অটোসোমাল রিসেসিভ সিউডোহাইপোলডোস্টেরনিজম টাইপ II এর কারণ হিসাবে একটি উপন্যাস হোমোজাইগাস KLHL3 মিউটেশন জীবনের দেরিতে নির্ণয় করা হয়েছে
Nov 02, 2023
বিমূর্ত ভূমিকা:
Pseudohypoaldosteronism type II (PHA II) হল একটি মেন্ডেলিয়ান ডিসঅর্ডার, যা হাইপারক্যালেমিক অ্যাসিডোসিস এবং নিম্ন রক্তরস রেনিনের মাত্রা, সাধারণত উচ্চ রক্তচাপের সাথে যুক্ত। WNK1, WNK4, CUL3 এবং KLHL3-এর মিউটেশনগুলি PHA II ঘটায়, WNK1, WNK4, এবং CUL3-তে প্রভাবশালী মিউটেশন এবং KLHL3-তে প্রভাবশালী বা অব্যবহিত মিউটেশন। 3 মাস থেকে 56 বছর বয়সে রোগ নির্ণয়ের সাথে, সাধারণত কিডনির স্বাভাবিক কার্যকারিতা রয়েছে এমন ব্যক্তিদের মধ্যে ক্রমাগত KLHL3 মিউটেশন সহ চৌদ্দটি পরিবার রিপোর্ট করা হয়েছে।
পদ্ধতি: আমরা হাইপারক্যালেমিক হাইপারটেনশনে আক্রান্ত রোগীর ক্লিনিকাল এবং জেনেটিক তদন্ত করেছি এবং আণবিক গতিবিদ্যা সিমুলেশন, COS7 কোষে হেটেরোলজাস এক্সপ্রেশন এবং WNK4 প্রোটিন এক্সপ্রেশনে KLHL3 প্রার্থীর রোগ মিউটেশনের প্রভাব তদন্ত করতে ওয়েস্টার্ন ব্লটিং ব্যবহার করেছি।
কিডনির জন্য সিস্টানচের ভেষজ ফর্মুলেশন পেতে এখানে ক্লিক করুন
ফলাফল: রোগী, একটি সংঘবদ্ধ পরিবারের একজন 58- বছর বয়সী মহিলা, উচ্চ রক্তচাপ, তীব্র পেশী ব্যথা, নেফ্রোলিথিয়াসিস, দীর্ঘস্থায়ী কিডনি রোগ (CKD) এবং করোনারি হৃদরোগের সাথে যুক্ত ক্রমাগত হাইপারক্যালেমিক অ্যাসিডোসিস দেখিয়েছেন৷ হাইড্রোক্লোরোথিয়াজাইড দিয়ে থেরাপি হাইপারক্যালেমিয়া, উচ্চ রক্তচাপ এবং পেশী ব্যথা সংশোধন করে। জেনেটিক বিশ্লেষণ একটি উচ্চ সংরক্ষিত KLHL3 অবস্থানে একটি সমজাতীয় p.Arg431Trp মিউটেশন প্রকাশ করেছে। সিমুলেশনগুলি মিউট্যান্ট প্রোটিনের স্থিতিশীলতা হ্রাস করার পরামর্শ দিয়েছে, যা ওয়েস্টার্ন ব্লট দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল। বন্য-প্রকার KLHL3 এর সাথে তুলনা করে, p.Arg- 431Trp KLHL3 এর কোট্রান্সফেকশন WNK4 প্রোটিনের মাত্রা বৃদ্ধির দিকে পরিচালিত করে, যা থিয়াজাইড-সংবেদনশীল বাহক এবং PHA II এর মাধ্যমে NaCl পুনঃশোষণ বৃদ্ধির কারণ হিসাবে অনুমান করা হয়।
উপসংহার: এমনকি জীবনের দেরীতে এবং CKD-এর উপস্থিতিতে উপস্থিত রোগীদের ক্ষেত্রেও, PHA II সন্দেহ করা উচিত যদি রেনিনের মাত্রা কম থাকে এবং হাইপারক্যালেমিক অ্যাসিডোসিস এবং হাইপারটেনশন CKD পর্যায়ের জন্য অপর্যাপ্ত হয়, বিশেষ করে সন্দেহজনক পারিবারিক ইতিহাসের উপস্থিতিতে।
ভূমিকা
