঙ্কিং অঞ্চলগুলি ব্যবহার করে সমজাতীয় পুনর্মিলনের মাধ্যমে অ্যালিলিক বিনিময় করা হয়েছিল।

SPN-এর জন্য, bgaA, pspA-এর আপস্ট্রিম এবং ডাউনস্ট্রিম অঞ্চল 500-bp এবং তার জিনগুলিকে উপযুক্ত প্রাইমার (টেবিল S3) সহ জিনোম থেকে বিবর্ধিত করা হয়েছিল এবং pBKS ভেক্টরে একত্রিত করা হয়েছিল। এই টুকরোগুলির ক্লোনিং করার পরে, একটি অ্যান্টিবায়োটিক প্রতিরোধের ক্যাসেট (ব্যাগের জন্য স্পেকটিনোমাইসিন পাশাপাশি pspA এবং hysA-এর জন্য ক্লোরামফেনিকল) এই গঠনে ঢোকানো হয়েছিল। লিনিয়ারাইজড রিকম্বিন্যান্ট প্লাজমিডগুলি তারপরে সক্ষমতা উদ্দীপক পেপটাইড 1 (জেনপ্রো বায়োটেক) ব্যবহার করে WT SPN-এ রূপান্তরিত হয়েছিল, সংশ্লিষ্ট অ্যান্টিবায়োটিক ব্যবহার করে রিকম্বিন্যান্টগুলি নির্বাচন করা হয়েছিল এবং পলিমারেজ চেইন রিঅ্যাকশন (PCR) এবং সংশ্লিষ্ট জিন লোকির সিকোয়েন্সিং দ্বারা জিন প্রতিস্থাপন নিশ্চিত করা হয়েছিল। STm-এর জন্য, λ-red recombinase পদ্ধতিটি জিন মুছে ফেলা মিউট্যান্ট (55) প্রজন্মের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল।

সংক্ষেপে, কানামাইসিন রেজিস্ট্যান্স ক্যাসেটের পরিবর্ধনের জন্য ব্যবহৃত প্রাইমার সিকোয়েন্সে দড়ির জিনের প্রান্তে সমজাতীয় ক্রমগুলি যুক্ত করা হয়েছিল। ক্যাসেটটি তখন ডাব্লুটি এসটিএম স্ট্রেনে ইলেক্ট্রোপোরেট করা হয়েছিল, এবং কানামাইসিন প্রতিরোধের উপর ভিত্তি করে সমজাতীয় পুনঃসংযোগের দ্বারা তৈরি নকআউটগুলি নির্বাচন করা হয়েছিল। পিসিআর এবং জিন লোকাসের সিকোয়েন্সিং ব্যবহার করে জিন মুছে ফেলার বিষয়টি নিশ্চিত করা হয়েছিল। শাটল ভেক্টর pIB166 (56) এ P23 প্রোমোটারের অধীনে পূর্ণদৈর্ঘ্য pspA, hysA, এবং একটি কাটা bgaA-T (1 থেকে 3168 bp) ক্লোন করা হয়েছিল এবং পরিপূরক হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল।

এই রিকম্বিনেন্ট প্লাজমিডগুলি সাইট-নির্দেশিত মিউটাজেনেসিসের জন্যও ব্যবহার করা হয়েছিল bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R, এবং bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, psp314R, psp314R, ksp313sp, K3sp5R, K97R, bgaA-TK97R) তৈরি করতে। রন ), এবং তার (hysADegron-BgaA এবং hysADegron-PspA) উপযুক্ত প্রাইমার সেট ব্যবহার করে (টেবিল S3) এবং ΔbgaA এবং ΔpspA মিউট্যান্টে রূপান্তরিত হয়েছে। সমস্ত ক্লোন ডিএনএ সিকোয়েন্সিং দ্বারা যাচাই করা হয়েছিল। BgaA, PspA এবং HysA এর বিভিন্ন রূপের অভিব্যক্তি যথাযথ অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে পশ্চিমা ব্লট দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল।

