সিস্টানচে থেকে প্রাপ্ত অ্যাক্টিওসাইড PI3K/AKT/mTOR পাথওয়ে সক্রিয় করে গ্লুকোকোর্টিকয়েড-প্ররোচিত অস্টিওপোরোসিসকে উন্নত করে

বিমূর্ত

উদ্দেশ্য

গ্লুকোকোর্টিকয়েড ক্লিনিকাল অনুশীলনে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়; যাইহোক, তারা পার্শ্ব প্রতিক্রিয়া সৃষ্টি করতে পারে, যেমনঅস্টিওপরোসিস. অ্যাক্টিওসাইডCistanche থেকে (ACT) বিভিন্ন রোগের বিরুদ্ধে লড়াই করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছে। গ্লুকোকোর্টিকয়েড-প্ররোচিত ক্ষেত্রে ACT এর কার্যকারিতা মূল্যায়ন করার জন্য গবেষণাটি পরিচালিত হয়েছিলঅস্টিওপরোসিস(জিআইওপি) এবং এর সম্ভাব্য প্রক্রিয়া।

পদ্ধতি
ডেক্সামেথাসোন (ডেক্স) প্ররোচিত করার জন্য ইন্ট্রামাসকুলারভাবে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিলঅস্টিওপরোসিসএকটি ইঁদুর মডেলে, এবং ACT মৌখিকভাবে দেওয়া হয়েছিল। ডেক্স-উদ্দীপিত ভিভোতে ACT পরিপূরক ছিলঅস্টিওব্লাস্টিকMC3T3-E1 কোষ। RT-qPCR এর mRNA স্তরগুলি মূল্যায়ন করতে সঞ্চালিত হয়েছিলহাড় গঠন(Runx2, CoL1A1), এবং হাড় রিসোর্পশন (OPG এবং RANKL)। একটি বাণিজ্যিক ELISA কিট সিরাম OC এবং CTX স্তরের মূল্যায়ন করার জন্য প্রয়োগ করা হয়েছিল। PI3K/AKT/mTOR সিগন্যালিং পাথওয়েতে প্রোটিনের মাত্রা মূল্যায়নের জন্য ওয়েস্টার্ন ব্লট করা হয়েছিল। সিসিকে-8 অ্যাস এবং ফ্লো সাইটোমেট্রি অস্টিওব্লাস্ট কার্যকারিতা এবং অ্যাপোপটোসিস মূল্যায়ন করার জন্য সঞ্চালিত হয়েছিল।

ডেক্স-উত্তেজক অস্টিওব্লাস্টিক চিকিত্সার জন্য Cistanche Acteoside পেতে এখানে ক্লিক করুন

ফলাফল
ACT ডেক্স-প্ররোচিত হাড়ের মাইক্রোস্ট্রাকচারের অবনতি হ্রাস করেছে, OC-এর সিরামের মাত্রা বৃদ্ধি করেছে এবং CTX (P) এর মাত্রা হ্রাস করেছে< 0.05). In the MC3T3-E1 cells, Dex inhibited cell viability and উন্নীত apoptosis; যাইহোক, এই প্রভাবটি ACT (P< 0.05). Concurrently, ACT reversed the reduction in Runx2, osterix, CoL1A1, and OPG mRNA levels, ALP activity, and the promotion of RANKL by Dex. Additionally, ACT attenuated Dex-induced inhibition of p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, and p-PI3K/PI3K protein levels by Dex (P < 0.05), while the PI3K/AKT/mTOR pathway inhibitor LY294002 diminished the potential effect of ACT (P < 0.05).

উপসংহার
থেকে ACTসিস্তানচেডেক্স-প্ররোচিত অস্টিওপোরোসিস উপশম করতে PI3K/AKT/mTOR সিগন্যালিং পাথওয়ে সক্রিয় করে অস্টিওপ্রোটেক্টিভ প্রভাব প্রয়োগ করতে পারে।