পদ্ধতিগত ধমনী উচ্চ রক্তচাপ বিশ্বব্যাপী 1.1 বিলিয়ন প্রাপ্তবয়স্কদের প্রভাবিত করে [1] এবং বিশ্বব্যাপী সর্বজনীন অসুস্থতা এবং মৃত্যুর জন্য সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণ পরিবর্তনযোগ্য ঝুঁকির কারণ হিসাবে বিবেচিত হয় [2]। আনুমানিক 90% প্রাপ্তবয়স্ক রোগীদের তথাকথিত প্রাথমিক বা অপরিহার্য উচ্চ রক্তচাপ রয়েছে মাল্টিফ্যাক্টোরিয়াল জিন-এনভায়রনমেন্ট ইটিওলজি [২], যেখানে উচ্চ রক্তচাপের একটি অন্তর্নিহিত কারণ বাকিতে চিহ্নিত করা যেতে পারে। সেকেন্ডারি হাইপারটেনশনের সাধারণ কারণগুলি হল প্রাথমিক অ্যালডোস্টেরনিজম, অবস্ট্রাকটিভ স্লিপ অ্যাপনিয়া, প্যারেনকাইমাল রেনাল ডিজিজ এবং রেনাল আর্টারি স্টেনোসিস [৩]। বিরল ক্ষেত্রে, উচ্চ রক্তচাপ একটি মনো-জেনিক বৈশিষ্ট্য হিসাবে উত্তরাধিকারসূত্রে প্রাপ্ত হয়। আক্রান্ত রোগীদের সাধারণত কম প্লাজমা রেনিনের মাত্রা থাকে, যেখানে অ্যালডোস্টেরন এবং ইলেক্ট্রোলাইটের মাত্রা অন্তর্নিহিত ইটিওলজির উপর নির্ভর করে পরিবর্তিত হয় [৪]। উচ্চ রক্তচাপের মেন্ডেলিয়ান ফর্মগুলি প্রায়শই শৈশব বা যৌবনে প্রকাশ পায়। প্রাপ্তবয়স্কদের খুব কমই মনো-জেনিক উচ্চ রক্তচাপের জন্য তদন্ত করা হয়; সুতরাং, সাধারণ জনগণের মধ্যে এর ব্যাপকতা অজানা রয়ে গেছে। একটি নির্বাচিত দলে (অন্তর্ভুক্তির মানদণ্ডের মধ্যে অন্তত একটি: সূচনাকালীন বয়স 35 বছরের কম বা সমান, প্রতিরোধী উচ্চ রক্তচাপ, ইলেক্ট্রোলাইট অস্বাভাবিকতা সহ উচ্চ রক্তচাপ, হরমোনের অস্বাভাবিকতা, অস্বাভাবিক ইমেজিং ফলাফল, বা পরামর্শমূলক ক্লিনিকাল লক্ষণ), 37 জন প্রার্থীর জিন পরীক্ষা করা হয়েছিল, এবং 1,179 টি ক্ষেত্রে (2.8%) [5] এর মধ্যে 33টিতে প্যাথোজেনিক বা সম্ভাব্য প্যাথোজেনিক রূপগুলি চিহ্নিত করা হয়েছিল।
এই গবেষণাটি সিউডোহাইপোয়ালডোস্টেরনিজম টাইপ II (PHA II), মেন্ডেলিয়ান হাইপারটেনশনের একটি ফর্ম যা হাইপারক্যালেমিক অ্যাসিডোসিস এবং নিম্ন প্লাজমা রেনিনের মাত্রা [6] এর উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করে। PHA II ফ্যামিলিয়াল হাইপারক্যালেমিক হাইপারটেনশন নামেও পরিচিত। এটি প্রথম 1964 সালে পেভার এবং পলিন দ্বারা বর্ণনা করা হয়েছিল একটি অল্প বয়স্ক পুরুষের মধ্যে গুরুতর উচ্চ রক্তচাপ এবং হাইপারক্যালেমিয়া সহ অন্যথায় স্বাভাবিক রেনাল ফাংশন থাকা সত্ত্বেও প্লাজমা রেনিন। গর্ডন এট আল-এর দ্বারা 1970 সালে একটি 10-বছর বয়সী মেয়ের ছোট উচ্চতা, উচ্চ রক্তচাপ, গুরুতর হাইপারক্যালেমিয়া, হালকা অ্যাসিডমিয়া, পর্যায়ক্রমিক পক্ষাঘাত এবং চাপা রেনিনের রিপোর্ট অনুসরণ করা হয়েছে। [১০], এই সিনড্রোমকে মাঝে মাঝে গর্ডনস সিনড্রোমও বলা হয়েছে।
2001 সালে, উইথ-নো-লাইসিন (ডব্লিউএনকে) সেরিন-থ্রোনাইন কিনেস জিন WNK1 এবং WNK4-এর মিউটেশনগুলিকে PHA II [১১] এর কারণ হিসেবে চিহ্নিত করা হয়েছিল, এবং KLHL3 (এনকোডিং কেলচ-এর মতো 3) এবং CUL3 (এনকোডিং) এর আরও মিউটেশন কুলিন 3) জিনগুলি 2012 [12, 13] এ বর্ণনা করা হয়েছিল। WNK1, WNK4, এবং CUL3-এ মিউটেশনের কারণে সৃষ্ট PHA II সাবফর্মগুলি হল অটোসোমাল-প্রধান ব্যাধি, যেখানে KLHL3 মিউটেশনগুলি একটি অটোসোমাল-প্রধান বা একটি অটোসোমাল-রিসেসিভ ফ্যাশনে উত্তরাধিকার সূত্রে প্রাপ্ত হতে পারে [12]। KLHL3 একটি এন-টার্মিনাল BTB ডোমেন