অ্যান্টিবডি এবং বিকারক

অ্যান্টি-এনোলেস এবং অ্যান্টি-পিএসপিএ সিরাম (এস. হ্যামারশমিড, গ্রিফসওয়াল্ড বিশ্ববিদ্যালয়, জার্মানি); অ্যান্টি-BgaA সিরাম (এস. কিং, ওহিও স্টেট ইউনিভার্সিটি, মার্কিন যুক্তরাষ্ট্র); এবং His6 (Invitrogen, MA1-21315), K48-Ub লিঙ্কেজ (মিলিপুর, 05-1307), K63-Ub লিঙ্কেজ (মিলিপুর, 14-6077-80 এর জন্য নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডিগুলি ), প্লাই (সান্তা ক্রুজ বায়োটেকনোলজি, sc-80500), FBXW7 (বেথাইল ল্যাবরেটরিজ, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} }), গ্লিসারালডিহাইড ফসফেট ডিহাইড্রোজেনেস (মিলিপুর, MAB374), GSK3 [সেল সিগন্যালিং টেকনোলজি (CST), D5C5Z], phosphothreonine (CST, 9381S), IgA, মুরিন মায়লোমা থেকে কাপ্পা, ক্লোন TEPC ({21}}-আল M1421), এবং PSMB7 (Invitrogen, PA5-111404) সংগ্রহ করা হয়েছিল৷ নিম্নলিখিত সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলি ব্যবহার করা হয়েছিল: হর্সরাডিশ পারক্সিডেস (এইচআরপি)-ট্যাগ করা অ্যান্টি-র্যাবিট (বায়োলিজেন্ড, 406401), এইচআরপি-ট্যাগযুক্ত অ্যান্টি-মাউস (বায়োলিজেন্ড 405306), অ্যান্টি-র্যাবিট অ্যালেক্সা ফ্লুর 488 (ইনভিট্রোজেন, এ27206), অ্যান্টি-র্যাবিট অ্যালেক্সা Fluor 555 (Invitrogen, A31572), বায়োটিন-সংযোজিত অ্যান্টি-মাউস ইমিউনোগ্লোবুলিন A (লাইফ টেকনোলজিস, M31115), অ্যান্টি-মাউস আলেক্সা ফ্লুর (ইনভিট্রোজেন, A31570), অ্যান্টি-মাউস অ্যালেক্সা ফ্লুর 488 (ইনভিট্রোজেন, অ্যান্টি-মাউস 22, অ্যান্টি-মাউস) Fluor 633 (Invitrogen, A21082), এবং FM4-64 (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক, T13320)।

প্রোটিন প্রকাশ এবং পরিশোধন

BgaA-T এবং এর রূপগুলি Xba I/Not I সীমাবদ্ধতা সাইটগুলি ব্যবহার করে pET28 এ ক্লোন করা হয়েছিল৷ এন-টার্মিনাল হিস-ট্যাগ সহ BgaA-T এনকোডিং রিকম্বিন্যান্ট প্লাজমিডগুলি প্রোটিন প্রকাশের জন্য E. coli BL21 (DE3) কোষে রূপান্তরিত হয়েছিল। 12 ঘন্টার জন্য শেকার ইনকিউবেটরে 37 ডিগ্রীতে কানামাইসিন (50 ug/ml) ধারণকারী LB-তে নতুনভাবে রূপান্তরিত উপনিবেশ জন্মানো হয়েছিল। প্রাথমিক সংস্কৃতির এক শতাংশ 1 লিটার এলবি ব্রোথে যোগ করা হয়েছিল এবং OD600nm 0.6 এবং 0.8-এর মধ্যে পৌঁছানো পর্যন্ত একটি শেকার ইনকিউবেটরে 37 ডিগ্রিতে ইনকিউব করা হয়েছিল। প্রোটিন এক্সপ্রেশন 100 μM আইসোপ্রোপাইল- -ডি-থিওগাল্যাক্টোপিরানোসাইড (IPTG) যোগ করে এবং 150 rpm-এ আন্দোলনের সাথে 5 থেকে 6 ঘন্টার জন্য 37 ডিগ্রিতে সংস্কৃতিকে আরও বৃদ্ধি করে।

4 ডিগ্রিতে 10 মিনিটের জন্য 6000 rpm-এ সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে কোষগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল। সেল পেলেটটি বাফার এ [25 মিমি ট্রিস (পিএইচ 8.0) এবং 300 এমএম NaCl] এ পুনরায় সাসপেন্ড করা হয়েছিল এবং সোনিকেশন দ্বারা লাইজড করা হয়েছিল। কোষের ধ্বংসাবশেষ সেন্ট্রিফিউগেশন (14,000 rpm, 50 মিনিট, 4 ডিগ্রি) দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল এবং সুপারনাট্যান্টকে একটি Ni-NTA কলামে প্রয়োগ করা হয়েছিল, বাফার A দিয়ে ভারসাম্যপূর্ণ। কলামটি 10টি কলাম ভলিউম বাফার দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল A, এবং হিস-ট্যাগযুক্ত প্রোটিনগুলিকে বাফার A-তে ইমিডাজল (250 মিমি) দিয়ে বিলুপ্ত করা হয়েছিল। BgaA-T-এর সমস্ত রূপ একই পদ্ধতি ব্যবহার করে প্রকাশ এবং বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। FBXW7-কে pGEX-4 T-1 ভেক্টরে সাবক্লোন করা হয়েছিল pCMV6-Entry-FBXW7 ভেক্টর থেকে Eco RI সীমাবদ্ধতা এনজাইম ব্যবহার করে একটি N-টার্মিনাল গ্লুটাথিয়ন S-ট্রান্সফারেস (GST) ট্যাগ রয়েছে৷