কীওয়ার্ড:অ্যাক্টিওসাইড সিস্তানচেগ্লুকোকোর্টিকয়েড-প্ররোচিতঅস্টিওপরোসিস

ভূমিকা
অস্টিওপোরোসিস (OP) একটি সাধারণ কঙ্কালের রোগ যা হাড়ের কম ভর, হাড়ের টিস্যু মাইক্রোস্ট্রাকচারের ধ্বংস এবং হাড়ের হোমিওস্টেসিসে ভারসাম্যহীনতা দ্বারা চিহ্নিত করা হয়। OP প্রতি বছর 8.9 মিলিয়নেরও বেশি ফ্র্যাকচার ঘটায় এবং অস্টিওপরোটিক ফ্র্যাকচার প্রায় প্রতি 3 সেকেন্ডে ঘটে এবং আজীবন অক্ষমতা বা মৃত্যুর দিকে নিয়ে যায় [2]। Glucocorticoids (GCs) সাধারণত অসংক্রামক প্রদাহজনক রোগের (যেমন হাঁপানি এবং প্রদাহজনক অন্ত্রের রোগ) পাশাপাশি অটোইমিউন অবস্থার চিকিত্সার জন্য পরিচালিত হয় [3]। যাইহোক, দীর্ঘমেয়াদী জিসি 30 শতাংশের বেশি ওপি ক্ষেত্রে এবং 10 শতাংশেরও বেশি অস্টিওনেক্রোসিসের ক্ষেত্রে প্রবণতা ব্যবহার করে [৪]। GCs সরাসরি অস্টিওব্লাস্টের বিস্তার এবং পার্থক্যকে বাধা দেয় [5], পরিপক্কতা এবং কার্যকলাপ হ্রাস করে এবং অস্টিওব্লাস্টগুলির অ্যাপোপটোসিসকে প্ররোচিত করে, যা ফলস্বরূপ গ্লুকোকোর্টিকয়েড-প্ররোচিত অস্টিওপরোসিস (GIOP) [6] এর বিকাশের দিকে পরিচালিত করে। অধিকন্তু, ক্রমবর্ধমান প্রমাণগুলি পরামর্শ দেয় যে অস্টিওব্লাস্ট কর্মহীনতা হাড়ের ক্ষয়ের প্রধান কারণ। অতএব, অস্টিওব্লাস্টের সংখ্যা এবং কার্যকারিতা বৃদ্ধি ওপি, বিশেষত জিআইওপি প্রতিরোধের প্রধান কৌশল বলে মনে হয়।

ভেষজ ওষুধ, বিশেষ করে প্রাকৃতিক যৌগের উপর ভিত্তি করে, বিভিন্ন রোগের চিকিত্সার জন্য হাজার হাজার বছর ধরে অনুশীলন করা হয়েছে [7]। সিস্তানচে চীনা ফার্মাকোপিয়াতে নথিভুক্ত একটি মূল্যবান ভেষজ যা জিনজিয়াং উইগুর স্বায়ত্তশাসিত অঞ্চলের দক্ষিণাঞ্চলে জন্মে এবং মরুভূমি জিনসেং নামে পরিচিত [৮]। সিস্টানচে বিভিন্ন প্রভাব রয়েছে, যেমন ইমিউন বর্ধিতকরণ, রেনাল সুরক্ষা, অ্যান্টি-এজিং, অ্যান্টিঅক্সিডেন্ট, অ্যান্টি-ইনফ্ল্যামেটরি এবং নিউরোপ্রোটেক্টিভ প্রভাব রয়েছে বলে প্রমাণিত হয়েছে [৯]।অ্যাক্টিওসাইড(ACT) হল Cistanche-এর একটি ফিনাইল ইথানোলিক গ্লুকোসাইড, যার জৈবিক ক্রিয়াকলাপ রয়েছে, যেমন নিউরোনাল অ্যাপোপটোসিস [10], লিভারের ক্ষতির উপশম [11], প্রদাহ বিরোধী [12], অ্যান্টিঅক্সিডেশন [13] , ডায়াবেটিস প্রতিরোধ [১৪], এবং স্থূলতা [১৫], সেইসাথে আর্টিকুলার কার্টিলেজের অবক্ষয় [১৬]। তদুপরি, বেশ কয়েকটি গবেষণায় ACT-এর ফার্মাকোকিনেটিক্স রিপোর্ট করা হয়েছে এবং নিশ্চিত করা হয়েছে যে মৌখিক ব্যবহার মাত্র 0.12 শতাংশ হলেও থেরাপিউটিক প্রভাব বিদ্যমান। ACT ভিভোতে সক্রিয় বিপাক সহ একটি প্রোড্রাগ হিসাবে বিবেচিত হয় [17]।

