কভারস্লিপ প্লেসমেন্ট দ্বারা সিমুলেটেড হাইপোপারফিউশন সহ কালচারড রেনাল টিউবুলার কোষে হাইপোক্সিয়া-ইনডিউসিবল ফ্যাক্টর-1 এর একটি স্বতন্ত্র বিতরণ

যোগাযোগ: অড্রে হু হোয়াটসঅ্যাপ/এইচপি: 0086 13880143964 ইমেল:audrey.hu@wecistanche.com

বিমূর্ত

রেনাল টিউবুলোইন্টারস্টিটিয়ামে দীর্ঘস্থায়ী হাইপোক্সিয়া দীর্ঘস্থায়ী হওয়ার অগ্রগতিতে মূল ভূমিকা পালন করেকিডনিরোগ(CKD)। তাই হাইপোক্সিয়ার প্রতিক্রিয়ায় টিউবুলার হাইপোক্সিয়া এবং হাইপোক্সিয়া-ইন্ডুসিবল ফ্যাক্টর (HIF)-1 এর কার্যকলাপের তদন্ত করা গুরুত্বপূর্ণ। পেরিটুবুলার কৈশিকের বিরলতা CKD-তে হাইপোপারফিউশন ঘটায়; যাইহোক, এইচআইএফ-এর উপর হাইপারফিউশনের প্রভাব খুব কমই তদন্ত করা হয়েছে। আমরা মানুষের মধ্যে কভারস্লিপ বসানোর কারণে হাইপোপারফিউশন প্ররোচিত করেছিকিডনি-2 কোষ এবং কভারস্লিপের নীচে একটি অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্ট পর্যবেক্ষণ করেছে৷ এইচআইএফ-1-এর ইমিউনোসাইটোকেমিস্ট্রি একটি পিমোনিডাজল-পজিটিভ এলাকার প্রান্তে একটি ডোনাট-আকৃতির গঠন দেখিয়েছে, যাকে আমরা "এইচআইএফ-রিং" নাম দিয়েছি। এইচআইএফ-রিং এর অক্সিজেন টান আনুমানিক 4 mmHg এবং 20 mmHg এর মধ্যে অনুমান করা হয়েছিল। এই ফলাফলটি অতীতের গবেষণার সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ ছিল না যা সমজাতীয় অক্সিজেন টান সহ অ্যানোক্সিক পরিসরে HIF-1 জমা দেখায়। আমরা আরও একটি কভারস্লিপের নীচে পিএইচ গ্রেডিয়েন্টের উপস্থিতি পর্যবেক্ষণ করেছি, সেইসাথে সংস্কৃতি মাধ্যমের pH পরিবর্তনের কারণে এইচআইএফ রিংটির একটি স্থানান্তর, পরামর্শ দিয়েছি যে এইচআইএফ -1 সম্পর্কিত দমন দ্বারা এইচআইএফ রিং গঠিত হয়েছিল। কম পিএইচ পর্যন্ত। এই গবেষণাটি দেখিয়েছে যে এইচআইএফ{10}} সক্রিয়করণ হাইপোপারফিউশন সহ সংস্কৃত কোষে শারীরবৃত্তীয় অবস্থার অনুকরণ করে।

কীওয়ার্ডহাইপারফিউশন, হাইপোক্সিয়া, হাইপোক্সিয়া-ইনডিউসিবল ফ্যাক্টর, অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্ট, পিএইচ

to relieve choric kidney disease

Cistanche herbaকিডনি রোগ প্রতিরোধ করে, নমুনা পেতে এখানে ক্লিক করুন

1|ভূমিকা

ক্রনিক এর ঘটনাকিডনিরোগ(CKD) সমাজের বয়স হিসাবে বিশ্বজুড়ে বাড়ছে (Tonelli & Riella, 2014)। CKD এর অগ্রগতি অপরিবর্তনীয় হয় একবার কিডনির ক্ষতি একটি নির্দিষ্ট মাত্রায় পৌঁছায় এবং অবশেষে শেষ পর্যায়ে রেনাল ডিজিজ (ESRD) হয়, অন্তর্নিহিত রোগ নির্বিশেষে। এই ফলাফল একটি "চূড়ান্ত সাধারণ পথ" এর অস্তিত্ব নির্দেশ করে। অতীতের প্যাথলজিকাল বিশ্লেষণ অনুসারে, রেনাল ফাংশন হ্রাস গ্লোমেরুলার ক্ষতির চেয়ে টিউবুলোইন্টারস্টিশিয়াল ক্ষতির সাথে আরও দৃঢ়ভাবে সম্পর্কিত। বেশ কিছু রিপোর্ট দেখা গেছে যে রেনাল ফাইব্রোসিস টিউবুলোইন্টারস্টিশিয়ামে দীর্ঘস্থায়ী হাইপোক্সিয়াকে প্ররোচিত করে এবং এই টিউবুলোইন্টারস্টিশিয়াল হাইপোক্সিয়া CKD বাড়িয়ে তোলে এবং ESRD-এর দিকে নিয়ে যায়। এই প্রমাণ ইঙ্গিত করে যে টিউবুলোইনটার্স্টিশিয়াল হাইপোক্সিয়া CKD এর চূড়ান্ত সাধারণ পথের একটি ভূমিকা পালন করে (মিমুরা এবং নাঙ্গাকু, 2010; নাঙ্গাকু, 2006)। দ্যকিডনিহাইপোক্সিয়ার জন্য অত্যন্ত সংবেদনশীল কারণ এটির অক্সিজেনের উচ্চ চাহিদা, এবং অভ্যন্তরীণ ধমনী এবং শিরাগুলির মধ্যে একটি অক্সিজেন শান্টের অস্তিত্ব (নাঙ্গাকু, 2006; ওয়েলচ এট আল।, 2001; ঝাং এট আল।, 2014)। অতএব, আমরা বিবেচনা করি যে হাইপোক্সিয়া এবং রেনাল টিউবুলোইনটারস্টিটিয়ামে হাইপোক্সিয়ার প্রতিক্রিয়া তদন্ত করা অপরিহার্য।

জীবন্ত প্রাণীতে হাইপোক্সিয়ার প্রাথমিক জৈবিক প্রতিক্রিয়া হাইপোক্সিয়া-ইনডিউসিবল ফ্যাক্টর (এইচআইএফ) পথের মাধ্যমে ঘটে (হাইপক্সিয়া, 2011; সেমেনজা এবং ওয়াং, 1992; ঝোউ এট আল।, 2003)। HIF - এবং -সাবুনিট নিয়ে গঠিত। যদিও -সাবুনিট গঠনগতভাবে সক্রিয়, তবে অক্সিজেনের উপস্থিতিতে -সাবুনিট ক্ষয়প্রাপ্ত হয়। নরমোক্সিক অবস্থার অধীনে, এইচআইএফ- প্রোলাইল হাইড্রোক্সিলেস ডোমেন (পিএইচডি) দ্বারা হাইড্রোক্সিলেটেড হয়, এটি ভন হিপেল-লিন্ডাউ টিউমার সাপ্রেসর (ভিএইচএল) দ্বারা স্বীকৃত হয়। এই স্বীকৃতির ফলে প্রোটিসোমে হাইড্রোক্সিলেটেড এইচআইএফ-এর সর্বব্যাপীতা এবং অবক্ষয় ঘটে। হাইপোক্সিক অবস্থার অধীনে, এইচআইএফ- সাইটোসোলে জমা হয়, কারণ নন-হাইড্রোক্সিলেটেড এইচআইএফ- অবক্ষয় থেকে রক্ষা পায়। জমে থাকা HIF- সাইটোসোল থেকে নিউক্লিয়াসে স্থানান্তরিত হয়, যেখানে এটি HIF- এর সাথে ডাইমারাইজ করে এবং একটি ট্রান্সক্রিপশনাল ফ্যাক্টর হিসাবে কাজ করে, ডাউনস্ট্রিম জিনের প্রকাশকে প্রচার করে। HIF- সাবুনিটের তিনটি চিহ্নিত আইসোফর্মের মধ্যে- HIF-1, HIF-2, এবং HIF-3 —রেনাল টিউবুলার এপিথেলিয়াল কোষগুলি HIF প্রকাশ করতে পরিচিত হয়-1 (টানাকা এট আল ., 2016)। পূর্ববর্তী গবেষণায় এইচআইএফ এর ক্ষণস্থায়ী বা আঞ্চলিক সঞ্চয় দেখানো হয়েছেকিডনিCKD এর সাথে (Goldfarb et al., 2006; Yu et al., 2012), এবং এই HIF CKD পরিবেশে অক্সিজেন টেনশন কমে যাওয়ায় সক্রিয় হয়। CKD-তে হাইপোক্সিয়ার সাথে মানিয়ে নেওয়ার কারণগুলি HIF পথগুলিকে দমন করে এমন কারণগুলির উপস্থিতির কারণে হতে পারে (Asai et al., 2016; Tanaka et al., 2013; Thangarajah et al., 2009)। এইচআইএফ অ্যাক্টিভেশনের প্রতিরক্ষামূলক প্রভাবগুলি স্ট্রেপ্টোজোটোসিন-প্ররোচিত ডায়াবেটিক ইঁদুর এবং 5/6 তম নেফ্রেক্টমি ইঁদুর সহ বেশ কয়েকটি প্রাণী মডেলে রিপোর্ট করা হয়েছে (ডেং এট আল।, 2010; নর্ডকুইস্ট এট আল।, 2015)। পিএইচ.ডি. CKD (আকিজাওয়া এট আল।, 2019; চেন এট আল।, 2017, 2019; কোয়েন এট আল।, 2017; মিয়াটা এট আল।, 2011; পের্গোলা আল। ., 2016; প্রোভেনজানো এট আল।, 2016)। যাইহোক, রেনাল হাইপোক্সিয়ার অগ্রগতির বিশদ বিবরণ এবং যেভাবে HIF জমা হয়কিডনিCKD সহ, অস্পষ্ট থাকুন। এইচআইএফ-এর অক্সিজেন-নির্ভর হাইড্রোক্সিলেশন সাইটোসোলে ঘটে এবং তাই আন্তঃকোষীয় এবং বহির্মুখী অক্সিজেন টান পরিমাপ করা গুরুত্বপূর্ণ। অক্সিজেনের উত্তেজনা পরিমাপের জন্য বিভিন্ন পদ্ধতি ব্যবহার করা হয়, যার মধ্যে রয়েছে মাইক্রোইলেকট্রোড বা রক্তের অক্সিজেন স্তর-নির্ভর চৌম্বকীয় অনুরণন ইমেজিং (BOLD-MRI) ব্যবহার। আমরা আন্তঃকোষীয় অক্সিজেন অবস্থার পরিমাণগত পরিমাপের জন্য ফসফোরেসেন্স লাইফটাইম ইমেজিং মাইক্রোস্কোপি (পিএলআইএম) ব্যবহার করেছি (হিরাকাওয়া এট আল।, 2017; ইয়োশিহারা এট আল।, 2015)। BTPDM1 হল ইরিডিয়াম (III) কমপ্লেক্স BTP, (bp)2Ir(acc) (bp=বেনজোয়েট-পাইরিডিন, aac=অ্যাসিটিলাসেটোন) এর উপর ভিত্তি করে একটি ফসফরেসেন্ট রঞ্জক যার ক্যাটানিক ডাইমেথাইলামিনো গ্রুপ, যা নিষ্ক্রিয়ভাবে অন্তঃকোষীয় লাইসোসোমে বিতরণ করা হয়। এটি অন্তঃকোষীয় অক্সিজেন চাপ পরিমাপ করার জন্য একটি ফসফো-সাম্প্রতিক অনুসন্ধান হিসাবে সংশ্লেষিত হয়েছিল (য়োশিহারা এট আল।, 2015)। BTPDM1 সহ PLIM সাধারণ ইঁদুরের রেনাল পৃষ্ঠের রেনাল টিউবুলার কোষে অক্সিজেনের আংশিক চাপের উচ্চ-রেজোলিউশন চিত্রগুলি অর্জন করতে সক্ষম করে, এমনকি সাধারণ কিডনিতেও অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্টের উপস্থিতি নির্দেশ করে এমন ডেটা সরবরাহ করে (হিরাকাওয়া এট আল।, 2018) )