GST-ট্যাগযুক্ত FBXW7 E. coli BL21 (DE3) কোষে 0.1 mM IPTG এর সাথে প্রোটিন এক্সপ্রেশন এবং 4 ঘন্টার জন্য 30 ডিগ্রীতে বৃদ্ধির পরে প্রকাশ করা হয়েছিল। ই. কোলি অশোধিত নির্যাস থেকে GST-FBXW7 Glutathione-Sepharose (GE HealthCare) কলাম ক্রোমাটোগ্রাফি ব্যবহার করে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। 4 ডিগ্রিতে 4700 rpm-এ সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে একটি 10-kDa আণবিক ওজন কাটঅফ ফিল্টার (Amicon) ব্যবহার করে বিশুদ্ধ প্রোটিন ধারণকারী ভগ্নাংশগুলিকে 0.5 মিলিগ্রাম/মিলি পর্যন্ত ঘনীভূত করা হয়েছিল। প্রোটিনের বিশুদ্ধতা এসডিএস-পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস (এসডিএস-পেজ) এর পরে কুমাসি নীল দিয়ে দাগ দিয়ে পরীক্ষা করা হয়েছিল।

হোস্ট সেল ট্রান্সফেকশন

BgaA-T একটি ইনফিউশন ক্লোনিং কিট (টাকারা) ব্যবহার করে ডক্সিসাইক্লিন-ইনডিউসিবল ভেক্টর pAK_Tol2_TRE_Blast (Addgene no. 130261) ক্লোন করা হয়েছিল। স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং দ্বারা একটি ইতিবাচক ক্লোন নিশ্চিত করা হয়েছিল। FBXW7R505C মিউটেশন একটি টেমপ্লেট হিসাবে pMRX-GFP-FBXW7 ব্যবহার করে সাইট-নির্দেশিত মিউটাজেনেসিস দ্বারা পরিচালিত হয়েছিল এবং সেঞ্জার সিকোয়েন্সিং দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল। সমস্ত ট্রান্সফেকশন লিপোফেক্টামিন 3000 রিএজেন্ট (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল এবং ব্লাস্টিসিডিন হাইড্রোক্লোরাইড (2 ug/ml; HiMedia) এর উপস্থিতিতে নির্বাচন করা হয়েছিল।

siRNA-নির্দেশিত জিন নকডাউন

নির্দিষ্ট জিনের RNA হস্তক্ষেপ-মধ্যস্থিত নকডাউনের জন্য, নিম্নলিখিত siRNA গুলি ব্যবহার করা হয়েছিল: siFBW7 (ধর্মাকন অন-টার্গেট স্মার্টপুল L-004246-00-0005), siCullin1 (কিয়াজেন, 1027423), siSKP1 (কিয়াজেন, SI003018) এবং ওএসআইএনটিজিআরএসআইএনটিএসআইআরএনএএসকে 9188 স্মার্টপুল এল-003010-00-0005)। সংক্ষেপে, একটি কূপ প্লেটে উত্থিত A549 কোষগুলিকে ক্ষণস্থায়ীভাবে জিন-নির্দিষ্ট siRNA বা স্ক্র্যাম্বল (siControl) (150 pmol) লিপোফেক্টামিন 3000 ব্যবহার করে প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল। ট্রান্সফেকশনের ছত্রিশ ঘন্টা পরে, কোষগুলিকে ওয়েস্টার্ন ব্লটিং এবং ইমিউনোফ্লোরোসেন্স বা পেনিসিলিন-জেন্টামাইসিন সুরক্ষা অ্যাসেসের জন্য প্রক্রিয়া করা হয়েছিল।