ঝাং এট আল। ইঁদুরের ওভারিয়েক্টমি-প্ররোচিত হাড়ের ক্ষতির উপর ACT এর একটি সম্ভাব্য প্রতিরক্ষামূলক প্রভাব প্রদর্শন করেছে [18]। ACT ডায়াবেটিক ইঁদুরের হাড়ের ক্ষয় রোধ করতে IGF-1/PI3K/mTOR সংকেত পথকে সংশোধন করে [19]। PI3K/AKT/mTOR পাথওয়ের GIOP [20] সহ বিভিন্ন রোগে গুরুতর নিয়ন্ত্রক ভূমিকা রয়েছে বলে জানা গেছে। নারিংগিন PI3K/AKT/mTOR সিগন্যালিং পাথওয়ে নিয়ন্ত্রণ করে GIOP-কে উপশম করে [২১]। উপরন্তু, এই সংকেত পথ অস্টিওব্লাস্ট পার্থক্য নিয়ন্ত্রণ করে [২২], হাড়ের গঠন [২৩], এবং ফ্র্যাকচার নিরাময় [২৪]। যাইহোক, জিআইওপিতে ACT এর সম্ভাব্য ভূমিকা এবং এটি PI3K/AKT/mTOR সিগন্যালিং পথের মড্যুলেশন দ্বারা নিয়ন্ত্রিত কিনা তা অজানা।

বর্তমান অধ্যয়নের লক্ষ্য একটি জিআইওপি ইঁদুরের মডেল এবং ভিট্রোতে অস্টিওব্লাস্টে ACT এর প্রতিরক্ষামূলক প্রভাবগুলি বোঝা এবং অন্তর্নিহিত আণবিক প্রক্রিয়াগুলিকে ব্যাখ্যা করা।

উপকরণ এবং পদ্ধতিসমূহ
পরীক্ষামূলক প্রাণী
সাংহাই ল্যাবরেটরি অ্যানিমেল সেন্টার (CAS, সাংহাই, চীন) থেকে 280-340 গ্রাম ওজনের চল্লিশ 8-সপ্তাহ বয়সী পুরুষ স্প্রাগ-ডাওলি (SD) ইঁদুর পাওয়া গেছে। পরীক্ষামূলক প্রাণীদের যত্নের পদ্ধতিগুলি কিকিহার মেডিকেল ইউনিভার্সিটি অ্যানিমাল এথিক্স কমিটির তৃতীয় অনুমোদিত হাসপাতাল দ্বারা অনুমোদিত প্রোটোকল অনুসরণ করে পরিচালিত হয়েছিল। এবং গবেষণাটি ARRIVE নির্দেশিকাগুলির সাথে একমত হয়ে পরিচালিত হয়েছিল। পশুদের জীবাণুমুক্ত, 24 ± 2 ডিগ্রী, 12 ঘন্টা আলো এবং অন্ধকার চক্র, 50 ± 5 শতাংশ আর্দ্রতা এবং খাবার ও পানির বিনামূল্যে প্রবেশাধিকার সহ পশু কেন্দ্রে রাখা হয়েছিল।

