টেলোমেরিক প্রোটিন TRF2 এর এক্সপ্রেশন নিয়ন্ত্রকদের জন্য একটি অভিনব স্ক্রীন সনাক্ত করা ছোট অণুগুলি যা TRF2 নির্ভরশীল ইমিউনোসপ্রেশন এবং টিউমার বৃদ্ধিকে ব্যাহত করে

অনুগ্রহ করে যোগাযোগ করুনoscar.xiao@wecistanche.comআরও তথ্যের জন্য

সরল সারসংক্ষেপ:টেলোমেরিক প্রোটিন টিআরএফ 2 (টেলোমেরিক রিপিট-বাইন্ডিং ফ্যাক্টর 2) মানুষের ক্যান্সারে নিয়ন্ত্রণ করা হয় এবং দুর্বল পূর্বাভাসের সাথে যুক্ত। TRF2 অনকোজেনিক বৈশিষ্ট্যগুলি এর অভ্যন্তরীণ টেলোমেরের প্রতিরক্ষামূলক ভূমিকার উপর নির্ভর করে, তবে ইমিউনোসপ্রেসিভ এবং অ্যাঞ্জিওজেনিক কার্যকলাপের মাধ্যমে কোষ-বহির্ভূত প্রভাবের উপরও নির্ভর করে। অতএব, TRF2 টার্গেট করা একটি প্রতিশ্রুতিশীল থেরাপিউটিক অ্যান্টি-ক্যান্সার কৌশল হিসাবে উপস্থিত হয়। এই গবেষণায়, আমরা TRF2 ইনহিবিটারগুলির জন্য স্ক্রীন করার জন্য একটি কোষ-ভিত্তিক পদ্ধতি তৈরি করেছি যা আমাদের দুটি যৌগ সনাক্ত করতে দেয় যা ভিভোতে TRF2 প্রো-অনকোজেনিক বৈশিষ্ট্যগুলিকে ভোঁতা করে।

বিমূর্ত: টেলোমেরিক রিপিট-বাইন্ডিং ফ্যাক্টর 2 (TRIF2) হল শেল্টেরিন প্রোটিন কমপ্লেক্সের একটি সাবইউনিট, যা অবাঞ্ছিত ডিএনএ ড্যামেজ রেসপন্স (DDR) অ্যাক্টিভেশন থেকে টেলোমেরেসকে আবদ্ধ করে এবং রক্ষা করে। টিআরএফ 2 এক্সপ্রেশন বার্ধক্য এবং ক্যান্সারে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে, সেলুলার সেন্সেন্সের সময় নিয়ন্ত্রিত হয় এবং অনকোজেনেসিসের সময় অতিরিক্ত এক্সপ্রেস হয়। TRF2 অত্যধিক এক্সপ্রেসিং ক্যান্সার প্রায়ই একটি খারাপ পূর্বাভাস প্রদর্শন করে। ক্যান্সার কোষে, TRF2 টেলোমের সুরক্ষা এবং নন-সেল স্বায়ত্তশাসিত ভূমিকা সহ একাধিক ফাংশন পালন করে, নিও-এনজিওজেনেসিস এবং ইমিউনোসপ্রেশন প্রচার করে।পিউরিটান ভিটামিন সিআমরা এখানে একটি আসল স্ক্রীনিং কৌশল উপস্থাপন করি, যা ছোট অণুগুলির সনাক্তকরণ সক্ষম করে যা TRF2 এক্সপ্রেশন হ্রাস বা বৃদ্ধি করে। ফুড অ্যান্ড ড্রাগ এজেন্সি (এফডিএ)-অনুমোদিত ওষুধের একটি ছোট লাইব্রেরি স্ক্রিনিং করে, আমরা দুটি অণু (AR-A014418 এবং alexidine-2HCl) সনাক্ত করেছি যেগুলি টিউমারের বৃদ্ধি, নিও-অ্যাঞ্জিওজেনেসিস এবং ইমিউনোসপ্রেশনকে একটি মাউসে TRF2 এক্সপ্রেশনকে নিয়ন্ত্রণ করে। জেনোগ্রাফ্ট মডেল। এই ফলাফলগুলি আক্রমনাত্মক মানব টিউমারগুলির চিকিত্সার জন্য TRF2 এক্সপ্রেশনকে হ্রাস করার কেমোথেরাপিউটিক কৌশলকে সমর্থন করে এবং TRF2 এক্সপ্রেশন স্তরগুলিকে সংশোধন করে সম্ভাব্য অ্যান্টি-ক্যান্সার এবং অ্যান্টি-এজিং অণুগুলির জন্য স্ক্রীনিং করতে সক্ষম এই সেল-ভিত্তিক অ্যাসকে বৈধ করে।

কীওয়ার্ড:TRF2; ক্যান্সার বার্ধক্য; সেল-ভিত্তিক স্ক্রীনিং অ্যাস; নিও-এনজিওজেনেসিস; ইমিউন দমন

আরো জানতে এখানে ক্লিক করুন

1। পরিচিতি

টেলোমেরেস হল বিশেষায়িত নিউক্লিওপ্রোটিন কাঠামো যা লিনিয়ার ক্রোমো-সোমের প্রান্তে পাওয়া যায় যা টেলোমেরেজ, শেল্টেরিন প্রোটিন কমপ্লেক্স এবং নন-কোডিং টেলোমেরিক রিপিট-ধারণকারী আরএনএ [1] এর মতো টেলোমের-সম্পর্কিত কারণ দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়। সঠিকভাবে নিয়ন্ত্রিত হলে, টেলোমেরেস ক্রোমোজোমগুলিকে অস্থিরতা এবং বার্ধক্য থেকে রক্ষা করে। টেলোমেরিক ডিএনএ শর্ট-এনিং প্রোগ্রামযুক্ত শারীরবৃত্তীয় বিকাশ এবং বার্ধক্যের অংশ হিসাবে ঘটে [2]। যাইহোক, অত্যধিক টেলোমের ডিএনএ সংক্ষিপ্তকরণ বিরল প্রোজেরয়েড সিনড্রোমগুলিকে চালিত করে, যেমন ডিসকেরাটোসিস কনজেনিটা [৩]। তদুপরি, অনিয়ন্ত্রিত টেলোমের রাজ্যগুলি এমন অসংখ্য রোগের সাথে জড়িত যা সাধারণ জনসংখ্যা জুড়ে সাধারণ, প্রায় সমস্ত ধরণের ক্যান্সার এবং বেশ কয়েকটি অবক্ষয়জনিত রোগ সহ [৪]। এইভাবে, নির্দিষ্ট টেলোমের উপাদানগুলিকে লক্ষ্য করার জন্য ফার্মাকোলজিকাল চিকিত্সার বিকাশ এই জাতীয় রোগ প্রতিরোধ ও চিকিত্সার জন্য প্রতিশ্রুতিবদ্ধ।

