একটি উপন্যাস, অ্যাটাক্সিয়া তেলাঙ্গিয়েক্টাসিয়ার অ্যাটাক্সিক মাউস মডেল যা একটি ক্লিনিক্যালি প্রাসঙ্গিক ননসেন্স মিউটেশন দ্বারা সৃষ্ট (পর্ব 2)

আরও তথ্য জানতে plz যোগাযোগ করুনdavid.wan@wecistanche.com

৩।{1}} আলোচনা

DDR পাথওয়েতে একটি সেকেন্ডারি হিট যোগ করার মাধ্যমে জিনোটক্সিক স্ট্রেস বৃদ্ধি করে, আমরা একটি অভিনব মাউস মডেল তৈরি করেছি যা আজ পর্যন্ত যেকোন মডেলের AT উপসর্গের সবচেয়ে ব্যাপক সেট প্রদর্শন করে। এর মধ্যে রয়েছে সেরিবেলার অ্যাট্রোফির সাথে যুক্ত গুরুতর এবং প্রগতিশীল অ্যাটাক্সিয়া এবং পিএন বৈশিষ্ট্যের বিপর্যয় এবং ক্যান্সারের উচ্চ ঘটনা এবং ইমিউন কোষের বিকাশে ত্রুটি। একসাথে, এই সহজাত রোগগুলি অকাল মৃত্যুর তিনটি প্রধান কারণকে অন্তর্ভুক্ত করেAT—প্রতিটি অবদানমৃত্যুর প্রায় এক তৃতীয়াংশ পর্যন্ত। এর মধ্যে, অ্যাটাক্সিয়ার অক্ষম প্রভাব সবচেয়ে অনুপ্রবেশকারী এবং রোগী এবং যত্নশীলদের দ্বারা তাদের জীবনযাত্রার মানের উপর সর্বাধিক প্রভাব ফেলে বলে রিপোর্ট করা হয়। এই কারণে, এই নতুন মাউস মডেলটিতে অ্যাটাক্সিয়া এবং সেরিবেলার অ্যাট্রোফির উপস্থিতি অত্যন্ত তাৎপর্যপূর্ণ, কারণ এটি প্রথমবারের মতো স্নায়বিক কর্মহীনতার প্রক্রিয়াগুলিকে ব্যাখ্যা করার জন্য একটি সংস্থান সরবরাহ করে না, তবে ভিভো মডেলে এটি একটি সমালোচনামূলকভাবে প্রয়োজনীয়। AT থেরাপিউটিকস পরীক্ষা করার জন্য গুরুতরভাবে প্রয়োজন, যেমন আমরা এখানে বর্ণনা করছি রিড-থ্রু যৌগ। আমরা Atm3535 এ অ্যাটাক্সিয়ার সামগ্রিক অগ্রগতির মধ্যে বেশ কিছু মিল খুঁজে পেয়েছি; Aptx ইঁদুর এবংএটি রোগীদের. ক্লিনিকাল AT-তে, মোটর ঘাটতি মোটামুটিভাবে 2 বছর বয়সে পরিলক্ষিত হয়, যখন বাবা-মা এবং ডাক্তাররা শিশু থেকে একটি মসৃণ, প্রতিবিম্বিতভাবে সমন্বিত গেটে রূপান্তর করার ক্ষমতা হ্রাস পায়- দুর্ভাগ্যবশত, রোগের কারণে প্রাথমিক পর্যায়ে মোটর ত্রুটি সম্পর্কে খুব কমই জানা যায়। কম প্রাদুর্ভাব এবং প্রাথমিক ডায়গনিস্টিক পরীক্ষার বর্তমান অভাব (Rothblum-Oviatt et al. 2016)। রোগীরা সাধারণত সাহায্য ছাড়াই হাঁটতে শেখে এবং স্নায়বিক লক্ষণগুলি জীবনের প্রথম 4 থেকে 5 বছর পর্যন্ত স্থিতিশীল থাকে (Rothblum-Oviatt et al. 2016)। আমরা Atm735×R3x এ মোটর ঘাটতির অনুরূপ প্রাথমিক অগ্রগতি পেয়েছি; Aptx^' ইঁদুর, P8 এ প্রাথমিক হালকা মোটর ঘাটতি সনাক্ত করে (রাইটিং রিফ্লেক্স ডেফিসিট) এর পরে আপেক্ষিক স্থিতিশীলতার সময়কাল, p210 এর পরে বিকাশশীল প্রগতিশীল এবং গুরুতর অ্যাটাক্সিয়া শুরু হওয়ার আগে যার মধ্যে চলাফেরা, চমকানো প্রতিবর্ত, কম্পন এবং লোকোমোটরের পরিবর্তন অন্তর্ভুক্ত ছিল কার্যকলাপ এটিএম এবং/অথবা এপিটিএক্স-এর নিউরোডেভেলপমেন্টাল ভূমিকা আছে কিনা সহ এই ফলাফলগুলি থেকে বেশ কয়েকটি গুরুত্বপূর্ণ প্রশ্ন উঠে আসে

সেরিবেলাম ডিসঅর্ডারের প্রাথমিক পর্যায়ে ফোকাস করা ভবিষ্যত অধ্যয়নগুলি বোঝার জন্য গুরুত্বপূর্ণ হবে যদি সেরিবেলামটি কর্মহীনতার আগে স্বাভাবিকভাবে বিকশিত হয় বা বিকাশগত ত্রুটিগুলি প্রাথমিক কারণ কিনা। আমরাও AT রোগীদের মতো দেখতে পেয়েছি যে দেরীতে বিকাশকারী অ্যাটাক্সিয়ার তীব্রতা পরিবর্তনশীল ছিল, কিছু ইঁদুর একটি আনাড়ি, উচ্চ-পদক্ষেপের পিছনের গেট (ভিডিও 3) এবং অন্যরা পিছনের ট্রাঙ্কের বিকৃতির মাধ্যমে প্রায় সম্পূর্ণভাবে নড়াচড়া করছে ( Fig.1E এবং ভিডিও 4)(Rothblum-Oviatt et al.2016; Levy and Lang 2018; Boder and Sedgwick 1958)। সামগ্রিকভাবে, আমরা পেয়েছি যে Atm?35×xR35×; Aptx' ইঁদুরের মোটর সমন্বয়ে একটি দৃশ্যত গভীর এবং পরিমাপযোগ্য প্রগতিশীল ক্ষতি হয়েছে যা AT রোগীদের মধ্যে দেখা যায়, যা Atm বা Aptx-এর অন্তত একটি কপি প্রকাশের মাধ্যমে উদ্ধার করা হয়েছিল। মস্তিষ্ক জুড়ে তুলনামূলকভাবে নির্বাচনী নিউরোপ্যাথলজি এবং অ্যাটাক্সিয়ার বিভিন্ন প্রকারে এর কার্যকারণ ভূমিকার কারণে AT-তে মোটর সমন্বয়ের ক্ষতিকে সেরিবেলার অবক্ষয়ের জন্য দায়ী করা হয়েছে (Hoche et al.2012)। সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণAT রোগীনিউরোইমেজিং স্টাডিজ (ওয়ালিস এট আল.2007; সাহামা এট আল. 2015; সাহামা এট আল। 2014; দিনেন এট আল। 2020; তাভানি এট আল। 2003; কোয়ারেন্টেলি এট আল। 2013), আমরা সেই সেরিবেলার সাইজটি Atm735 × R× তে দেখতে পাই ; Aptx' ইঁদুরগুলি প্রাথমিকভাবে স্বাভাবিক, কিন্তু স্নায়বিক ফাংশনের পরিবর্তনের সাথে ক্রমান্বয়ে অ্যাট্রোফি করে। যদিও সেরিবেলার টিস্যুর ক্ষতি মানুষের মধ্যে অ্যাটাক্সিয়ার প্রধান কারণ হিসাবে বিবেচিত হয়েছে, এটি ক্লিনিকাল ডেটা থেকে স্পষ্ট নয় যদি অ্যাটাক্সিয়ার তীব্রতা পোস্টমর্টেম পাওয়া সেরিবেলার ডিজেনারেশনের পরিমাণের একটি ভাল পূর্বাভাস (অ্যাগুইলার এট আল। 1968b: Crawford et al, 2006) : Dineen et al.2020)। Atm?35×R35×; Aptx^ ইঁদুর, আমরা পুরকিঞ্জে নিউরন ডেনড্রাইট স্তরের পাতলা হওয়ার সাথে সম্পর্কিত স্পষ্ট অ্যাট্রোফি খুঁজে পেয়েছি যা দেরীতে, গুরুতর আচরণগত ঘাটতির আগে। Atm?35xR35× এ আমাদের হিস্টোলজিক্যাল পর্যবেক্ষণ; Aptx'mice পরামর্শ দেয় যে সেরিবেলার কোষের গভীর ক্ষতির পরিবর্তে সেরিবেলার ফাংশনের পরিবর্তনগুলি অ্যাটাক্সিক ফেনোটাইপের জন্য যথেষ্ট, বেশ কয়েকটি SCA-তে উল্লেখযোগ্য PN ক্ষতির আগে আচরণগত ত্রুটিগুলির পর্যবেক্ষণের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ (Shakkottai et al. 2011: Lorenzetti et al. 2000; Clark et al. 1997; Jayabal et al.2016)। এটিএম এবং এপিটিএক্স-এর ঘাটতি ইঁদুরে অ্যাটাক্সিয়া তৈরি করার জন্য কেন প্রয়োজন যখন উভয়ের ক্ষতি মানুষের মধ্যে অ্যাটাক্সিয়া সৃষ্টির জন্য যথেষ্ট তা এখনও অস্পষ্ট। একটি সম্ভাবনা হল যে ইঁদুরের মস্তিষ্ক আরও নমনীয়ভাবে ক্ষতিপূরণমূলক পথ বা অপ্রয়োজনীয় প্রোটিন ব্যবহার করতে পারে 10-20কে ডিএনএ ক্ষতগুলির প্রতিক্রিয়া করার সময় যা কোষগুলিকে প্রতিদিন প্রভাবিত করে (লিন্ডাহল এবং বার্নস 2000)। সম্ভাব্যভাবে এই চ্যালেঞ্জ মোকাবেলা করার জন্য ডিএনএ মেরামতের বিভিন্ন রূপ বিদ্যমান, যার মধ্যে রয়েছে বেস এক্সিশন মেরামত (বিইআর), নিউক্লিওটাইড এক্সিশন মেরামত (এনইআর),