বৈশিষ্ট্যযুক্ত, তারপরে একটি BACK ডোমেন এবং একটি সি-টার্মিনাল ছয়-ব্লাড-প্রপেলার গঠন যা তথাকথিত কেলচ-সদৃশ পুনরাবৃত্তি (চিত্র 1d,2a-এ দেখানো হয়েছে) নিয়ে গঠিত। প্রপেলার ব্লেডের মধ্যে বা তার মধ্যে প্রভাবশালী KLHL3 মিউটেশন ক্লাস্টার, যেখানে রিসেসিভ মিউটেশনগুলি প্রোটিন জুড়ে বিতরণ করা হয় [12]। আধিপত্যশীল মামলার তুলনায় রেসেসিভ কেস কম সাধারণ; মোট, 14 টি পরিবারের 21 জন রোগীকে রিসেসিভ KLHL3 মিউটেশন প্রকাশ করা হয়েছে [12-15] (সারণী 1)।
PHA II-তে হাইপারটেনশনের অন্তর্নিহিত প্যাথোফিজিওলজি কিডনির দূরবর্তী সংবেদনশীল টিউবুলে থিয়াজাইড-সংবেদনশীল বাহক (Na-Cl cotransporter, NCCT) এর মাধ্যমে NaCl পুনঃশোষণ বৃদ্ধি করে এবং থিয়াজাইডের সাথে থেরাপি PHA রোগীদের উচ্চ রক্তচাপ এবং ইলেক্ট্রোলাইট উভয়ই সংশোধন করে। [১৬]। সংক্ষেপে, WNK1 এবং WNK4 ফসফরিলেট OSR1 (অক্সিডেটিভ স্ট্রেস-প্রতিক্রিয়াশীল জিন 1) এবং SPAK (Ste20-সম্পর্কিত প্রোলিন-অ্যালানাইন-সমৃদ্ধ কাইনেজ), যা পরে NCCT কে ফসফরিলেট করে এবং সক্রিয় করে [17, 18]। KLHL3 হল ubiquitin ligase CUL3 এর একটি সাবস্ট্রেট অ্যাডাপ্টার; KLHL3-CUL3 জটিল ডাব্লুএনকে কাইনেসগুলিকে সর্বজনীন করে তোলে এবং এইভাবে তাদের অবক্ষয়কে প্রচার করে [১৯]। Ubiquitin ligase ফাংশন হারানো বা WNK kinases এর প্রতিবন্ধী আবদ্ধতা WNK প্রাচুর্য বৃদ্ধি, NCCT ফসফোরিলেশন বৃদ্ধি [18], এবং দূরবর্তী সংকোচিত টিউবুলে NaCl শোষণ বৃদ্ধি করে। নেফ্রনের পরবর্তী অংশগুলিতে, ENaC (এপিথেলিয়াল সোডিয়াম চ্যানেল) এর মাধ্যমে NaCl পুনঃশোষণ এবং ROMK (রেনাল আউটার মেডুলারি পটাসিয়াম চ্যানেল) এর মাধ্যমে K+ নিঃসরণ হ্রাস পায় [20, 21]। KLHL3 নকআউট ইঁদুরগুলি দূরবর্তী সংকোচিত টিউবুলের হাইপোপ্লাসিয়া দেখায়, WNK1 এবং WNK4 এর মাত্রা দৃঢ়ভাবে বৃদ্ধি পায় এবং কিডনিতে OSR1, SPAK এবং NCC ফসফোরিলেশন বৃদ্ধি করে। আরও, তারা হাইপারক্যালেমিয়া, হাইপারক্লোরেমিয়া এবং মেটাবলিক অ্যাসিডোসিস [22] প্রদর্শন করে। এখানে, আমরা অটোসোমাল-রিসেসিভ পিএইচএ II সহ একজন রোগীর রিপোর্ট করি এবং অন্তর্নিহিত জেনেটিক মিউটেশন এবং প্যাথোফিজিওলজির বৈশিষ্ট্য বর্ণনা করি।
উপকরণ এবং পদ্ধতিসমূহ
ডিএনএ প্রস্তুতি এবং স্যাঞ্জার সিকোয়েন্সিং ডিএনএ প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে QIAamp DNA ব্লাড ম্যাক্সি কিট (কিয়াজেন) ব্যবহার করে একটি পেরিফেরাল ভেনাস রক্তের নমুনা থেকে প্রস্তুত করা হয়েছিল। KLHL3 [13], WNK1, এবং WNK4 [11], এবং CUL3_9F (5′-AGGAGACACTTTCTCTCAAACCG-3′) এর জন্য প্রকাশিত প্রাইমার ব্যবহার করে জিনোমিক ডিএনএর স্ট্যান্ডার্ড পিসিআর এবং সরাসরি দ্বিমুখী সেঞ্জার সিকোয়েন্সিং করা হয়েছিল। এবং CUL3 এর জন্য CUL3_9R (5′-TGTTCTTCTCCAAAACAATCTACC-3′) প্রাইমার। ইউরোফিন্স জিনোমিক্সে স্যাঙ্গার সিকোয়েন্সিং করা হয়েছিল।