যতদূর টেলোমের এবং ক্যান্সার উদ্বিগ্ন, অত্যাবশ্যক DNA ক্ষতি প্রতিক্রিয়া (DDR) চেক-পয়েন্ট কখনও কখনও ব্যর্থ হয়; এটি অত্যধিক টেলোমেরিক ডিএনএ সংক্ষিপ্তকরণ এবং বিভ্রান্তিকর ক্রোমোজোম পুনর্বিন্যাসের দিকে পরিচালিত করতে পারে, যা অনকোজেনেসিসে অবদান রাখতে পারে। তদ্ব্যতীত, টেলোমারেজের আপগ্র্যুলেশন সমস্ত ক্যান্সারের প্রায় 90 শতাংশের বিকাশের একটি মূল ঘটনা, কারণ এটি ক্যান্সার কোষগুলিতে সীমাহীন বৃদ্ধি প্রদান করতে পারে [5]। এই কারণে, টেলোমারেজ ইনহিবিশন ক্যান্সারের চিকিত্সার বিকাশের জন্য বেশ কয়েকটি গবেষণার লক্ষ্য ছিল [6]। সাম্প্রতিক অগ্রগতি সত্ত্বেও, অ্যান্টি-টেলোমারেজ ওষুধের ক্লিনিকাল ব্যবহারের কিছু সীমাবদ্ধতা রয়েছে। উদাহরণস্বরূপ, ক্যান্সার কোষের বিস্তার রোধ করার জন্য, একটি সমালোচনামূলকভাবে সংক্ষিপ্ত টেলোমেরিক ডিএনএ দৈর্ঘ্যে পৌঁছাতে হবে এবং সংক্ষিপ্ত টেলোমেয়ারের অ্যান্টি-অনকোজেনিক প্রভাবগুলি p53 টিউমার সাপ-প্রেসার জিনের অনুপস্থিতিতে হারিয়ে যায় [7,8]। এই ল্যাগ পিরিয়ড থেরাপিউটিক কার্যকারিতা হ্রাস করে এবং সেল পুনর্নবীকরণকে সীমিত করে এবং বিকল্প পুনর্মিলন-ভিত্তিক টেলোমেয়ার প্রসারণ প্রক্রিয়াগুলি সক্রিয় করার পক্ষপাতী হয়ে বার্ধক্যজনিত পার্শ্ব প্রতিক্রিয়া বাড়ায় [9,10]।sistancheঅতএব, অ্যান্টি-টেলোমেরেজ কৌশলগুলি ক্যান্সার কোষগুলিকে লক্ষ্য করার জন্য আরও উপযুক্ত হতে পারে যা ইতিমধ্যেই সমালোচনামূলকভাবে সংক্ষিপ্ত টেলোমেরেসকে আশ্রয় করে [১১]।

টেলোমারেজ ছাড়াও, শেল্টেরিন কমপ্লেক্স সাবুনিটের (TRF1,TRF2,RAP1,TIN2,TPP1 এবং POT1) অভিব্যক্তি এবং কার্যকলাপের পরিবর্তনগুলি টিউমারিজেনেসিসের সাথে জড়িত, এবং কিছু ক্ষেত্রে স্বাধীনভাবে টেলোমেরের দৈর্ঘ্য [12-16]। এইভাবে, ক্যান্সারের চিকিৎসার জন্য আশ্রয়কে টার্গেট করা অ্যান্টি-টেলোমারেজ হস্তক্ষেপের একটি আকর্ষণীয় বিকল্প হতে পারে। শেল-টেরিন সাবুনিট TRF2 একটি আকর্ষণীয় প্রার্থীর প্রতিনিধিত্ব করে; ক্যান্সার এবং ভাস্কুলার কোষ উভয় ক্ষেত্রেই TRF2 বিভিন্ন মানবিক রোগে অতিমাত্রায় প্রকাশ পায় এবং এটি সাধারণত একটি দুর্বল পূর্বাভাসের সাথে যুক্ত হয় [17-20]। উল্লেখযোগ্যভাবে, TRF2 অত্যধিক এক্সপ্রেশন টিউমারিজেনেসিস অ-কোষ স্বায়ত্তশাসিতভাবে প্রচার করতে পারে, যার ফলে ইমিউনোসপ্রেশন এবং নিও-এনজিওজেনেসিস[13,18-20]বিশেষ করে, TRF2 আপগ্র্যুলেশন একটি শক্তিশালী ইমিউনোসপ্রেসিভ মাইক্রোএনভায়রনমেন্ট তৈরি করে। হেপারান সালফেট প্রোটিওগ্লাইকান্সের অভিব্যক্তি পরিবর্তন করে, TRF2 সরাসরি TLR2 পাথওয়ে [21] এর মাধ্যমে মাইলয়েড-ডিরাইভড সাপ্রেসিভ সেল (MDSCs) নিয়োগ এবং সক্রিয় করে। যেখানে ক্যান্সার কোষে TRF2 অত্যধিক এক্সপ্রেশন HSPG সংশ্লেষণের নিয়ন্ত্রণের দ্বারা টিউমার মাইক্রোএনভায়রনমেন্টে NK কোষের নিয়োগকে দৃঢ়ভাবে বাধা দেয়[13], TRF2 এর অত্যধিক এক্সপ্রেশন দ্বারা প্ররোচিত MDSC-এর TLR2 অ্যাক্টিভেশন এনকে কোষের শক্তিশালী রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা হ্রাস করে। এনকে কোষগুলির অবক্ষয়, IFNgamma উত্পাদন এবং হত্যা [21]।cistanche কিএইভাবে, TRF2 ওভার এক্সপ্রেশন MDSC-নির্ভর ইমিউনোসপ্রেসিভ মাইক্রোএনভায়রনমেন্ট গঠনের মাধ্যমে NK কোষের নিয়োগ এবং পরোক্ষভাবে NK কোষগুলির কার্যকারিতাকে সরাসরি বাধা দিয়ে অ্যান্টি-টিউমার ইমিউনোসারভিলেন্সের প্রাথমিক পর্যায়ে দৃঢ়ভাবে ভোঁতা করে। ফলস্বরূপ, কোষ-স্বায়ত্তশাসিত এবং নন-সেল-স্বায়ত্তশাসিত প্রক্রিয়াগুলির মাধ্যমে ক্যান্সারে TRF2 লক্ষ্য করা একটি মূল্যবান বহু-হিট কৌশল হতে পারে সেন্সেসকে প্রচার করার পাশাপাশি নিও-এনজিওজেনেসিস এবং ইমিউন এস্কেপকে দুর্বল করে।

cistanche বিরোধী বার্ধক্য করতে পারেন

আজ অবধি, সমস্ত চিহ্নিত ছোট যৌগগুলি যা TRF2 লক্ষ্য করে ক্রোমোজোমের শেষগুলিকে ডিডিআর থেকে রক্ষা করার ক্ষমতাকে দুর্বল করে এইভাবে সম্ভাব্য বার্ধক্যজনিত পার্শ্ব প্রতিক্রিয়াগুলির সাথে [22]। আমাদের পূর্ববর্তী কাজ দেখিয়েছে যে TRF2 এক্সপ্রেশনের আংশিক হ্রাস DDR[13] প্ররোচিত না করেই নন-সেল-স্বায়ত্তশাসিত প্রভাবের মাধ্যমে মাউস মডেলগুলিতে টিউমারজিনিসিটি বিপরীত করতে পারে। তাই আমরা যুক্তি দিয়েছি যে ক্যান্সারে অতিরিক্ত TRF2 কমানোর উপর ফোকাস করা তার অত্যধিক এক্সপ্রেশনের ফলে বার্ধক্যজনিত পার্শ্ব প্রতিক্রিয়া ছাড়াই ক্যান্সারের চিকিত্সার জন্য একটি আকর্ষণীয় কৌশল হতে পারে। এই গবেষণায়, আমরা TRF2 স্থিতিশীলতা লক্ষ্য করে ছোট কম-পাউন্ড সনাক্ত করতে একটি আসল স্ক্রীনিং প্ল্যাটফর্ম উপস্থাপন করি। আমরা দেখাই যে দুটি শীর্ষ হিট TRF2 ওভার এক্সপ্রেশনের টিউমারিজেনিক কার্যকলাপকে বাধা দেয়। এই সমীক্ষায় প্রমাণিত হয়েছে যে TRF2 এক্সপ্রেশন ফার্মাকোলজিক্যালি মডিউল করা যেতে পারে এবং আমাদের স্ক্রীনিং অ্যাস হল সম্ভাব্য অ্যান্টি-ক্যান্সার এবং অ্যান্টি-বার্ধক্য বৈশিষ্ট্য সহ TRF2 এক্সপ্রেশন স্তরগুলিকে সংশোধন করতে সক্ষম ওষুধ নির্বাচনের জন্য একটি নির্ভরযোগ্য পদ্ধতি।