Cistanche সম্পর্কে আরও জানতে এখানে ক্লিক করুন

সেইসাথে সমজাতীয় এবং নন-হোমোলোগাস শেষ যোগদান (HEJ এবং NHEJ, যথাক্রমে), যেগুলির সবকটি ATM এবং APTX এর সাথে জড়িত (Chou et al.2015; Caglayan et al.2017; Wakasugi et al. 2014; Tumbale et al. 2018; Chatterjee and Walker 2017) বিকল্পভাবে, এটি হতে পারে যে ক্ষেত্রে শুধুমাত্র ATM বা APTX-এর ঘাটতি মাউসের তুলনামূলকভাবে সংক্ষিপ্ত আয়ুষ্কালে কোষের স্বাস্থ্যকে পর্যাপ্তভাবে প্রভাবিত করে না, এবং এইভাবে এই সময়ের মধ্যে ডিএনএ ক্ষতির পর্যাপ্ত সঞ্চয় করার জন্য উভয় প্রোটিন নির্মূল করা প্রয়োজন। DNA ক্ষতির প্রতিক্রিয়ায় ATM এবং APTX-এর স্বতন্ত্র জৈব রাসায়নিক বৈশিষ্ট্য এবং কার্যকরী ভূমিকা রয়েছে এবং সেইজন্য উভয়েরই ঘাটতি জিনোমের স্থায়িত্বের (অর্থাৎ, জিনোটক্সিক স্ট্রেস বৃদ্ধি) বৃহত্তর আঘাতের কারণ হতে পারে বলে পূর্বাভাস দেওয়া হয়েছে। আমাদের অনুসন্ধান যে দুটি জিনোম স্থায়িত্ব পাথওয়ে প্রোটিন ইঁদুরের স্নায়বিক ত্রুটিগুলি প্ররোচিত করার জন্য প্রয়োজনীয় তা দৃঢ়ভাবে পরামর্শ দেয় যে এটি অক্সিডেটিভ স্ট্রেস সিগন্যালিং, মাইটোফ্যাজি বা মাইটোকন্ড্রিয়াল ফাংশনের সম্ভাব্য কার্যগুলির পরিবর্তে ডিএনএ মেরামতে এটিএম এর ওরিওলের ক্ষতি যা সেরিবেলার ত্রুটিগুলি ঘটায় ( শিলো 2020)। বিকল্পগুলিকে অবশ্য পুরোপুরি উড়িয়ে দেওয়া যায় না, কারণ APTX, ATM-এর মতো, মস্তিষ্কের কোষের মাইটোকন্ড্রিয়ায় দেখা গেছে, যেখানে এটি মাইটোকন্ড্রিয়াল ডিএনএ প্রক্রিয়াকরণকে সমর্থন করে বলে মনে করা হয় (Meagher and Lightowlers 2014; Sykora et al. 2011)। এই নতুন মাউস মডেল এই সম্ভাবনাগুলি অন্বেষণ করার জন্য একটি নতুন টুল সরবরাহ করে এবং যান্ত্রিকভাবে সংজ্ঞায়িত করে কিভাবে এটিএম এবং এপিটিএক্সের ক্ষতি শেষ পর্যন্ত সেরিবেলার কর্মহীনতার কারণ হয়। AtmR35XR35X থেকে রেকর্ড করা PN-তে দেখা জৈব-ভৌতিক বিশৃঙ্খলা; Aptx ইঁদুর একইভাবে অ্যাটাক্সিয়ার অন্যান্য মাউস মডেলগুলিতে পাওয়া যায়। এর মধ্যে আমরা PN ইনপুট প্রতিরোধ, মেমব্রেন ক্যাপাসিট্যান্স, এবং AP থ্রেশহোল্ড এবং প্রস্থে যে পরিবর্তনগুলি লক্ষ্য করেছি, যা 1, 3, এবং 7-এর মতো SCA-এর মাউস মডেলগুলিতেও বর্ণনা করা হয়েছে (স্টোয়াস এট আল.2020; শাক্কোত্তাই এট আল.2011; ডেল 'Orco et al.2015)। অধিকন্তু, PN অ্যাকশন সম্ভাব্য ফায়ারিং ফ্রিকোয়েন্সিতে প্রগতিশীল হ্রাস আমরা ইতিবাচকভাবে AtrnR35XR35X এ অ্যাটাক্সিয়ার বিকাশের সাথে সম্পর্কযুক্ত; Aptx'mice 1, 2, 3,5, 6, এবং 13 সহ SCAs 1, 2, 3,5, 6, এবং 13 এর পাশাপাশি কয়েকটি এপিসোডিক ফর্ম সহ প্রচুর পরিমাণে অ্যাটাক্সিক মাউস মডেলে রিপোর্ট করা হয়েছে (পর্যালোচনা দেখুন (কুক, ফিল্ডস এবং ওয়াট 2021))। স্বতন্ত্র সেলুলার ত্রুটির কারণে সৃষ্ট বিভিন্ন অ্যাটাক্সিয়া জুড়ে পরিলক্ষিত পিএন বিভ্রান্তির উল্লেখযোগ্য ওভারল্যাপের প্রেক্ষিতে, পিএন এপি ফায়ারিং ফ্রিকোয়েন্সি পুনরুদ্ধার করা একটি বিস্তৃত-ভিত্তিক থেরাপিউটিক পদ্ধতি হিসাবে বিবেচিত হয়েছে। যাইহোক, এটি অস্পষ্ট রয়ে গেছে যে পিএন ফায়ারিং হ্রাস করা অ্যাটাক্সিয়ার একটি কারণ। অধিকন্তু, পরীক্ষামূলক প্রমাণগুলি নির্দেশ করে যে পিএন ক্রিয়াকলাপে পরিবর্তনগুলি প্রকৃতপক্ষে পিএন ফিজিওলজির চলমান রোগ-সম্পর্কিত দুর্বলতার সময় হোমিওস্ট্যাসিস বজায় রাখার জন্য একটি সাধারণ প্রতিক্রিয়া হতে পারে (ডেল'ওরকো এট আল.2015)। এইভাবে, সমস্ত সেরিবেলার অ্যাটাক্সিয়া জুড়ে ক্রমাগত প্রচেষ্টার প্রয়োজন হয় জেনেটিক, আণবিক, এবং সেলুলার ব্যাঘাতকে রোগের কারণে সেরিবেলার নিউরাল সিগন্যালিং এর নির্দিষ্ট পরিবর্তনগুলির সাথে লিঙ্ক করার জন্য যা শেষ পর্যন্ত অ্যাটাক্সিয়া তৈরি করে। এই প্রচেষ্টায় তাৎপর্যপূর্ণ গুরুত্ব নির্ধারণ করা হবে যে রোগ-সৃষ্টিকারী সেরিবেলার ত্রুটিগুলি সাধারণত সেরিবেলার ফাংশন (যেমন, চলাচলের সময় সমন্বয়কারী সংকেতের ক্ষতি) বা প্রভাবশালী-নেতিবাচক প্রভাব (যেমন, স্নায়ুতন্ত্রকে ব্যাহত করে) দ্বারা অ্যাটাক্সিয়া সৃষ্টি করে কিনা। অস্বাভাবিক নিউরাল আউটপুট প্যাটার্ন সহ সার্কিট)। পরিশেষে, যদিও সেরিবেলার অ্যাটাক্সিয়াস মোকাবেলার জন্য একটি সাধারণ থেরাপিউটিক কৌশল সবচেয়ে বেশি প্রভাব ফেলবে, একটি নির্দেশিত পদ্ধতি যা সেলুলার কর্মহীনতার স্বতন্ত্র জেনেটিক এবং আণবিক কারণগুলিকে মোকাবেলা করে শেষ পর্যন্ত সফলভাবে একটি কার্যকর থেরাপিউটিক বিকাশের জন্য প্রয়োজনীয় হতে পারে। DNA-এর ঘাটতির মধ্যে যান্ত্রিক সংযোগ। এটিএম এবং এপিটিএক্সের মতো স্থিতিশীলতা প্রোটিন এবং পিএন কর্মহীনতা স্পষ্ট নয়। আমাদের ফলাফলগুলি সুপারিশ করে যে পিএনগুলিতে এটিএম এবং এপিটিএক্স ক্ষতির প্রভাব অন্তর্নিহিত, কারণ আমরা গ্রানুল কোষগুলির প্রিসিন্যাপটিক বৈশিষ্ট্যগুলিতে পরিবর্তন বা তাদের সেলুলার ক্ষতির প্রমাণ পাই না (জিসিএল বেধের কোনও পরিবর্তন)। অধিকন্তু, যখন আমরা ATM- এবং APTX-স্বল্পতাপূর্ণ PN এবং বন্য প্রকারে নিম্নতর অলিভারি ইনপুটগুলির স্বল্পমেয়াদী প্লাস্টিকতার পার্থক্য লক্ষ্য করেছি, এই ফলাফলগুলি সম্ভবত Inositol 1,4,5- হ্রাসের মাধ্যমে Ca2* হোমিওস্ট্যাসিসে একটি ব্যাঘাতের দিকে নির্দেশ করে। ট্রাইফসফেট রিসেপ্টর 1(ltpr1) এক্সপ্রেশন, SCAs 1,2 এবং 3 মাউস মডেল এবং এটিএম-ঘাটতি ইঁদুরের অনুরূপ (Kim et al.2020; Chen et al.2008; Demirci et al.2009; Shakkottai et al.2011)। যদিও এটি ভবিষ্যতের পরীক্ষা এবং তুলনা করার জন্য একটি প্রতিশ্রুতিশীল উপায় প্রদান করে, এটি এখনও অস্পষ্ট, এমনকি SCA-এর জন্যও, Ca²* হোমিওস্টেসিসের পরিবর্তন, কারণ কারণ বা অন্য একটি উপসর্গ বা এমনকি অসুস্থ বা বিরক্তিকর PNs এর ক্ষতিপূরণমূলক প্রতিক্রিয়া (ডেল 'Orco et al.2015)। ইমিউন সিস্টেমে, এটিএম ডিএনএ ব্রেকগুলির মেরামতের সাথে জড়িত যা বি-এবং টি-কোষের পূর্বসূরিতে অ্যান্টিজেন রিসেপ্টর জিনের জিন পুনর্বিন্যাসের সময় ঘটে, এই কোষগুলির অ্যান্টিজেন রিসেপ্টর (এলজি এবং টিসিআর) বৈচিত্র্যের জন্য একটি গুরুত্বপূর্ণ ঘটনা। যে খুঁজেটি সেলরক্তে অনুপাত উল্লেখযোগ্যভাবে কমে গেছে যা মানুষের এবং AT নকআউট ইঁদুরের পূর্ববর্তী গবেষণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ (Schubert, Reichenbach, and Zielen 2002; Hathcock et al.2013; Chao, Yang, and Xu 2000; Barlow et al.1996)। পেরিফেরিতে টি-কোষের এই হ্রাস সম্ভবত সেলুলার এবং হিউমারাল অনাক্রম্যতা উভয়ের ত্রুটির সাথে সম্পর্কযুক্ত। গুরুত্বপূর্ণভাবে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে ATM জিনের এক অনুলিপির অভিব্যক্তি রক্তে CD4 প্লাস ঘাটতি পুনরুদ্ধার করার জন্য যথেষ্ট যা নির্দেশ করে যে আংশিক ATM এক্সপ্রেশন পুনরুদ্ধার করতে সক্ষম থেরাপির থেরাপিউটিক কার্যকারিতা থাকবে। যদিও আমরা এই কাগজে বি-কোষের বিকাশের মূল্যায়ন করিনি, তবে সম্ভবত তাদের যান্ত্রিক মিল (মার্শাল এট আল। 2018) এই প্রক্রিয়ার ক্ষেত্রে অনুরূপ সিদ্ধান্তগুলি প্রযোজ্য হবে। প্রত্যাশিত হিসাবে, পেরিফেরাল রক্তে টি-কোষের হ্রাস ত্রুটিপূর্ণ থাইমোসাইট বিকাশের সাথে সম্পর্কযুক্ত। থাইমাসে, আমরা দুটি প্রধান ত্রুটি খুঁজে পেয়েছি। একটি, প্রাথমিকভাবে APTX ঘাটতি দ্বারা প্ররোচিত, DN3 থেকে DN4 ট্রানজিশনে একটি ত্রুটি হিসাবে প্রকাশ করে যা TCR লোকাসের প্রাথমিক পুনর্বিন্যাসের সাথে মিলে যায়। অন্যান্য ত্রুটি, প্রাথমিকভাবে এটিএম-এর ঘাটতির কারণে সৃষ্ট, ডবল-পজিটিভ CD4*CD8-এর একক-পজিটিভ কোষে, প্রাথমিকভাবে CD4' থাইমোসাইটের অগ্রগতির সঙ্গে সম্পর্কযুক্ত। যদিও APTX প্রাপ্তি আশ্চর্যজনক ছিল, কারণ এর ঘাটতি (AOA 1) ইমিউন ঘাটতির সাথে সম্পর্কিত নয়, APTX XRCC4(Clements et al. 2004) সহ TCR জিন পুনর্বিন্যাস প্রোটিনের সাথে যোগাযোগ করতে পরিচিত। টিসিআর জিন পুনর্বিন্যাসের সময় শেষ-যোগদানের প্রক্রিয়াগুলিতে APTX এর ভূমিকা সংজ্ঞায়িত করার লক্ষ্যে ভবিষ্যতের অধ্যয়নগুলি হবে