ক্রম প্রান্তিককরণ
NCBI প্রোটিন ব্লাস্ট (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) এবং eggNOG ডাটাবেস (http://eggnogdb.embl.de) ব্যবহার করে হোমোলগাস প্রোটিন সিকোয়েন্সগুলি চিহ্নিত করা হয়েছিল। দেখানো সিকোয়েন্সের মধ্যে রয়েছে মানব KLHL3 এবং এর অর্থলগ: হোমো সেপিয়েন্স (NP_059111.2), Mus musculus (NP_001349344.2), গ্যালাস গ্যালাস (XP_015149442.1), ড্যানিও রিরিও (XP_021328460.1), সিওনা ইনটেস্টিনালিস (XP_009862126.1), ড্রোসোফিলা মেলানোগাস্টার (NP_724095.1), এবং ক্যানোরহাবডিটিস এলিগানস (NP_001254310.1) . মানব প্যারালগগুলি সাহিত্য গবেষণা দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছে এবং এতে KLHL1 থেকে KLHL42 অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছে যেমন অনলাইন সম্পূরক সারণী 1-এ দেখানো হয়েছে (সমস্ত অনলাইন সরবরাহকারী উপাদানের জন্য, দেখুন www.karger.com/doi/10.1159/000521626) [২৩]। জালভিউ সংস্করণ 2.10.5 ব্যবহার করে সিকোয়েন্সগুলি সারিবদ্ধ করা হয়েছিল [24]। ডোমেন কাঠামোটি ইউনিপ্রট (Q9UH77, 13 এপ্রিল, 2021-এ অ্যাক্সেস করা হয়েছিল) থেকে ছিল এবং DOG [25] ব্যবহার করে ভিজ্যুয়ালাইজ করা হয়েছিল।
প্লাজমিড এবং সাইট-নির্দেশিত মিউটাজেনেসিস
pTRE2hyg WNK4 এবং pFN21A KLHL3 প্লাজমিড ছিল ডাঃ শিনিচি উচিদা (টোকিও মেডিকেল অ্যান্ড ডেন্টাল ইউনিভার্সিটি) এর সদয় উপহার। p.R431W মিউটেশন প্রবর্তনের জন্য, প্রাইমারগুলি প্রাইমার এক্স (https://www.bioinformatics.org/primerx): 5′- GATGAACACGCGGTGGAGCAGTGTGG -3′ (KLHL3_ R431W{{10}) ব্যবহার করে ডিজাইন করা হয়েছিল }F) এবং 5′- CCACACTGCTCCACCGCGTGTTCATC -3′ (KLHL3_R431W_1R)। মিউট্যান্টের অবশিষ্টাংশগুলি গাঢ়ভাবে দেখানো হয়েছে। নির্মাতার নির্দেশ অনুসারে সাইট-নির্দেশিত মিউটাজেনেসিস একটি PfuUltra হাই-ফিডেলিটি ডিএনএ পলিমারেজ (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) সহ কুইকচেঞ্জ সাইট-নির্দেশিত মুটাজেনেসিস কিট ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল। সিডিএনএ ইউরোফিন্স জিনোমিক্সে স্যাঞ্জার-সিকোয়েন্সড ছিল। প্লাজমিডগুলি QIAGEN প্লাজমিড প্লাস ম্যাক্সি কিট ব্যবহার করে প্রস্তুত করা হয়েছিল।
টিস্যু কালচার, ক্ষণস্থায়ী ট্রান্সফেকশন এবং ওয়েস্টার্ন ব্লট
COS7 কোষগুলি DMEM + L-glutamine, 10% FBS, এবং 1% পেনিসিলিন/স্ট্রেপ্টোমাইসিন (সমস্ত Gibco, Thermo Fisher) এ সংষ্কৃত হয়েছিল। স্থানান্তরের জন্য, কোষগুলিকে 6-কূপ প্লেটে 1.9 × 105 কোষ/কূপ ঘনত্বে বীজ করা হয়েছিল এবং প্রায় 90% ঘনত্বে বেড়েছে৷ কোষগুলি 1 µg pTRE2hyg WNK4 এবং 2 µg pFN21A (খালি ভেক্টর বা KLHL3 ওয়াইল্ড টাইপ [WT]) বা KLHL3 R431W cDNA ব্যবহার করে Lipofectamine 2000 (উৎপাদনকারীর বৈজ্ঞানিক নির্দেশাবলী অনুসারে থার্মো