জিআইওপি মডেল নির্মাণ
7 দিনের অভিযোজিত খাওয়ানোর পর, ইঁদুরকে এলোমেলোভাবে নিয়ন্ত্রণ এবং মডেল গ্রুপে বিভক্ত করা হয়েছিল র্যান্ডম নম্বর টেবিল পদ্ধতি ব্যবহার করে, ডেক্সামেথাসোন (ডেক্স, সিগমা-অলড্রিচ সেন্ট লুইস, এমও, ইউএসএ) 5 মিলিগ্রাম/কেজি সপ্তাহে দুবার 6 সপ্তাহের জন্য ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। মডেল গ্রুপের ইঁদুরগুলিতে ওপিকে ইন্ট্রামাসকুলারভাবে প্ররোচিত করতে [25]। কন্ট্রোল গ্রুপের (n = 10) ইঁদুরগুলিকে সমান পরিমাণে স্যালাইন দিয়ে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। 6 সপ্তাহে উভয় গ্রুপের ইঁদুরের শরীরের ওজনে কোনও উল্লেখযোগ্য পরিবর্তন লক্ষ্য করা যায়নি। পরবর্তীকালে, মডেল গ্রুপের ইঁদুরগুলিকে মডেল গ্রুপ, ACT লো ডোজ গ্রুপ (মডেল প্লাস ACT-L) গ্রুপ এবং ACT হাই ডোজ গ্রুপ (মডেল প্লাস ACT-H) গ্রুপে বিভক্ত করা হয়েছিল। ACT (HPLC 98 শতাংশ) Baoji Herbest Bio-tech., Ltd. (Baoji, China) থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল এবং একটি জলীয় দ্রাবক সাসপেনশন দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। 50 mg/kg/d এবং 100 mg/kg/d ACT এর ডোজ কম এবং উচ্চ ডোজ গ্রুপের ইঁদুরদের মুখে মুখে দেওয়া হয়েছিল (প্রতি গ্রুপে 8 ইঁদুর), এবং 8 সপ্তাহের জন্য অব্যাহত ছিল। তাদের মধ্যে, নমুনার আকার পূর্ববর্তী গবেষণার উপর ভিত্তি করে গণনা করা হয়েছিল [26]। 0.05 [95 শতাংশ আত্মবিশ্বাসের ব্যবধান (= 0.05)], 80 শতাংশ শক্তি এবং 0.5 এর প্রভাবের আকারের একটি দ্বি-পার্শ্বের তাত্পর্য স্তর বিবেচনা করে, শক্তি বিশ্লেষণ অনুমান করেছে যে একটি দল প্রতি 6টি প্রাণীর একটি প্রয়োজনীয় নমুনা আকার রয়েছে 30 শতাংশ অস্টিওপরোসিসের প্রাসঙ্গিক প্রভাব স্তর। আরও, 20 শতাংশের ঝরে পড়ার হার সহ, প্রতি গ্রুপে 8টি প্রাণী (মোট 32টি ইঁদুর) আদর্শ হিসাবে বিবেচিত হয়েছিল।

ইঁদুরের সিরাম নমুনা
8 সপ্তাহ পর, ইঁদুরকে 10 শতাংশ ক্লোরাল হাইড্রেট (400 মিলিগ্রাম/কেজি, ইন্ট্রাপেরিটোনলি, সোলারবিও, বেইজিং চায়না) দিয়ে অ্যানেস্থেটাইজ করা হয়েছিল, পেটের মহাধমনী থেকে রক্ত ​​সংগ্রহ করা হয়েছিল, ঘরের তাপমাত্রায় জমাট বাঁধা হয়েছিল এবং 3500 আরপিএম/মিনিট 10 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল। পরবর্তী ব্যবহার না হওয়া পর্যন্ত সিরামটি 1.5 মিলি সেন্ট্রিফিউজ টিউবে সংরক্ষণ করা হয়েছিল।

হাড়ের খনিজ ঘনত্বের মূল্যায়ন
হাড়ের খনিজ ঘনত্ব (BMD) একটি DAX ছোট প্রাণীর হাড়ের ঘনত্বের মিটার (Ranzhe Instrument Equipment Co., Shanghai, China) দ্বারা ব্যবহার করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, ইঁদুরগুলি সুপাইন অবস্থানে স্থাপন করা হয়েছিল এবং পিছনের অঙ্গগুলি বাইরের দিকে অবস্থিত ছিল। প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে ইঁদুরের ডান ফিমার স্ক্যান করা হয়েছিল এবং BMD মানগুলি রেকর্ড করা হয়েছিল [27]।

হাড়ের অঙ্গসংস্থান বিশ্লেষণ
পরীক্ষার শেষে, অতিরিক্ত ক্লোরাল হাইড্রেটের ইন্ট্রাপেরিটোনিয়াল ইনজেকশন দ্বারা ইঁদুরগুলিকে ইথানাইজ করা হয়েছিল এবং ফিমারগুলিকে 70 শতাংশ ইথানলে স্থির করা হয়েছিল। পরবর্তীকালে, পূর্ববর্তী গবেষণায় বর্ণিত একটি VivaCT 40μCT সিস্টেমে স্ক্যান করা হয়েছিল এবং হাড়ের ভলিউম/মোট ভলিউম (BV/TV), হাড়ের ট্র্যাবেকুলার নম্বর (Tb.N), হাড়ের ট্র্যাবেকুলার পুরুত্ব (Tb.Tn), এবং হাড়ের ট্র্যাবেকুলার বিচ্ছেদ। (Tb.Sp) মূল্যায়ন করা হয়েছিল [28]। ইউথানেশিয়ার জন্য, 10 শতাংশ ক্লোরাল হাইড্রেট (350 মিলিগ্রাম/কেজি) একটি ইন্ট্রাপেরিটোনিয়াল ইনজেকশন দ্বারা হাড়ের আকারবিদ্যা বিশ্লেষণের পরে এসডি ইঁদুরগুলিকে অবেদন দেওয়া হয়েছিল।