2. উপাদান এবং পদ্ধতি 2.1.কোষ

মানব ভ্রূণের কিডনি (HEK)293-টি কোষ (ATCC CRL-1573) এবং BJ-HELTRAs কোষগুলি[13] Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) (Lonza, Levallois Perret, France) এর সাথে সম্পূরকভাবে বেড়ে ওঠে। 10 শতাংশ ভ্রূণ বাছুরের সিরাম (FCS), 100 IU/mL পেনিসিলিন এবং 100ug/mL স্ট্রেপ্টোমাইসিন (Invitrogen, Cergy Pontoise, France)।

2.2.SDS-পৃষ্ঠা এবং ওয়েস্টার্ন ব্লটিং

মোট সেল লাইসেটগুলি প্রস্তুত করা হয়েছিল, ইলেক্ট্রোফোরসিস দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল এবং পূর্বে বর্ণিত হিসাবে ব্লট করা হয়েছিল [14]। সংক্ষেপে, কোষগুলি লাইসিস বাফারে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং লাইজ করা হয়েছিল (8.76 g/L NaCl 10 mM Tris-HCL pH7.2,0.1 শতাংশ SDS,0.1 শতাংশ ট্রিটন এক্স -100,10 g/L সোডিয়াম ডিঅক্সিকোলেট, 5 মিমি ইথিলেনেডিয়ামাইনটেট্রাসেটিক অ্যাসিড (EDTA), 1{{50} ug/mL leupeptine, 1 mM AEBSF এবং 19 ug/mL এপ্রোটিনিন)। তারপরে বিসিএ প্রোটিন অ্যাসে কিট (ইন্টারচিম, মনলুকন, ফ্রান্স) ব্যবহার করে নমুনাগুলি টাইটেরেট করা হয়েছিল। নমুনাগুলি (60 ug/লেন) লোডিং বাফারে 5 মিনিটের জন্য 95 ডিগ্রিতে উত্তপ্ত করা হয়েছিল (500 মিমি ট্রিস-এইচসিএল, 100 মিমি ডিটিআই, 2 শতাংশ এসডিএস, 0.1 শতাংশ ব্রোমোফেনল নীল, 10 শতাংশ গ্লিসারল পিএইচ 6.8)। তারপরে নমুনাগুলি 10 শতাংশ পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেলে লোড করা হয়েছিল এবং 160 V এ 45 মিনিটের জন্য চালানো হয়েছিল। তারপরে ট্রান্স-ব্লট এসডি সেমি-ড্রাই ইলেক্ট্রোফোরেটিক ট্রান্সফার সেল ব্যবহার করে প্রোটিনগুলি ইমোবিলন-এফএল মেমব্রেনে (মিলিপুর, আপস্টেট নিউ ইয়র্ক, ইউএসএ) স্থানান্তরিত হয়েছিল। Rad, Hercules, CA, USA) ইন্টারসেপ্ট ব্লকিং বাফারে (LI COR, Lincoln, NE, USA) প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলির মিশ্রণের সাথে 4 ডিগ্রিতে রাতারাতি ইনকিউবেশনের আগে ঝিল্লিগুলি 1 ঘন্টার জন্য অবরুদ্ধ করা হয়েছিল (mouselgGl anti-TRF2 at1: 250;এবং খরগোশ IgGanti-Beta-actin 1:10 এ মিশ্রিত,000) ইন্টারসেপ্ট ব্লকিং বাফারে 0.5 শতাংশ Tween20 রয়েছে। পিবিএস 0.1 শতাংশ টুইন20-এ ধোয়ার পর, ইন্টারসেপ্ট ব্লকিং বাফারে ঘরের তাপমাত্রায় ঝিল্লিগুলি 1 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল যাতে 0.25 শতাংশ টুইন20 থাকে যাতে সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলির মিশ্রণ রয়েছে: অ্যান্টি-TRF2 অ্যান্টিবডি এবং ছাগল অ্যান্টি-রবিট আইআরডিই 680 অ্যান্টি-বিটা-অ্যাক্টিন অ্যান্টিবডির জন্য 800CW (1:15,000 ডিলিউশন)।এন্টি বার্ধক্য cistancheপ্রাথমিক এবং IRDye সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিগুলি যেগুলি ব্যবহার করা হয়েছিল তা অ্যান্টিবডি টেবিলে (সারণী 1) নীচে তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। অবশেষে, প্রোটিন ব্যান্ডগুলি LiCor Odyssey 9120 ইমেজিং সিস্টেম (LI-COR) ব্যবহার করে ভিজ্যুয়ালাইজ করা হয়েছিল। TRF2 এক্সপ্রেশন অ্যাক্টিন ব্যান্ড এবং ব্যাকগ্রাউন্ডের তীব্রতায় TRF2 ব্যান্ডের তীব্রতা স্বাভাবিক করে পরিমাপ করা হয়েছিল।

2.3.ক্লোনিং কৌশল

মানুষের TRF2 সিডিএনএ সিকোয়েন্সটি একটি এইচআইভি-এসএফএফভি-জিএফপি-ডব্লিউপিআরই ডেরিভেটিভ [২৩] একটি লেন্টিভাইরাল SFFV-GPR প্লাজমিডের BamHI/BclI সীমাবদ্ধতা সাইটগুলির মধ্যে ক্লোন করা হয়েছিল। এসএফএফভি-জিপিআর প্লাজমিডে একটি প্লীহা ফোকাস গঠনকারী ভাইরাস (এসএফভি) প্রোমোটার রয়েছে যা একটি জিপিআর পলিসিস্ট্রোনিক জিন নিয়ন্ত্রণ করে যা সবুজ ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন (জিএফপি), একটি পিউরোমাইসিন প্রতিরোধের প্রোটিন এবং ট্যাগ-রেড ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন (RFP)-T (S158) এর সিডিএনএ সিকোয়েন্স সমন্বিত করে। -RFP), প্রতিটি E2 এবং T2 Picornaviridae ক্রম দ্বারা পৃথক করা হয়েছে। HTRF2 cDNA RFP-T-এর সি-টার্মিনাল অঞ্চলে ঢোকানো হয়েছিল, একটি RFP-TRF2 ফিউশন প্রোটিনের অভিব্যক্তি সক্ষম করতে।

2.4.লেন্টিভাইরাস উত্পাদন

লেন্টিভাইরাস উত্পাদনের জন্য, 5 × 10* HEK 293-টি কোষগুলি 8.6 ug খালি SFFV-GPR বা RFP-TRF2- প্রকাশ করে SFFV-GPR ভেক্টর, 8.6 ug লেন্টি দিয়ে স্থানান্তরিত হয়েছিল -ডেল্টা 8.91 এবং 2.8 ug এর VSV-g ক্যালসিয়াম ফসফেট-মিডিয়াটেড ট্রান্সফেকশনের মাধ্যমে। স্থানান্তরিত কোষগুলিকে DMEM-তে 37 ডিগ্রিতে 10 শতাংশ FCS সম্পূরক 10-সেমি ডিশে 5 শতাংশ CO2 সহ সংষ্কৃত করা হয়েছিল। নবনির্মিত ভাইরাস ধারণকারী সুপারন্যাট্যান্টগুলি 48 ঘন্টা পরে সংগ্রহ করা হয়, তারপর একটি 0{25}μm মিলিপুর ফিল্টার অতিক্রম করে। ভাইরাস টাইট্রেশনের পরে, একটি 1∶1 （ভাইরাস∶সেল） অনুপাত BJ-HELTRAs সেল লাইনকে সংক্রামিত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল, যা TRF2 ত্রুটিগুলির প্রতিরোধের জন্য বেছে নেওয়া হয়েছিল[13]।cistanche উপকারীএকটি ক্লোন যা GFP এবং ফিউজড RFP-TRF2 প্রোটিনকে মাঝারি মাত্রায় প্রকাশ করে তারপর ফ্লুরোসেন্স-অ্যাক্টিভেটেড সেল সর্টিং (FACS) দ্বারা বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল।