ফিশার) দ্বারা স্থানান্তরিত হয়েছিল। দুটি স্বাধীন ক্লোন প্রতিটি স্থানান্তরের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল। ট্রান্সফেকশনের আটচল্লিশ ঘন্টা পরে, কোষগুলিকে ঠান্ডা পিবিএসে ধুয়ে 10 মিমি ট্রিস-এইচসিএল (পিএইচ 7.5), 150 মিমি NaCl, 1 মিমি ইডিটিএ এবং 1% এনপি40 সম্পূর্ণ প্রোটিজ ইনহিবিটর ককটেল (রোচে, মার্ক) এ লাইজ করা হয়েছিল। লাইসেটকে 20,000 g 4 ডিগ্রিতে 30 মিনিটের জন্য সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল, এবং সুপারনাট্যান্টকে −20 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়েছিল। প্রোটিনের ঘনত্ব প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে বিসিএ অ্যাস (পিয়ার্স, থার্মো ফিশার) দ্বারা ডুপ্লিকেট (মান) বা ট্রিপ্লিকেট (নমুনা) নির্ধারণ করা হয়েছিল। প্রায় 20 µg মোট প্রোটিন SDSPAGE দ্বারা ভগ্নাংশ করা হয়েছিল এবং একটি PVDF ঝিল্লিতে স্থানান্তরিত হয়েছিল (1.5 h, 100 V)। TBST-তে 2% শুকনো দুধে ঝিল্লি ব্লক করা হয়েছিল। পলিক্লোনাল খরগোশ অ্যান্টি-হ্যালোট্যাগ (প্রোমেগা #G9281, 1:500, 4 ডিগ্রী রাতারাতি) ব্যবহার করে ওয়েস্টার্ন ব্লট সঞ্চালিত হয়েছিল, তারপরে গাধা আইজিজি অ্যান্টি-র্যাবিট আইজিজি (এইচ + এল)-এইচআরপিও (জ্যাকসন ইমিউনোরিসার্চ # {{46) দিয়ে ধোয়া ও ইনকিউবেশন করা হয়েছিল }}, dianova, 1:20,000, ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টা), ধোয়া, এবং উন্নত কেমিলুমিনসেন্ট সনাক্তকরণ (আমেরশাম ইসিএল প্রাইম ওয়েস্টার্ন ব্লটিং ডিটেকশন রিএজেন্ট, জিই হেলথকেয়ার)। রটিফ্রি স্ট্রিপিং বাফার 2.0 (কার্ল রথ) ব্যবহার করে ব্লটগুলি ছিনতাই করা হয়েছিল, টিবিএসটি-তে 2% শুকনো দুধে রাতারাতি 4 ডিগ্রিতে ব্লক করা হয়েছিল, এবং মনোক্লোনাল মাউস অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ M2 (সিগমাঅলড্রিচ #F1804, মার্ক, 1:1,{{69} }, ঘরের তাপমাত্রায় 1.5 ঘন্টা), তারপরে গাধা IgG অ্যান্টি-মাউস IgG (H + L)-HRPO (জ্যাকসন ইমিউনোরিসার্চ # 715-035-151, ডায়ানোভা, 1:20,000, 1 ঘণ্টা ঘরে তাপমাত্রা), ইসিএল সনাক্তকরণ, স্ট্রিপিং, এবং উপরের মত ব্লক করা। তারপরে ব্লটগুলিকে মনোক্লোনাল মাউস অ্যান্টি- -অ্যাক্টিন (সিগমা-অলড্রিচ # A2228, মার্ক, 1:5,000, ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টা) এবং গাধা আইজিজি অ্যান্টি-মাউস আইজিজি দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল, আবার ইসিএল সনাক্তকরণের পরে। একটি ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad) এ ইমেজ ল্যাব সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে ব্যান্ডগুলি পরিমাপ করা হয়েছিল। অ্যান্টি-হ্যালোট্যাগ অ্যান্টিবডি এবং অ্যান্টি-ফ্ল্যাগ M2 অ্যান্টিবডি দ্বারা শনাক্ত করা ব্যান্ডগুলির তীব্রতা যথাক্রমে অ্যান্টি- - অ্যাক্টিন