এনজাইম-লিঙ্কড ইমিউনোসর্বেন্ট অ্যাস (ELISA)
বাণিজ্যিক ELISA কিটগুলি ইঁদুরের সিরামে অস্টিওক্যালসিন (OC, E-EL-R0243c, Elabscience) এবং C-টার্মিনাল টেলোপেপ্টাইড (CTX, E-EL-R1405c, Elabscience) মাত্রা সনাক্তকরণের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, বিকারকগুলিকে 18-25 ডিগ্রীতে সরিয়ে দেওয়া হয়েছিল যাতে ধোয়ার এবং মানক কাজ করার জন্য দ্রবণকে সুষম ও প্রস্তুত করা হয়। এনজাইম প্লেট প্লেট স্ট্যান্ডার্ড, ফাঁকা, এবং নমুনা কূপ সঙ্গে সেট আপ করা হয়েছিল। প্রায় 100 μL নমুনা পাতলা দ্রবণ কূপগুলিতে যোগ করা হয়েছিল, 37 ডিগ্রিতে 90 মিনিটের জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল এবং 37 ডিগ্রিতে 60 মিনিটের জন্য একটি বায়োটিনিলেটেড অ্যান্টিবডি দিয়ে প্রতিস্থাপিত হয়েছিল। ধোয়ার পরে, এনজাইম-বাইন্ডিং ওয়ার্কিং সলিউশন যোগ করা হয়েছিল এবং 30 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। সাবস্ট্রেট দ্রবণ (90 μL) যোগ করা হয়েছিল, এবং আলো থেকে সুরক্ষা সহ 15 মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। যখন নীল গ্রেডিয়েন্ট স্ট্যান্ডার্ড কূপগুলিতে উপস্থিত হয়েছিল, তখন সমাপ্তির সমাধানের 50 μL যোগ করা হয়েছিল এবং OD450-এর পরিবর্তন বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

বিপরীত প্রতিলিপি-পরিমাণগত রিয়েল-টাইম PCR (RT-qPCR)
TRlzol LS রিএজেন্ট ইঁদুরের সিরাম এবং ACT-চিকিত্সা করা MC3T3-E1 কোষে যোগ করা হয়েছিল, এবং ক্লোরোফর্ম যোগ করার পরে ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউবেশনের মাধ্যমে মোট আরএনএ বের করা হয়েছিল। একটি Nanodrop ND-1000 স্পেকট্রোফোটোমিটারে A260/280 শোষণ পরিমাপ করে RNA ঘনত্ব এবং বিশুদ্ধতা নিশ্চিত করা হয়েছিল। সুপারস্ক্রিপ্ট II রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেস কিটটি RNA থেকে cDNA-তে বিপরীত প্রতিলিপির জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল। পরবর্তীকালে, সিডিএনএ একটি টেমপ্লেট হিসাবে প্রয়োগ করা হয়েছিল, একটি প্রাইমার যোগ করা হয়েছিল, এবং এসওয়াইবিআর-গ্রিন পিসিআর মাস্টার মিক্স কিটকে মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং ddH2O থেকে 20 μL পর্যন্ত পরিপূরক করা হয়েছিল, এবং ফলিত বায়োসিস্টেম AMI7500 ফাস্ট রিয়েল-টাইম পিসিআর ব্যবহার করে পিসিআর পরিবর্ধন প্রতিক্রিয়া সঞ্চালিত হয়েছিল। সিস্টেম (ABI, CA, USA)। GAPDH স্বাভাবিককরণের জন্য একটি অভ্যন্তরীণ রেফারেন্স হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং আপেক্ষিক অভিব্যক্তি স্তরগুলি 2−ΔΔCt পদ্ধতি ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল এবং ট্রিপ্লিকেটগুলিতে সঞ্চালিত হয়েছিল। রান্ট-সম্পর্কিত ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টর 2 (Runx2), কোলাজেন টাইপ I 1 (CoL1A1), নিউক্লিয়ার ফ্যাক্টর-κB লিগ্যান্ড (RANKL), অস্টেরিক্স এবং অস্টিওপ্রোটেজেরিন (OPG) এর রিসেপ্টর অ্যাক্টিভেটর জন্য প্রাইমার সিকোয়েন্স সারণি 1 এ উপস্থাপিত হয়েছে।