কাঠামোর পূর্বাভাস এবং মডেলিং

সমস্ত কাঠামো AlphaFold (প্রোটিন হোমোলজি/অ্যানালজি রিকগনিশন ইঞ্জিন V 20) (57) দ্বারা ভবিষ্যদ্বাণী করা হয়েছিল এবং PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, version 2.0 Schrödinger, LLC) ব্যবহার করে কল্পনা করা হয়েছিল। IUPred (54) স্কোরের উপর ভিত্তি করে PyMol-এ স্ট্রাকচারগুলি কালার-কোড করা হয়েছিল অর্ডারকৃত (নীল) থেকে বিকৃত (লাল) থেকে সাদা পর্যন্ত।

পশ্চিমা শোষক

SPN কালচারগুলিকে {{0}}.4 OD600nm lysed করা হয়েছিল sonication দ্বারা, এবং অপরিশোধিত নির্যাসগুলিকে সেন্ট্রিফিউগেশন (15,000 rpm, 30 মিনিট, 4 ডিগ্রি) অনুসরণ করে সংগ্রহ করা হয়েছিল৷ A549s-এর জন্য, মনোলেয়ারগুলিকে PBS দিয়ে বেশ কয়েকবার ধুয়ে বরফ-ঠাণ্ডা রেডিওইমিউনোপ্রেসিপিটেশন অ্যাসে (RIPA) বাফার [50 mM tris-Cl (pH 7.89), 150 mM NaCl, 1 শতাংশ Triton X-100, 0.5 শতাংশ ium-এ লাইস করা হয়েছিল। deoxycholate, এবং 1 শতাংশ SDS] প্রোটেজ ইনহিবিটর ককটেল (প্রোমেগা), সোডিয়াম ফ্লোরাইড (10 মিমি), এবং EDTA (5 মিমি) ধারণকারী। সেল সাসপেনশনটি সংক্ষিপ্তভাবে সোনিকেটেড এবং সেল লাইসেট সংগ্রহের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। ব্যাকটেরিয়া বা A549 সেল লাইসেট (10 বা 20 ug) এ উপস্থিত প্রোটিনগুলি 12 শতাংশ SDS-PAGE জেলগুলিতে পৃথক করা হয়েছিল এবং একটি সক্রিয় পলিভিনাইলডিন ডিফ্লুরাইড ঝিল্লিতে স্থানান্তরিত হয়েছিল। 5 শতাংশ স্কিমড দুধে ব্লক করার পরে, মেমব্রেনগুলি যথাযথ প্রাথমিক এবং এইচআরপি-ট্যাগযুক্ত সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দিয়ে পরীক্ষা করা হয়েছিল। ব্লটগুলি শেষ পর্যন্ত একটি বর্ধিত কেমিলুমিনেসেন্স সাবস্ট্রেট (বায়ো-র্যাড) ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল।
পেনিসিলিন-জেন্টামাইসিন সুরক্ষা পরীক্ষা

OD600nm 0.4 পর্যন্ত বেড়ে ওঠা SPN স্ট্রেনগুলি টড-হিউইট ব্রোথে পরিপূরক 0.2 শতাংশ খামির নির্যাস (THY) পিবিএস (PBS) এ পুনঃস্থাপন করা হয়েছিল pH 7.4), এবং 10 এর বহুগুণ সংক্রমণ (MOI) সহ A549 monolayers-এর সংক্রমণের জন্য অ্যাস মিডিয়াতে মিশ্রিত করা হয়। সংক্রমণের 1 ঘন্টা পরে, monolayers DMEM দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয় এবং পেনিসিলিন (10 ug/ml) সমন্বিত একটি অ্যাস মিডিয়াম দিয়ে ইনকিউব করা হয়। ) এবং জেন্টামাইসিন (400 ug/ml) 2 ঘন্টার জন্য এক্সট্রা সেলুলার SPN মেরে ফেলুন। তারপর কোষগুলিকে 0.025 শতাংশ ট্রাইটন এক্স-100 দিয়ে লাইসেট করা হয়েছিল, এবং কার্যকর SPN গণনা করার জন্য ব্রেন হার্ট ইনফিউশন আগর প্লেটে লাইসেট প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল। শতকরা আক্রমণ হিসাবে গণনা করা হয়েছিল [সংক্রমণের জন্য ব্যবহৃত লাইসেট/সিএফইউতে কলোনিফর্মিং ইউনিট (সিএফইউ)] × 100। আন্তঃকোষীয় বেঁচে থাকার মূল্যায়ন করার জন্য, সংক্রমণের 9 ঘন্টা পরে (পেনিসিলিন-জেন্টামাইসিন চিকিত্সার শুরু থেকে), সেল লাইসেটগুলি প্রস্তুত করা হয়েছিল। উপরে উল্লিখিত, এবং স্প্রেড প্লেটেড এবং বেঁচে থাকা ব্যাকটেরিয়া গণনা করা হয়েছিল। সারভাইভাল এফিসিয়েন্সি ( শতাংশ ) নির্দেশিত সময় পয়েন্টে নিয়ন্ত্রণের সাপেক্ষে শতাংশ বেঁচে থাকার একটি ভাঁজ পরিবর্তন হিসাবে উপস্থাপিত হয়েছিল (0 ঘন্টা স্বাভাবিক করা হয়েছে)।