2.5.ফ্লো সাইটোমেট্রি স্ক্রীনিং

BJ-HELTRAs ক্লোনাল লাইন কোষ যাতে SFFV-GPR ভেক্টর থাকে এবং RFP-TRF2 ফিউশন প্রোটিন প্রকাশ করে DMEM মাধ্যমের ভাল প্লেটে 10 শতাংশ FCS এবং 1 শতাংশ পেনিসিলিন/স্ট্রেপ্টোমাইসিন সম্পূরক হয়। ওষুধের চিকিত্সার 24 ঘন্টা পরে, কোষগুলিকে ট্রিপসিনাইজ করা হয়েছিল এবং 0.5 শতাংশ ফর্মালডিহাইড (FA) দিয়ে ফিক্স করার আগে ফসফেট-বাফারযুক্ত স্যালাইন (PBS) যাতে 0.5 মিমি ইডিটিএ এবং 2 শতাংশ এফসিএস থাকে। একটি FacsCalibur হাই-থ্রুপুট স্যাম্পলার (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) ব্যবহার করে সাইটোমেট্রি প্রবাহিত করতে।

2.6.রিয়েল-টাইম পরিমাণগত পলিমারেজ চেইন প্রতিক্রিয়া (RT-qPCR)

RNeasy মিনি কিট (কিয়াজেন, ভেনলো, নেদারল্যান্ডস) ব্যবহার করে মোট আরএনএ বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল। মোট RNA এর 1 ug সহ সুপারস্ক্রিপ্ট II রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেস (ইনভিট্রোজেন) ব্যবহার করে বিপরীত প্রতিলিপি করা হয়েছিল। প্রতিটি জিনের অভিব্যক্তি GAPDH এর সাথে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। নিম্নলিখিত প্রাইমারগুলি ব্যবহার করা হয়েছিল: hTRF2 Fw 5'-GCTGCCTGACTIGAACAGT-3';hTRF2 Rv 5'-CCGTTCTCAACCAACCCTC-3';hGAPDHFw5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'hCCCCATCGCTCAGACAC-3'hCCGCCATGACGAC'-3' 14}}। 2.7.আলমার ব্লু

একটি 96-কূপ ফ্ল্যাট-বটম প্লেটে, প্রতি কূপে 5 × 103 কোষ 200 uL DMEMsup-তে 10 শতাংশ FCS-এর সাথে পরিপূরক বীজ বপন করা হয়েছিল। ওষুধের চিকিত্সার 24 ঘন্টা পরে, AlamarBlue (Bio-Rad) এর 10 uL যোগ করা হয়েছিল এবং স্পেকট্রোস্টার ন্যানো প্লেট রিডারে (BMGLabtech, Ortenberg, Germany) 36 ঘন্টার জন্য শোষণ 570 nm এবং 600 nm পরিমাপ করা হয়েছিল। AlamarBlue এর অক্সিডেশন-হ্রাস শতাংশ নির্মাতার দ্বারা বর্ণিত হিসাবে নির্ধারিত হয়েছিল।

2.8.প্রাণী

পরীক্ষাগুলি জানভিয়ার ল্যাবস (ফ্রান্স) থেকে 8- থেকে 12- সপ্তাহ বয়সী এনএমআরআই নগ্ন মহিলা ইঁদুরে সম্পাদিত হয়েছিল৷ সমস্ত মাউস পরীক্ষা স্থানীয় এবং আন্তর্জাতিক প্রাতিষ্ঠানিক নির্দেশিকা অনুসারে পরিচালিত হয়েছিল এবং IRCAN এবং আঞ্চলিক (CIEPAL Cote d'Azur #187 এবং #188) এবং জাতীয় (ফরাসি গবেষণা মন্ত্রণালয় #03482.01/02482.2) এর প্রাণী পরিচর্যা কমিটি দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল এবং #02973.01/02973.2) কর্তৃপক্ষ।

2.9.টিউমার বৃদ্ধির পরীক্ষা

প্রতিটি NMRI নগ্ন মাউস পিবিএসের 100 μL （n=8 ইঁদুর প্রতি গ্রুপ）-এ স্থগিত 1 x 106 BJ-HELTRAs কোষগুলির সাথে পিছনের নিচের অংশে ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। 16, 18, 20 এবং 22 দিনে ইঁদুরগুলিকে 100 uL DMSO (45 শতাংশ), অ্যালেক্সিডিন{11}HCl (1 mg/kg) অথবা AR-A014418 (5 mg/kg) ইনট্রাপেরিটোনিয়াল ইনজেকশন দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। তারপর 26 তম দিন পর্যন্ত অনুসরণ করা হয়। টিউমারের চেহারাটি প্রতিদিন প্যালপেশন দ্বারা মূল্যায়ন করা হয়েছিল। একটি ক্যালিপার ব্যবহার করে প্রতি 2-3 দিনে টিউমারের আকার পরিমাপ করা হয়। টিউমারের আয়তন তখন হেমি-ইলিপসয়েড সূত্র ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিল:π×(L×1× h)/6, যেখানে L দৈর্ঘ্যের সাথে, I প্রস্থের সাথে এবং h টিউমারের উচ্চতার সাথে মিলে যায়।

2.10.ম্যাট্রিজেল প্লাগ অ্যাসেস

BJ-HELTRAs কোষগুলিকে DMSO (1 শতাংশ), অ্যালেক্সিডিন-2HCl (1 uM) বা AR-A014418 （10 μM） দিয়ে 2 দিনের জন্য চিকিত্সা করা হয়েছিল। তারপর, পিবিএস-এ স্থগিত 100 μL 1 × 10 ডিগ্রী চিকিত্সা কোষের সাথে 400 uL গ্রোথ-ফ্যাক্টর-রিডুসড ম্যাট্রিজেল (কর্নিং, নিউ ইয়র্ক, ইউএসএ) আইসোফ্লুরেন অ্যানেস্থেশিয়ার অধীনে এনএমআরআই নগ্ন ইঁদুরের পিছনে উপকূলীয়ভাবে টিকা দেওয়া হয়েছিল। ইনোকুলেশনের 5 তম দিনে, ম্যাট্রিজেল প্লাগগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল, এবং অনুপ্রবেশকারী কোষগুলি 37 ডিগ্রিতে 30 মিনিটের জন্য ডিসপেস (কর্নিং), কোলাজেনেস A (রোচে, বেল, সুইজারল্যান্ড) এবং DNAseI (রোচে) হজমের মাধ্যমে এনজাইমেটিক বিচ্ছিন্নকরণের মাধ্যমে সংগ্রহ করা হয়েছিল। ]। 4 ডিগ্রিতে 30 মিনিটের জন্য সংযুক্ত অ্যান্টিবডিগুলির সাথে দাগ দেওয়ার আগে কোষগুলিকে Fe-Block অ্যান্টি-CD16/CD32 অ্যান্টিবডি (ক্লোন 2.4G2) দিয়ে বরফের উপর 15 মিনিটের জন্য স্যাচুরেট করা হয়েছিল। ব্যবহৃত সংযোজিত অ্যান্টিবডিগুলি অ্যান্টিবডি টেবিলে তালিকাভুক্ত করা হয়েছে। পিবিএস-এ 0.5 মিমি ইডিটিএ, 2 শতাংশ এফসিএস এবং 0.5 শতাংশ এফএ দিয়ে স্থির করা হয়েছে। DIVA6 সফ্টওয়্যার (BD Biosciences) এবং FlowJo 10 (LLC) সহ একটি ARIA III সাইটোমিটার ব্যবহার করে দাগযুক্ত কোষগুলি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