ওয়েস্টার্ন-ব্লট বিশ্লেষণ
কোষে 1 শতাংশ প্রোটেজ ইনহিবিটরযুক্ত RIPA লাইসেট যোগ করা হয়েছিল এবং 4 ডিগ্রিতে 5 মিনিটের জন্য ঝাঁকুনি দিয়ে কোষের লাইসিসের পরে প্রতিটি গ্রুপ থেকে মোট প্রোটিন সংগ্রহ করা হয়েছিল। প্রতিটি গ্রুপে প্রোটিনের ঘনত্ব পরিমাপ করার জন্য বিসিএ অ্যাস কিট নিযুক্ত করা হয়েছিল। এর পরে, প্রোটিন নমুনাগুলিকে 10 শতাংশ সোডিয়াম ডোডেসিল সালফেট (SDS) বাফারের সাথে সমান আয়তনে মিশ্রিত করা হয়েছিল এবং প্রোটিন হ্রাসের জন্য 5 মিনিটের জন্য 95 ডিগ্রিতে একটি জল স্নানে সিদ্ধ করা হয়েছিল। একটি 12 শতাংশ এসডিএস-পলিঅ্যাক্রিলামাইড উল্লম্ব জেল প্রস্তুত করা হয়েছিল, এবং জেলটি শক্ত হওয়ার পরে, 120 এমএ 90 মিনিট জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস বিচ্ছেদের জন্য 30 ইউজি প্রোটিন নমুনা করা হয়েছিল। প্রোটিনটি তখন 120 মিনিটের জন্য 90 V এ PVDF ঝিল্লিতে স্থানান্তরিত হয়েছিল। 5 শতাংশ বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন দিয়ে সিল করার পরে, মার্কার এবং লক্ষ্য প্রোটিন ব্যান্ডের আণবিক ওজনের উপর ভিত্তি করে PVDF ঝিল্লি কাটা হয়েছিল এবং 4 ডিগ্রিতে রাতারাতি সংশ্লিষ্ট প্রাথমিক অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। p-AKT, p-mTOR, এবং p-PI3K এর বিরুদ্ধে খরগোশের পলিক্লোনাল অ্যান্টিবডিগুলিকে 1:1000 অনুপাতে পাতলা করা হয়েছিল (প্রোটিনটেক, উহান, চীন)। টিবিএসটি 30 মিনিটের জন্য ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল এবং 1 ঘন্টার জন্য ঘরের তাপমাত্রায় সংশ্লিষ্ট হর্সরাডিশ পারক্সিডেস-লেবেলযুক্ত সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। বর্ধিত কেমিলুমিনেসেন্স রিএজেন্ট ব্যবহার করে দাগটি কল্পনা করা হয়েছিল। ইমেজ জে ব্যবহার করে প্রোটিন ব্যান্ডের ঘনত্ব পরিমাপ করা হয়েছিল। আপেক্ষিক প্রোটিনের মাত্রা গণনা করার জন্য একটি নিয়ন্ত্রণ হিসাবে GAPDH নিযুক্ত করা হয়েছিল।

কোষ সংস্কৃতি এবং গ্রুপিং
মাউস প্রি-অস্টিওব্লাস্ট MC3T3-E1 চীনা টিস্যু কালচার কালেকশন (CTCC, China) থেকে কেনা হয়েছিল এবং -MEM-তে 10 শতাংশ ভ্রূণের বোভাইন সিরাম এবং 100 U/mL পেনিসিলিন এবং 100 mg/mL স্ট্রেপ্টোমাইসিন রয়েছে 37 ডিগ্রী এবং 5 শতাংশ CO2 এ আর্দ্র ইনকিউবেটর। হাড়ের পার্থক্য সংস্কৃতির জন্য, 10 mM- -গ্লিসারোফসফেট এবং 50 mg/mL অ্যাসকরবিক অ্যাসিড (সিগমা-অলড্রিচ) -MEM-এর সাথে মিশিয়ে অস্টিওজেনিক ইনডাকশন মাধ্যম তৈরি করা হয়েছিল এবং প্ররোচিত করার জন্য MC3T3-E1 কোষে যোগ করা হয়েছিল। তাদের পার্থক্য। মাধ্যমটি 3 দিন পরে পরিবর্তন করা হয়েছিল। ক্ষারীয় ফসফেটেস (ALP) কার্যক্ষমতার জন্য 14 দিনের জন্য সংস্কৃতি ব্যবহার করা হয়েছিল। তদ্ব্যতীত, কোষগুলিকে PI3K ইনহিবিটর LY294002 (10 μM) দিয়ে 30 মিনিটের জন্য প্রিট্রিটেড করা হয়েছিল, তারপরে ডেক্স এবং ACT দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল।