জীবন্ত অঙ্গে অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্ট রয়েছে, সহকিডনি, এমনকি সাধারণ অবস্থার মধ্যেও (হিরাকাওয়া এট আল।, 2018; কিটজম্যান, 2017; ঝডানোভ এট আল।, 2015), এবং এই ধরনের গ্রেডিয়েন্টগুলি CKD-তেও আশা করা যেতে পারে। হাইপোপারফিউশন CKD-তে মাইক্রোভাসকুলেচারের বিরলতার কারণে ঘটে, যেখানে প্রগতিশীল গ্লোমেরুলার আঘাতের ফলে পেরিটুবুলার কৈশিক রক্ত প্রবাহ হ্রাস পায়, যা আন্তঃস্থায়ী ফাইব্রোসিসকে বাড়িয়ে তোলে। ইন্টারস্টিশিয়াল ফাইব্রোসিস টিউবুলার কোষে অক্সিজেনের প্রসারণ এবং সরবরাহকে বাধাগ্রস্ত করে এবং মাইক্রোভাস্কুলেচারের বিরলতার দিকে পরিচালিত করে, টিউবুলোইনটারস্টিশিয়াল হাইপোক্সিয়াকে আরও বাড়িয়ে তোলে (মিমুরা এবং নাঙ্গাকু, 2010; নাঙ্গাকু, 2006)। হাইপোপারফিউশনের জৈবিক প্রভাব অবশ্য অস্পষ্ট থেকে যায়, কারণ বেশিরভাগ গবেষণায় সমজাতীয় পারফিউশন এবং অক্সিজেন টেনশনের অবস্থার অধীনে হাইপোক্সিয়া এবং এইচআইএফ-1-এর প্রভাবের তদন্ত করা হয়েছে (রেক্সিয়াস-হল এট আল।, 2017)। পূর্ববর্তী গবেষণায় প্রমাণিত হয়েছে যে একটি কভারস্লিপ দিয়ে আচ্ছাদিত মনোলয়ার্ড কালচারড কোষগুলি সংস্কৃতি মাধ্যমের প্রসারণে বাধা দ্বারা প্ররোচিত হাইপোপারফিউশনের একটি ভাল মডেল সরবরাহ করে। মডেল করা হাইপোপারফিউশন একটি অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্টের সাথে যুক্ত কারণ একটি কভারস্লিপ মাধ্যমের উপরের অংশ থেকে কোষে অক্সিজেন ছড়াতে বাধা দেয় (Pitts & Toombs, 2004; Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015)। একটি কভারস্লিপ দিয়ে আচ্ছাদিত কালচারড কোষের মনোলেয়ারে, আন্তঃকোষীয় অক্সিজেন টান কভারস্লিপের প্রান্ত থেকে দূরত্বের সাথে কমে যায় কারণ সংস্কৃত কোষে সীমিত অক্সিজেন ছড়িয়ে পড়ে। ফলস্বরূপ, কভারস্লিপের প্রান্ত থেকে কেন্দ্রে একটি অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্ট তৈরি হয় এবং আন্তঃকোষীয় অক্সিজেন টান কভারস্লিপের কেন্দ্রে একটি অ্যানোক্সিক পরিসরে নেমে যেতে পারে (তাকাহাশি এবং সাটো, 2010; ইয়োশিহারা এট আল।, 2015) . বর্তমান গবেষণায়, আমরা এইচআইএফ অ্যাক্টিভেশনের উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করেছি এবং একটি অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্ট সহ হাইপারফিউশনের উপস্থিতিতে এইচআইএফ- অভিব্যক্তিতে অক্সিজেন-স্বাধীন পরিবর্তন আছে কিনা তা তদন্ত করেছি। যেহেতু ভিভোর রেনাল টিউবুলে একটি অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্ট সহ হাইপোপারফিউশন বিদ্যমান, তাই কভারস্লিপ মডেলে এইচআইএফ- এক্সপ্রেশনের উপর অক্সিজেন-স্বাধীন প্রভাবের পর্যবেক্ষণ CKD-তে এইচআইএফ-সঞ্চয়ের অন্তর্নিহিত অপ্রতুলতার প্রক্রিয়া সম্পর্কে অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করতে পারে।

acteoside in cistanche have good effcts to antioxidant

cistanche নির্যাসকিডনির জন্য

2|উপকরণ এবং পদ্ধতিসমূহ

2.1|সেল সংস্কৃতি

সভ্য কোষগুলিকে 5 শতাংশ CO2 সহ একটি আর্দ্রতাযুক্ত ইনকিউবেটরে ইনকিউবেট করা হয়েছিল। হাইপোক্সিক ইনকিউবেশন একটি ব্যক্তিগত CO2/মাল্টি-গ্যাস ইনকিউবেটর APM-30D (Astec) এ সম্পাদিত হয়েছিল। অ্যানোক্সিয়া একটি অ্যানোক্সিয়া ব্যাগ, অ্যানেরোপ্যাক এবং অ্যানেরোবিক চাষের সেট #A-13 (মিতসুবিশি গ্যাস কেমিক্যাল) দিয়ে প্ররোচিত হয়েছিল।

HK-2 কোষ (Homo sapiens, humanকিডনি, পুরুষ, CRL- 2190, ATCC, RRID: CVCL_0302), স্বাভাবিক প্রাপ্তবয়স্ক মানুষের কিডনি থেকে একটি অমর প্রক্সিমাল টিউবুল এপিথেলিয়াল সেল লাইন, ডালবেকোর পরিবর্তিত ঈগলের মাঝারি/পুষ্টি মিশ্রণ F{{2} } হ্যাম (DMEM/F12) (D8062, সিগমা অ্যালড্রিচ) 10 সেমি কালচারে 10 শতাংশ ভ্রূণ বোভাইন সিরাম (FBS) (F7524, সিগমা অ্যালড্রিচ), এবং পেনিসিলিন-স্ট্রেপ্টোমাইসিন দ্রবণ (15070063, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) রয়েছে৷ উত্তরণের জন্য, HK-2 কোষগুলিকে ট্রিপসিন (204-16935, ওয়াকো পিওর কেমিক্যাল ইন্ডাস্ট্রিজ, লিমিটেড) দিয়ে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং 5 মিনিটের জন্য 300 গ্রাম সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল৷

HeLa সার্ভিকাল ক্যান্সার কোষ এবং মানব ভ্রূণকিডনিকোষ 293 (HEK293) DMEM-এ কম (1000 mg/L) গ্লুকোজ (D6046, Sigma Aldrich) সহ একটি 10 সেমি কালচার ডিশে 5 শতাংশ FBS ধারণ করে সংস্কৃতি করা হয়েছিল। এই কোষগুলি HK-2 কোষ হিসাবে পাস করা হয়েছিল।

রেনাল প্রক্সিমাল টিউবুল এপিথেলিয়াল সেল (RPTECs) (CC- 2553, Cambrex) RenaLifeTM Comp kits (LRC-LL0025, Lonza Ltd.) ব্যবহার করে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল। উত্তরণের জন্য, RPTEC গুলিকে ট্রিপসিন ব্যবহার করে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল, ট্রিপসিন নিউট্রালাইজিং সলিউশন (CC-5002, Lonza Ltd.) দিয়ে নিরপেক্ষ করা হয়েছিল এবং 5 মিনিটের জন্য 200 গ্রাম সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল।

2.2|একটি কভারস্লিপ বসানো দ্বারা একটি হাইপোপারফিউশন মডেল স্থাপন

15 মিমি ব্যাসের গোলাকার আকৃতির কভারস্লিপ (C015001, মাতসুনামি) আল্ট্রাসাউন্ড ব্যবহার করে পরিষ্কার করা হয়েছিল এবং ব্যবহারের আগে 99.5 শতাংশ ইথানলে সংরক্ষণ করা হয়েছিল। কভারস্লিপের বাইরে কোষগুলির পর্যবেক্ষণের ভিত্তিতে দুটি পদ্ধতি নিযুক্ত করা হয়েছিল।

মনোলয়ার্ড কালচারড সেলগুলি একটি কভারস্লিপ এবং একটি থালার নীচের মধ্যে স্যান্ডউইচ করা হয়েছিল (চিত্র S1a,b), বা একটি বিকল্প পদ্ধতি (চিত্র S1c), যা নীচে বর্ণিত হয়েছে। অক্সিজেন ইমেজিং বা PH ইমেজিং হোক না কেন লাইভ ইমেজিংয়ের জন্য আমাদের কভারস্লিপ মডেল প্রতিষ্ঠা করতে হয় ঐতিহ্যগত বা বিকল্প পদ্ধতি নির্বাচন করা হয়েছিল। ইমিউনোসাইটোকেমিস্ট্রি (আইসিসি) এর জন্য, বিকল্প পদ্ধতিটি বেছে নেওয়া হয়েছিল, কারণ ঐতিহ্যগত পদ্ধতি ব্যবহার করার সময়, সেল ফিক্সেশনের জন্য কভারস্লিপ অপসারণের সময় বেশিরভাগ কোষ ঘন ঘন ডিশের নীচে থেকে বিচ্ছিন্ন হয়ে যায় (চিত্র S2a)।

2.2.1|প্রথাগত পদ্ধতি

প্রথম দিনে, 100 শতাংশ * (প্রায় 5.0 × 105/ডিশ) এর সঙ্গমে 27 মিমি গ্লাস-ভিত্তিক ডিশের (3910-035, ইওয়াকি) নীচে সেলগুলি স্থাপন করা হয়েছিল। রাতারাতি অ্যান্টিবায়োটিক দ্রবণ ছাড়াই 10 শতাংশ FBS ধারণকারী DMEM/F12-এ তাদের সংস্কৃতি করা হয়েছিল। 2 য় দিনে, নির্দেশিত সময়ের জন্য একটি কভারস্লিপ সংস্কৃত কোষের উপরে স্থাপন করা হয়েছিল (চিত্র S1b)।

2.2.2|বিকল্প পদ্ধতি

দিনে 100 শতাংশ সঙ্গমে (প্রায় 5.0 × 105/থালা) একটি 35 মিমি-কালচার ডিশের কভারস্লিপে কোষগুলি বীজ করা হয়েছিল।

1. তারা রাতারাতি অ্যান্টিবায়োটিক দ্রবণ ছাড়াই 10 শতাংশ FBS ধারণকারী DMEM/F12-এ সংষ্কৃত হয়েছে। ২য় দিনে, কভার-স্লিপটি উল্টানো হয়েছিল, একটি নির্দিষ্ট সময়ের জন্য (চিত্র S1c) একটি নতুন 27 মিমি গ্লাস-ভিত্তিক ডিশের নীচে এর কোষগুলির পৃষ্ঠকে সংযুক্ত করতে।

এছাড়াও আমরা 10 মিমি (CS01005, মাতসুনামি) (চিত্র S2b) ব্যাস সহ বৃত্তাকার আকৃতির কভারস্লিপ ব্যবহার করে একটি কভারস্লিপ মডেল তৈরি করেছি।

2.3|BTPDM1 সহ লাইভ অক্সিজেন ইমেজিং

উপরে বর্ণিত হিসাবে, সংষ্কৃত কোষগুলি 1 দিনে প্রস্তুত করা হয়েছিল। ২য় দিনে, কোষগুলিকে হ্যাঙ্কসের ব্যালেন্সড সল্ট দ্রবণ (HBSS) (H8264, সিগমা অ্যালড্রিচ) দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল এবং 500 nM BTPDM1 দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল, একটি ইরিডিয়াম-ভিত্তিক ক্যাট্যানিক লিপোফিলিক রঞ্জক যা একটি অন্তঃকোষীয় ফসফরেসেন্ট প্রোবেটওয়াই (আল-সেলুলার) হিসাবে ব্যবহৃত হয়। 2015), DMEM/F12 এ ফেনল রেড ছাড়া (21041-025, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) 30 মিনিটের জন্য। এইচবিএসএস দিয়ে কোষগুলি দুবার ধোয়ার পরে, উপরে বর্ণিত হিসাবে সেগুলি একটি কভারস্লিপ এবং একটি থালার নীচের মধ্যে স্যান্ডউইচ করা হয়েছিল। একটি কভারস্লিপ দিয়ে আচ্ছাদিত সংস্কৃতিযুক্ত কোষগুলিতে BTPDM1 থেকে ফসফোরেসেন্সের তীব্রতা একটি উত্তেজনা এবং নির্গমন ফিল্টার ব্যবহার করে পর্যবেক্ষণ করা হয়েছিল এবং BTPDM1 ফসফোরেসেন্স (হিরাকাওয়া এট আল।, 2015) একটি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ, BZ-X710 (Keyence Corporation) ব্যবহার করে সনাক্ত করা হয়েছিল। উল্টানো ফ্লুরোসেন্ট মাইক্রোস্কোপ থেকে প্রাপ্ত চিত্রগুলি BZ-X বিশ্লেষণ সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে উজ্জ্বলতা এবং বৈসাদৃশ্যের জন্য সামঞ্জস্য করা হয়েছিল।