2.11.পরিসংখ্যান

সমস্ত গ্রাফ এবং পরিসংখ্যান বিশ্লেষণগুলি গ্রাফপ্যাড প্রিজম সফ্টওয়্যার (সান দিয়েগো, CA,USA) ব্যবহার করে উত্পাদিত হয়েছিল৷ সমস্ত ফলাফলকে গড় ± স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন (sd) বা গড় (SEM) এর ± স্ট্যান্ডার্ড ত্রুটি হিসাবে উপস্থাপন করা হয়৷ মান-হুইটনি টু-টেইল্ড টেস্ট ব্যবহার করে উপায়গুলির মধ্যে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য নির্ধারণ করা হয়েছিল। লগ-র‍্যাঙ্ক (ম্যানটেল-কক্স) পরীক্ষা টিউমার গ্রহণ নির্ধারণ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। প্রতিটি পরীক্ষার জন্য, পি<0.05 was="" considered="" statistically="">

3। ফলাফল

3.1.TRF2 ইনহিবিটরি অণুর সনাক্তকরণ

TRF2 প্রোটিনের মাত্রা সংশোধন করতে সক্ষম ওষুধের জন্য স্ক্রীন করার জন্য, আমরা TRF2 এর N-টার্মিনাসে মিশ্রিত GFP জিন এবং RFP সহ-প্রতিলিপি করার জন্য একটি লেন্টিভাইরাল সিস্টেম ব্যবহার করেছি। অন্যত্র বর্ণিত একটি সাধারণ কৌশল অনুসরণ করে [২৩], আমরা একটি জিআরটি লেন্টিভাইরাস তৈরি করেছি, যেখানে এসএফএফভি প্রবর্তক একটি পলি-সিস্ট্রোনিক জিন এনকোডিং জিএফপি, একটি পিউরোমাইসিন রেজিস্ট্যান্স প্রোটিন এবং শুধুমাত্র একটি নিয়ন্ত্রণ হিসাবে RFP-TRF2 বা RFP এর অভিব্যক্তি নিয়ন্ত্রণ করে (চিত্র 1A)। ফলস্বরূপ, সমস্ত স্থানান্তরিত কোষ GFP এবং RFP-TRF2 উভয়ই প্রকাশ করে। এই সিস্টেমটি ড্রাগগুলি সনাক্ত করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছিল যা TRF2 এক্সপ্রেশনকে মডিউল করে, ফ্লো সাইটোমেট্রি ব্যবহার করে RFP তীব্রতা পরিমাপ করে, যখন GFP তীব্রতা রিপোর্টার নির্মাণের প্রতিলিপির জন্য একটি অভ্যন্তরীণ নিয়ন্ত্রণ হিসাবে কাজ করে।

আমরা জিআরটি লেন্টিভাইরাসগুলিকে মানব বিজে-হেল্ট্রাস ফাইব্রোব্লাস্টে রূপান্তরিত করেছি যা SV40 এবং hTERT দ্বারা অমর হয়ে গেছে এবং রাস v12 দ্বারা অনকোজেনিক রেন্ডার করা হয়েছে [13]। TRF2-এর আপ-এবং ডাউন-নিয়ন্ত্রণ উভয়ের পরিমাপ সহজতর করার জন্য, একটি পিউরোমাইসিন-প্রতিরোধী ক্লোন যা GFP এবং RFP-TRF2 প্রোটিন উভয়কেই পরিমিতভাবে প্রকাশ করে FACS বাছাই ব্যবহার করে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং GRI-BJ-HELTRAs (চিত্র 1A) নামকরণ করা হয়েছিল। একটি ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে, আমরা 10 uM জেমসিটাবাইন দিয়ে GRT-BJ-HELTRAs কোষগুলিকে চিকিত্সা করেছি, 24 ঘন্টার জন্য TRF2 স্থিতিশীলতা [24] এর পূর্বে বর্ণিত মডুলেটর। খালি ভেক্টরের সাথে ট্রান্সডুস করা কোষগুলিতে কোনও RFP মড্যুলেশন সনাক্ত করা না গেলেও, DMSO-চিকিত্সা করা নিয়ন্ত্রণের তুলনায় জেমসিটাবাইন-চিকিত্সা করা GRT-BJ-HELTRAs কোষগুলিতে RFP/GFP মানে ফ্লুরোসেন্স তীব্রতা (MFI) অনুপাতের একটি উল্লেখযোগ্য হ্রাস লক্ষ্য করা গেছে (82 শতাংশ নিয়ন্ত্রণের; পি<0.0001)(figure 1b).moreover,="" gemcitabine="" specifically="" diminished="" rfp-trf2="" protein="" levels="" without="" affecting="" gfp="" levels="" (figure="" s1a).="" of="" note,="" we="" observed="" here="" that="" gemcitabine="" is="" reducing="" trf2="" level="" in="" contrast="" to="" the="" published="" work[24],="" a="" difference="" that="" may="" be="" explained="" by="" cell="" type="" differences="" in="" the="" dna="" damage="" response="" induced="" by="" gemcitabine="" since="" trf2="" stability="" can="" be="" altered="" in="" a="" p53-dependent="" manner="" [25].="" this="" effect="" was="" further="" confirmed="" by="" western="" blotting="" analyses="" where="" we="" observed="" that="" endogenous="" trf2="" levels="" were="" affected="" by="" gemcitabine="" treatment="" on="" untrans-duced="" bj-heltras="" cells="" (figure="" s1b).therefore,="" grt-bj-heltras="" cells="" enabled="" detection="" of="" specific="" variations="" in="" trf2="" protein="" levels="" induced="" by="" drug="" treatment.="" or="" gemcitabine="" (right="" panel)(n=""><0.001;two-tailed student'st="" test).="" (c)representative="" rfp/gfp="" flow="" cytometry="" plots="" of="" trf2="" vector-transduced="" bj-heltras="" cells="" treated="" with="" 10="" um="" of="" alexidine-2hcl,="" ar-a014418="" or="" dmso="" (left="" panel).="" box-plot="" quantification="" of="" rfp-trf2="" fusion="" (trf2="" vector)="" proftein="" levels="" following="" treatment="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418(right="" panel)(n=""><0.05;mann-whitney test).(d)representative="" western="" blotting="" showing="" reduced="" trf2="" protein="" levels="" following="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" in="" untransduced="" bj-heltras="" cells="" (left="" panel;="" full="" western="" lolotting="" image="" is="" presented="" in="" figure="" s2a).="" quantification="" of="" trf2="" protein="" levels="" after="" treatment="" with="" 10="" μm="" alexidine-2hccl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" （right="" panel)(n="2;mean" +="" standard="" error="" of="" the="" mean).(e)quarntification="" of="" trf2="" mrna="" levels="" analyzed="" by="" rt-qpcr="" after="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="">