গুরুত্বপূর্ণ, এবং সম্ভাবনা যে বিকল্প শেষ-যোগদানের প্রক্রিয়া, যেমন মাইক্রোহোমোলজির ব্যবহার, এর অনুপস্থিতিতে রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতার অভাবের জন্য দায়ী আরও তদন্তের প্রয়োজন (Bogue et al. 1997)। Atm?35×/R35× এর বেঁচে থাকার ক্ষমতা; Aptx'mice আগের AT মাউস মডেলের তুলনায় যথেষ্ট দীর্ঘ। তুলনায়, প্রথমAT KOবার্লো এট আল দ্বারা রিপোর্ট করা মাউস মডেল। থাইমোমাস থেকে সাধারণত জন্মের 2-4 মাসের মধ্যে মারা যায় (বারলো এট আল। 1996)। এটি এবং অন্যান্য অনেক নকআউট AT মাউস মডেলগুলিতে ক্যান্সারের বেঁচে থাকার ক্ষমতা কমে যাওয়া সম্ভবত জেনেটিক, কারণ মিউটেশনকে আশ্রয়কারী ব্যাকগ্রাউন্ড স্ট্রেন A/J এবং C57BL/6 সহ ক্যান্সারের প্রাদুর্ভাব এবং বেঁচে থাকার ক্ষেত্রে উল্লেখযোগ্য প্রভাব ফেলেছে।

BALBC এবং 129S স্ট্রেনের উপর উল্লেখযোগ্যভাবে বেঁচে থাকার পটভূমিতে (Genik et al. 2014)। আমাদের এটিএম-ঘাটতি ইঁদুরগুলি একটি C57BL/6 ব্যাকগ্রাউন্ডে তৈরি করা হয়েছিল তা সম্ভবত অন্তর্নিহিত; যে Aptx*t ইঁদুরগুলি অ্যাটাক্সিয়া বিকাশ করে না, এটি তাদের তুলনামূলকভাবে দীর্ঘ জীবনকাল। প্রদত্ত যে Atm35xR35×; অসম্ভাব্য যে AT KO ইঁদুরের প্রাথমিক মৃত্যু একটি অ্যাট্যাক্সিক ফেনোটাইপ পর্যবেক্ষণে বাধা দেয় যা অন্যথায় এই ইঁদুরগুলিতে বিকাশ লাভ করবে। যাইহোক, এটি অজানা যে C57BL/6 ব্যাকগ্রাউন্ড অ্যাটাক্সিয়া বিকাশের জন্য স্থিতিস্থাপকতা প্রদান করে, যেমন এটি ক্যান্সারের জন্য করে। রোগের তীব্রতাকে প্রভাবিত করে এমন জেনেটিক বা সম্ভবত এপিজেনেটিক কারণগুলিকে সংজ্ঞায়িত করা ভবিষ্যতে থেরাপিউটিক বিকাশের পথ প্রদান করতে পারে। আমাদের মাউস মডেলে ATM এবং APTX নাল মিউটেশনের বৈশ্বিক প্রকৃতির পরিপ্রেক্ষিতে, আমরা সম্পূর্ণরূপে উড়িয়ে দিতে পারি না যে অতিরিক্ত-সেরিবেলার ত্রুটিগুলি গুরুতর অ্যাটাক্সিক ফেনোটাইপের ক্ষেত্রেও অবদান রাখতে পারে, এবং এইভাবে ফোরব্রেন, ব্রেনস্টেম, মেরুদণ্ডের সেরিবেলামের বাইরে ভবিষ্যতে পরীক্ষা করা যেতে পারে। , এবং এমনকি পেশী পরিচালনা করা প্রয়োজন হবে. সেরিবেলামের মধ্যে, যদিও আমরা সেরিবেলামের বিভিন্ন অঞ্চলের মধ্যে পিএন ফায়ারিং বৈশিষ্ট্যগুলিতে কিছু শারীরবৃত্তীয় পার্থক্য খুঁজে পেয়েছি, আমরা এমএল প্রস্থ বা পিএন ঘনত্বের আঞ্চলিক পার্থক্য সনাক্ত করিনি। যাইহোক, সেরিবেলামে একটি গ্রুপিং ফ্যাক্টর হিসাবে আঞ্চলিক শারীরস্থান ব্যবহার করার ক্ষেত্রে চ্যালেঞ্জ রয়েছে, কারণ টিস্যুর ভৌত ভাঁজগুলি অগত্যা কার্যকরী, আণবিক অভিব্যক্তি, বা শারীরবৃত্তীয় সম্পত্তি ডোমেনের সীমানার সাথে সম্পর্কযুক্ত নয় যা বর্ণনা করা হয়েছে (Apps and Hawkes 2009) ; Tsutsumi et al.2015; Gao, van Beugen, and De Zeeuw 2012; Zhou et al.2014)। এই ডোমেনের মধ্যে সেরিবেলার ত্রুটির পরিমাণ পরীক্ষা করার উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করা পরীক্ষাগুলি ভবিষ্যতের গবেষণায় গুরুত্বপূর্ণ হবে এবং AT রোগীদের শারীরবৃত্তীয় পার্থক্যের উপাখ্যানমূলক প্রতিবেদনের তুলনায় (ভেরহেগেন এট আল। এবং টেপ্লিটজ 1979; মোনাকো এট আল। 1988; টেরপ্লান এবং ক্রাউস 1969; স্ট্রিচ 1966; সলিটার 1968; সলিটার এবং লোপেজ 1967; আগুইলার এট আল। 1968a; পলা-বারবোসা এট আল। 1983)। যখন আমরা Atm735wR35x এ অ্যাটাক্সিয়ার অগ্রগতির দুটি সম্ভাব্য পর্যায় সনাক্ত করি; Aptx ইঁদুর, মানুষের মধ্যে শৈশব-সূচনার তুলনায় ইঁদুরের প্রাপ্তবয়স্ক অবস্থায় গুরুতর অ্যাটাক্সিয়ার পরবর্তী পর্যায়ের বিকাশ ঘটে। এটি কিছু নিউরোডেভেলপমেন্টাল গবেষণায় এর ব্যবহার সীমিত করতে পারে। এছাড়াও, ভবিষ্যৎ পরীক্ষা-নিরীক্ষার ব্যাখ্যা অবশ্যই সাবধানতার সাথে ফ্যাক্টর করতে হবে যে এই নতুন মডেলটি একই সময়ে দুটি জিনোম স্থিতিশীলতা জিনে নাল মিউটেশন প্রকাশ করে, এমন একটি পরিস্থিতি যা AT বা AOA1 সহ মানুষের রোগীদের মধ্যে সনাক্ত করা হয়নি। অবশেষে, কোথায়, কখন, এবং কীভাবে ATM ঘাটতির কারণে সেরিবেলার প্যাথলজি এবং অ্যাটাক্সিয়া হয় তা চিহ্নিত করা একটি চ্যালেঞ্জ হয়ে দাঁড়িয়েছে, কারণ পূর্বের ATM-ঘাটতি ইঁদুরগুলিতে সাধারণত সেলুলার এবং আণবিক ঘাটতিগুলিকে অ্যাট্যাক্সিক ফেনোটাইপের সাথে যুক্ত করার জন্য প্রয়োজনীয় বৈশিষ্ট্যের অভাব ছিল। তদন্তের একাধিক প্রতিশ্রুতিবদ্ধ উপায়গুলি সংজ্ঞায়িত করা হয়েছে, যার মধ্যে রয়েছে নিউরোনাল স্তরে ফোকাস করা, যেখানে এটিএম অক্সিডেটিভ স্ট্রেস সিগন্যালিং (চেন এট আল.2003) এবং সিনাপটিক ফাংশন (লি এট আল.2009; ভেইল এট আল.2016) এর সাথে জড়িত। পাশাপাশি গ্লিয়াল ফাংশন, যেখানে সাম্প্রতিক প্রমাণগুলি পরামর্শ দেয় যে গ্লিয়াল প্যাথলজি সেরিবেলার প্যাথলজির একটি প্রধান কারণ হতে পারে (কামিনস্কি এট আল। 2016; ক্যাম্পবেল এট আল.2016; Petersen, Rimkus, and Wassarman 2012; Weyemi et al.2015)। এই অভিনব প্রাণীর মডেলটি কীভাবে এটিএমের ঘাটতি সেরিবেলার প্যাথলজি এবং অ্যাটাক্সিয়া সৃষ্টি করে সে সম্পর্কে যান্ত্রিক অনুমান পরীক্ষা করার জন্য একটি নতুন সরঞ্জাম সরবরাহ করে। উপরন্তু, এই মডেলটি পূর্বে প্রস্তাবিত থেরাপিউটিক প্রার্থীদের (Browne et al.2004; Chen et al.2003) এবং আমাদের নিজস্ব SMRT যৌগগুলি (Du et al. 2013) পরীক্ষা করার জন্য একটি গুরুত্বপূর্ণ প্রাক-ক্লিনিক্যাল টুল হিসাবে সবচেয়ে গুরুত্বপূর্ণভাবে কাজ করতে পারে। থেরাপিউটিক পরীক্ষার জন্য উপযুক্ত প্রিক্লিনিকাল মডেল না থাকার গুরুতর সীমাবদ্ধতাগুলি, বিশেষত AT এবং AOA1-এর মতো বিরল ব্যাধিগুলির জন্য, অতিরিক্ত ব্যাখ্যা করা যায় না।