2.4|ইমিউনোসাইটোকেমিস্ট্রি

একটি কভারস্লিপের কোষগুলিকে DMEM/F12-এ 200 µM পিমোনিডাজল HCl (HP3-100, Hypoxyprobe, Inc.) দিয়ে 1 ঘন্টার জন্য ফেনল রেড ছাড়াই সংষ্কৃত করা হয়েছিল, তারপরে কভারস্লিপটিকে ঘুরিয়ে একটি কভার গ্লাস ডিশের সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল, যেমন পূর্বে বর্ণিত। তারপরে কোষগুলিকে একটি নির্দিষ্ট সময়ের জন্য ফেনল লাল ছাড়াই DMEM/F12 তে সংস্কৃতি করা হয়েছিল। যখন পিমোনিডাজল কাউন্টারস্টেইনিং ব্যবহার করা হয়নি, তখন পিমোনিডাজলের সাথে প্রিট্রিটমেন্ট বাদ দেওয়া হয়েছিল।

সংস্কৃতির সময়কাল শেষ হওয়ার পরে, প্রতিটি কভারস্লিপ সংগ্রহ করা হয়েছিল, এবং কোষগুলি অবিলম্বে বরফের উপর মিথানল/এসিটোন (1:1) দিয়ে স্থির করা হয়েছিল, যেখানে তারা 30 মিনিটের জন্য ছিল। Dulbecco এর ফসফেট-বাফারযুক্ত স্যালাইন (PBS) (D5652, Sigma Aldrich) দিয়ে দুবার ধোয়ার পর, কোষের ঝিল্লিটি 30 মিনিটের জন্য ভেদ করা হয়েছিল, 5 শতাংশ বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন (BSA) (A3059, সিগমা অ্যালড্রিচ এবং 30 মিনিটের জন্য) 10 মিনিটের জন্য সিরাম-মুক্ত প্রোটিন ব্লক (X0909, DAKO) সহ। কোষগুলিকে একটি প্রথম অ্যান্টিবডি এবং পরবর্তীতে দ্বিতীয়, ফ্লুরোসেন্ট অ্যান্টিবডি দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল। প্রথম অ্যান্টিবডিগুলির তালিকা সারণি S1 এ দেওয়া হয়েছে। FITC-সোয়াইন পলিক্লোনাল অ্যান্টি-র্যাবিট ইমিউনোগ্লোবুলিন (F0205, 1:20 dilution, DAKO) প্রথম অ্যান্টিবডি হিসাবে ব্যবহৃত হত যদি হোস্ট একটি খরগোশ হয়। ফ্লুরোসেন্ট অ্যান্টিবডি Alexa Fluor 594 streptavidin (S11227, 1:500 dilution, Thermo Fisher Scientific) প্রথম অ্যান্টিবডি হিসাবে ব্যবহার করা হত যদি হোস্ট একটি মাউস হয়, তারপরে বায়োটিনিলেটেড অ্যান্টি-মাউস IgG (H প্লাস L) (BA{{23}) }, 1:1000 dilution, Vector Laboratories), দ্বিতীয় অ্যান্টিবডি হিসাবে। প্রতিটি নমুনার জন্য বিসবেনজিমাইড এইচ 33342 ট্রাইহাইড্রোক্লোরাইড (বি 2261, সিগমা অ্যালড্রিচ) ব্যবহার করে পারমাণবিক স্টেনিং করা হয়েছিল।

নিম্নোক্ত ফিল্টার সহ একটি উল্টানো ফ্লুরোসেন্ট মাইক্রোস্কোপ, BZ-X710 (Keyence Corporation) ব্যবহার করে ফ্লুরোসেন্ট সংকেত পর্যবেক্ষণ করা হয়েছে: 560/40 nm এর উত্তেজনা তরঙ্গদৈর্ঘ্য (Ex) সহ টেক্সাস রেড, 630/75 nm (GFP) এর নির্গমন তরঙ্গদৈর্ঘ্য (Em) যেমন: 470/40 nm, Em: 525/50 nm), এবং DAPI (ex: 360/40 nm, Em: 460/50 nm)। BZ-X বিশ্লেষণ সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে উজ্জ্বলতা এবং বৈসাদৃশ্যের জন্য চিত্রগুলি সামঞ্জস্য করা হয়েছিল।

2.5|কোবাল্ট ক্লোরাইড দিয়ে চিকিত্সা করা HK-2 কোষের HIF-এর ICC

কোবাল্ট ক্লোরাইড দিয়ে চিকিত্সা করা HK-2 কোষের একটি কভারস্লিপ মডেল তৈরি করার জন্য বিকল্প পদ্ধতিটি পরিবর্তন করা হয়েছিল। HK-2 কোষগুলিকে 1 দিনে একটি কভারস্লিপে অর্ধ-সংলগ্ন ঘনত্বে (2.5 × 105/ডিশ) বীজ দেওয়া হয়েছিল এবং 16 ঘন্টার জন্য 300 μM কোবাল্ট ক্লোরাইড হেক্সাহাইড্রেট (C 8661, সিগমা অ্যালড্রিচ) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল দিন 2. দিন 3-তে, কভারস্লিপটি 3 ঘন্টার জন্য একটি নতুন 27 মিমি গ্লাস-ভিত্তিক ডিশের নীচে কোষের পৃষ্ঠগুলিকে সংযুক্ত করার জন্য উল্টানো হয়েছিল এবং HIF-এর ICC সঞ্চালিত হয়েছিল।

2.6|পশ্চিমা শোষক

বিভিন্ন অক্সিজেন টেনশনের অধীনে এবং বিভিন্ন pH স্তরে HIF{{0}} জমার তদন্ত করতে, 1.0 × 106 HK-2 কোষ প্রতি 10 সেমি কালচার ডিশ নরমোক্সিয়া, 2 শতাংশ অক্সিজেন, 1 শতাংশ অক্সিজেন, বা অ্যানোক্সিয়া, 5 ঘন্টার জন্য বা DMEM/F12-এ pH 7.4, pH 6.0, বা pH 5.0-এ 5 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল।

এই কোষগুলি RIPA বাফারে 50 মিলিমিটার ট্রিস-বাফার (pH 8৷{5}}), 150 mM NaCl, 0.5 w/v শতাংশ সোডিয়াম ধারণকারী ছিল deoxy-cholate, 0.1 w/v শতাংশ SDS, এবং 1.0 w/v শতাংশ NP40৷

ওয়েস্টার্ন ব্লটিং-এর জন্য, SDS নমুনা বাফার যাতে রয়েছে {{0}}.35 M Tris-HCl (pH 6.8), 10 শতাংশ SDS, 36 শতাংশ গ্লিসারল, 0.012 শতাংশ ব্রোমোফেনল ব্লু, এবং 0.1 M dithiothreitol (DTT) প্রোটিনে যোগ করা হয়েছিল। এসডিএস নমুনা বাফার ধারণকারী প্রোটিন 5 মিনিটের জন্য 95 ডিগ্রীতে ফুটিয়ে ফুটিয়ে তোলা হয়েছিল।

প্রোটিনগুলিকে 10 শতাংশ SDS পলিঅ্যাক্রিলামাইড জেলে ইলেক্ট্রোফোরেসিস দ্বারা পৃথক করা হয়েছিল। তারপর প্রোটিনগুলিকে একটি AmershamTM HybondTM PVDF মেমব্রেনে (10600023, GE Healthcare) ট্রান্স-ব্লট® ব্যবহার করে ট্রান্সফার বাফারে (48 মিমি ট্রিস-বেস বাফার, 39 মিমি গ্লাইসিন, 0.04 শতাংশ SDS, এবং 20 v/v শতাংশ মিথানল) স্থানান্তর করা হয়েছিল। TurboTM ট্রান্সফার সিস্টেম (বায়ো-র্যাড)। ঝিল্লিগুলি প্রাথমিক অ্যান্টিবডি, অ্যান্টি-এইচআইএফ1 অ্যান্টি-বডি (NB100-134, 1:500 ডিলিউশন, নোভাস বায়োলজিক্যালস, RRID: AB_350071), এবং অ্যান্টি-অ্যাক্টিন অ্যান্টিবডি (A2066) সহ ঘরের তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করা হয়েছিল , 1:2000 dilution, Sigma Aldrich, RRID: AB_476693), এবং পরবর্তীকালে সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডিতে, পলিক্লোনাল গোট অ্যান্টি-র্যাবিট ইমিউনোগ্লোবুলিন/HRP (P0448, 1:10000 dilution, DAKO, RRID: AB{{26} }})। পিয়ার্সটিএম ইসিএল প্লাস ওয়েস্টার্ন ব্লটিং সাবস্ট্রেট (32132, থার্মোফিশার সায়েন্টিফিক) সনাক্তকরণের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল। একটি লুমিনোইমেজ বিশ্লেষক ইমেজ কোয়ান্টলাস4000মিনি (জিই হেলথকেয়ার) ব্যবহার করে কেমিলুমিনেসেন্স পরিলক্ষিত হয়েছিল। কমপক্ষে তিনটি স্বাধীন পরীক্ষা-নিরীক্ষা করে প্রজননযোগ্যতা নিশ্চিত করা হয়েছিল। ন্যাশনাল ইনস্টিটিউট অফ হেলথ ইমেজজে সফ্টওয়্যার ব্যবহার করে ব্যান্ডগুলির তীব্রতা পরিমাপ করা হয়েছিল (Schneider et al., 2012)।

2.7|Luciferase রিপোর্টার অ্যাস

সমজাতীয় হাইপোক্সিক কালচার ইনকিউবেশনে HIF1 জমে পরিমাপ করার জন্য একটি লুসিফেরেস রিপোর্টার অ্যাস করা হয়েছিল। আমরা পূর্বে একটি হাইপোক্সিয়া-প্রতিক্রিয়াশীল উপাদান (HRE) দ্বারা চালিত একটি ট্যাগযুক্ত লুসিফেরেজ জিন তৈরি করেছি এবং হাইপোক্সিয়া-প্রতিক্রিয়াশীল রিপোর্টার ভেক্টর (ট্রান্সজিন নির্মাণ) তৈরি করেছি। এটি এম CMV-প্রমোটার-লুসিফেরেজ ট্রান্সক্রিপশন ইউনিট (প্রি-লুক) (চিয়াং এট আল।, 2011; তানাকা এবং আল।, 2004)।

কূপ প্রতি 1.0 × 105 ঘনত্বের HK{{0}} কোষগুলি 12-ওয়েল কালচার প্লেটে (150628, থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক) প্রস্তুত করা হয়েছিল। কোষগুলি 500 ng pGL3-বেসিক HRE-লুসিফেরেজ ভেক্টর এবং 30 ng pRL-SV40 রেনিলা লুসিফেরেজ কন্ট্রোল ভেক্টর (প্রোমেগা) দিয়ে সহ-স্থানান্তরিত হয়েছিল, 2 μl FuGENE® HD ট্রান্সফেকশন রিএজেন্ট (E2311, Promega) ব্যবহার করে আমরা হব. HK-2 কোষগুলি 500 ng ofpGL3- বেসিক ফায়ারফ্লাই লুসিফেরেজ ভেক্টর এবং 30 ng ofpRL-SV40 রেনিলা লুসিফেরেজ কন্ট্রোল ভেক্টর (প্রোমেগা) এর সাথে সহ-স্থানান্তরিত একটি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।