ইমিউনোফ্লোরেসেন্স

ইমিউনোফ্লুরোসেন্স অ্যাসের জন্য, A549 বা HeLa কোষগুলি কাচের কভারস্লিপগুলিতে জন্মানো হয়েছিল এবং 1 ঘন্টার জন্য MOI ~25 এ SPN বা STm স্ট্রেন দ্বারা সংক্রামিত হয়েছিল এবং তারপরে 2 ঘন্টা অ্যান্টিবায়োটিক চিকিত্সা করা হয়েছিল। সংক্রমণের পরে কাঙ্ক্ষিত সময়ে (A549s-এ SPN সংক্রমণের জন্য 9 ঘন্টা এবং HeLa-তে STm সংক্রমণের জন্য 3 ঘন্টা), কোষগুলিকে DMEM দিয়ে ধুয়ে 10 মিনিটের জন্য −20 ডিগ্রিতে বরফ-ঠাণ্ডা মিথানল দিয়ে স্থির করা হয়েছিল। আরও, কভারস্লিপগুলি পিবিএস-এ 3 শতাংশ বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন (বিএসএ) দিয়ে ঘরের তাপমাত্রায় (আরটি) 2 ঘন্টার জন্য ব্লক করা হয়েছিল। তারপরে কোষগুলিকে পিবিএস-এ 1 শতাংশ বিএসএ-তে রাতারাতি 4 ডিগ্রিতে একটি উপযুক্ত প্রাথমিক অ্যান্টিবডি দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল, পিবিএস দিয়ে ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল এবং আরটি-তে 1 ঘন্টার জন্য পিবিএস-এ 1 শতাংশ বিএসএ-তে একটি উপযুক্ত সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। শেষ পর্যন্ত, কভারস্লিপগুলি পিবিএস দিয়ে ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল এবং লেজার স্ক্যানিং কনফোকাল মাইক্রোস্কোপ (এলএসএম 780, কার্ল জেইস) ব্যবহার করে ভিজ্যুয়ালাইজেশনের জন্য 4′,6-ডায়ামিডিনো-2-ফেনিলিন্ডোল (ভেক্টর ল্যাবরেটরিজ) সহ বা ছাড়া VECTASHIELD সহ কাচের স্লাইডে মাউন্ট করা হয়েছিল। ) 40× বা 63× তেলের উদ্দেশ্যের নিচে। ছবিগুলি অপটিক্যাল সেকশনিংয়ের পরে অর্জিত হয়েছিল এবং তারপর ZEN লাইট সফ্টওয়্যার (সংস্করণ 5.0) ব্যবহার করে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল। সুপার রেজোলিউশন মাইক্রোস্কোপি একইভাবে সিম মোডে Elyra 7 (Carl Zeiss) ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল। স্থানীয়করণ বিশ্লেষণের জন্য, প্রতিলিপিতে n> 100 ব্যাকটেরিয়া চাক্ষুষ গণনা দ্বারা ব্যাকটেরিয়া স্কোর করা হয়েছিল।