4।{1}} উপাদান এবং পদ্ধতি

4.1 নৈতিকতা বিবৃতি

ন্যাশনাল ইনস্টিটিউট অফ হেলথের ল্যাবরেটরি অ্যানিম্যালসের যত্ন এবং ব্যবহারের জন্য গাইডের সুপারিশ অনুসারে এই অধ্যয়নটি কঠোরভাবে সম্পাদিত হয়েছিল। সমস্ত প্রাণী দ্য লুন্ডকুইস্ট ইনস্টিটিউট (31374-03,31773-02) এবং UCLA(ARC-2007-082, ARC{{3})-এ অনুমোদিত প্রাতিষ্ঠানিক প্রাণী যত্ন ও ব্যবহার কমিটি (IACUC) প্রোটোকল অনুযায়ী পরিচালনা করা হয়েছিল })। প্রোটোকলটি লুন্ডকুইস্ট ইনস্টিটিউটের প্রাণী পরীক্ষার নীতিশাস্ত্র সংক্রান্ত কমিটি দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল (আশ্বাস নম্বর: D16-00213)৷ প্রয়োজনে সমর্থন প্রদান এবং নৈতিক শেষ পয়েন্টগুলি বেছে নিয়ে ব্যথা এবং কষ্ট কমানোর জন্য প্রতিটি প্রচেষ্টা করা হয়েছিল।

4.2 ইঁদুর

All mice were group-housed and kept under a 12-h day/night cycle with food and water available ad libitum. Animals were housed within the general mouse house population, and not in specialized pathogen-free rooms. Older animals were made available wetted food or food gel packs on the ground of the cages as ataxia developed. Atm35 and Atm935×mice were created and provided by Dr. Hicks and colleagues at the University of Manitoba. These mice were created to contain the c.103C>উত্তর আফ্রিকার একটি বৃহৎ জনসংখ্যার মধ্যে পাওয়া T মিউটেশনATরোগীদের using recombineering Gateway technology and site-directed mutagenesis. A C>T mutation at this position in the mouse Atm gene creates a TAG G stop codon. The same mutation in the human ATM gene produces a TGA G stop codon. In consideration of the use of these models for therapeutic interventions, we chose to create a mouse model for each of the two PTC codons(Fig.1A). A modified Gateway R3-R4-destination vector was used to pull out the desired region of the mouse Atm gene from a Bacterial Artificial Chromosome (BAC) and subsequently mutated to create either a TAG G stop codon at codon 35(M00001, position 103(C>T))or a TGA G stop codon (M00002, position 103 (CAG>TGA), মানুষের AT PTC প্রতিলিপি করা)। এরপর জিনোমিক অ্যালিলগুলিকে 3-ওয়ে গেটওয়ে রিঅ্যাকশন (Bradley et al. 2012) ব্যবহার করে NorCOMM স্তন্যপায়ী টার্গেটিং ভেক্টরের একটি পরিবর্তিত সংস্করণে ক্লোন করা হয়েছিল। ফলস্বরূপ লক্ষ্যবস্তু ভেক্টরগুলিকে C2 ES কোষে ইলেক্ট্রোপোরেট করা হয়েছিল (C57BI/6N, A. Nagy ল্যাব, টরন্টো, কানাডা থেকে প্রাপ্ত) এবং G418 (Gertsenstein et al.2010) দ্বারা নির্বাচনের মাধ্যমে সফলভাবে লক্ষ্যবস্তু ক্লোনগুলি চিহ্নিত করা হয়েছিল। এটিএম জিন লোকাসে মিউটেটেড টার্গেটিং ক্যাসেটের ইন্টিগ্রেশন সাউদার্ন ব্লট দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছিল, এবং এটিএম পিটিসি মিউটেশনের উপস্থিতি নিশ্চিত করতে পিসিআর পণ্যগুলির সিকোয়েন্সিং দ্বারা, এটিএম লোকাসে ত্রুটি-মুক্ত লক্ষ্যবস্তু এবং ত্রুটি-মুক্ত কার্যকরী উপাদানগুলির উপস্থিতি নিশ্চিত করা হয়েছিল।

ভেক্টর (ডেটা দেখানো হয়নি)। ট্রান্সজেনিক লাইনগুলি পেতে ব্লাস্টোসিস্ট ইনজেকশনের জন্য ইতিবাচক ES ক্লোনগুলি ব্যবহার করা হয়েছিল। ট্রান্সজেনিক অ্যালিলে একটি ফ্লক্সড মানব বিটা-অ্যাক্টিন প্রোমোটার-ডেল্টা রয়েছেTK1-নিও cassette in the intron upstream of the region containing the mutated exon. This floxed cassette was subsequently excised by crossing with a Cre driver mouse(B6.C-Tg(CMV-are)1Cgn/J) to generate Atm3x+ and AtmM1(103CTMFcc, respectively) mouse lines Atm35×+ (MGI nomenclature: AtmTM1(103CAG>TGA)MFGCc;(চিত্র 1A)। দুটি Atm লাইনের জিনোটাইপিং Tm 62 ডিগ্রি ডিগ্রীতে নিম্নলিখিত প্রাইমারগুলি ব্যবহার করে সঞ্চালিত হয়েছিল: Atm জিন ফরোয়ার্ড (F) প্রাইমার:5'-CCTTTGAGGCATAAGTTGCAACTTG-3'; এবং Atm জিন রিভার্স(R)প্রাইমার: 5'-GTACAGTGTATCAGGTTAGGCATGC-3', 151bp এর একটি ওয়াইল্ড-টাইপ অ্যালিল প্রোডাক্ট বা 241bp এর টার্গেটেড অ্যালিল প্রোডাক্ট তৈরি করে (ডুমুর 1A, 1B)।Atmn35× এবং Atm035×v ছিল C57BI/6J সারোগেট মায়েদের ব্যবহার করে ক্রায়োপ্রিজারভেশন এবং পরবর্তী পুনরুত্পাদনের আগে 9 প্রজন্মের (99.2 শতাংশ আইসোজেনিক) জন্য C57Bl/6J ইঁদুরের সাথে ব্যাক-ক্রস করা হয়েছে। Atm735× এবং Atm?35x এবং Atm 35×/Q35× প্রজননকারী ছিল F1 ভাইবোন Atm35 এবং Atm835X প্লাস ইঁদুর থেকে। AtmR35×k35×: উভয়ই উর্বর বলে পাওয়া গেছে। Aptx নকআউট (Aptx) ইঁদুরগুলি তৈরি করা হয়েছিল এবং ড. ম্যাকিনন (Ahel et al.2006) থেকে ভ্রূণ হিসাবে ড. ম্যাথিউসকে প্রদান করা হয়েছিল, এবং পরবর্তীতে C57Bl/6J সারোগেট মায়েদের মাধ্যমে পুনরুদ্ধার করা হয়েছিল। Aptx' ইঁদুর একটি C57Bl/6 এবং 129 মিশ্র পটভূমিতে রয়েছে। Atm35k35; বিভিন্ন বন্যপ্রকৃতির Aptx ইঁদুর, heterozygous, এবং homozygous সমন্বয়ে Atm35X থেকে তৈরি করা হয়েছিল; Aptxt breeders তৈরি করা হয়েছিল Atm?35×R35 এবং Aptx^ ইঁদুর অতিক্রম করে। ডাবল মিউট্যান্ট এবং সংশ্লিষ্ট নিয়ন্ত্রণ ইঁদুরের একটি দল গাইট বিশ্লেষণ এবং SHERPA পরীক্ষার (Figs.2,3) জন্য অনুদৈর্ঘ্য আচরণগত গবেষণায় ব্যবহৃত হয়েছিল। ইলেক্ট্রোফিজিওলজিকাল, ইমিউনোহিস্টোলজিকাল এবং উল্লম্ব মেরু পরীক্ষা পরীক্ষার জন্য বয়সের সাথে মিলে যাওয়া ডাবল মিউট্যান্ট এবং নিয়ন্ত্রণ ইঁদুরের একাধিক অতিরিক্ত দল ব্যবহার করা হয়েছিল (Figs.4, 7)। ইমিউনোলজিকাল এবং প্রোটিন এক্সপ্রেশন পরীক্ষাগুলি মূল AtmR35× এবং Atm35 × পুনঃপ্রাপ্ত ইঁদুর (Figs.5, 6, এবং 8) থেকে প্রজনন করা ইঁদুর ব্যবহার করে পরিচালিত হয়েছিল। পি8-11 ইঁদুরের কানের টিস্যুর নমুনা থেকে জিনোটাইপিং করা হয়েছিল। Transnetyx Inc. দ্বারা পরিচালিত রিয়েল-টাইম পিসিআর পদ্ধতিগুলি প্রতিটি প্রাণীর জিনোটাইপ নির্ধারণ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। কানের বায়োপসির মতো একই সময়ে দেওয়া পায়ের আঙুলের ট্যাটুর মাধ্যমে প্রাণীদের শনাক্তযোগ্য করা হয়েছিল। Atm35× এবং Atm35× এর জন্য অনন্য প্রাইমারগুলি পরিমাপ করা হয়েছিল এবং বন্য-প্রকার, হেটেরোজাইগাস এবং হোমোজাইগাস ইঁদুর (উপরে তালিকাভুক্ত) সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। Aptx' এবং Aptx*" প্রাইমারগুলি তাদের জিনোটাইপগুলি মূল্যায়ন করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।

4.3 পশু স্বাস্থ্য

P8, 45, 120,210,400 এ ডিজিটাল স্কেলের মাধ্যমে পশুদের ওজন করা হয়েছিল। প্রাণীর মৃত্যু রেকর্ড করা হয়েছিল যেদিন মৃত পাওয়া গেছে, বা euthanization দিনে যখন প্রাণীরা মানবিক শেষ বিন্দুতে পৌঁছেছিল (60-এর দশকের মধ্যে প্রাণীরা নিজেকে ঠিক করতে অক্ষম, গুরুত্বপূর্ণ চুলের ম্যাট স্ব-সজ্জার অভাব বা অত্যধিক কষ্টের ইঙ্গিত দেয় যা পশুচিকিত্সা দ্বারা উল্লেখ করা হয়েছে। কর্মী). মৃত্যুর পর পশুর মৃতদেহ অবিলম্বে হিমায়িত করা হয়েছিল, এবং পোস্টমর্টেম নেক্রোপসিগুলি ব্যাচে করা হয়েছিল। অভ্যন্তরীণ অঙ্গগুলির চাক্ষুষ পরিদর্শনের মাধ্যমে কর্মীদের পশুচিকিত্সক (ডঃ ক্যাটালিনা গুয়েরার) সহযোগিতায় মৃত্যুর সম্ভাব্য কারণটি আমাদের সর্বোত্তম ক্ষমতার জন্য নির্ধারিত হয়েছিল। কিছু ইঁদুরকে নরখাদক করা হয়েছিল বা ঘটনাক্রমে ভিভারিয়াম কর্মীদের দ্বারা নিষ্পত্তি করা হয়েছিল এবং ছিল

তাই "নিখোঁজ" হিসাবে লেবেল করা হয়েছে৷ মৃত্যুর কোনও স্পষ্ট দৃশ্যমান কারণ ছাড়াই ইঁদুরগুলিকে "অনির্ধারিত" হিসাবে লেবেল করা হয়েছিল৷ থাইমাস সাধারণত অল্প বয়সী ইঁদুরের যেখানে থাকে তার কাছাকাছি থোরাসিক ভরের সাথে পাওয়া ইঁদুরগুলিকে "থাইমিক ক্যান্সার" হিসাবে তালিকাভুক্ত করা হয়েছিল৷ অন্য সকলকে চিহ্নিত করা হয়েছিল৷ মৃত্যুর সম্ভাব্য কারণগুলি (যেমন, বর্ধিত লিভার, প্রস্রাব বাধা) "অন্য" হিসাবে চিহ্নিত করা হয়েছিল।