স্থানান্তরিত কোষগুলি নরমক্সিয়া, 2 শতাংশ হাইপোক্সিয়া, 1 শতাংশ হাইপোক্সিয়া, বা একটি অ্যানোক্সিয়া ব্যাগের অধীনে 5 ঘন্টার জন্য ইনকিউব করা হয়েছিল। দ্বৈত লুসিফেরেস অ্যাসের জন্য 100 μl প্যাসিভ প্রোটিন লাইসিস বাফার ব্যবহার করে কোষগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল। পরিমাপের জন্য একটি LB9507 লুমিনোমিটার (ইজি এবং বার্থহোল্ড) ব্যবহার করা হয়েছিল। স্থানান্তর দক্ষতার জন্য সংশোধন করার জন্য, ফায়ারফ্লাই লুসিফেরেজ লাইট ইউনিটের আপেক্ষিক মান রেনিলা লুসিফেরেজ দ্বারা ভাগ করা হয়েছিল।

cistanche for ed

ed এর জন্য cistanche

2.8|অ্যাপোপটোসিস বিশ্লেষণ

সভ্য কোষগুলিকে একটি কভারস্লিপ দিয়ে আচ্ছাদিত করা হয়েছিল 0 মিনিট, 15 মিনিট, 30 মিনিট, 1 ঘন্টা, 3 ঘন্টা, 6 ঘন্টা এবং 24 ঘন্টা, এবং তারপরে ট্রিপসিন ব্যবহার করে সংগ্রহ করা হয়েছিল। 30 মিনিটের জন্য 3 শতাংশ হাইড্রোজেন পারক্সাইড (081- 04215, ওয়াকো পিওর কেমিক্যাল ইন্ডাস্ট্রিজ, লিমিটেড) দিয়ে চিকিত্সা করা কোষগুলি একটি অ্যাপোপটোটিক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে প্রস্তুত করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে, একটি Muse™ সেল বিশ্লেষক (মিলিপুর) এ মিউজ অ্যানেক্সিন ভি এবং ডেড সেল কিটস (MCH100105, মিলিপুর) ব্যবহার করে অ্যাপোপটোসিসের পরিমাণগত বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।

2.9|পরিমাণগত রিয়েল-টাইম PCR (qRT-PCR)

মোট RNA নিষ্কাশন এবং cDNA সংশ্লেষণ যথাক্রমে RNAiso Plus (9109, Takara) এবং PrimeScript™ RT মাস্টার মিক্স (RR036B, পারফেক্ট রিয়েল টাইম) (টাকারা) এর জন্য প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে পরিচালিত হয়েছিল। সিএফএক্স কানেক্ট রিয়েল-টাইম পিসিআর ডিটেকশন সিস্টেমে (বায়ো-র্যাড) থান্ডারবার্ড সাইবিআর কিউপিসিআর মিক্স (কিউপিএস- 201, টয়োবো) ব্যবহার করে রিয়েল-টাইম পিসিআর করা হয়েছিল। ট্রান্সক্রিপ্ট স্তরগুলি -অ্যাক্টিন এমআরএনএ এক্সপ্রেশনের স্তরে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। জিন-নির্দিষ্ট প্রাইমার ব্যবহার করে কিউআরটি-পিসিআর ট্রিপলিকেটে সঞ্চালিত হয়েছিল। HIF-1 ফরওয়ার্ড, 5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3′ এবং বিপরীত, 5′-TGGGTAGGAGATGGGAGATGC-3′ প্রাইমার ব্যবহার করে প্রশস্ত করা হয়েছিল। -অ্যাক্টিন ফরওয়ার্ড, 5′-TCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3′, এবং বিপরীত 5′-AACTGGTCTCAAG TCAGTGTACAGG-3′ প্রাইমার ব্যবহার করে প্রশস্ত করা হয়েছিল।

2.10|siRNA দিয়ে ট্রান্সফেকশন

HK-2 কোষে RNAi-প্ররোচিত HIF-1 নকডাউন তদন্ত করার জন্য, 5৷{4}} × 104 HK-2 কোষ প্রতি কূপ ছয়-কূপ প্লেটে প্রস্তুত করা হয়েছিল। দুই ধরনের RNAi—HIF-1 siRNA (siHIF-1 #1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] এবং siHIF-1 #2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific])- Lipofectamine RNAiXMA এর সাথে ব্যবহার করা হয়েছিল ট্রান্সফেকশন রিএজেন্ট (থার্মো ফিশার সায়েন্টিফিক)। নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে, স্টিলথ RNAi™ siRNA নেগেটিভ কন্ট্রোল মেড জিসি ডুপ্লেক্স #3 (12935-113) ব্যবহার করা হয়েছিল; প্রতিটি siRNA এর 1.5 μl এবং 5 μl RNAiMAX মিশ্রিত করা হয়েছিল। siRNA- স্থানান্তরিত কোষগুলি 48 ঘন্টার জন্য নরমোক্সিক বা হাইপোক্সিক (1 শতাংশ O2) অবস্থার অধীনে ইনকিউব করা হয়েছিল এবং আরএনএ বের করা হয়েছিল। qRT-PCR ব্যবহার করে HIF-1 নকডাউনের কার্যকারিতা পরীক্ষা করা হয়েছিল৷

2.11|একটি PH গ্রেডিয়েন্টের প্রভাবের লাইভ ইমেজিং

আমরা একটি কভারস্লিপের অধীনে জীবন্ত কোষগুলির অন্তঃকোষীয় পিএইচ গ্রেডিয়েন্টটি কল্পনা করেছি। কভারস্লিপ মডেলটি বাস্তবায়নের আগে, প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে কোষগুলিকে pHrodo Green AM আন্তঃকোষীয় pH নির্দেশক (p35373, ThermoFisher Scientific) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল। একটি উল্টানো ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ, BZ-X710 (Keyence Corporation) একটি GFP ফিল্টার সহ একটি কভারস্লিপের নীচে ফ্লুরোসেন্স তীব্রতার গ্রেডিয়েন্টের সময় পরিবর্তন পর্যবেক্ষণ করতে ব্যবহৃত হয়েছিল।

2.12|HIF রিং এর পরিমাণগত বিশ্লেষণ

2.12.1|HIF রিং এর সাইট

আমরা ইমেজজে ব্যবহার করে কভারস্লিপ প্রান্ত থেকে এইচআইএফ রিং এবং পিমোনিডাজল-পজিটিভ এলাকার দূরত্ব পরিমাপ করেছি, নিম্নরূপ। এইচআইএফ রিং এবং পিমোনিডাজল-পজিটিভ বৃত্তের বাইরের এবং অভ্যন্তরীণ বৃত্তের ক্ষেত্রগুলি নির্ধারণ করা হয়েছিল এবং প্রতিটি বৃত্তের ব্যাসার্ধ গণনা করা হয়েছিল। প্রতিটি মান 7.5 মিমি থেকে বিয়োগ করা হয়েছে, যা একটি 15 মিমি কভারস্লিপের ব্যাসার্ধ, একটি কভারস্লিপ প্রান্ত থেকে এর দূরত্ব গণনা করতে। প্রতিটি অবস্থায় এইচআইএফ-এর আইসিসির তিনটি স্বাধীন পরীক্ষা করা হয়েছিল।

2.12.2|HIF রিং এর সংজ্ঞা

আমরা নরমোক্সিয়া এবং নিরপেক্ষ পিএইচ এর অধীনে ইনকিউবেট করা একটি কভারস্লিপ মডেল থেকে প্রাপ্ত ফ্লুরোসেন্ট চিত্রগুলি ব্যবহার করেছি। আমরা HIF রিং এর সাইট এবং এর বাইরে এবং ভিতরে 2.5–3 হিসাবে সংজ্ঞায়িত করেছি৷{3}} স্কেল (0.22–0.45 মিমি), 0.5 –1।{11}} স্কেল (1.12– 1.35 মিমি), এবং 5। আমরা নমুনা প্রতি HIF-1 সংকেতের পাঁচটি সাইট পরিমাপ করেছি এবং গড় গণনা করেছি। এইচআইএফের আইসিসির তিনটি স্বাধীন পরীক্ষা করা হয়েছিল।

cistanche extract powder

cistanche নির্যাস পাউডার

2.13|PLIM চিত্র দ্বারা অক্সিজেনের চাপ পরিমাপ

2.13.1|অক্সিজেন চাপ পরিমাপ করার জন্য একটি ক্রমাঙ্কন লাইন নির্মাণ

আমাদের পূর্ববর্তী প্রতিবেদনে বর্ণিত পদ্ধতির উপর ভিত্তি করে HK-2 কোষগুলির একটি ক্রমাঙ্কন বক্ররেখা তৈরি করা হয়েছিল (Yoshihara et al., 2015)৷ 30 মিনিটের জন্য 500 nM BTPDM1 দিয়ে লোড করা HK-2 কোষগুলিকে একটি অক্সিজেন-ঘনত্ব-পরিবর্তনযোগ্য মাল্টি-গ্যাস ইনকিউবেটরে একটি উল্টানো ফ্লুরোসেন্ট মাইক্রোস্কোপ দিয়ে সজ্জিত করা হয়েছিল যা আজীবন পরিমাপ ব্যবস্থার সাথে সংযুক্ত ছিল। স্টার্ন-ভলমার বিশ্লেষণের উপর ভিত্তি করে একটি ক্রমাঙ্কন লাইন তৈরি করা হয়েছিল HK{10}} কোষের ফসফরেসেন্স লাইফটাইম (PL) ব্যবহার করে বিভিন্ন অক্সিজেন টেনশনের অধীনে

সমীকরণ (1)

Construction of a calibration line to measure oxygen pressure

যেখানে τp pO2-এ PL-কে প্রতিনিধিত্ব করে, τ0 ডিঅক্সিজেনেশনে PL-কে প্রতিনিধিত্ব করে, kq নির্বাণ হার ধ্রুবক, এবং pO2 অক্সিজেনের আংশিক চাপকে প্রতিনিধিত্ব করে। এই ক্রমাঙ্কন লাইন ব্যবহার করে, অক্সিজেনের চাপ PL থেকে গণনা করা যেতে পারে।

2.13.2|একটি কভারস্লিপ মডেলের PLIM চিত্র

30 মিনিটের জন্য 500 nM BTPDM1 দিয়ে লোড করা HK-2 কোষগুলি প্রস্তুত করা হয়েছিল৷ একটি কভারস্লিপ মডেল একটি O2 ঘনত্ব-পরিবর্তনযোগ্য মাল্টি-গ্যাস ইনকিউবেটরে একটি উল্টানো ফ্লুরোসেন্ট মাইক্রোস্কোপ দিয়ে সজ্জিত, আজীবন পরিমাপ ব্যবস্থার সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল।

ফসফোরসেন্স লাইফটাইম ইমেজিং মাইক্রোস্কোপি (পিএলআইএম) চিত্রগুলি একটি কনফোকাল স্ক্যানিং সিস্টেম (হিরাকাওয়া এট আল।, 2018) দিয়ে সজ্জিত একটি উল্টানো ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করে রেকর্ড করা হয়েছিল। PLIM চিত্রগুলি 21 শতাংশ O2 বা 4 শতাংশ O2 তে 30 মিনিটের ইনকিউবেশনের পরে প্রাপ্ত হয়েছিল। কভারস্লিপ প্রান্তের কাছাকাছি উপরের, নীচে, বাম এবং ডান অঞ্চল থেকে নমুনা প্রতি চারটি PLIM চিত্র নেওয়া হয়েছিল, একটি কভারস্লিপে পিএল-এর বৈচিত্র বিবেচনা করে গড় PL নির্ধারণ করতে।

2.13.3|একটি PLIM ছবিতে HIF রিং সনাক্তকরণ

পিমোনিডাজল অক্সিজেনের চাপের 10 mmHg এর নিচে ইতিবাচক ছিল। ক্রমাঙ্কন লাইন অনুসারে 10 mmHg অক্সিজেনের চাপের PL সমতুল্য ছিল 4034.6 ns, তাই PLIM ছবিতে পিমোনিডাজল বৃত্তের বাইরের রেখা চিহ্নিত করা যেতে পারে। পরবর্তীকালে, PLIM চিত্রের বাইরের এবং ভিতরের HIF রিংগুলির সাইটগুলি দূরত্ব পরিমাণগত বিশ্লেষণ ব্যবহার করে পাওয়া যেতে পারে। আমরা 21 শতাংশ O2 এবং 4 শতাংশ O2 তে HIF রিংয়ের সমতুল্য গড় PL-এর পরিসর পরিমাপ করেছি।

2.13.4|HIF রিং এর অক্সিজেন চাপ পরিমাপ

আমরা ক্রমাঙ্কন লাইন ব্যবহার করে PLs থেকে HIF রিংয়ের অক্সিজেন চাপের পরিসর গণনা করেছি। PLIM ছবিগুলি SPCImage 5 ব্যবহার করে বিশ্লেষণ করা হয়েছিল৷{1}} (Becker & Hickl GmbH)৷