সংক্রমণ ইলেক্ট্রন অনুবীক্ষণ

SPN এবং STm-এর সংক্রমণের পর, কোষগুলিকে {{0}}.1 M সোডিয়াম ক্যাকোডিলেট বাফার দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল, 0.1 M সোডিয়াম ক্যাকোডিলেট বাফারে 2.5 শতাংশ গ্লুটারালডিহাইড (সিগমা-অলড্রিচ) দিয়ে স্থির করা হয়েছিল ( সিগমা-অলড্রিচ) 4 ডিগ্রিতে 3 ঘন্টার জন্য। স্থিরকরণের পরে, কোষগুলিকে একটি সেল স্ক্র্যাপারের মাধ্যমে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং 10 মিনিটের জন্য 2000 rpm-এ ছুরি দেওয়া হয়েছিল৷ তারপরে কোষগুলিকে 0.1 এম সোডিয়াম ক্যাকোডিলেট বাফার দিয়ে ধুয়ে 0.1 এম সোডিয়াম ক্যাকোডিলেট বাফারে 1 শতাংশ অসমিয়াম টেট্রোক্সাইড দিয়ে 4 ডিগ্রিতে 20 মিনিটের জন্য পোস্টফিক্স করা হয়। পরবর্তীতে ক্যাকোডিলেট বাফার এবং পাতিত জল দিয়ে ধোয়ার পরে, কোষগুলিকে 30 মিনিটের জন্য ইথানল (50, 70, 95, এবং 100 শতাংশ) এবং প্রোপিলিন অক্সাইডের ঘনত্ব বৃদ্ধিতে ডিহাইড্রেট করা হয়েছিল এবং শেষ পর্যন্ত ইপোক্সি রেজিনে এমবেড করা হয়েছিল (ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপি বাই 1403) 45 মিনিটের জন্য 75 ডিগ্রিতে পলিমারাইজেশন। পরবর্তীকালে, ক্যাপসুলগুলিকে 45 মিনিটের জন্য 95 ডিগ্রি ওভেনে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল। একটি Leica EM UC7 আল্ট্রামাইক্রোটোমে একটি হীরার ছুরি ব্যবহার করে আল্ট্রাথিন বিভাগগুলি (70 এনএম) কাটা হয়েছিল এবং 2 শতাংশ ইউরানাইল অ্যাসিটেট এবং 1 শতাংশ সীসা সাইট্রেট দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল এবং 120 KV এ ট্রান্সমিশন ইলেক্ট্রন মাইক্রোস্কোপ (Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific) ব্যবহার করে দেখা হয়েছিল৷

প্রাক্তন ভিভো সর্বব্যাপী

A549- প্রকাশকারী BgaA-T এবং এর রূপগুলিকে MG132 (5 μM) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল, এবং প্রোটিন অভিব্যক্তিগুলিকে ডক্সিসাইক্লিন (100 ug/ml) দিয়ে 24 ঘন্টার জন্য প্ররোচিত করা হয়েছিল। কোষগুলি তখন RIPA বাফারে লাইজ করা হয়েছিল, এবং নমুনাগুলি SDS-PAGE (8 শতাংশ) দ্বারা ইলেক্ট্রোফোরস করা হয়েছিল। প্রোটিন এক্সপ্রেশনের নিশ্চিতকরণ এবং BgaA-T এবং এর বিভিন্ন রূপের সর্বব্যাপীতা যথাক্রমে অ্যান্টি-BgaA এবং অ্যান্টি-K{10}}Ub অ্যান্টিবডিগুলির সাথে অনুসন্ধানের পরে ওয়েস্টার্ন ব্লট দ্বারা প্রমাণিত হয়েছিল।

ইন ভিট্রো সর্বব্যাপী

ইন ভিট্রো সর্বব্যাপী অ্যাসেসের জন্য, পূর্বে বর্ণিত হিসাবে রিকম্বিন্যান্ট প্রোটিনগুলি শুদ্ধ করা হয়েছিল (58)। SCFFBW7 E3 ligase কমপ্লেক্সটি রিকম্বিন্যান্ট 0.1 mM E1 (UBE1; বোস্টন বায়োকেম), 0.25 mM E2 (cdc34; বোস্টন বায়োকেম), এবং ubiquitin (2.5 ug/ml; বোস্টন) দিয়ে ইনকিউবেট করা হয়েছিল বায়োকেম) বিশুদ্ধ BgaA-T এবং এর রূপগুলির উপস্থিতিতে। 25 ডিগ্রীতে 2 ঘন্টার জন্য অ্যাস বাফার [50 মিমি ট্রিস (পিএইচ 8), 5 মিমি এমজিসিএল2, 5 মিমি অ্যাডেনোসিন ট্রাইফসফেট (এটিপি), 1 মিমি -মারকাপটোথেনল, এবং 0.1 শতাংশ টুইন 20] এ সর্বজনীন প্রতিক্রিয়া সঞ্চালিত হয়েছিল . প্রতিক্রিয়াগুলি 5× ল্যামেমলি বাফারের সাথে বন্ধ করা হয়েছিল, SDS-PAGE জেলগুলিতে সমাধান করা হয়েছিল এবং একটি অ্যান্টি-BgaA অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে ইমিউনোব্লটিং দ্বারা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