4.4 আচরণ

কোনও আচরণগত পরীক্ষা করার আগে, ইঁদুরগুলি 20 মিনিটের জন্য আচরণগত স্যুটে অভ্যস্ত ছিল। ইঁদুরগুলি তাদের দৈনন্দিন চক্রের সাথে সামঞ্জস্য রেখে দিনের বিভিন্ন সময়ে পরীক্ষা করা হয়েছিল। আচরণগত পরীক্ষার একটি ব্যাটারি আচরণের উপর নির্ভর করে তবে ইঁদুরের একই দলে নির্দেশিত জিনোটাইপগুলির নিষ্পাপ ডবল মিউট্যান্ট ইঁদুরের উপর সঞ্চালিত হয়েছিল। পরীক্ষার ব্যাটারির মধ্যে ক্যাটওয়াক গেইট অ্যাসেসমেন্ট (P45, 120,210, 400) এবং স্মিথক্লাইন-বিচাম হারওয়েল ইম্পেরিয়াল-কলেজ এবং রয়্যাল-লন্ডন-হসপিটাল ফেনোটাইপ অ্যাসেসমেন্ট (SHERPA) পরীক্ষার (P30 এবং 40) একটি উপসেট অন্তর্ভুক্ত ছিল। এই পরীক্ষাগুলি UCLA আচরণগত কোর দ্বারা পরিচালিত হয়েছিল। ডাবল মিউট্যান্ট এবং নিয়ন্ত্রণ ইঁদুরগুলি অতিরিক্তভাবে উল্লম্ব মেরু পরীক্ষায় পরীক্ষা করা হয়েছিল। প্রতিটি পরীক্ষার বিষয়ের মধ্যে সমস্ত আচরণগত যন্ত্রপাতি ইথানল (70 শতাংশ) দিয়ে মুছে ফেলা হয়েছিল।

গাইট বিশ্লেষণ

আমরা একটি নলডাস ক্যাটওয়াক গেইট বিশ্লেষণ সিস্টেম ব্যবহার করেছি যা আধা-স্বয়ংক্রিয়ভাবে পরিমাপ এবং স্বাভাবিক অ্যাম্বুলেশনের সময় ইঁদুরের গতি বিশ্লেষণ করার জন্য ডিজাইন করা হয়েছে। সংক্ষেপে, একটি কাঁচ-নীচের করিডোর জুড়ে ইঁদুরের গতিবিধি একটি কেন্দ্রীয় অবস্থান থেকে ভিডিও রেকর্ড করা হয়। গ্লাস ওয়াকিং প্ল্যাটফর্ম জুড়ে হালকা আলোকসজ্জার কারণে ভিডিওতে পায়ের ছাপগুলি হাইলাইট করা হয়েছে। একটি ভিডিওর প্রতিটি মাউস ধাপ পরবর্তীতে ক্যাটওয়াক এক্সটি (নল্ডাস) ব্যবহার করে আধা-স্বয়ংক্রিয় পদ্ধতিতে সনাক্ত করা হয়। প্রতিটি মাউসের জন্য একটি দৌড়ে পর্যবেক্ষণ করা প্ল্যাটফর্ম জুড়ে সামঞ্জস্যপূর্ণ অ্যাম্বুলেশনের 3টি ট্রায়াল থাকে। শুধুমাত্র সামঞ্জস্যপূর্ণ ট্রায়াল গৃহীত হয়, এবং করিডোর জুড়ে উভয় দিকে 3টি অনুগত ট্রায়াল সম্পূর্ণ করতে ইঁদুর 10টি প্রচেষ্টা নিতে পারে। কমপ্লায়েন্ট ট্রায়ালগুলিকে 5 s-লং-এর নীচে প্ল্যাটফর্ম জুড়ে চলাফেরা এবং 60 শতাংশের বেশি গতির তারতম্য ছাড়াই সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল৷ একবার প্ল্যাটফর্মে স্থাপন করা হলে, ইঁদুররা সাধারণত পরীক্ষক প্রম্পটিংয়ের প্রয়োজন ছাড়াই পিছনে পিছনে দৌড়ায়।

উল্লম্ব মেরু

ইঁদুরগুলিকে 80 সেন্টিমিটার লম্বা বোল্টের শীর্ষে রাখা হয় এবং তাদের নাক নীচের দিকে এবং পিছনের পাঞ্জাগুলি যতটা সম্ভব শীর্ষের কাছাকাছি থাকে। ইঁদুর অবিলম্বে ছেড়ে দেওয়া হয়, এবং সময় বসানোর সাথে সাথেই শুরু হয়।

যখন প্রথম অগ্রভাগ মেরুটির নীচের পৃষ্ঠকে স্পর্শ করে তখন সময় বন্ধ হয়ে যায়। একটি ইঁদুরের স্বাভাবিক প্রবণতা হ'ল অবিলম্বে মেরু থেকে নেমে যাওয়া, এবং মেরুটি অতিক্রম করার জন্য তাদের 60 এর দশক পর্যন্ত দেওয়া হয়, অন্যথায়, তাদের মেরু থেকে নামতে সাহায্য করা হয়। একটি অ-সম্পূর্ণ ট্রায়াল স্বয়ংক্রিয়ভাবে 30 এর একটি সময় দেওয়া হয়, কারণ 95 শতাংশ ইঁদুর যেগুলি 30 সেকেন্ডের মধ্যে নেমে আসেনি তারা এখনও 60 এর দশকে মেরুতে ছিল। SHIRPA আচরণগত পরীক্ষাগুলি P30 এ ক্যালিফোর্নিয়া বিশ্ববিদ্যালয়, লস এঞ্জেলেস আচরণগত কোর দ্বারা পরিচালিত হয়েছিল

এবং P400. সমস্ত পরামিতি একটি পরিমাণগত মূল্যায়ন প্রদানের জন্য স্কোর করা হয়। যা সময়ের সাথে সাথে এবং বিভিন্ন পরীক্ষাগারের মধ্যে ফলাফলের তুলনা করতে সক্ষম করে। প্রতিটি মাউস পরের মাউসে যাওয়ার আগে ~20-মিনিট সময়ের মধ্যে সমস্ত আচরণ জুড়ে পরীক্ষিত হয়েছিল। পরীক্ষক প্রাণী জিনোটাইপ অন্ধ ছিল. স্ক্রিনটি পূর্বে বর্ণিত হিসাবে সঞ্চালিত হয়েছিল (রজার্স এট আল। 1997)।

আচরণগত পর্যবেক্ষণ

প্রাথমিক স্ক্রীন একটি আচরণগত পর্যবেক্ষণ প্রোফাইল প্রদান করে এবং প্রতিটি প্রাণীর মূল্যায়ন শুরু হয় 5 মিনিটের জন্য একটি দেখার জার (10 সেমি ব্যাস) মধ্যে অবিচ্ছিন্ন আচরণ পর্যবেক্ষণ করে। শরীরের অবস্থান, স্বতঃস্ফূর্ত কার্যকলাপ, শ্বাস-প্রশ্বাসের হার এবং কম্পনের স্কোর করা আচরণ ছাড়াও, পর্যবেক্ষক উদ্ভট বা স্টেরিওটাইপড আচরণ এবং খিঁচুনি, বাধ্যতামূলক চাটা, আত্ম-ধ্বংসাত্মক কামড়, এবং রেট্রোপালশন (পিছন দিকে হাঁটা) এবং স্থানিকের ইঙ্গিতগুলির কোনও উদাহরণ লগ করেন। বিপথগামীতা

এরিনা আচরণ

তারপরে, স্থানান্তর উত্তেজনা পরীক্ষা এবং স্বাভাবিক আচরণ পর্যবেক্ষণের জন্য মাউসকে রঙ্গভূমিতে (30 সেমি x 50 সেমি) স্থানান্তর করা হয়। 30 s-পিরিয়ডের মধ্যে লোকোমোটর কার্যকলাপ পরিমাপ করার জন্য ক্ষেত্রটিকে 10 x 10 cm² বর্গক্ষেত্রের একটি গ্রিডে চিহ্নিত করা হয়েছে। মাউস যখন ক্ষেত্রটিতে সক্রিয় থাকে, তখন চমকপ্রদ প্রতিক্রিয়া, চালচলন, শ্রোণী উচ্চতা এবং লেজের উচ্চতা রেকর্ড করা হয়।

সুপাইন সংযম

স্বায়ত্তশাসিত আচরণ রেকর্ড করার জন্য প্রাণীটিকে একটি সুপিন অবস্থানে সংযত করা হয়। এই মূল্যায়নের সময়, গ্রিপ শক্তি, শরীরের টোন, পিন্না রিফ্লেক্স, কর্নিয়াল রিফ্লেক্স, পায়ের আঙ্গুলের চিমটি, তারের কৌশল এবং হার্ট রেট মূল্যায়ন করা হয়েছিল।

ব্যালেন্স এবং ওরিয়েন্টেশন

অবশেষে, ভেস্টিবুলার সিস্টেম ফাংশনের বেশ কয়েকটি ব্যবস্থা সম্পাদিত হয়েছিল। রাইটিং রিফ্লেক্স, কন্টাক্ট রাইটিং রিফ্লেক্স এবং নেতিবাচক জিওট্যাক্সিস পরীক্ষা করা হয়েছিল। এই প্রক্রিয়া জুড়ে কণ্ঠস্বর, প্রস্রাব এবং সাধারণ ভয়, বিরক্তি বা আগ্রাসন রেকর্ড করা হয়েছিল।