অ্যান্টিবডি দ্বারা শনাক্ত করা ব্যান্ডগুলির অনুরূপ তীব্রতা দ্বারা ভাগ করা হয়েছিল। KLHL3-এর অভিব্যক্তির মাত্রা নির্ণয় করার জন্য, উপরের মতো কোষগুলিকে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল তবে 0 µg, 0.5 µg, 1 µg, 2 µg, 4 µg, এবং pFN21A KLHL3 WT বা R431W এর 8 µg ব্যবহার করে। জেল ইলেক্ট্রোফোরেসিস এবং ব্লটিং উপরের মতো সঞ্চালিত হয়েছিল। সাইক্লোহেক্সিমাইড চেজ অ্যাস-এর জন্য, কোষগুলিকে উপরের হিসাবে বীজ করা হয়েছিল এবং 2 µg pFN21A KLHL3 WT বা 4 µg KLHL3 R431W দিয়ে স্থানান্তরিত করা হয়েছিল। ট্রান্সফেকশনের আটচল্লিশ ঘন্টা পরে, 100 µM সাইক্লোহেক্সিমাইড যোগ করা হয়েছিল, এবং কোষগুলি নির্দেশিত সময় পয়েন্টের পরে লাইজ করা হয়েছিল। আরও বিশ্লেষণের ধাপগুলি উপরে ছিল।
চিত্র 2. WT এবং p.Arg431Trp (R431W) KLHL3 কেলচ ডোমেনের MD সিমুলেশন। কেলচ ডোমেনের একটি টপ-ডাউন ভিউ (PDBID: 4CH9), -প্রপেলার ব্লেড দ্বারা রঙিন (K1–K6)। মিউটেশন সাইটটি একটি হলুদ তারা দ্বারা নির্দেশিত, এবং আগ্রহের অঞ্চলটি ধূসর রঙের (অবশিষ্ট 425-465), এবং WNK4 পেপটাইড (সিমুলেশনগুলিতে অন্তর্ভুক্ত নয়) স্বচ্ছ এবং ধূসর রঙের। b প্রোটিন ব্যাকবোনে ম্যাপ করা কেলচ ডোমেনের MSF-এর মধ্যে পার্থক্য। মিউটেশন সাইট একটি হলুদ তারকা দ্বারা নির্দেশিত হয়। লাল রঙ প্রোটিনের আরও গতিশীল (কম স্থিতিশীল) অংশ নির্দেশ করে। c সম্পূর্ণ প্রোটিনের RMSD (শীর্ষ), অবশিষ্টাংশ 425–465 (মাঝখানে), এবং তিনটি স্বাধীন সিমুলেশন প্রতিলিপি (বোল্ড লাইন, চলমান গড়) জন্য স্ফটিক কাঠামো থেকে বাইন্ডিং পকেট (নীচে)। d hbonds এর বেহালা প্লট (বাম) এবং COM দূরত্ব (মাঝখানে) K3 (অবশিষ্ট 425–441) এবং K4 (442–465)-প্রপেলার ব্লেড এবং বাইন্ডিং-পকেট ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক্স (ডান) এর মধ্যে। e পরীক্ষামূলক/প্রাথমিক মডেল (কালো) সহ প্রতিটি প্রতিরূপের (WT, নীল; R431W, ধূসর) চূড়ান্ত ফ্রেম (1.1 μs) থেকে K3–K4 ইন্টারফেসের কাঠামোগত ওভারলে। প্রোটিন ব্যাকবোন একটি কার্টুন হিসাবে প্রদর্শিত হয়, অবশিষ্টাংশ 431 লাঠি হিসাবে প্রদর্শিত হয়। MSF, মানে বর্গক্ষেত্র ওঠানামা।
আণবিক গতিবিদ্যা সিমুলেশন
WT মডেলটি WNK4 পেপটাইড খণ্ডের সাথে জটিলতায় মানব কেলচ ডোমেনের এক্স-রে স্ফটিক কাঠামোর (PDBID: 4CH9) উপর ভিত্তি করে তৈরি হয়েছিল [26]। অনুপস্থিত পরমাণু এবং টার্মিনাল ক্যাপগুলি ভিজ্যুয়াল আণবিক গতিবিদ্যা সংস্করণ 1.9.3 [27] এ psfgen ইউটিলিটি ব্যবহার করে যুক্ত করা হয়েছিল। মিউট্যান্ট (R431W) KLHL3 মডেলটি Modeller সংস্করণ 9.18 ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল [28]। প্রতিটি সিস্টেমের জন্য চূড়ান্ত অবশিষ্টাংশের পরিসীমা ছিল 300–585৷ WT এবং R431W মডেলের N- এবং C-টার্মিনি যথাক্রমে এসিটিলেশন এবং এন-মিথাইল্যামিডেশন দ্বারা নিরপেক্ষ করা হয়েছিল। ডিফল্ট প্রোটোনেশন স্টেটগুলি PROPKA সংস্করণ 3.0 [29] এর সাথে বিশ্লেষণ অনুসারে প্রতিটি টাইট্রাটেবল অবশিষ্টাংশে বরাদ্দ করা হয়েছিল। প্রাথমিক ভারসাম্য সিমুলেশনের পরে KLHL3 থেকে বিচ্ছিন্ন হওয়ার কারণে WNK4 পেপটাইড উত্পাদন সিমুলেশন থেকে সরানো হয়েছিল।