2.14|পরিসংখ্যান সংক্রান্ত বিশ্লেষণ

Dunnett এর পরীক্ষা পরীক্ষামূলক এবং নিয়ন্ত্রণ গ্রুপ তুলনা করার জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল, এবং মান <.05 পরিসংখ্যানগতভাবে="" উল্লেখযোগ্য="" পার্থক্য="" নির্দেশ="" করার="" জন্য="" বিবেচনা="" করা="" হয়েছিল।="" তিন="" বা="" ততোধিক="" গোষ্ঠীর="" তুলনা="" করার="" জন্য="" ছাত্রদের="" টি-পরীক্ষা="" ব্যবহার="" করা="" হয়েছিল,="" এবং="" বনফেরনি="" সামঞ্জস্য="" করা="" পি-মান="" প্রয়োগ="" করা="" হয়েছিল।="" সমস্ত="" পরিসংখ্যান="" বিশ্লেষণ="" jmp="" pro="" ver13.2.1="" (sas)="" ব্যবহার="" করে="" সম্পাদিত="" হয়েছিল।="" মানগুলি="" একটি="" সাধারণভাবে="" বিতরণ="" করা="" জনসংখ্যা="" থেকে="" প্রাপ্ত="" বলে="" ধরে="" নেওয়া="" হয়েছিল="" এবং="" গড়="" ±="" স্ট্যান্ডার্ড="" বিচ্যুতি="" (sd)="" হিসাবে="" দেখানো="">

একটি cistanche কি

3|ফলাফল

3.1|হাইপোপারফিউশন মডেলে অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্ট গঠন

আমরা ফসফোরেসেন্স ব্যবহার করে সরাসরি অক্সিজেন টান মূল্যায়ন করে কভারস্লিপ প্লেসমেন্ট দ্বারা প্ররোচিত হাইপোপারফিউশন মডেলে একটি অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্টের অস্তিত্ব নিশ্চিত করেছি। ফসফরেসেন্সের তীব্রতা পরিমাপ অক্সিজেন চাপের আনুমানিক প্রবণতা অনুমান করতে পারে (হিরাকাওয়া এট আল।, 2015; ইয়োশিহারা এট আল।, 2015)। আমরা BTPDM1 দিয়ে চিকিত্সা করা HK-2 কোষের একটি কভারস্লিপ মডেলের ফসফোরেসেন্স তীব্রতা পর্যবেক্ষণ করেছি। ফসফরেসেন্সের তীব্রতার চিত্রগুলি কভারস্লিপের ভিতরের বেশিরভাগ অংশে হাইপোক্সিয়া দেখায়, তবে প্রান্তের কাছে কোনও হাইপোক্সিয়া নেই, একটি পর্যবেক্ষণ যা HK-2 কোষে কভারস্লিপের প্রান্তের চারপাশে একটি অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্টের অস্তিত্বের পরামর্শ দেয় কভারস্লিপ (চিত্র 1a)। যেহেতু ফসফোরেসেন্সের তীব্রতা প্রোবের ঘনত্বের উপর নির্ভর করে, এবং উত্তেজনার সময়ের উপর, একটি ফসফরেসেন্স লাইফটাইম (PL) পরিমাপ অক্সিজেন চাপের পরিমাণগত বিশ্লেষণের জন্য দরকারী (Yoshihara et al., 2015)। এইভাবে, একটি কভারস্লিপের প্রান্তের চারপাশে সংস্কৃত কোষগুলির অক্সিজেন টানের পরিমাণগত পরিমাপের জন্য, আমরা 30 মিনিটের জন্য একটি কভারস্লিপ দিয়ে আবৃত HK-2 কোষগুলির PLIM চিত্রগুলি পেয়েছি (চিত্র 1b)৷ কভারস্লিপ প্রান্ত থেকে দূরত্ব বাড়ার সাথে সাথে PL প্রসারিত হয়েছে। আমরা নিশ্চিত করেছি যে অক্সিজেন টান, একটি ক্রমাঙ্কন লাইন (চিত্র S3) ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছে, কভারস্লিপ প্রান্ত থেকে দূরত্ব বৃদ্ধির সাথে সাথে হ্রাস পেয়েছে, যা কভারস্লিপের প্রান্তের চারপাশে একটি অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্টের অস্তিত্বের প্রমাণ প্রদান করে (চিত্র 1c)। ফসফোরেসেন্স তীব্রতার অস্থায়ী প্রোফাইলের পরীক্ষা নির্দেশ করে যে কভারস্লিপ বসানোর 10 মিনিট পরে অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্ট তৈরি হতে শুরু করে

(চিত্র 1d)।

3.2|হাইপোপারফিউশন মডেল,"HIF রিং"-এ অনন্য HIF-1 বিতরণ

আমরা একটি অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্ট সহ হাইপোপারফিউশন মডেলে HIF-1 বিতরণ পরীক্ষা করেছি। HK-2 কোষে HIF-1-এর ICC পিমোনিডাজল-পজিটিভ এলাকার প্রান্তে একটি ডোনাট-আকৃতির বর্ধন দেখিয়েছে, যাকে আমরা বলি "HIF রিং" (চিত্র 2a)। HIF-1 সংকেতের তীব্রতা HIF রিং এর ভিতরের বা বাইরের অংশের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল (চিত্র 2b)। এই ঘটনাটি অন্য HIF-1 অ্যান্টিবডি (চিত্র S4a) বা অন্যান্য টিউবুলার সেল লাইন (চিত্র S4b,c) দিয়ে ICC ব্যবহার করে নিশ্চিত করা হয়েছে। আমরা HIF-1-এর ICC বিশ্লেষণও করেছি অন্যান্য ধরনের সংস্কৃত কোষে, যেমন HeLa সার্ভিকাল ক্যান্সার কোষ। যদিও কভারস্লিপে এই কোষগুলির দুর্বল আনুগত্য HIF-1 বিতরণের বিশদ মূল্যায়নকে কঠিন করে তুলেছে, আমরা হেলা কোষে (চিত্র S4d) HIF-1-এর একটি ডোনাট-আকৃতির বর্ধন লক্ষ্য করেছি৷

এইচআইএফ রিং এবং পিমোনিডাজল-পজিটিভ এলাকা কভারস্লিপ বসানোর কয়েক ঘন্টা পরে গঠন শুরু করে এবং এইচআইএফ রিংটি 3 ঘন্টা (চিত্র 2c) দ্বারা স্থির দেখা দেয়। HIF-1 নকডাউনের ফলে HIF-1 সংকেত অদৃশ্য হয়ে যায়, যার মধ্যে HIF রিং (চিত্র 2d, চিত্র S4e) ছিল, যা নির্দেশ করে যে HIF রিং HIF-1 এর উপর নির্ভরশীল ছিল।

HIF রিং গঠন অক্সিজেনের উপর নির্ভরশীল হওয়ার সম্ভাবনার তদন্ত করার জন্য, আমরা বিভিন্ন অক্সিজেন টান সহ ইনকিউবেশনের অধীনে কভারস্লিপ মডেলে HIF-1 এর বিতরণ তদন্ত করেছি। আমরা একটি কভারস্লিপ মডেল তৈরি করার সাথে সাথেই বিভিন্ন অক্সিজেন টান সহ হাইপোক্সিক চেম্বারে একটি থালা রেখেছি। হাইপোক্সিক ইনকিউবেশনের সময়, আমরা লক্ষ্য করেছি যে এইচআইএফ রিং এবং পিমোনিডাজল-পজিটিভ এলাকা উভয়ই বাইরের দিকে প্রসারিত হয়েছে (চিত্র 3a)। আমরা নরমক্সিয়া, 4 শতাংশ O2 এবং 1 শতাংশ O2 ইনকিউবেশনের অধীনে একটি কভারস্লিপ প্রান্ত থেকে প্রতিটি HIF রিং এবং পিমোনিডাজল-পজিটিভ এলাকার দূরত্ব পরিমাপ করেছি। এইচআইএফ রিং এবং পিমোনিডাজল-পজিটিভ এলাকা উভয়ই বাইরের দিকে প্রসারিত হয়েছে কারণ আশেপাশের অক্সিজেনের উত্তেজনা হ্রাস পেয়েছে (চিত্র 3 বি)। এই ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে HIF রিং HIF-1 এবং অক্সিজেন টানের উপর নির্ভরশীল ছিল৷

ডোনাট-আকৃতির জমা হওয়া HIF-এর একটি নির্দিষ্ট প্রপঞ্চ তা নিশ্চিত করার জন্য, আমরা কভারস্লিপ মডেলে হাউসকিপিং জিনগুলির সাথে আইসিসি সম্পাদন করেছি। জিএপিডিএইচ এবং অ্যাক্টিন সংকেতগুলি একটি কভারস্লিপের পুরো অঞ্চলে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল এবং এইচআইএফ রিংয়ের অঞ্চল এবং অন্যান্য অঞ্চলের মধ্যে তুলনীয় ছিল (চিত্র S5a, b)।

FIGURE 2 Unique HIF-1α distribution in the hypoperfusion model,

3.3|এইচআইএফ রিংয়ের অক্সিজেনের চাপের পরিমাপ

আমরা একটি কভারস্লিপ দিয়ে আচ্ছাদিত সংস্কৃত কোষে HIF-1 জমার রিং-আকৃতির বর্ধিতকরণ নিশ্চিত করেছি, যা অক্সিজেন টানের উপর নির্ভরশীল একটি ঘটনা। জড়িত অক্সিজেন টান পরিসীমা নির্ধারণ করতে, আমরা একটি ফসফোরেসেন্স জীবনকাল কৌশল ব্যবহার করে HIF রিংয়ের অক্সিজেন চাপ বিশ্লেষণ করেছি। আমরা 21 শতাংশ O2 বা 4 শতাংশ O2 (চিত্র 4a) এ 30 মিনিট ইনকিউবেশনের পরে কভারস্লিপ মডেলের PLIM চিত্রগুলি পেয়েছি৷ এইচআইএফ রিংটি HIF এর আইসিসিতে পিমোনিডাজল বৃত্তের প্রান্তে গঠিত হয় (চিত্র 3b)। আমরা PLIM ছবিতে সাইটটিকে চিহ্নিত করেছি যা HIF-এর ICC-তে pimonidazole- পজিটিভ এলাকার সমতুল্য ছিল এবং পরবর্তীতে HIF রিং থেকে দূরত্বের ডেটার পরিমাণগত বিশ্লেষণ ব্যবহার করে HIF রিং (চিত্র 4b) এর সাথে সম্পর্কিত সাইটটিকে চিহ্নিত করেছি। pimonidazole-পজিটিভ এলাকা (চিত্র 3b)। আমরা HIF রিংয়ের PL-এর পরিসরও পরিমাপ করেছি এবং তারপর 21 শতাংশ O2 (4.20 [3.46–4.97] ~35.9 [28.5–44.9] mmHg) এ HIF রিংয়ের অক্সিজেন চাপ গণনা করতে একটি ক্রমাঙ্কন লাইন (চিত্র S3) ব্যবহার করেছি। , এবং 4 শতাংশ O2 (2.19 [0.21–4.32] ~20.4 [17.1–24.1] mmHg) (চিত্র 4c)।

FIGURE 3 HIF-1α distribution under different homogenous oxygen tensions incubation. (a) ICC of HIF of HK-2 cells covered with a round 15 mm coverslip under different homogenous oxygen tensions, incubated for 3 h