ব্যবহৃত সরন্জাম

1.ক্লিয়ার প্লেক্সিগ্লাস এরিনা (আনুমানিক অভ্যন্তরীণ মাত্রা 55x33 x18 সেমি)। অঙ্গনের মেঝেতে একটি প্লেক্সিগ্লাস শীট 15 স্কোয়ার (11 সেমি) দিয়ে চিহ্নিত করা হয়েছে। একটি অনমনীয় অনুভূমিক তার (3 মিমি ব্যাস) পিছনের ডান কোণে এমনভাবে সুরক্ষিত থাকে যে তারের কৌশলের সময় প্রাণীরা পাশ স্পর্শ করতে পারে না। একটি গ্রিড (40x 20 সেমি) 12 মিমি জাল (আনুমানিক) সহ টেইল সাসপেনশন এবং গ্রিপ শক্তির আচরণ পরিমাপের জন্য বাক্সের প্রস্থ জুড়ে সুরক্ষিত। 2. একটি পরিষ্কার প্লেক্সিগ্লাস সিলিন্ডার (15 x ll সেমি) দেখার জার হিসাবে ব্যবহার করা হয়েছিল। 3. একটি গ্রিড মেঝে (40x 20 সেমি) 12 মিমি জাল সহ যার উপর দেখার বয়াম দাঁড়িয়ে আছে।4। বেঞ্চ থেকে গ্রিড বাড়াতে চারটি নলাকার স্টেইনলেস-স্টিল সমর্থন করে (3 সেমি দৈর্ঘ্য x 2.5 সেমি ব্যাস)। 5. একটি বর্গাকার (13 সেমি) স্টেইনলেস স্টিলের প্লেট যা অ্যারেনাতে প্রাণীদের স্থানান্তরের জন্য। 6. কর্নিয়াল এবং পিনা রিফ্লেক্স পরীক্ষার জন্য ফোরসেপে রাখা 3/0 মেরসিল্কের দৈর্ঘ্য 7. লালা এবং কামড়ের পরীক্ষা করার জন্য একটি প্লাস্টিকের ডোয়েল রড একটি পেন্সিল পয়েন্টে তীক্ষ্ণ করা হয়েছিল৷8৷ পায়ের আঙ্গুলের চিমটির জন্য সূক্ষ্ম বিন্দু দিয়ে বাঁকা (125 মিমি ফরসেপ, ফিলিপ হ্যারিস সায়েন্টিফিক, ক্যাট নং ডি46-174), বিচ্ছেদকারী সরঞ্জামের এক জোড়া 9.একটি স্টপওয়াচ।10। চমকপ্রদ প্রতিক্রিয়া পরীক্ষা করার জন্য একটি IHR ক্লিক বক্স ব্যবহার করা হয়। ক্লিক বক্স 90dB SPL-এ একটি সংক্ষিপ্ত 20 kHz টোন তৈরি করে যখন মাউসের 30cm উপরে রাখা হয়। প্রফেসর কেপি স্টিল, এমআরসি ইনস্টিটিউট অফ হিয়ারিং রিসার্চ, ইউনিভার্সিটি পার্ক, নটিংহাম এনজি7 2আরডির সাথে যোগাযোগ করুন। 11.একটি শাসক।12.একটি 30 সেমি পরিষ্কার প্লেক্সিগ্লাস টিউব যার অভ্যন্তরীণ ব্যাস 2.5 সেমি কনট্যাক্ট রাইটিং রিফ্লেক্সের জন্য।4.5 ইলেক্ট্রোফিজিওলজি তীব্র সেরিবেলার স্লাইস তৈরি করা 300 μm পুরুত্বের কিউট প্যারাসাজিটাল স্লাইস পরীক্ষামূলক মাইলসেবেল এবং লিটারমেট কন্ট্রোল থেকে প্রস্তুত করা হয়েছিল। প্রকাশিত পদ্ধতি অনুসরণ করে (Hansen et al., 2013)। সংক্ষেপে, সেরিবেলাকে দ্রুত অপসারণ করা হয় এবং একটি বরফ-ঠাণ্ডা বহির্মুখী দ্রবণে নিমজ্জিত করা হয় (মিমি): 119 NaCl, 26 NaHCOg, 11 গ্লুকোজ, 2.5 KCl, 2.5 CaCla, 1.3 MgCla, এবং 1 NaHzPOa, pH7.4 যখন 5 শতাংশ CO-/95 শতাংশ O2 সহ গ্যাসযুক্ত। সেরেবেলাকে একটি ভাইব্রেটোম (লাইকা ভিটি-100, লাইকা বায়োসিস্টেম, নুস্লোচ, জার্মানি) ব্যবহার করে প্যারাসাজিটালি ভাগ করা হয়েছিল এবং প্রাথমিকভাবে 35 ডিগ্রীতে -30 মিনিটের জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল, এবং তারপরে ভারসাম্যপূর্ণ এবং ব্যবহার না হওয়া পর্যন্ত ঘরের তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল। এক্সট্রাসেলুলার ইলেক্ট্রোফিজিওলজি এক্সট্রাসেলুলার এবং ইন্ট্রাসেলুলার রেকর্ডিংগুলি পুরকিঞ্জে নিউরন (পিএন) থেকে ক্রমাগত কার্বোজেন-বুদযুক্ত এক্সট্রা সেলুলার দ্রবণ দিয়ে পারফিউজ করা হয়েছিল এবং 37 ডিগ্রি সে (বহির্মুখী) বা 32 ডিগ্রি (অন্তঃকোষীয়) ± 1 ডিগ্রি (উপরে) রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল। একটি Zeiss পরীক্ষক মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে DIC অপটিক্স এবং একটি জল-নিমজ্জন 40× উদ্দেশ্য (NA 0.75) দিয়ে কোষগুলিকে কল্পনা করা হয়েছিল। ~3 MQ প্রতিরোধের (মডেল P-1000, Sutter Instruments, Novato, CA) গ্লাস পাইপেটগুলি বহির্মুখী দ্রবণে পূর্ণ ছিল এবং ভোল্টেজ-ক্ল্যাম্প মোডে অ্যাকশন পটেনশিয়াল-সম্পর্কিত ক্যাপাসিটিভ কারেন্ট ট্রানজিয়েন্টগুলি পরিমাপ করার জন্য PN অ্যাক্সন টিলার কাছে অবস্থান করা হয়েছিল। পাইপেট সম্ভাব্য 0 mV এ অনুষ্ঠিত হয়। পুরো-কোষ প্যাচ-ক্ল্যাম্প রেকর্ডিংয়ের জন্য, পাইপেটগুলি একটি আন্তঃকোষীয় দ্রবণ (মিমি) দিয়ে পূর্ণ করা হয়েছিল: 140 মাস (CH3KO3S), 10 NaCl, 2 MgCl2,0.2 CaClz, 10 HEPES, 14 ফসফোক্রিটাইন （ট্রিস সল্ট）, 1 EGTA, 4g -ATP,0.4 Na-GTP.100 μM পিক্রোটক্সিন (সিগমা) ইনহিবিটরি GABAegeric সিনাপটিক ইনপুটগুলিকে ব্লক করতে যোগ করা হয়েছিল। ডেটা ব্যবহার করে অর্জিত হয়েছিল

ভোল্টেজ বা কারেন্ট-ক্ল্যাম্প মোডে 20 বা 100 kHz এ একটি MultiClamp 700B পরিবর্ধক, pClamp10 (আণবিক ডিভাইস, সানিভেল, CA) সহ ডিজিডেটা 1440 এবং 2 থেকে 4 kHz এ ফিল্টার করা হয়েছে। সিরিজ প্রতিরোধ সাধারণত 10 থেকে 15 MQ এর মধ্যে ছিল। শুধুমাত্র স্বল্প-মেয়াদী প্লাস্টিসিটি পরীক্ষার জন্য সিরিজ প্রতিরোধের 80 শতাংশ ক্ষতিপূরণ দেওয়া হয়েছিল। এক্সট্রা সেলুলার রেকর্ডিংয়ের জন্য, সমস্ত জিনোটাইপ, লিঙ্গ এবং বয়স গোষ্ঠীতে প্রতিটি প্রাণীর জন্য মোট 20 থেকে 45টি পিএন রেকর্ড করা হয়েছিল। রেকর্ডিংগুলি সেরিবেলামের মধ্য-পার্শ্বিক এবং রোস্ট্রোকডাল অক্ষ উভয় জুড়ে বিতরণ করা হয়েছিল। শুধুমাত্র একটি "স্বাস্থ্যকর" চেহারা (সেলুলার সীমানার কম বৈসাদৃশ্য) এবং নিয়মিত, নিরবচ্ছিন্ন ফায়ারিং রেট সহ কোষগুলি পরীক্ষা করা হয়েছিল। বিশ্লেষণের সময়, কয়েকটি কোষে 2 সেকেন্ডেরও বেশি সময় ধরে ফায়ারিংয়ের ফাঁক পাওয়া গেছে এবং এই কোষগুলিকে বিশ্লেষণ থেকে বাদ দেওয়া হয়েছে, কারণ এই ধরণের ফায়ারিং "অস্বাস্থ্যকর" হওয়ার সাথে সম্পর্কিত। ডাবল মিউট্যান্ট টিস্যু গুণগতভাবে আলাদা ছিল না। রেকর্ডিংয়ের আগে ডিআইসি মাইক্রোস্কোপির অধীনে উপস্থিতি, বা অন্যান্য জিনোটাইপের তুলনায় "অস্বাস্থ্যকর" কোষের সংখ্যাও বেশি ছিল না (P400-এ নিয়ন্ত্রণ জিনোটাইপ জুড়ে সমস্ত কোষের 7 শতাংশ বনাম 4 থেকে 11 শতাংশ)। স্নায়ু ক্রিয়াকলাপের স্থানিক তুলনা ফ্লোকুলাস, পার্শ্বীয় (2"ডি বা 3'), মধ্যবর্তী (6" বা 7ম) এবং মধ্যবর্তী (11" বা 12টি) স্লাইসগুলিতে সিরিয়াল বিভাগ থেকে রেকর্ডিংয়ের মাধ্যমে প্রাপ্ত হয়েছিল। নিম্ন নম্বরের স্লাইসগুলি ব্যবহার করা হয়েছিল ছোট বয়সের গোষ্ঠীগুলি (P45 এবং 110) বয়সের গোষ্ঠীগুলির মধ্যে রেকর্ডিংয়ের আপেক্ষিক অবস্থানের সাথে মোটামুটি মেলে৷ 0-3 টিস্যু গুণমান এবং স্বাস্থ্যের উপর নির্ভরশীল প্রতিটি স্লাইসের মধ্যে প্রতিটি লোবিউল থেকে রেকর্ডিং তৈরি করা হয়েছিল৷ প্রতিটি রেকর্ডিং {{29} পর্যন্ত স্থায়ী হয়েছিল৷ }মিনিট। প্রতিটি বয়সের জন্য 3 থেকে 5টি ইঁদুর ব্যবহার করা হয়েছিল এবং পরীক্ষাকারীকে জিনোটাইপ, বয়স এবং লিঙ্গের জন্য অন্ধ করা হয়েছিল।

আন্তঃকোষীয় রেকর্ডিংগুলি PNs থেকে মধ্যম সেরিবেলামের (যেমন, ভার্মিস) লোবুল IIl বা VIl-এ প্রাপ্ত হয়েছিল; লোবিউলের মধ্যে বৈশিষ্ট্যের কোনো পরিসংখ্যানগত পার্থক্য পরিলক্ষিত হয়নি।