সমস্ত সিমুলেশনগুলি GROMACS সফ্টওয়্যার প্যাকেজ সংস্করণ 2021 [30] ব্যবহার করে পরিচালিত হয়েছিল৷ CHARMM36m ফোর্স-ফিল্ড প্যারামিটারগুলি প্রোটিন পরমাণুর জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল [31]। ডিফল্ট CHARMM প্যারামিটার ব্যবহার করে আয়নগুলি বর্ণনা করা হয়েছিল এবং TIP3P মডেলটি জলের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল [32]। প্রাথমিক ভারসাম্যের ধাপের জন্য 1 fs-এর একটি ইন্টিগ্রেশন টাইম ধাপ ব্যবহার করা হয়েছিল, 2 fs পরবর্তী সমস্ত সিমুলেশনের জন্য ব্যবহার করা হচ্ছে। হাইড্রোজেন জড়িত সমস্ত বন্ধন LINCS [33] ব্যবহার করে সীমাবদ্ধ ছিল। ননবন্ডেড ভ্যান ডার ওয়ালস মিথস্ক্রিয়াগুলি লেনার্ড-জোনস সম্ভাব্যতা ব্যবহার করে 1.2 এনএম এর কাটঅফ ব্যাসার্ধের সাথে গণনা করা হয়েছিল; 1.2-1.0 এনএম পরিসরে বাহিনীগুলি মসৃণভাবে বন্ধ করা হয়েছিল। সমস্ত ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক্স মসৃণ কণা-জাল Ewald [34] পদ্ধতি ব্যবহার করে 1.2 nm এর একটি বাস্তব-স্পেস কাটঅফ দূরত্ব ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল। আইসোকোরিক-আইসোথার্মাল এনসেম্বলে (NVT) প্রাথমিক সিমুলেশন অনুসরণ করে, পরবর্তী সমস্ত সিমুলেশনগুলি 0.5 ps এর সময় ধ্রুবক সহ বেলসিটিরেস্কেলিং থার্মোস্ট্যাট [35] ব্যবহার করে 310.15 K তাপমাত্রায় আইসোবারিক-আইসোথার্মাল এনসেম্বল (NPT) এ সঞ্চালিত হয়েছিল। থার্মোস্ট্যাট প্রোটিন এবং দ্রাবক (অর্থাৎ, জল এবং আয়ন) আলাদাভাবে প্রয়োগ করা হয়েছিল; সেন্টার-অফ-ম্যাস (COM) গতি অপসারণের জন্য একই গ্রুপগুলি ব্যবহার করা হয়েছিল। একটি বারেন্ডসেন [৩৬] বা প্যারিনেলো-রহমান [৩৭] ব্যারোস্ট্যাট ব্যবহার করে একটি আইসোট্রপিক পদ্ধতিতে 5 পিএস সময় ধ্রুবক সহ 1 বারের চাপ চাপানো হয়েছিল।
WT এবং R431W মডেলগুলি 1.2 × 1.2 × 1.2 nm3 এর প্রাথমিক মাত্রা সহ একটি ঘনবক্সে সমাধান করা হয়েছিল। প্রতিটি সিস্টেমকে 150 mM NaCl দিয়ে নিরপেক্ষ করা হয়েছিল৷ একটি প্রাথমিক খাড়া-ডিসেন্ট এনার্জি মিনিমাইজেশনের পরে, প্রতিটি সিস্টেমকে সমস্ত প্রোটিন পরমাণুর অবস্থানের সংযমের সাথে 5 এনএসের জন্য এনভিটি এনসেম্বলে সামঞ্জস্য করা হয়েছিল। পূর্ববর্তী ধাপের মতো একই সংযম সহ 5 এনএসের জন্য এনপিটি এনসেম্বলে একটি পরবর্তী ভারসাম্যমূলক পদক্ষেপ সম্পাদিত হয়েছিল। চূড়ান্ত 5- এন ভারসাম্য সিমুলেশনের জন্য সমস্ত পার্শ্ব চেইন থেকে অবস্থানের সীমাবদ্ধতাগুলি সরানো হয়েছে৷ WT এবং R431W সিস্টেমের স্বাধীন উৎপাদন সিমুলেশনের জন্য ভারসাম্যের চূড়ান্ত পর্যায় থেকে তিনটি প্রাথমিক কাঠামো তৈরি করা হয়েছিল এবং সমস্ত অবস্থানের সীমাবদ্ধতাগুলি সরিয়ে দেওয়া হয়েছিল। প্রতিটি উত্পাদন প্রতিলিপি 1.1 µs এর জন্য সিমুলেট করা হয়েছিল; প্রথম 0.1 µs বিশ্লেষণ থেকে সরানো হয়েছিল।