ফ্লো সাইটোমেট্রি ব্যবহার করে, আমরা তারপরে 396টি ফুড অ্যান্ড ড্রাগ অ্যাডমিনিস্ট্রেশন (এফডিএ) অনুমোদিত ফার্মাকোলজিকাল যৌগগুলি স্ক্রীন করেছি যা জৈবিক-আইকাল প্রক্রিয়াগুলির ছয়টি প্রধান বিভাগকে লক্ষ্য করতে সক্ষম: আয়ন চ্যানেল, ফসফেটেস, কাইনেস, এপিজেনেটিক ফ্যাক্টর, নিউক্লিয়ার রিসেপ্টর লিগান্ডস এবং Wnt পাথওয়ে .GRT-BJ-HELTRAs কোষগুলিকে প্রথমে 396 টি যৌগের প্রতিটির 10 uM বা DMSO দিয়ে 24 ঘন্টা আগে প্রবাহ সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণ (চিত্র S1D) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। এই ক্ষেত্রে, 84 টি যৌগ TRF2 প্রোটিন স্তরগুলিকে সংশোধন করতে পাওয়া গেছে (চিত্র S1D, ডান প্যানেল; টেবিল S1), এবং একটি গৌণ পর্দার জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল (চিত্র S1E; ​​টেবিল S1)। এই সেকেন্ডারি স্ক্রিনে, নির্বাচিত যৌগগুলির 10 uM সহ GRT-BJ-HELTRAs কোষগুলির চিকিত্সা করার পাশাপাশি, অ-ট্রান্সডুসড BJ-HELTRAs কোষ বা BJ-HELTRAs কোষগুলিকে একটি খালি ভেক্টরের সাহায্যে ট্রান্সডুস করা হয়েছে এমনভাবে ব্যবহার করা হয়েছিল যাতে মিথ্যা ইতিবাচক নির্গত টিং লাল বাদ দেওয়া হয়। বা সবুজ অটোফ্লোরেসেন্স বা RFP বা GFP প্রোটিন প্রভাবিত করে। 18টি সেরা কম-পাউন্ডগুলিকে ওয়েস্টার্ন ব্লটিং (চিত্র S2A, B টেবিল S1) এর উপর ভিত্তি করে নন-ট্রান্সডুসড BJ-HELTRAs কোষে এন্ডোজ নাউস TRF2-এর অভিব্যক্তি মডিউল করার ক্ষমতা নির্ধারণের জন্য নির্বাচিত করা হয়েছিল। আমরা হিটগুলিকে সংজ্ঞায়িত করেছি যৌগ হিসাবে TRF2 ডোজের কমপক্ষে 20 শতাংশ দ্বারা পরিমিত হয় (উপরে বা নীচে)। এই মানদণ্ডগুলি ব্যবহার করে, ওয়েস্টার্ন ব্লটিং দ্বারা মূল্যায়ন করা 18টি ওষুধের মধ্যে, তাদের মধ্যে 9টি হ্রাস পেয়েছে এবং একটি অন্তঃসত্ত্বা TRF2 প্রোটিনের মাত্রা বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র S2A, সারণী S1) তারপরে আমরা ভিভো পরীক্ষার জন্য এই ওষুধগুলির মধ্যে দুটি যৌগ বেছে নেওয়ার সিদ্ধান্ত নিয়েছি কিনা তা নির্ধারণ করতে। TRF2 ওভার এক্সপ্রেশনের প্রো-অনকোজেনিক প্রভাবগুলিকে প্রতিহত করে। নন-টিউমারিজেনিক কোষে ডিডিআর অ্যাক্টিভেশন এবং পার্শ্বপ্রতিক্রিয়া এড়াতে, আমরা এমন যৌগগুলি নির্বাচন করেছি যেগুলি সর্বোচ্চ বা সর্বনিম্ন স্তরের TRF2 ডোজ পর্যন্ত হ্রাস পায়নি। তাদের মধ্যে, AR এবং AD সেই মানদণ্ডের সাথে সঙ্গতিপূর্ণ ছিল। উভয় যৌগই ফ্লো সাইটোমেট্রি (চিত্র 1C), অন্তঃসত্ত্বা TRF2 প্রোটিন স্তর দ্বারা বিশ্লেষণ করা GRT-BJ-HELTRAs কোষে RFP-TRF2 কে কমিয়েছে, যেমনটি পশ্চিমা ব্লটিং বিশ্লেষণ দ্বারা দেখানো হয়েছে (চিত্র 1D; চিত্র S2A,B) এবং TERF2 mRNA স্তর হিসাবে নির্ধারণ করা হয়েছে। -qPCR (চিত্র 1E)। অধিকন্তু, AR এবং AD এর স্বতন্ত্র LD50 ঘনত্বের সাথে চিকিত্সার ফলে উভয় BJ-HELTRAs কোষে এবং TRF2-অতিরিক্ত BJ-HELTRAs কোষে (চিত্র S3A-C) TERF2 mRNA এক্সপ্রেশন কমে যায়।

3.2.AR-A014418 এবং Alexidine-2HCl উচ্চ TRF2 এক্সপ্রেশন লেভেল দ্বারা প্রদত্ত টিউমারিজেনিসিটি বিপরীত করেছে

আমরা পরবর্তীতে টিউমার বৃদ্ধিতে AR এবং AD এর প্রভাব মূল্যায়ন করেছি। TRF2-অত্যধিক এক্সপ্রেসিং ক্যান্সারকে লক্ষ্য করার ক্ষমতা নিয়ন্ত্রণ করতে, আমরা স্ট্যান্ডার্ড BJ-HELTRAs কোষ এবং TRF2-অতিপ্রকাশকারী BJ-HELTRAs কোষ উভয়ের উপর AR এবং AD-এর সম্ভাব্য অ্যান্টি-টিউমারিজেনিক প্রভাবগুলি বিশ্লেষণ করেছি। BJ-HELTRAs কোষগুলিকে TRF2lentiviral ভেক্টর বা খালি ভেক্টর দিয়ে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল, তারপর নগ্ন ইঁদুরের মধ্যে সাবকুটেনিয়াস ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল। তারপরে ইঁদুরগুলিকে DMSO, 1 mg/kg AD বা 5 mg/kg AR দিয়ে 16,18,20 এবং 22 পোস্ট-ইনজেকশন [26,27] (চিত্র 2A) দিনে চিকিত্সা করা হয়েছিল। পূর্বে রিপোর্ট [13,21] হিসাবে, TRF2 ওভার এক্সপ্রেশন টিউমার ini প্রচার করেছে। ভিভোতে সংযুক্তি এবং বৃদ্ধি (চিত্র 2B-D;p<0.05). treatment="" with="" neither="" ar="" nor="" ad="" impacted="" tumor="" volume="" in="" bj-heltras="" cells="" transduced="" with="" the="" empty="" vector="" (figure="" 2e,="" upper="" panels)="" neither="" tumor="" growth="" rate(figure="" 2f-h).="" by="" contrast,="" both="" drugs="" induced="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" tumor="" volume="" of="" trf2-overexpressing="" xenografted="" tumors,="" leading="" to="" significantly="" smaller="" tumor="" sizes="" at="" day="" 26="" (figure="" 2e,middle=""><001)but also="" of="" the="" tumor="" growth="" rate="" (figure="" 2f-h)="" at="" each="" time-point.="" furthermore,="" the="" vol-ume="" and="" growth="" rates="" of="" trf2-overexpressing="" tumors="" treated="" by="" the="" two="" drugs="" returned="" to="" levels="" similar="" to="" those="" of="" the="" control="" tumors,="" thus="" demonstrating="" the="" trf2-specific="" selectivity="" of="" ar="" and="" ad="" (figure="" 2e,lower="" panels).these="" results="" show="" that="" ar="" and="" ad="" treatment="" reversed="" specifically="" the="" tumorigenicity="" conferred="" by="" trf2="" overexpression.="" or）="" were="" injected="" subcutaneously（1×10°cells/100μl）into="" nmri="" nude="" mice.="" the="" mice="" were="" then="" treated="" with="" dmso,alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)="" or="" ar-a014418(5="" mg/kg)="" at="" days16,18,20="" and="" 22="" post-injection,="" then="" followed="" up="" until="" day="" 26="" (n="8" mice="" per="" group).(b-d)="" the="" percentage="" of="" tumor-free="" mice="" (b)="" and="" tumor="" volumes(c)="" were="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" in="" mice="" injected="" with="" bj-heltras="" cells="" overexpressing="" trf2(trf2="" vector)="" or="" empty="" vector.="" tumor="" take="" based="" on="" palpability="" was="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" and="" is="" represented="" as="" a="" percentage="" of="" tumor-free="" mice.p="" values="" were="" determined="" using="" the="" log-rank="" mantel-cox="" test(*=""><0.05). tumor="" volumes="" were="" assessed="" at="" different="" time-points="" (mean="" ±="" standard="" deviation);="" tumor="" volume="" at="" d.ay="" 15="" is="" represented="" in="" (d).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><0.001). (e)="" tumor="" volumes="" were="" followed="" as="" in="" (c)="" after="" repetitive="" treatments="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg),="" or="" ar-a014418(5mg/kg).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><0.0001;ns: not="" significant).(f-h)="" tumor="" growth="" rate="" of="" ar-a014418(5mg/kg)treated="" mice(f,h)="" or="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)(g,h)="" treated="" mice="" were="" determined="" by="" considering="" the="" last="" day="" before="" treatment="" for="" empty="" vector="" or="" trf2="" vector="" as="" 100%.="" variations="" of="" the="" growth="" rate="" in="" both="" treatments="" over="" the="" time="" are="" represented="" in="" (f,g)="" and="" for="" each="" time-point="" (h).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><>