কোষের কার্যক্ষমতা পরীক্ষা
সেল কাউন্টিং কিট-8 (CCK-8) অ্যাস ACT দিয়ে চিকিত্সা করা অস্টিওব্লাস্টগুলির কার্যকারিতা মূল্যায়ন করার জন্য সঞ্চালিত হয়েছিল। MC3T3-E1 কোষগুলিকে 5 × 103 কোষ/কূপে 96 টি ওয়েল প্লেটে টিকা দেওয়া হয়েছিল। পূর্ববর্তী গবেষণার উপর ভিত্তি করে ডেক্সের 1 μM পরিমাণ বিবেচনা করা হয়েছিল [29] এবং ACT (10−8, 10−7, 10−6, এবং 10−5 M) এর গ্রেডিয়েন্ট ঘনত্বের সাথে সহ-ইনকিউব করা হয়েছিল। 10:1 অনুপাতে মিক্সিং মিডিয়াম এবং CCK-8 রিএজেন্ট যোগ করার পর 96-ওয়েল প্লেটের কালচার মিডিয়াম প্রতিস্থাপিত হয়েছিল। 37 ডিগ্রীতে 1 ঘন্টা অবিরত ইনকিউবেশনের পরে, OD450-এর পরিবর্তন মূল্যায়ন করা হয়েছিল।

অস্টিওব্লাস্ট অ্যাপোপটোসিস নম্বর সনাক্তকরণ
MC3T3-E1 কোষগুলি যেগুলি বিভিন্ন চিকিত্সার শিকার হয়েছিল সেগুলি EDTA-মুক্ত ট্রিপসিন ব্যবহার করে হজম করা হয়েছিল এবং সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা সংগ্রহ করা হয়েছিল। 1 × বাইন্ডিং বাফার দিয়ে ধোয়ার পর, 5 μL Annexin V-FITC যোগ করা হয়েছিল এবং 5 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করা হয়েছিল, 5 μL PI দিয়ে পরিপূরক এবং একটি 200-জাল নাইলন জালের মধ্য দিয়ে পাস করা হয়েছিল৷ নমুনাগুলি FACScan ফ্লো সাইটোমেট্রি সিস্টেম ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

ALP কার্যকলাপ পরীক্ষা
MC3T3-E1 কোষগুলিকে 24-ওয়েল প্লেটে ইনোকুলেশন করা হয়েছিল, এবং প্লাস্টার করার পরে ACT এবং Dex যোগ করা হয়েছিল৷ কোষ সংস্কৃতির মাধ্যমটিকে সংস্কৃতির জন্য একটি অস্টিওজেনিক পার্থক্য মাধ্যম দিয়ে প্রতিস্থাপিত করা হয়েছিল। সেল লাইসিস দ্রবণ (P0012J, বেয়োটাইম বায়োটেকনোলজি) দ্বারা কোষের লাইসিস ব্যবহার করার পরে, সুপারনাট্যান্টটি সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং স্ট্যান্ডার্ড কার্ভটি প্লট করা হয়েছিল। একটি ALP কিট (P0132S, বেয়োটাইম বায়োটেকনোলজি) ALP কার্যকলাপ মূল্যায়ন করতে ব্যবহৃত হয়েছিল এবং OD450 গণনা করা হয়েছিল।

পরিসংখ্যান সংক্রান্ত বিশ্লেষণ
ট্রিপলিকেটে তিনটি স্বাধীন পরীক্ষা করার পর, গ্রাফপ্যাড প্রিজম 6৷{1}} সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল এবং গড় ± স্ট্যান্ডার্ড বিচ্যুতি হিসাবে প্রকাশ করা হয়েছিল৷ ANOVA একাধিক গ্রুপের মধ্যে পরিসংখ্যানগত পার্থক্য তুলনা করার জন্য নিযুক্ত করা হয়েছিল। P-মান < 0.05 পরিসংখ্যানগতভাবে আলাদা বলে বিবেচিত হয়েছিল৷