বিশ্লেষণ করে

ক্ল্যাম্পফিট (আণবিক ডিভাইস), গোপ্রো (ওয়েভমেট্রিক্স) এবং এক্সেল (মাইক্রোসফ্ট) এ স্ট্যান্ডার্ড এবং কাস্টম রুটিন ব্যবহার করে স্বতঃস্ফূর্ত অ্যাকশন সম্ভাব্য ইন্টারস্টিমুলাস ব্যবধানগুলি সনাক্ত এবং বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। বিশেষত, কর্ম সম্ভাবনা থ্রেশহোল্ড সনাক্ত করা হয়েছে, এবং স্পাইকিং পরিসংখ্যান (যেমন, ফ্রিকোয়েন্সি এবং ব্যবধানের দৈর্ঘ্য) নির্ধারণ করা হয়েছে (TaroTools;https://sites.google.com/site/tarotoolsregister/)। গড় ইন্টার-স্পাইক ব্যবধান (CV) এবং মধ্যবর্তী আন্তঃ-স্পাইক ব্যবধান (CV2=2 ISIN প্লাস 1-ISINl/(ISIN প্লাস 1 প্লাস ISIN)) ব্যবহার করে এক্সেলে গণনা করা হয়েছিল কাস্টম ম্যাক্রো। lgorPro ব্যবহার করে স্ট্যান্ডার্ড ঝিল্লি বৈশিষ্ট্য বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। RM নির্ধারণ করা হয়েছিল একটি -5 mV স্টেপ পালস থেকে একটি-80 mV ধারণ ক্ষমতার 3 ভোল্টেজ ট্রেস প্রতিক্রিয়া এবং সূচনার পরে 900 এবং 1000 ms এর মধ্যে বর্তমান বিচ্যুতি পরিমাপ করে। ঝিল্লির সময় ধ্রুবকটি শিখরের 90 শতাংশ থেকে 10 শতাংশ পর্যন্ত প্রাথমিক ক্ষয় পর্যায়ে একটি একক সূচককে ফিট করে পরিমাপ করা হয়েছিল। ঝিল্লির ধ্রুবককে RM দ্বারা ভাগ করে CM গণনা করা হয়েছিল। sEPSC ইভেন্টগুলি একটি 1- মিনিটের যুগে রেকর্ড করা হয়েছিল এবং Neuroexpress (v21.1.13) ব্যবহার করে সনাক্ত ও পরিমাপ করা হয়েছিল। থিটা-গ্লাস ইলেক্ট্রোড (WPI) এবং একটি TTL-নিয়ন্ত্রিত উদ্দীপক বিচ্ছিন্নকারী (ISO-Flex, AMPI) ব্যবহার করে সমান্তরাল এবং আরোহণকারী ফাইবার অ্যাক্সনগুলিকে উদ্দীপিত করা হয়েছিল। উদ্ভাসিত EPSC প্রশস্ততা এবং ক্ষয় সময়ের ধ্রুবকগুলি (সমান্তরাল জন্য 1 এক্সপ এবং ক্লাইম্বিং ফাইবারগুলির জন্য 2 এক্সপ) lgorPro-তে কাস্টম রুটিনগুলি ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল৷ ~70 mV সম্ভাব্যতা বজায় রাখার জন্য একটি হোল্ডিং কারেন্ট সামঞ্জস্য সহ -500 এবং 2250 pA (250 pA ধাপ) এর মধ্যে 1 s বর্তমান ইনজেকশনের একটি সেটের অংশ হিসাবে কর্ম সম্ভাবনা পরীক্ষা করা হয়েছিল। অ্যাকশন সম্ভাব্য তরঙ্গরূপগুলি কাস্টম ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল

lgorPro-এ রুটিন। অ্যাকশন পটেনশিয়াল থ্রেশহোল্ডকে প্রথম মেমব্রেন ভোল্টেজ হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল যেখানে প্রথম ডেরিভেটিভ 30 mV/ms অতিক্রম করেছিল (Zhu et al.2006)।

4.6 সেরিবেলার অ্যাট্রোফির পরীক্ষা

সেরিবেলার আকার মাথার খুলি থেকে মস্তিষ্ক অপসারণের পরপরই, একটি পৃষ্ঠীয়, সম্পূর্ণ-মাউন্ট চিত্র প্রাপ্ত হয়েছিল। তারপরে ফিজি (এনআইএইচ) ব্যবহার করে চিত্রগুলি প্রক্রিয়া করা হয়েছিল। ফোরব্রেন এবং সেরিবেলার আকারগুলি তাদের 2-মাত্রিক স্থানের রূপরেখা দিয়ে এবং তারপর এলাকা গণনা করে মূল্যায়ন করা হয়েছিল। আমরা একটি আপেক্ষিক সেরিবেলাম-টু-ফোরব্রেইন অনুপাত তৈরি করতে সেরিবেলামের ফলাফলগুলিকে অগ্রভাগের আকার দ্বারা ভাগ করে সামগ্রিক মস্তিষ্কের আকারের সম্ভাব্য পার্থক্যের জন্য স্বাভাবিক করেছি। পরীক্ষার্থীরা প্রাণীটির জিনোটাইপের প্রতি অন্ধ ছিলেন। ইমিউনোহিস্টোকেমিস্ট্রি সংশ্লিষ্ট অধ্যয়নের শেষ পয়েন্টে (P45, 120,210,4{{7{{1{108}}4}}}}0), সমস্ত জিনোটাইপের পুরুষ এবং মহিলা ইঁদুর এই গবেষণায় উপস্থাপিত আইসোফ্লুরেন দিয়ে চেতনানাশক করা হয়েছিল এবং ফসফেট-বাফারযুক্ত স্যালাইনের সাথে ট্রান্সকার্ডিয়াল পারফিউশন করা হয়েছিল তারপরে 4 শতাংশ (ডব্লিউ/ভি) বাফারযুক্ত প্যারাফর্মালডিহাইড (পিএফএ) এবং তারপর মস্তিষ্ক নিষ্কাশনের জন্য ব্যবচ্ছেদ করা হয়েছিল। মাথার খুলি থেকে মস্তিষ্ক অপসারণের পরপরই পুরো মস্তিষ্কের ছবি তোলা হয় এবং মস্তিষ্ককে 24 ঘন্টার জন্য 4 শতাংশ পিএফএ-তে ডুবিয়ে রাখা হয় এবং তারপর 72-এর জন্য 0.05 শতাংশ অ্যাজাইড এবং 30 শতাংশ সুক্রোজ দিয়ে ট্রিস-বাফার স্যালাইনে (টিবিএস) ক্রায়োপ্রোটেক্ট করা হয়। ঘন্টা এবং পরবর্তী ব্যবহার না হওয়া পর্যন্ত 4 ডিগ্রীতে সংরক্ষণ করা হয়। সেরিবেলামকে ফোরব্রেন থেকে আলাদা করা হয়েছিল এবং একটি স্লাইডিং মাইক্রোটোম (মাইক্রোম এইচএম 430, থার্মো সায়েন্টিফিক）) ব্যবহার করে 40 μm পুরুত্বে বিভাগে সেট করা হয়েছিল। সেরিবেলাম বিভাগগুলি ছয়টির একটি সিরিজে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং পরবর্তী ব্যবহার না হওয়া পর্যন্ত TBS-AF (30 শতাংশ সুক্রোজ, 0.05 শতাংশ সোডিয়াম অ্যাজাইড, এবং 30 শতাংশ ইথিলিন গ্লাইকোল সহ TBS) 4 ডিগ্রি বা -20 ডিগ্রিতে সংরক্ষণ করা হয়েছিল। Purkinje নিউরনের ইমিউনোফ্লুরোসেন্ট ভিজ্যুয়ালাইজেশনের জন্য, উভয় Atm* এর সেরিবেলাম বিভাগ; Aptx*t এবং Atm?35×R35×; Aptx^(n=5 প্রতি জিনোটাইপ) টিবিএস-এ 5 মিনিটের জন্য তিনবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং তারপর 30 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় 15 শতাংশ স্বাভাবিক ছাগলের সিরামে ব্লক করা হয়েছিল এবং তারপরে খরগোশ বা মাউস অ্যান্টি-ক্যালবিন্ডিন ডি-এ ফ্রি-ফ্লোটিং ইনকিউবেশন -28k (1:1000) একটি অরবিটাল শেকারে ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য। তারপরে বিভাগগুলি টিবিএস দিয়ে তিনবার 5 মিনিটের জন্য ধুয়ে ফেলা হয়, তারপরে ছাগল-বিরোধী খরগোশ বা মাউস আলেক্সা ফ্লুর 488 (1:1000) একটি অরবিটাল শেকারে ঘরের তাপমাত্রায় 1 ঘন্টার জন্য ফ্রি-ফ্লোটিং ইনকিউবেশন করা হয়। সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি ইনকিউবেশনের পরে, বিভাগগুলি টিবিএস-এ 5 মিনিটের জন্য তিনবার ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল, তারপরে মাউন্ট করা হয়েছিল এবং DAPI-এর সাথে ফ্লুরোমাউন্ট-জি দিয়ে কভার-স্লিপ করা হয়েছিল। কিছু বিভাগের জন্য, অ্যান্টি-ক্লিভড ক্যাসপেস-3(1:200) এবং অ্যান্টি-CD68(1:400) অ্যান্টিবডিগুলি অতিরিক্তভাবে একটি আলেক্সা ফ্লুর 647 (1:500) সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে ক্যালবিন্ডিনের সাথে সমান্তরালভাবে পরীক্ষা করা হয়েছিল। ApoTome 2 (Carl Zeiss Microscopy, Axio Imager.M2) দ্বারা সজ্জিত একটি Zeiss মাইক্রোস্কোপে স্টেরিও ইনভেস্টিগেটর (MBF Bioscience, ver.2020) ব্যবহার করে স্লাইডগুলি স্ক্যান করা হয়েছে 2.5, 10,20,40, বা 63x উদ্দেশ্য, এবং চিত্র ব্যবহার করে। একটি Hamamatsu CMOS ক্যামেরা (Hamamatsu Photonics, ORCA Flash 4.0 LT plus) দিয়ে ধারণ করা হয়েছে। ফলাফলের চিত্রগুলিতে প্রতিটি লোবিউলে ক্যালবিন্ডিন-প্রতিক্রিয়াশীল কোষের সংখ্যা পরিমাপ করতে, আমরা 300 থেকে 500 μm লম্বার মধ্যে এলোমেলোভাবে 2 লাইন আঁকতে Stereo Investigator ব্যবহার করেছি। প্রতিটি লোবিউল এবং ম্যানুয়ালি 40x ম্যাগনিফিকেশনের অধীনে টিস্যু স্লাইসের 40 um বেধের মধ্যে দৈর্ঘ্য বরাবর PN-এর মোট সংখ্যা গণনা করে। 2D ঘনত্ব(PNs এর #/(রৈখিক দৈর্ঘ্য*40 um বেধ)) তখন প্রতি লোবিউলে দুটি নমুনা ছিল লোবিউল এবং প্রাণীদের মধ্যে আরও তুলনা করার জন্য গড়। ক্যালবিন্ডিন পজিটিভ পিএন ডেনড্রাইটের প্রস্থ 20x ম্যাগনিফিকেশনের অধীনে 25 বা 40 um পুরু টিস্যু বিভাগে প্রতিটি প্রাণী থেকে লোবুল VI-তে একটি পূর্বনির্ধারিত স্থানে পরিমাপ করা হয়েছিল। প্রাথমিক এবং মাধ্যমিক শাখাগুলির ডেনড্রাইটিক প্রস্থগুলি পিএন কোষের দেহ এবং আণবিক স্তরের প্রান্তের মধ্যরেখায় পরিমাপ করা হয়েছিল। প্রতি বিভাগে 7 থেকে 13টি ডেনড্রাইট পরিমাপ করা হয়েছিল, প্রতি প্রাণীর জন্য একটি বিভাগ। PN সোম্যাটিক পরিমাপের জন্য, স্টেরিও ইনভেস্টিগেটর 20x ম্যাগনিফিকেশনের অধীনে সমগ্র মিডিয়াল বিভাগে বিতরণ করা পিএনগুলি এলোমেলোভাবে নির্বাচন করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। প্রতি প্রাণীর গড় PN প্রস্থ 3টি সিরিয়াল বিভাগে (প্রতি বিভাগে 16 থেকে 37 PNs) জুড়ে গড় ফলাফলের দ্বারা নির্ধারিত হয়েছিল। PN প্রস্থগুলি PN স্তরের লম্বভাবে বা প্রস্থানকারী ডেনড্রাইটে কয়েক ডিগ্রির বেশি হলে তা পরিমাপ করা হয়েছিল। মলিকুলার লেয়ার এবং গ্রানুল সেল লেয়ার (যথাক্রমে ক্যালবিন্ডিন এবং ডিএপিআই দাগের সাথে ভিজ্যুয়ালাইজ করা হয়েছে) প্রতিটি লোবিউলের জন্য পূর্বনির্ধারিত স্থানে দুটি প্রস্থ পরিমাপের গড় করে স্টিরিও ইনভেস্টিগেটরে প্রস্থ মূল্যায়ন করা হয়েছিল, 2.5x CD68 এর অধীনে প্রতিটি লোবিউলের দীর্ঘ সীমার সাথে প্রায় অর্ধেক পথ। সেরিবেলার বিভাগে ইতিবাচকতা CD68 এর মোট শতাংশ এলাকা এবং পুরো মধ্যম সেরিবেলার অংশ জুড়ে ইতিবাচক দাগ পরিমাপ করে পরিমাপ করা হয়েছিল। 10x সেলাই করা ছবিগুলিকে নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণে থ্রেশহোল্ড করা হয়েছিল এবং ইমেজজে ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল, প্রতি প্রাণীর একটি বিভাগ। ক্যালবিন্ডিন-পজিটিভ PN-এর শতাংশের পরিমাণ নির্ণয় করতে যা ক্লিভড ক্যাসপেসের জন্য পজিটিভ ছিল-3 আমরা স্টেরিও ইনভেস্টিগেটর ব্যবহার করে পুরো সেরিবেলাম জুড়ে পিএন গণনা করেছি। পশু প্রতি তিন, 20x বিবর্ধন সেলাই করা ছবিগুলি পরীক্ষা করা হয়েছিল এবং ফলাফলগুলি গড় করা হয়েছিল। ক্যাসপেস-3 ইতিবাচকতার থ্রেশহোল্ড শুধুমাত্র সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি দিয়ে দাগযুক্ত নিয়ন্ত্রণ বিভাগ থেকে প্রতিষ্ঠিত হয়েছিল। নন-ফ্লুরোসেন্ট হিস্টোলজিক্যাল বিশ্লেষণের জন্য, 25-উম-মোটা, মুক্ত-ভাসমান টিস্যু বিভাগগুলিকে ইতিবাচক চার্জযুক্ত স্লাইডগুলিতে এবং রাতারাতি বাতাসে শুকানো হয়। টিস্যুটি ফসফেট-বাফারযুক্ত স্যালাইনে (পিবিএস) 5 মিনিটের জন্য দুবার ধোয়া হয়, তারপর ~25 সেকেন্ডের জন্য 95 শতাংশ ইথানলে 0.1 শতাংশ হেমাটোক্সিলিন এবং 3 সেকেন্ডের জন্য 95 শতাংশ ইথানলে 0.5 শতাংশ ইওসিন দিয়ে ক্রমাগতভাবে দাগ দেওয়া হয় এবং ডাবল-ডিলড জলে ধুয়ে ফেলা হয়। প্রতিটি দাগ। টিস্যু পরবর্তীতে 1 মিনিটের জন্য 95 শতাংশ ইথানল, 100 শতাংশ ইথানল এবং 100 শতাংশ জাইলিন ওয়াশের জন্য ডিহাইড্রেটেড হয়েছিল, তারপরে পারমাউন্ট দিয়ে ঢেকে দেওয়া হয়েছিল। একই জিস মাইক্রোস্কোপ এবং এমবিএফ অধিগ্রহণ সফ্টওয়্যারে একটি রঙিন ক্যামেরা (কিউ ইমেজিং, এমবিএফ বায়োসায়েন্সেস) ব্যবহার করে স্লাইডগুলি চিত্রিত করা হয়েছিল। পরীক্ষার্থীদেরকে মাউসের জিনোটাইপের জন্য অন্ধ করা হয়েছিল যেখানে বিভাগগুলি পরীক্ষা করা হয়েছিল এবং সমস্ত হিস্টোলজিকাল পরিমাপের জন্য পরীক্ষার ক্রমটি ইন্টারলিভ করা হয়েছিল।