3.3.AR-A014418 এবং অ্যালেক্সিডাইন-2HCI কাউন্টার্যাক্টেড TRF2-নির্ভরশীল ইমিউনোসপ্রেশন এবং নিও-অ্যাঞ্জিওজেনেসিস

AR এবং AD-এর অ্যান্টিটিউমার প্রভাবগুলি TRF2 এর অ-কোষ স্বায়ত্তশাসিত অনকোজেনিক বৈশিষ্ট্যগুলিকে লক্ষ্য করতে পারে কিনা তা নির্ধারণ করতে, আমরা চিকিত্সা করা টিউমারগুলিতে ইমিউন কোষের অনুপ্রবেশ এবং সক্রিয়করণের পাশাপাশি অ্যাঞ্জিওজেনেসিস পরীক্ষা করেছি। আমরা নগ্ন ইঁদুরের মধ্যে ম্যাট্রিজেল দিয়ে সাবকুটেনিয়াস ইনজেকশন দেওয়ার আগে 48 ঘন্টার জন্য 1 uM AD, 10 uM AR বা DMSO সহ স্ট্যান্ডার্ড এবং TRF2-ওভার এক্সপ্রেসিং BJ-HELTRAs কোষ (চিত্র S3A) চিকিত্সা করেছি। ম্যাট্রিজেল প্লাগগুলি ফ্লো সাইটোমেট্রি (চিত্র 3A) দ্বারা টিউমার মাইক্রোএনভায়রন-মেন্ট বিশ্লেষণ করার জন্য 5 দিনের পোস্ট-ইনজেকশনে সংগ্রহ করা হয়েছিল। প্রত্যাশিত [13,21], TRF2 ওভার এক্সপ্রেশন গ্লোবাল ইমিউন সেল (CD45 প্লাস সেল) অনুপ্রবেশ (চিত্র 3B; চিত্র S4A) পরিবর্তন করেনি, তবে প্রাকৃতিক হত্যাকারী (NK) কোষ নিয়োগ (চিত্র 3C; চিত্র S4B) এবং এনকে ফাংশনকে বাধা দেয়। -ality (চিত্র 3C-E; চিত্র S4C), এবং MDSC অনুপ্রবেশ বৃদ্ধি (চিত্র 3F)। TRF2-বিজে-হেল্ট্রাস কোষগুলিকে বিশেষভাবে অত্যধিক প্রকাশ করে, যেকোনও একটি ওষুধের সাথে চিকিত্সার ফলে বিশ্বব্যাপী প্রতিরোধ ক্ষমতা বৃদ্ধি পায় (চিত্র 3B; চিত্র S4A), সেইসাথে ইন্ট্রা-টিউমারাল এনকে কোষগুলির পরিমাণ এবং কার্যকারিতা (চিত্র 3C-E; চিত্র S4B,C)। উল্লেখযোগ্যভাবে, উভয় ওষুধই TRF2 অত্যধিক এক্সপ্রেশন (চিত্র 3C) দ্বারা প্ররোচিত NK সেল-মধ্যস্থতা প্রতিরোধী নজরদারি (CD107a প্লাস এবং CD69 প্লাস NK সেল) প্রতিরোধকে সম্পূর্ণরূপে উদ্ধার করেছে। এটি MDSC নিয়োগে একটি নাটকীয় হ্রাস (চিত্র 3F; চিত্র S4D) এবং মনোসাইট এবং ম্যাক্রোফেজগুলির (চিত্র 3G) বর্ধিত নিয়োগের সাথে যুক্ত ছিল।

পূর্বে রিপোর্ট করা [14,20] হিসাবে, টিউমার এনজিওজেনেসিস টিআরএফ2-ওভার এক্সপ্রেসিং টিউমারে নিয়ন্ত্রণ টিউমারের তুলনায় বেশি ছিল। যদিও TRF2 অত্যধিক এক্সপ্রেশন টিউমারবডের মধ্যে CD31 প্লাস CD45-এন্ডোথেলিয়াল কোষের পরিমাণ বাড়িয়েছে (চিত্র 3H; চিত্র S4E), যেকোনও ওষুধের সাথে চিকিত্সার পরে খালি ভেক্টর বা TRF2-অভার এক্সপ্রেসিং টিউমারগুলির মধ্যে কোনও পার্থক্য সনাক্ত করা যায়নি। ing TRF2（TRF2 ভেক্টর） বা খালি ভেক্টরকে 1uM অ্যালেক্সিডিন{{12}HCl বা 10 μM AR-A014418 বা DMSO দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল 2 দিন আগে ম্যাট্রিজেল (1 × 10 ডিগ্রী কোষ) দিয়ে এনএমআরআই-এ সাবকুটেনিয়াস ইনজেকশন n=8)। ইমিউন এবং এন্ডোথেলিয়াল কোষের অনুপ্রবেশ তারপরে ফ্লো সাইটোমেট্রি দ্বারা ইনজেকশন-পরবর্তী 5 দিন মূল্যায়ন করা হয়েছিল। (বিএইচ)। ম্যাট্রিজেল প্লাগের ইমিউন অনুপ্রবেশের ফ্লো সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণ। জীবিত কোষের মধ্যে ম্যাট্রিজেল প্লাগগুলিতে অনুপ্রবেশকারী ইমিউন কোষের সংখ্যা দেখানো হয়েছে। মোট ইমিউন কোষের অনুপ্রবেশ (CD45 প্লাস কোষ) দেখানো হয়েছে (B); প্রাকৃতিক হত্যাকারী (NK) কোষ (NKp46 প্লাস কোষ) অনুপ্রবেশ (C) এ দেখানো হয়েছে; সক্রিয় NK কোষ (CD107a প্লাস এবং CD69 প্লাস NK কোষ) অনুপ্রবেশ (D,E) এ দেখানো হয়েছে; মাইলয়েড থেকে প্রাপ্ত দমনকারী কোষ (MDSC; CD11b প্লাস GR1 প্লাস)) অনুপ্রবেশ (F) এ দেখানো হয়েছে; মনোসাইট-ম্যাক্রোফেজ অনুপ্রবেশ (G) এ দেখানো হয়েছে এবং এন্ডোথেলিয়াল কোষের অনুপ্রবেশ (H.p) এ দেখানো হয়েছে মান- ব্যবহার করে মান নির্ধারণ করা হয়েছে। হুইটনি পরীক্ষা (*p<><><0.001;n =="" 8="" mice="" per="">