3.4|সমজাতীয় অক্সিজেন টানের অধীনে HIF-1 জমে

যদিও কভারস্লিপ মডেলে HIF রিংয়ের বাইরে HIF-1-এর দুর্বল সংকেতগুলি অপর্যাপ্ত হাইপোক্সিয়ার জন্য দায়ী করা যেতে পারে, তবে রিংয়ের ভিতরে থাকা, যেখানে HIF-1কে নিম্ন অক্সিজেন উত্তেজনা দ্বারা আরও জোরালোভাবে সক্রিয় করা উচিত ছিল, অবশ্যই একটি অক্সিজেন-স্বাধীন ঘটনা দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হবে। শুধুমাত্র হাইপোপারফিউশন মডেলে ঘটে এমন অ্যানোক্সিক এলাকায় HIF-1-এর সর্বাধিক সঞ্চয়ের অভাবের ঘটনাগুলি পরীক্ষা করার জন্য, আমরা পরীক্ষা করেছিলাম যে ইনকিউবেশনের অধীনে অক্সিজেন টান এবং HIF-1 জমার মধ্যে একটি বিপরীত সম্পর্ক ছিল কিনা। সমজাতীয় অক্সিজেন টান সহ। বিভিন্ন সমজাতীয় অক্সিজেন টেনশনের অধীনে সেল লাইসেটের ওয়েস্টার্ন ব্লট বিশ্লেষণ অ্যানোক্সিক ইনকিউবেশনের সময় HIF-1 জমে বৃদ্ধি দেখায় (চিত্র 5a)। HRE-luciferase রিপোর্টার অ্যাসে আরও ইঙ্গিত করেছে যে HIF-1 সঞ্চয়ন কম অক্সিজেন টেনশনের সাথে একজাতীয় অক্সিজেন টেনশনের (চিত্র 5b) অবস্থার অধীনে বৃদ্ধি পেয়েছে। এই ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে এইচআইএফ{10}} জমা হওয়া অক্সিজেন টেনশন-নির্ভর ছিল, অ্যানোক্সিক পরিসরে সর্বাধিক সঞ্চয়ন পরিলক্ষিত হয়৷ হাইপোপারফিউশন মডেল এবং সমজাতীয় অক্সিজেন টান সহ মডেলের মধ্যে HIF-1 এর বৈশিষ্ট্যগুলি পরিবর্তিত হওয়া উচিত। আমরা অনুমান করেছি যে এই হাইপোপারফিউশন মডেলে HIF-1 জমা হওয়ার অনন্য ঘটনাটি অক্সিজেন টেনশন ছাড়া অন্য কোনো ফ্যাক্টর দ্বারা নির্ধারিত হতে পারে।

FIGURE 4 Measurement of the range of oxygen pressure of the HIF ring. (a) Phosphorescence lifetime imaging microscopy (PLIM) images of a coverslip model obtained after 30 min incubation in 21% O2 or 4% O2. Four PLIM images per sample, at the upper, bottom, left, and right regions near a coverslip edge, were taken to measure phosphorescence lifetimes (PLs).

3.5|এইচআইএফ রিং গঠন পিএইচডি থেকে স্বাধীন ছিল

আমরা পরীক্ষা করে দেখেছি যে HIF-1 অবক্ষয়, HIF-রিং গঠনের একটি সম্ভাব্য প্রক্রিয়া, HIF রিংয়ের ভিতরে আপ-নিয়ন্ত্রিত হয়েছে কিনা। এই ধারণাটি অকার্যকর বলে মনে হয়েছিল, কারণ পিএইচডি দ্বারা হাইড্রোক্সিলেশন, HIF অবক্ষয়ের একটি হার-সীমিত প্রক্রিয়া, একটি সাবস্ট্রেট হিসাবে অক্সিজেন প্রয়োজন। কোবাল্ট ক্লোরাইড একটি রাসায়নিক HIF স্টেবিলাইজার হিসাবে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়। আমরা কোবাল্ট ক্লোরাইড দিয়ে চিকিত্সা করা HK-2 কোষগুলির একটি কভারস্লিপ মডেল তৈরি করেছি এবং HIF-এর ICC বিশ্লেষণ করেছি৷ HIF-1 সংকেত HIF রিংয়ের ভিতরে বাড়েনি, যা রিংয়ের বাইরে HIF-1-এর বর্ধিত সংকেতের কারণে অস্পষ্ট হয়ে ওঠে (চিত্র 6c)। PHD2 এর নকডাউন সহ HK-2 কোষের ICC, যা কোষ সংস্কৃতি পরীক্ষায় প্রাথমিক HIF প্রোলাইল হাইড্রোক্সিলেস বলে মনে করা হয় (স্ট্রোইটজকি এট আল।, 2019), একই রকম ফলাফল তৈরি করেছে (চিত্র S6)। এই ফলাফলগুলি নির্দেশ করে যে এইচআইএফ অবক্ষয়ের পিএইচডি-ভিএইচএল অক্ষটি এইচআইএফ রিং গঠনের সাথে সম্পর্কিত নয়।

3.6|HIF-1 জমে pH এর প্রভাব

পূর্ববর্তী একটি প্রতিবেদনে কার্ডিয়াক মায়োসাইটের একটি কভারস্লিপ মডেলের ব্যবহার বর্ণনা করা হয়েছিল যার কভারস্লিপের ভিতরে pH কমে গিয়েছিল (পিটস অ্যান্ড টুম্বস, 2004)৷ আমরা একটি কভারস্লিপের অধীনে পিএইচ এবং এইচআইএফ রিং গঠনে এর প্রভাব তদন্ত করেছি। আমরা HK-2 কোষগুলিকে একটি অন্তঃকোষীয় pH সূচক দিয়ে চিকিত্সা করেছি, যার ফ্লুরোসেন্স তীব্রতা কোষের pH মূল্যায়নের অনুমতি দেয়৷ লাইভ ইমেজিং দেখায় যে পিএইচ ভিতরের বেশিরভাগ অংশে কমে গেছে, কিন্তু কভারস্লিপের প্রান্তের কাছাকাছি নয়, কভারস্লিপ মডেলের প্রান্তের চারপাশে পিএইচ গ্রেডিয়েন্টের অস্তিত্বের পরামর্শ দেয় (চিত্র 6a)। ফ্লুরোসেন্সের তীব্রতা এবং কভারস্লিপ প্রান্ত থেকে দূরত্বের মধ্যে পারস্পরিক সম্পর্কের পরিমাণগত বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে দূরত্ব বৃদ্ধির সাথে সাথে পূর্বেরটি উচ্চতর হয়েছে, একটি পর্যবেক্ষণ যা কভারস্লিপ প্রান্তের চারপাশে pH এবং অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্টের অস্তিত্বকে সমর্থন করে (চিত্র 6b)। সমজাতীয় অক্সিজেন ঘনত্বের অধীনে সেল লাইসেটের পশ্চিমী ব্লট বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে pH 5.0 মাঝারি চাপা HIF-1 হাইপোক্সিক অবস্থার অধীনে ইনকিউবেশন (চিত্র S7a–d)। আমরা আরও নিশ্চিত করেছি যে বিভিন্ন pH অবস্থার অধীনে হাইপোক্সিয়ার অধীনে HIF-1 জমা হওয়া pH 6.0 এর নিচে কমে গেছে (চিত্র S8a–c)।

একটি প্রতিবেদনে হালকা অম্লীয় অবস্থার গুরুত্বের উপর জোর দেওয়া হয়েছে, pH প্রায় 6৷{1}}৷ এই সমীক্ষা অনুসারে, হাইপোক্সিয়ার পরে পুনঃঅক্সিজেনেশন মিডিয়াকে অম্লীয় করে তোলে, যা ভিএইচএলের নিউক্লিওলার সিকোয়েস্টেশন ঘটায়। পরিবর্তে, C2C12 myotubes, PC12 নিউরন এবং 786-0 রেনাল ক্যান্সার কোষে এইচআইএফের অবক্ষয় রোধ করা হয়েছিল (মেখাইল এট আল।, 2004)। আমাদের গবেষণায়, 50 থেকে 7.4 পর্যন্ত pH মান সহ একটি কভারস্লিপ মডেলে HIF-1 জমে থাকা অঞ্চল এবং যে অঞ্চলে এটি চাপা ছিল তাদের মধ্যে টিউবুলার কোষগুলিতে VHL বিতরণে কোনও পরিবর্তন হয়নি৷ (চিত্র S9a–c)। টিউবুলার কোষগুলি পিএইচ অবস্থার বিস্তৃত পরিসরের সংস্পর্শে আসে (বার্ক এট আল।, 1999; পাভুলুরি এট আল।, 2019; রঘুনান্দ এট আল।, 2003), তাই আমরা বিভিন্ন পিএইচ-এর মিডিয়াতে এইচআইএফ রিংয়ের তারতম্য তদন্ত করেছি। 5.0 এবং 8.5 এর মধ্যে মান। এইচআইএফ রিংটি পিএইচ 8.5 এবং 7.4 (চিত্র 6 সি) সহ মিডিয়াতে স্পষ্টভাবে পরিলক্ষিত হয়েছিল। এইচআইএফ রিংটি পিএইচ 6.5 তেও বিদ্যমান ছিল কিন্তু অস্পষ্ট ছিল (চিত্র 6 সি)। HIF-1 সংকেতটি pH 5.0 এ একটি কভারস্লিপের পুরো এলাকায় ক্ষয় করা হয়েছিল৷ (চিত্র 6c)। আমরা HIF রিং এবং পিমোনিডাজল-পজিটিভ এলাকার (চিত্র 7a) প্রান্তের মধ্যে অবস্থানগত সম্পর্কের আরও পরিমাণগত বিশ্লেষণ করেছি এবং আবিষ্কার করেছি যে পিএইচ-এর উপর নির্ভর করে রিংটির অবস্থান পরিবর্তিত হয়। অভ্যন্তরীণ-বৃত্তটি pH 7.4-এর তুলনায় pH 6.5-এ বাইরের দিকে প্রসারিত হওয়ার প্রবণতা দেখায়, যখন বাইরের বৃত্তটি পিমোনিডাজল-পজিটিভ এলাকার (চিত্র 7b,c) প্রান্তের উপর ভিত্তি করে pH 8.5-এ উল্লেখযোগ্যভাবে ভিতরের দিকে সঙ্কুচিত হয়। আমরা আরও নিশ্চিত করেছি যে হাউসকিপিং জিনের ক্রিয়াকলাপগুলি অ্যাসিডিক ইনকিউবেশন (চিত্র এস 10) এর অধীনে একটি কভারস্লিপ মডেলে বজায় রাখা হয়েছিল। অতএব, HIF রিং গঠনের অন্তর্নিহিত প্রক্রিয়াতে pH একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে বলে মনে হয়।

FIGURE 5 HIF-1α accumulation in homogenous oxygen tension. (a) Quantitative analysis of HIF-1α protein in different homogenous oxygen tensions by western blotting.

4|আলোচনা

এই গবেষণায়, আমরা কভারস্লিপ বসানো দ্বারা প্ররোচিত হাইপোপারফিউশনের একটি মডেল ব্যবহার করে রেনাল টিউবুলার কোষে HIF-1-এর একটি অনন্য বিতরণ শনাক্ত করেছি। আমরা দেখতে পেয়েছি যে এইচআইএফ রিংটির গঠন এবং রক্ষণাবেক্ষণ অক্সিজেন চাপ এবং পিএইচ দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়েছিল, উভয়ই একটি কভারস্লিপ মডেলের কভারস্লিপ প্রান্তে একটি গ্রেডিয়েন্টে বিদ্যমান ছিল। এই ফলাফলগুলির উপর ভিত্তি করে, আমরা HIF রিং গঠনের জন্য একটি সম্ভাব্য প্রক্রিয়া প্রস্তাব করি, যার মধ্যে HIF-1 জমে থাকা অক্সিজেনের উত্তেজনা হ্রাস পায় এবং একটি কভারস্লিপ প্রান্ত থেকে একটি নির্দিষ্ট দূরত্বের মধ্যে কম pH এর কারণে জমা হওয়া দমন করা হয় (চিত্র 8) )