4.7 প্রবাহ সাইটোমেট্রি পরিমাপ

নির্দিষ্ট অ্যান্টি-মাউস অ্যান্টিবডি∶CD4, CD8, CD3, CD44, এবং CD25 দিয়ে দাগ দিয়ে রক্ত ​​এবং থাইমাস কোষের প্রবাহ সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, সম্পূর্ণ রক্তের নমুনাগুলি (50 μ) ফ্লুরোসেন্ট-লেবেলযুক্ত অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে দাগযুক্ত করা হয়েছিল, তারপরে লাল রক্তকণিকাগুলিকে BD লাইসিং দ্রবণ ব্যবহার করে লাইস করা হয়েছিল যখন জীবন্ত সাদা রক্ত ​​​​কোষগুলি একটি কার্যকরতা দাগ ব্যবহার করে দাগ দেওয়া হয়েছিল। Thymi যান্ত্রিকভাবে বিচ্ছিন্ন ছিল. 1 থেকে 2 মিলিয়ন থাইমাস কোষ একইভাবে CD4, CD8, CD44, এবং CD25-এর জন্য নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে দাগযুক্ত ছিল। ইমিউনো-দাগযুক্ত শ্বেত রক্তকণিকা বা থাইমাস নমুনাগুলির বিশ্লেষণ FACS ARIA l ব্যবহার করে করা হয়েছিল এবং পূর্বে রিপোর্ট করা হিসাবে FlowJo সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে ডেটা বিশ্লেষণ করা হয়েছিল (Sanghez et al. 2017)।

4.8 পশ্চিমী বায়োটস

প্রোটিন নির্যাস (কোষ/টিস্যু) রেডিওইমিউনোপ্রেসিপিটেশন অ্যাসে (RIPA) লাইসিস বাফার (150 mM NaCl, 1 শতাংশ ননাইডেট পি-40 [NP-40],0তে একজাত করা হয়েছিল .5 শতাংশ ডিঅক্সিকোলেট,0.1 শতাংশ এসডিএস, 50 মিমি ট্রিস, পিএইচ 8.0) প্রোটিজ ইনহিবিটর সহ (10 ug/ml AEBSF, 10 ug/ml leupeptin, 5 ug/ml পেপস্ট্যাটিন, 5 ug/ml কাইমোট্রিপসিন, 10ug/ml aprotinin)। প্রোটিন নির্যাস sonicated এবং তারপর 4C এ 15 মিনিটের জন্য 13,000 rpm এ সেন্ট্রিফিউগেশন দ্বারা pelleted ছিল। বিসিএ প্রোটিন অ্যাস প্রোটিনের ঘনত্বের পরিমাণ নির্ধারণ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। প্রতি লেনে 50 থেকে 100 ug সমান পরিমাণ প্রোটিন সমন্বিত নমুনাগুলিকে 4 থেকে 12 শতাংশ গ্রেডিয়েন্ট TGX প্রিকাস্ট জেল বায়োর্যাড ব্যবহার করে আলাদা করা হয়েছিল তারপর ট্রান্সব্লট সেমি-ড্রাই বায়োর্যাড সিস্টেমে নাইট্রোসেলুলোজ ট্রান্সফার প্যাক ব্যবহার করে স্থানান্তর করা হয়েছিল। স্থানান্তরিত ব্লটগুলিকে সমান প্রোটিন লোড করার জন্য Ponceau S স্টেইন দ্বারা দাগ দেওয়া হয়েছিল তারপর ঘরের তাপমাত্রায় 60 মিনিটের জন্য TBST-এ 5 শতাংশ ননফ্যাট শুষ্ক দুধ দিয়ে ধুয়ে এবং ব্লক করা হয়েছিল। প্রাথমিক অ্যান্টিবডিগুলি 4 ডিগ্রীতে রাতারাতি কাঁপতে থাকে। নিম্নলিখিত অ্যান্টিবডিগুলির জন্য ব্লটগুলি পরীক্ষা করা হয়েছিল: ATM (D2E2) খরগোশ mAb সেল সিগন্যালিং, 1:1000 dilution এ, -Actin (D6A8) খরগোশ mAb সেল সিগন্যালিং, GAPDH (D16H11) খরগোশ mAb সেল সিগন্যালিং এর পরে উপযুক্ত হর্সসেরা (personoxid) HRP) সেকেন্ডারি অ্যান্টি-রবিট, অ্যান্টি-মাউস ঘরের তাপমাত্রায় 2 ঘন্টার জন্য। TBST এর সাথে একাধিক ধোয়ার পরে, Azure c400 এবং BioRad ChemiDoc ইমেজিং সিস্টেম ব্যবহার করে Radiance Plus chemiluminescence substrate দ্বারা প্রোটিন এক্সপ্রেশন সনাক্ত করা হয়েছিল। ইমেজজে ব্যবহার করে এটিএমের ঘনত্বের বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। নির্দেশিত হিসাবে 2টি প্রযুক্তিগত এবং 2-3টি জৈবিক প্রতিলিপি দিয়ে পরীক্ষা করা হয়েছিল৷

4.9 পরিসংখ্যানগত মূল্যায়ন

প্রতিটি গোষ্ঠীর জন্য নির্বাচিত প্রাণীর সংখ্যা 0.5 এর আকার, 0.8 এর শক্তি এবং প্রাথমিক ডেটা থেকে আনুমানিক প্রভাবের আকারের উপর ভিত্তি করে GPPower v3.1 ব্যবহার করে একটি অগ্রাধিকার শক্তি বিশ্লেষণের উপর ভিত্তি করে ছিল বা পূর্বের অধ্যয়ন। আমরা উভয় প্যারামেট্রিক (1-এবং 2-ওয়ে ANOVA) ব্যবহার করেছি সাধারণভাবে বিতরণ করা এবং নন-প্যারামেট্রিক (ক্রুস্কাল ওয়ালেস) পরিসংখ্যান পদ্ধতির জন্য ব্যবধান ডেটার জন্য গোষ্ঠীর মধ্যে পার্থক্য পরীক্ষা করার জন্য এবং পরবর্তীতে যুগ্মভাবে একাধিক তুলনা পরীক্ষা দ্বারা নির্দেশিত হিসাবে পাঠ্য ডুমুর মধ্যে ইমিউন তথ্য জন্য outliers. 6 এবং 7 ROUT পদ্ধতির মাধ্যমে বাদ দেওয়া হয়েছিল (Q=2 শতাংশ)। প্রতিটি ডেটা সেটের জন্য ব্যবহৃত নির্দিষ্ট বিশ্লেষণগুলি প্রতিটি চিত্রের কিংবদন্তিতে উল্লেখ করা হয়েছে৷ সমস্ত পরিসংখ্যানের জন্য: ns তাৎপর্যপূর্ণ নয়, *p এর থেকে কম বা সমান 0.05,** p<0.01,***><0.001,****><0.0001. data="" are="" reported="" as="" mean="" ±="" sem="" and="" box="" and="" whisker="" plots="" indicate="" the="" minimum,="" first="" quartile,="" median,="" third="" quartile,="" and="" maximum="" data="" values.="" all="" figures="" and="" statistical="" analyses="" were="" completed="" using="" excel="" (microsoft="" 360)="" or="" prism="" v8="" and="" 9="">