4। আলোচনা

এখানে, আমরা টেলোমেরিক প্রোটিন TRF2-এর অভিব্যক্তি পরিবর্তন করে এমন যৌগগুলির জন্য স্ক্রীন করার জন্য একটি কোষ-ভিত্তিক অ্যাসের বিকাশের প্রতিবেদন করি। এফডিএ-অনুমোদিত অণুগুলির একটি ছোট লাইব্রেরি স্ক্রীনিং করে, আমরা এমন যৌগগুলি চিহ্নিত করেছি যা হয় TRF2 অভিব্যক্তি মাত্রা বাড়াতে বা হ্রাস করতে পারে। আমরা আবিষ্কার করেছি যে AD এবং AR TRF2 কে নিয়ন্ত্রিত করেছে এবং টিউমার কোষগুলির জন্য নির্দিষ্ট অ্যান্টি-টিউমারিজেনিক ক্রিয়াকলাপ প্রদর্শন করেছে যা TRF2-কে অতিরিক্ত এক্সপ্রেস করে। আরও প্রদর্শন করে তাদের TRF2-নির্দিষ্ট কার্যকলাপ, AR এবং AD চিকিত্সা TRF2 ওভার এক্সপ্রেশন দ্বারা প্রদত্ত ইমিউনোসপ্রেশন এবং নিও-এনজিওজেনেসিস উদ্ধার করে। আশ্চর্যজনকভাবে, AR বা AD চিকিত্সার পরে TRF2 ওভার-এক্সপ্রেসিং টিউমারগুলির জন্য বিশ্বব্যাপী ইমিউন ইনফিল্ট্রেশন বৃদ্ধি করা হয় তা থেকে বোঝা যায় যে TRF2 অতিরিক্ত-প্রকাশিত হলে সেই ওষুধগুলি ইমিউন প্রতিক্রিয়া বাড়াতে আরও শক্তিশালী। এই ওষুধগুলি NK কোষের কার্যকারিতা (CD107a এবং CD69 প্লাস NK কোষ) পুনরুদ্ধার করে TRF2 ওভার এক্সপ্রেশনের ইমিউনোসপ্রেসিভ প্রভাবকে বাধা দেয় এবং MDSC অনুপ্রবেশকে দৃঢ়ভাবে হ্রাস করে। এটি পরামর্শ দেয় যে এই ওষুধগুলি TRF2-নির্ভর নির্দিষ্ট প্রোগ্রামকে ভোঁতা করে যা ইমিউন এস্কেপ এবং ইমিউনোসপ্রেশনকে ট্রিগার করে এবং ডেঞ্জার অ্যাসোসিয়েটেড মলিকিউলস (DAMP) নিঃসরণকে বাড়িয়ে তুলতে পারে যা বিশেষ করে যখন TRF2 অতিরিক্ত এক্সপ্রেস হয় তখন ইমিউন প্রতিক্রিয়া বাড়ায়। লক্ষণীয়, আমরা লক্ষ্য করি যে AR এবং AD TRF2 ওভারএক্সপ্রেশনের ইমিউনোসপ্রেসিভ এবং প্রো-এনজিওজেনিক ফাংশনগুলি উদ্ধার করেছে, TRF2 ওভারএক্সপ্রেস-সায়নের দুটি বৈশিষ্ট্য যা আমরা পূর্বে DDR স্বাধীন হিসাবে দেখিয়েছি। এইভাবে, আমরা অনুমান করেছি যে টিউমার বৃদ্ধিতে এআর এবং এডি প্রভাবগুলি ডিডিআর-স্বাধীন, একটি প্রক্রিয়া যা আরও গবেষণায় সম্পূর্ণরূপে বর্ণনা করা বাকি রয়েছে। বর্তমান প্রুফ অফ কনসেপ্ট স্টাডি প্রমাণ দেয় যে TRF2 এক্সপ্রেশনের ফার্মাকোলজিকাল হ্রাস একটি মূল্যবান ক্যান্সার বিরোধী কৌশল হতে পারে

যদিও স্ক্রিনিং পদ্ধতিতে TRF2 প্রোটিনের মাত্রাকে ট্রান্সক্রিপ্ট মাত্রার থেকে স্বাধীনভাবে বিবেচনা করা হয়, উভয় ওষুধই অন্তঃসত্ত্বা TERF2 mRNA মাত্রা হ্রাস করে, যা বোঝায় যে AR এবং AD TRF2 নিয়ন্ত্রণের একাধিক স্তরকে লক্ষ্য করে। এটিকে সমর্থন করে, AR হল Wnt সংকেত [28] এর একটি প্রতিরোধক, যা TERF2 ট্রান্সক্রিপশনের একটি সক্রিয়কারী [29]। আরও সাধারণভাবে, Wnt সিগন্যালিং পথকে লক্ষ্য করে ওষুধগুলি স্ক্রীনিং পদক্ষেপের সময় সমৃদ্ধ হয়েছিল (চিত্র S1B-D)। কিভাবে AD, একটি মাইটোকন্ড্রিয়া-টার্গেটিং এজেন্ট, TRF2 অভিব্যক্তিকে প্রভাবিত করে তা নির্ধারণ করা বাকি আছে। যেহেতু উচ্চ TRF2 মাত্রা প্রদর্শন করে এমন ক্যান্সারগুলির একটি দুর্বল পূর্বাভাস থাকে এবং কেমোথেরাপির প্রতিরোধ ক্ষমতা বৃদ্ধি পায় [২১], এআর এবং এডি এই জাতীয় টিউমারগুলির জন্য আগ্রহের থেরাপিউটিক এজেন্ট। TRF2[13]-এর টেলোমেরিক এবং প্রো-অনকোজেনিক ক্রিয়াকলাপগুলিকে একত্রিত করার সম্ভাবনা ফার্মাকোলজিক্যালভাবে TRF2-কে কমিয়ে আনার সম্ভাবনা বাড়ায় এইভাবে ক্ষতিকারক প্রো-বার্ধক্যজনিত পার্শ্ব প্রতিক্রিয়া ছাড়াই বহু-হিট অ্যান্টি-ক্যান্সার সুবিধা প্রদান করে। অতএব, ক্লিনিকাল স্টাডিতে TRF2 এক্সপ্রেশন লেভেলে এই ওষুধের সিনারজিস্টিক প্রভাব নির্ধারণের জন্য ভবিষ্যতের অধ্যয়নগুলি নিশ্চিত করা হয়।

যদিও বিভিন্ন মানব ক্যান্সারে TRF2 আপ-নিয়ন্ত্রিত হয় [13,21], তবুও অনেক টিস্যুর স্বাভাবিক এবং প্যাথলজিকাল বার্ধক্য উভয় সময়েই এর অভিব্যক্তি হ্রাস পায়। বার্ধক্য এবং ক্যান্সারের মধ্যে সংযোগস্থল [31-35]। অতএব, এখানে বর্ণিত স্ক্রীনিং পদ্ধতির দ্বারা চিহ্নিত অণুগুলি আকর্ষণীয় ওষুধ প্রার্থী, উভয়ই এই গবেষণায় নিশ্চিত হওয়া TRF2 ডাউনরেগুলেশনের জন্য ক্যান্সার-বিরোধী এজেন্ট এবং TRF2 আপ-রেগুলেট করে সম্ভাব্য অ্যান্টি-এজিং এজেন্ট হিসাবে।

এই নিবন্ধটি ক্যান্সার 2021, 13, 2998 থেকে নেওয়া হয়েছে। https://doi.org/10.3390/cancers13122998 https://www.mdpi.com/journal/cancers