হাইপোপারফিউশন সিকেডিতে মাইক্রোভাস্কুল্যাচারের বিরলতা দ্বারা প্ররোচিত হয় (মিমুরা এবং নাঙ্গাকু, 2{{20}}10; নাঙ্গাকু, 2006)। আমাদের পূর্ববর্তী কাজে, আমরা সাধারণ মাউস কিডনির রেনাল টিউবুলার কোষে একটি অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্টের উপস্থিতি প্রদর্শন করতে ভিভো ইমেজিং ব্যবহার করেছি (হিরাকাওয়া এট আল।, 2018)। CKD-তে নলাকার কোষে অক্সিজেনের টানও ভিন্নতর হতে পারে বলে আশা করা হচ্ছে। যাইহোক, অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্ট সহ হাইপারফিউশনের অস্তিত্ব হাইপোক্সিয়া, এইচআইএফ-এর বিরুদ্ধে প্রতিরক্ষা ব্যবস্থাকে প্রভাবিত করে কিনা তা এখনও স্পষ্ট নয়। এই গবেষণায়, আমরা একটি হাইপোপারফিউশন মডেলের অধীনে সংস্কৃতিযুক্ত প্রক্সিমাল টিউবুল কোষে এইচআইএফ বিতরণ তদন্ত করেছি এবং আবিষ্কার করেছি যে সংস্কৃতিযুক্ত রেনাল টিউবুলার কোষগুলিতে অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্ট সফলভাবে একটি বৃত্তাকার কাচের কভারস্লিপ ব্যবহার করে মডেল করা হয়েছিল। সমজাতীয় অক্সিজেন টান ব্যবহার করে পরীক্ষা-নিরীক্ষা থেকে প্রমাণ পাওয়া যায় যে HIF-1, যার হাইড্রোক্সিলেশন এবং পরবর্তী অবক্ষয় মূলত অক্সিজেন-নির্ভর, সঞ্চিত। অক্সিজেন টান কমে যাওয়ার সাথে সাথে HIF-1 এর পরিমাণ বৃদ্ধি পায়। আমাদের কভারস্লিপ মডেলে, তবে, HIF-1 অ্যানোক্সিক এলাকায় চাপা ছিল এবং একটি কভারস্লিপ প্রান্ত থেকে একটি নির্দিষ্ট দূরত্বে সর্বাধিক জমা হয়েছিল৷ এই ডোনাট-আকৃতির HIF সঞ্চয় আগে কখনও দেখানো হয়নি। আমরা দেখিয়েছি যে ইনকিউবেটিং বায়ুমণ্ডলের অক্সিজেন টান নির্বিশেষে এইচআইএফ রিং গতি লক্ষ্য করা যেতে পারে, তবে এর অবস্থান অক্সিজেনের টানের উপর নির্ভরশীল ছিল। HIF রিং-এ অক্সিজেনের টেনশনের পরিসীমা BTPDM1 এর সাথে PLIM ব্যবহার করে প্রায় 4-20 mmHg পরিমাপ করা হয়েছিল। বেশিরভাগ পূর্ববর্তী গবেষণা, যা একটি সমজাতীয় অক্সিজেন টান সহ বায়ুমণ্ডলে সংষ্কৃত কোষগুলির উপর দৃষ্টি নিবদ্ধ করা হয়েছিল, দেখা গেছে যে হাইপোক্সিক বা অ্যানোক্সিক রেঞ্জে HIF-1 প্রোটিনের পরিমাণ বৃদ্ধি পেয়েছে (Ameri et al., 2002; Carrera et al. , 2014)। সুতরাং, আমাদের মডেলে, এইচআইএফ রিং গঠন অবশ্যই অক্সিজেন টান ব্যতীত অন্য কোনও ফ্যাক্টর দ্বারা প্রভাবিত হয়েছে; এটি পিএইচডি থেকে স্বাধীন ছিল, এইচআইএফ অবক্ষয়ের একটি হার-সীমিত প্রক্রিয়া। এইচআইএফ রিং গঠনের প্রক্রিয়ার ব্যাখ্যায় একটি অগ্রগতি হল কভার-লিপ মডেলে পিএইচ গ্রেডিয়েন্টের পাশাপাশি অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্টের ভূমিকা সম্পর্কে আমাদের আবিষ্কার, যা ভিভো হাইপোপারফিউশনের মতো মিডিয়ার প্রবাহকে সীমিত করেছিল। মডেল. এই হাইপোপারফিউশন মডেলে, কভার-স্লিপ প্রান্ত থেকে দূরত্ব বৃদ্ধির সাথে সাথে অন্তঃকোষীয় pH হ্রাস পেয়েছে এবং কভারস্লিপ প্রান্তের চারপাশে একটি pH গ্রেডিয়েন্ট পরিলক্ষিত হয়েছে। আমরা দেখিয়েছি যে HIF-1 জমে কম pH এ, pH 5.0 এর কাছাকাছি, সমজাতীয় অক্সিজেন টানের অধীনে নিরপেক্ষ pH-এ ইনকিউবেশনের তুলনায় দমন করা হয়েছিল। এইচআইএফ রিংয়ের বাইরের প্রান্তটি পিএইচ 6.5 এ বাইরের দিকে প্রসারিত হয় এবং পিমোনিডাজল-পজিটিভ এলাকার প্রান্তের উপর ভিত্তি করে এইচআইএফ রিংয়ের ভিতরের প্রান্তটি পিএইচ 8.5-এ ভিতরের দিকে সঙ্কুচিত হয়। HIF রিংটি অম্লীয় অবস্থার অধীনে অস্পষ্ট ছিল, এবং HIF-1 সংকেত pH 5.0 এ অদৃশ্য হয়ে গিয়েছিল৷ সুতরাং, আমরা একটি কভারস্লিপ মডেলে এইচআইএফ রিং গঠনের জন্য পিএইচ-এর গুরুত্ব ব্যাখ্যা করেছি। আমরা সম্ভাবনা প্রদর্শন করেছি যে রিংয়ের ভিতরে কম pH দ্বারা HIF-1 জমে থাকা দমন দ্বারা HIF রিং গঠিত হয়েছিল৷

কভারস্লিপ পদ্ধতি ব্যবহার করে বেশ কয়েকটি পূর্ববর্তী গবেষণায় ক্যান্সার কোষ ব্যবহার করা হয়েছে। মানব হেপাটোমা সেল লাইন Hep3B ব্যবহার করে একটি প্রতিবেদন অনুসারে, যা সবুজ ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন (AcGFP1) এর অক্সিজেন-নির্ভর রেডশিফ্টকে প্রকাশ করে, একটি আয়তক্ষেত্রাকার কভারস্লিপ দিয়ে আচ্ছাদিত কোষগুলির লাইভ ইমেজিং একটি কভারস্লিপ প্রান্ত থেকে দূরত্ব বৃদ্ধির সাথে সাথে লাল শিফট দেখায় (তাকাহাশি এবং সাটো, 2010)। হেপাটোমা কোষের নির্গমন বর্ণালী সবুজ ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন (GFP) ফ্লুরোসেন্সের তরঙ্গদৈর্ঘ্য থেকে লাল রঙে স্থানান্তরিত হয় কারণ অক্সিজেনের উত্তেজনা কমে যায়। অন্য একটি গবেষণায়, একটি বৃত্তাকার 15-মিমি কভারস্লিপ সহ SCC-7 কোষের অক্সিজেন টান একটি ফসফোরেসেন্স লাইফটাইম কৌশল ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল। অক্সিজেন টান ছিল 6.9 mmHg এবং 166 mmHg, PL থেকে গণনা করা হয়েছে, যা ছিল যথাক্রমে 3.89 µs এবং 893 µs, 0-2 মিমি ভিতরে, এবং 0-1 মিমি কভারস্লিপ প্রান্তের বাইরে, (Yoshihara et al., 2015)। কভারস্লিপ পদ্ধতিটি কার্ডিয়াক মায়োসাইটের সাথেও ব্যবহার করা হয়েছে, এমন একটি সিস্টেম যা ভিভো ইস্কেমিয়া-রিপারফিউশন মডেলের প্রতিশ্রুতিশীল হিসাবে মনোযোগ আকর্ষণ করেছে। কেলি এট আল দেখিয়েছেন যে কভারস্লিপ দ্বারা আবৃত মায়োসাইটগুলি সময়ের সাথে সাথে চিহ্নিত আকারগত পরিবর্তনের মধ্য দিয়ে যায়, যার সাথে মাইটোকন্ড্রিয়াল মেমব্রেন সম্ভাব্য এবং প্লাজমা মেমব্রেনের গতিশীলতার পরিবর্তন ঘটে, যার ফলে মায়োসাইটের মৃত্যু ঘটে। তারা আরও দেখান যে একটি কভারস্লিপ দ্বারা আচ্ছাদিত মায়োসাইটের অন্তঃকোষীয় pH একটি কভারস্লিপের কেন্দ্রে আনুমানিক pH 4 এ দ্রুত নেমে যায় (Pitts & Toombs, 2004)। একটি কভার-স্লিপ মডেল, একটি কভারস্লিপের অধীনে সংষ্কৃত কোষে অক্সিজেন বা পুষ্টির বিস্তারকে বাধা দেয়, একটি কভারস্লিপের কেন্দ্রে, বাইরে এবং প্রান্তে যথাক্রমে ইস্কেমিক, স্বাভাবিক এবং প্রান্তিক অঞ্চলগুলির একটি ইন ভিভো মডেল অনুকরণ করতে পারে। বেশ কিছু গবেষণায় এই মডেলটিকে ভিট্রোতে মায়োসাইটের ইসকেমিয়া-রিপারফিউশন মডেল হিসেবে ব্যবহার করা হয়েছে (চুন এট আল।, 2015; পিটস এট আল।, 2008; সোলহজু ও ও'রোরকে, 2015; ওয়াং এট আল।, 2012)। আমাদের সর্বোত্তম জ্ঞান অনুসারে, আমাদের অধ্যয়নটি টিউবুলার কোষগুলিতে একটি কভারস্লিপ পদ্ধতি প্রয়োগ করার জন্য প্রথম। আমাদের সিস্টেমে, একটি কভারস্লিপ প্রান্ত থেকে একটি অঞ্চলের দূরত্ব 10 mmHg অক্সিজেন টেনশনের সমতুল্য, যেখানে পিমোনিডাজল পজিটিভ হওয়া উচিত ছিল 1.22 মিমি, এবং কভারস্লিপ প্রান্ত থেকে 2 মিমি দূরত্বের মধ্যে অক্সিজেনের উত্তেজনা শূন্যের মতো কমে গেছে . এই ফলাফলটি প্রায় 15 মিমি কভারস্লিপ ব্যবহার করে পূর্ববর্তী প্রতিবেদনের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ হতে পারে, প্রান্ত থেকে কমপক্ষে 2 মিমি এর মধ্যে একটি অক্সিজেন গ্রেডিয়েন্টের অস্তিত্ব প্রদর্শন করে (আকিয়ামা এট আল।, 2018; ইয়োশিহারা এট আল।, 2015)। আমরা কভারস্লিপ (চিত্র এস 11) এর অধীনে কোষগুলির অ্যাপোপটোসিসের হার পরীক্ষা করেছি এবং আবিষ্কার করেছি যে এইচআইএফ রিংয়ের ভিতরেও জিএপিডিএইচ এবং অ্যাক্টিন বজায় রাখা হয়েছিল, এটি ইঙ্গিত করে যে এইচআইএফ রিংটি কেবল সেল অ্যাপোপটোসিস বা এইচআইএফ রিংয়ের ভিতরে মৃত্যুর কারণে ঘটেনি।

বেশ কয়েকটি গবেষণায় বিভিন্ন পদ্ধতি ব্যবহার করে কিডনিতে অক্সিজেনের উত্তেজনা পরিমাপ করা হয়েছে। সাধারণ কিডনির অক্সিজেন টান পরিমাপের কয়েকটি উদাহরণ নিম্নরূপ: 50 mmHg এবং 30 mmHg কর্টেক্স এবং মেডুলায় মাইক্রোইলেকট্রোড ব্যবহার করে; এবং PLIM ব্যবহার করে কর্টেক্সের টিউবুলার কোষের S1 এবং S2 সেগমেন্টে 49 mmHg এবং 41 mmHg (হিরাকাওয়া এট আল।, 2017, 2018; ঝাং এট আল।, 2014)। অসুস্থ কিডনির অক্সিজেন টেনশন কম হবে। অক্সিজেন মাইক্রোইলেক্ট্রোড ব্যবহার করে পূর্ববর্তী প্রতিবেদন অনুসারে, ডায়াবেটিক ইঁদুরের রেনাল প্যারেনকাইমাল অক্সিজেন টান কম ছিল: কর্টেক্স এবং মেডুলায় যথাক্রমে 36 mmHg এবং 11 mmHg (Heyman et al., 2013; Palm et al., 2003)। যেহেতু অক্সিজেন মাইক্রোইলেকট্রোডগুলি গড় প্যারেনচাইমাল অক্সিজেন টান পরিমাপ করে, তাই অসুস্থ কিডনিতে একটি বিস্তৃত পরিসর প্রত্যাশিত। একটি ইস্কেমিক কিডনির মডেলে অন্তঃকোষীয় অক্সিজেনের উত্তেজনা শূন্য mmHg-এ কমে গেছে যার পার্শ্বীয় রেনাল ধমনী এবং শিরা আটকানো ছিল (হিরাকাওয়া এট আল।, 2015)। এই ফলাফলগুলি বিবেচনা করে, HIF রিং-এ অক্সিজেনের টেনশনের পরিসর, প্রায় 4-20 mmHg, ভিভোতে প্রশংসনীয় বলে মনে হচ্ছে।

FIGURE 7 Quantitative analysis about the impact of pH on HIF ring.