সিমুলেশন চলাকালীন কাঠামোগত স্থিতিশীলতা মূল্যায়ন করতে, স্ফটিক কাঠামো থেকে রুট গড় বর্গক্ষেত্র বিচ্যুতি (RMSDs) সমগ্র প্রোটিনের C পরমাণুর জন্য, সেইসাথে K3–K4 ইন্টারফেস (অবশিষ্ট 425–465) এবং WNK4- বাইন্ডিং পকেট (অবশিষ্ট 339, 355, 360, 386, 402, 407, 432, 449, 451, 481, 498, 528, এবং 577)। RMSD ট্রেসগুলির চলমান গড়গুলি গণনা করা হয়েছিল এবং কাঁচা ডেটা দিয়ে ওভারলেড করা হয়েছিল।
কাঠামোগত স্থিতিশীলতার উপর মিউটেশনের প্রভাব প্রোটিন সি পরমাণুর গড় বর্গক্ষেত্র ওঠানামার পার্থক্য গণনা করে, ফ্রেম এবং প্রতিলিপিগুলির উপর গড় এবং WT প্রোটিন কাঠামোতে ম্যাপিং করে কল্পনা করা হয়েছিল। সমস্ত প্রোটিন ভিজ্যুয়ালাইজেশন ChimeraX [38] ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল। K3 (অবশিষ্ট 425-441) থেকে K4 (অবশিষ্ট 442-465) ইন্টারফেসে R431W মিউটেশনের প্রভাব হাইড্রোজেন বন্ড (H-বন্ড) বিশ্লেষণ এবং দুটি গ্রুপের মধ্যে COM দূরত্ব দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল। এইচ-বন্ডগুলি যথাক্রমে 3.5 Å এবং 30 ডিগ্রির দূরত্ব এবং কোণ কাটঅফ সহ GROMACS টুল gmx hbond ব্যবহার করে প্রতিটি ফ্রেমে মূল্যায়ন করা হয়েছিল। প্রতিটি ফ্রেমে COM দূরত্ব একইভাবে মূল্যায়ন করা হয়েছিল - উভয় Hbonds এবং COM দূরত্বের বিতরণকে বেহালা প্লট হিসাবে কল্পনা করা হয়েছিল। ট্র্যাজেক্টোরি এবং প্রতিলিপিগুলির মাধ্যমে গড় গণনা করা হয়েছিল।
WNK4-বাইন্ডিং পকেটের ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক্স গণনা করা হয়েছিল g_elpot [39] ব্যবহার করে। বাইন্ডিং পকেটে ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক সম্ভাবনার সময়কাল 8 Å ব্যাসার্ধের সাথে একটি গোলাকার ভলিউম সংজ্ঞায়িত করে মূল্যায়ন করা হয়েছিল, যা বাঁধাই পকেট নিয়ে গঠিত অবশিষ্টাংশের জ্যামিতিক কেন্দ্রে কেন্দ্রীভূত ছিল। ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক্সের বৈচিত্র্যের মূল্যায়ন করার জন্য, 50-এনএস ব্লক গড় গণনা করা হয়েছিল। WT এবং R431W মিউট্যান্টের বাইন্ডিং পকেটের মধ্যে ইলেক্ট্রোস্ট্যাটিক সম্ভাবনার বন্টনটি বেহালা প্লট হিসাবে কল্পনা করা হয়েছিল, যার গড় 50-এনএস ব্লক এবং ট্র্যাজেক্টোরির উপর গণনা করা হয়েছিল।
সাপোর্টিভ সার্ভিস অফ ওয়েসিস্তানচে- চীনের বৃহত্তম সিস্টানচে রপ্তানিকারক:
ইমেল:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/টেল:+86 15292862950
আরও স্পেসিফিকেশন বিশদ বিবরণের জন্য কেনাকাটা করুন:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