ইন ভিট্রো কিনাসে অ্যাস

ভিট্রো কিনেস অ্যাসে সঞ্চালনের জন্য, GSK3 kinase এনজাইম সিস্টেম (Promega) নিম্নলিখিত পরিবর্তনগুলির সাথে প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে ব্যবহৃত হয়েছিল। সংক্ষেপে, 40 mM tris, (pH 7.5), 20 mM MgCl2 দ্বারা গঠিত প্রতিক্রিয়া বাফারে 400 μM ATP সহ সক্রিয় GSK3 এর 0.5 ug সক্রিয় GSK3-তে 3 ug রিকম্বিন্যান্ট BgaA-T যোগ করা হয়েছিল , BSA (0.1 mg/ml), এবং 50 μM dithiothreitol। প্রতিক্রিয়াটি 30 ডিগ্রীতে 2 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল এবং 1× লেমেমলি বাফার যোগ করে বন্ধ করা হয়েছিল। পূর্বে উল্লিখিত হিসাবে ওয়েস্টার্ন ব্লটিং এর জন্য নমুনাগুলি সিদ্ধ এবং ইলেক্ট্রোফোরস করা হয়েছিল। ফসফরিলেটেড বিজিএ-টি একটি অ্যান্টি-ফসফোথ্রোনিন অ্যান্টিবডি দিয়ে সনাক্ত করা হয়েছিল।

ভিভো মডেলে

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 শতাংশ প্রারম্ভিক শরীরের ওজন, এবং উচ্চারিত অনুনাসিক বা চোখের স্রাব। টার্মিনাল এনেস্থেশিয়ার অধীনে কার্ডিয়াক পাংচারের মাধ্যমে রক্তের নমুনাগুলি প্রাপ্ত করা হয়েছিল এবং ব্যাকটেরিয়া গণনার জন্য প্লীহাগুলি পোস্টমর্টেম করা হয়েছিল। টিস্যু নমুনাগুলি একটি হাতে ধরা টিস্যু হোমোজেনাইজার দিয়ে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল এবং রক্তের আগর প্লেটগুলিতে দাগ দেওয়ার আগে হোমোজেনেটগুলি পিবিএস-এ সিরিয়ালভাবে মিশ্রিত করা হয়েছিল। প্লেটগুলি রাতারাতি 37 ডিগ্রী, 5 শতাংশ CO2-এ ইনকিউবেট করা হয়েছিল এবং পরের দিন ব্যাকটেরিয়া কলোনির সংখ্যা মূল্যায়ন করা হয়েছিল।

পরিসংখ্যান সংক্রান্ত বিশ্লেষণ

গ্রাফপ্যাড প্রিজম সংস্করণ 5 পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। পৃথক পরীক্ষার জন্য গৃহীত পরিসংখ্যানগত পরীক্ষাগুলি সংশ্লিষ্ট চিত্রের কিংবদন্তিতে উল্লেখ করা হয়েছে। P < 0.05 পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল। ডেটা স্বাভাবিকতার জন্য এবং পরীক্ষিত প্রতিটি গোষ্ঠীর বৈচিত্র সংজ্ঞায়িত করার জন্য পরীক্ষা করা হয়েছিল। সমস্ত মাল্টিপ্যারামিটার বিশ্লেষণে একাধিক তুলনার জন্য সংশোধন অন্তর্ভুক্ত রয়েছে এবং ডেটা ± SD হিসাবে উপস্থাপন করা হয় যদি না অন্যথায় বলা হয়।

রেফারেন্স এবং নোট

ME Bianchi, DAMPs, PAMPs, এবং অ্যালার্মিন: বিপদ সম্পর্কে আমাদের যা জানা দরকার। জে. লিউকোক। বায়োল 81, 1-5 (2007)।

2. TH Mogensen, সহজাত ইমিউন প্রতিরক্ষায় প্যাথোজেন স্বীকৃতি এবং প্রদাহজনক সংকেত। ক্লিন। মাইক্রোবায়োল। রেভ. 22, 240-273 (2009)।

3. কে. রে, বি. মার্টেইন, পিজে সানসোনেটি, সিএম ট্যাং, ভিতরের জীবন: সাইটোসোলিক ব্যাকটেরিয়ার অন্তঃকোষীয় জীবনধারা। নাট। রেভ. মাইক্রোবায়োল। 7, 333–340 (2009)।

4. এক্স জিয়াং, জেডজে চেন, ইমিউন প্রতিরক্ষা এবং প্যাথোজেন এড়ানোর ক্ষেত্রে সর্বজনীনতার ভূমিকা। নাট। রেভ. ইমিউনল। 12, 35-48 (2011)।

5. ভি. ভোজান্দিচোভা, পি. স্টোজকোভা, কে. হারসিক, পি. রেহুলকা, জে. স্টুলিক, ব্যাকটেরিয়া হোস্ট-প্যাথোজেন মিথস্ক্রিয়ায় সর্বব্যাপী ব্যবস্থা। অণুজীব 9, 638 (2021)।

6. ই. ফিস্কিন, টি. বিওন্ডা, আই. ডিকিক, সি. বেহেরেন্ডস, সালমোনেলা টাইফিমুরিয়াম সংক্রমণের প্রতিক্রিয়ায় হোস্ট এবং ব্যাকটেরিয়া ইউবিকুইটিনোমের গ্লোবাল বিশ্লেষণ। মোল। সেল 62, 967–981 (2016)।

7. কিউ. চাই, এক্স. ওয়াং, এল. কিয়াং, ওয়াই. ঝাং, পি. জি, জেড. লু, ওয়াই ঝং, বি. লি, জে. ওয়াং, এল. ঝাং, ডি. ঝো, ডব্লিউ লি, ডব্লিউ ডং, ওয়াই পাং, জিএফ গাও, সিএইচ লিউ, একটি মাইকোব্যাকটেরিয়াম যক্ষ্মা পৃষ্ঠের প্রোটিন হোস্ট জেনোফ্যাজিকে ট্রিগার করতে ইউবিকুইটিন নিয়োগ করে। নাট। কমুন 10, 1973 (2019)।

8. EG Otten, E. Werner, A. Crespillo-Casado, KB Boyle, V. Dharamdasani, C. Pathe, B. Santhanam, F. Randow, ব্যাকটেরিয়া সংক্রমণের সময় RNF213 দ্বারা লাইপোপলিস্যাকারাইডের সর্বজনীনতা। প্রকৃতি 594, 111–116 (2021)।

9. A. Yamada, M. Hikichi, T. Nozawa, I. Nakagawa, FBXO2/SCF ubiquitin ligase কমপ্লেক্স ব্যাকটেরিয়া পৃষ্ঠের গ্লাইকান সনাক্ত করার মাধ্যমে জেনোফ্যাজি নির্দেশ করে। EMBO Rep. 22, e52584 (2021)।

10. P. Engstrom, TP Burke, CJ Tran, AT Iavarone, MD Welch, Lysine methylation একটি অন্তঃকোষীয় রোগজীবাণুকে সর্বব্যাপীতা এবং অটোফ্যাজি থেকে রক্ষা করে। বিজ্ঞান অ্যাড. 7, eabg2517 (2021)।

11. J. Celli, LRSAM1, একটি E3 ubiquitin ligase যার ব্যাকটেরিয়া সম্পর্কে ধারণা রয়েছে। সেল হোস্ট মাইক্রোব 12, 735–736 (2012)।

12. এলএইচ ফ্রাঙ্কো, ভিআর নায়ার, সিআর শ্যার্ন, আরজে জেভিয়ার, জেআর টোরিয়ালবা, এমইউ শিলো, বি. লেভিন, ইউবিকুইটিন লিগেজ স্মারফ1 মাইকোব্যাকটেরিয়াম যক্ষ্মা এবং অ্যান্টি-যক্ষ্মা হোস্ট প্রতিরক্ষার নির্বাচনী অটোফ্যাজিতে কাজ করে। সেল হোস্ট মাইক্রোব 21, 59–72 (2017)।

13. জে. নোড, এ. ভন ডের মালসবার্গ, সি. পাথে, এমএ মিশেল, ডি. কোমান্ডার, এফ. র্যান্ডো, LUBAC সংশ্লেষিত লিনিয়ার ইউবিকুইটিন চেইনগুলি অটোফ্যাজি এবং NF-κB সক্রিয় করে সাইটোসল-আক্রমণকারী ব্যাকটেরিয়াকে সীমাবদ্ধ করে। নাট। মাইক্রোবায়োল। 2, 17063 (2017)।

14. PS Manzanillo, JS Ayres, RO Watson, AC Collins, G. Souza, CS Rae, DS Schneider, K. Nakamura, MU Shiloh, JS Cox, the ubiquitin ligase parkin intracellular pathogens প্রতিরোধের মধ্যস্থতা করে৷ প্রকৃতি 501, 512-516 (2013)।

15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, সাইটোসোলিক সালমোনেলাকে লক্ষ্য করে হোস্ট সেল সর্বব্যাপী যন্ত্রপাতি সম্প্রসারণ। EMBO প্রতিনিধি 18, 1572–1585 (2017)।

For more information:1950477648nn@gmail.com