আমরা আরও আবিষ্কার করেছি যে পিএইচ HIF রিং গঠনের পাশাপাশি অক্সিজেন টানকে প্রভাবিত করে। যেহেতু কিডনির টিউবুলার এপিথেলিয়াল কোষগুলি ক্রমাগত প্রস্রাবের তরলের সংস্পর্শে থাকে, তাই টিউবুলার কোষগুলির pH প্রস্রাবের দ্বারা প্রভাবিত হওয়া উচিত। প্রস্রাবের pH-এর বিস্তৃত পরিসর বিবেচনা করে, আমরা 5 এর pH পরিসরে ইনকিউব করা কোষগুলি অধ্যয়ন করার সিদ্ধান্ত নিয়েছি৷{1}}–8.5৷ স্বাভাবিক কিডনিতে pH এর পরিসর নিয়ে গবেষণা হয়েছে। একটি সমীক্ষায় দেখা গেছে যে কর্টেক্সের pH ছিল 7.39 ± 0৷{10}}8, এবং মেডুলার ছিল 7.20 ± {{2{{39} }}}। আরেকটি গবেষণা, এমআরআই-ভিত্তিক পিএইচ ইমেজিং ব্যবহার করে, পিএইচ মান যথাক্রমে 7.3 ± 0.13 এবং 7৷{51}} ± 0.29 দেখিয়েছে (রঘুনন্দ এট আল।, 2003)। এটি রিপোর্ট করা হয়েছিল যে রেনাল pH 6.5 থেকে 6.32 পর্যন্ত হ্রাস পেয়েছে এবং গুরুতর ক্ষেত্রে 5.83 পর্যন্ত কম হয়েছে, অ্যাসিডোসিস সহ CKD-এর একটি মাউস মডেলে (পাভুলুরি এট আল।, 2019)। এই পর্যবেক্ষণগুলি পিএইচ ড্রপ এবং সিকেডি-তে তারতম্যের প্রমাণ দিয়েছে। যাইহোক, CKD-এ দীর্ঘস্থায়ী হাইপোক্সিয়া দ্বারা প্ররোচিত HIF-1-এর উপর pH-এর প্রভাব যথেষ্ট ভালভাবে পরীক্ষা করা হয়নি। বর্তমান গবেষণায়, পিএইচ 6.5 এবং পিএইচ 7.4 এর মধ্যে এইচআইএফ রিংয়ের একটি পরিবর্তন লক্ষ্য করা গেছে, একটি পিএইচ পরিসর যা CKD-তে প্রশংসনীয়। এই ফলাফলটি অনুমানকে সমর্থন করে যে pH-এর একটি হালকা হ্রাস CKD-এ HIF-1 জমাকে প্রভাবিত করে। CKD-এর গুরুতর ক্ষেত্রে 6.0-এর নিচে pH কমে যাওয়ার প্রমাণের ভিত্তিতে, নিম্ন pH-এ HIF-1 শারীরবৃত্তীয় অবস্থার মূল্যায়ন করাও প্রয়োজন। যদিও এমন রিপোর্ট পাওয়া গেছে যে একটি অম্লীয় পরিবেশ, এমনকি নরমোক্সিয়াতেও, HIF কে স্থিতিশীল করে-1, এই রিপোর্টগুলির বেশিরভাগই পিএইচ 6.0 এর উপরে হালকা অম্লতার অবস্থার তদন্ত করেছে (ফিলাটোভা এট আল।, 2016; মেখাইল এট আল।, 2004) . এই কাজে, আমরা pH 5.0 তে টিউবুলার কোষে HIF-1 জমে থাকা দমন এবং pH 5.0 তে ইনকিউবটেড একটি কভারস্লিপ মডেলে HIF-1 সংকেতের ক্ষয় দমন দেখিয়েছি। অতএব, ভিভোতে CKD-তে রেনাল pH হ্রাস অপর্যাপ্ত HIF সক্রিয়করণের সাথে সম্পর্কিত হতে পারে, সেইসাথে হাইপোক্সিক কিডনিতে ইউরেমিক টক্সিনের সাথে, CKD অগ্রগতিকে আরও বাড়িয়ে দেয় (Tanaka et al., 2013)।

FIGURE 8 Possible mechanism of HIF ring formation. There is a pH gradient as well as an oxygen gradient at the coverslip edge in the hypoperfusion model, induced by coverslip placement.

আমাদের গবেষণায় বিভিন্ন সীমাবদ্ধতা উপস্থিত রয়েছে। প্রথমত, হাইপোপারফিউশনের ক্ষেত্রে, অক্সিজেনের ঘাটতি এবং পিএইচ হ্রাসের উপস্থিতি ছাড়াও সংস্কৃতি মিডিয়াতে পুষ্টির ঘাটতি থাকা উচিত। যাইহোক, পিএইচ, অক্সিজেন টান এবং হাইপোপারফিউশন দ্বারা প্ররোচিত অন্যান্য কারণগুলির প্রভাবগুলি বর্ণনা করা কঠিন। শরীরে, ইস্কিমিয়া, রক্তের প্যাথলজিকাল হাইপোপারফিউশন কম অক্সিজেন এবং কম পুষ্টির সংমিশ্রণ দ্বারা সৃষ্ট, অঙ্গ এবং কোষে ঘটে। হাইপোক্সিয়া সেন্সিং এবং ইস্কেমিয়া সেন্সিং এর মধ্যে পার্থক্য বোঝা গুরুত্বপূর্ণ। প্রতিটি ফ্যাক্টরের জৈবিক প্রভাব ব্যাখ্যা করতে অসুবিধা হওয়া সত্ত্বেও, আমাদের হাইপোপারফিউশন মডেলটি শারীরবৃত্তীয়ভাবে বিশ্বাসযোগ্য, ভিভোতে প্যাথলজিকাল অবস্থার অনুকরণ করে। দ্বিতীয়ত, একটি কভারস্লিপ মডেল তৈরির জন্য দক্ষতা এবং অনুশীলনের প্রয়োজন, যেহেতু কভারস্লিপ অপসারণের সময় বেশিরভাগ কোষ মাঝে মাঝে বিচ্ছিন্ন হয়ে যায়, বিশেষ করে যখন ঐতিহ্যগত পদ্ধতি ব্যবহার করে (চিত্র S2a)। এই সমস্যাটি ব্যবহৃত সেল লাইনের উপর নির্ভর করে। উদাহরণস্বরূপ, HEK 293 কোষে একটি কভারস্লিপ মডেল প্রয়োগ করা আমাদের পক্ষে কঠিন ছিল কারণ একটি কভারস্লিপে তাদের আনুগত্য তুলনামূলকভাবে দুর্বল ছিল। তৃতীয়ত, একটি কভারস্লিপের অধীনে সংস্কৃত কোষগুলির ক্ষতি হ্রাস করা বাঞ্ছনীয় ছিল। ক্ষতিগ্রস্থ কোষের সংখ্যা বৃদ্ধির সাথে সাথে যে সময়কালে তারা আচ্ছাদিত হয়েছিল তা বৃদ্ধি পেয়েছে, যেমন অ্যাপোপটোসিসের বিশ্লেষণ দ্বারা দেখানো হয়েছে। আমরা নির্ধারণ করেছি যে এইচআইএফ রিং অনুমান করার জন্য 3 ঘন্টা উপযুক্ত ছিল যখন এটি স্থির বলে মনে হয়েছিল, এবং প্রায় 10 শতাংশের মতো কোষ অ্যাপোপটোটিক হয়ে গেছে (চিত্র S11)। চতুর্থ সীমাবদ্ধতাটি ছিল প্রতিটি নমুনায় (চিত্র S2b, c) অভিন্ন উপায়ে একটি কভারস্লিপে সংস্কৃতিযুক্ত কোষগুলিকে সংযুক্ত করার অসুবিধা। একটি কভার-ঠোঁটের মডেল তৈরির একটি ঐতিহ্যগত এবং একটি বিকল্প পদ্ধতির মধ্যে সংযুক্তির পার্থক্যও অধ্যয়নকে প্রভাবিত করতে পারে। আমরা একটি ফসফোরেসেন্স লাইফটাইম কৌশল দ্বারা HIF রিংয়ের সমতুল্য অক্সিজেন টেনশনের পরিসীমা পরিমাপ করেছি, যেখানে আমরা একটি ঐতিহ্যগত পদ্ধতি ব্যবহার করে একটি কভারস্লিপ মডেল তৈরি করেছি। যেহেতু ইমিউনোসাইটোকেমিস্ট্রির সময় এইচআইএফ রিংটি একটি বিকল্প পদ্ধতি ব্যবহার করে কল্পনা করা হয়েছিল, তাই সত্যিকারের অক্সিজেনের উত্তেজনা ভিন্ন হতে পারে। আমরা প্রমাণ ব্যবহার করে এই ত্রুটিগুলি কমিয়েছি যে অক্সিজেন টেনশনের 10 mmHg বা তার কম সময়ে পিমোনিডাজল ইতিবাচক ছিল। পঞ্চম সীমাবদ্ধতা হল অন্তঃকোষীয় pH অগত্যা সংস্কৃতি মাধ্যমের pH এর মতো নয়। অতীতের বেশ কয়েকটি প্রতিবেদনে দেখানো হয়েছে যে আন্তঃকোষীয় pH একটি নির্দিষ্ট পরিমাণে মাঝারি pH-এর সাথে সংস্কৃত কোষে সামঞ্জস্যপূর্ণ (Michl et al., 2019), আমরা মাঝারি pH পরিবর্তন করে শুধুমাত্র অন্তঃকোষীয় pH-এর প্রবণতা মূল্যায়ন করতে পারি। ভিভোতে, অন্তঃকোষীয় এবং বহির্মুখী অঞ্চলের pH-এর মধ্যে সম্পর্ক, যেমন প্রস্রাব বা শরীরের তরল, সংস্কৃত কোষের তুলনায় আরও জটিল। এইভাবে, ভিভোতে HIF-1 প্রোটিন জমা হওয়া কীভাবে pH শিফট নিয়ন্ত্রণ করে সে সম্পর্কে আরও অধ্যয়ন ভবিষ্যতের জন্য প্রয়োজনীয় হবে।

Cistanche is good for kindney function

Cistanche সুবিধা: উন্নতি কিডনিফাংশন

আরেকটি সীমাবদ্ধতা হল পিএইচ-এর হাইপোক্সিয়া মার্কার, পিমোনিডাজলের উপর প্রভাব থাকা উচিত। আমরা আমাদের কভারস্লিপ মডেলে বিভিন্ন পিএইচ অবস্থার অধীনে একটি কভারস্লিপের কেন্দ্র থেকে পিমোনিডাজল-পজিটিভ এলাকার প্রান্তের দূরত্ব তুলনা করেছি। পিমোনিডাজল-পজিটিভ এলাকার প্রান্তটি পিএইচ 6.5, 7.4 এবং 8.5 (চিত্র S12a, b) এর মধ্যে তুলনীয় ছিল। পূর্ববর্তী একটি গবেষণায় বিভিন্ন pH মানগুলিতে পিমোনিডাজল বাঁধাইয়ের রক্ষণাবেক্ষণও দেখানো হয়েছে (ক্লেটার এট আল।, 2006)। এই প্রমাণের উপর ভিত্তি করে, আমরা উপসংহারে পৌঁছেছি যে পিমোনিডাজল আমাদের কভারস্লিপ পরীক্ষার জন্য একটি উপযুক্ত হাইপোক্সিয়া চিহ্নিতকারী। চূড়ান্ত সীমাবদ্ধতা হল HIF রিং, Pt(II)- এবং Pd(II)-পোরফাইরিনগুলির প্রায় 4 mmHg এবং 20 mmHg (0.52 শতাংশ O2 থেকে 2.6 শতাংশ O2) এর মধ্যে অক্সিজেনের উত্তেজনা দেওয়া হয়েছে, যা জৈবিক হিসাবে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয় অক্সিজেন প্রোব, Ir(III) কমপ্লেক্স (Yoshihara et al., 2017) ব্যবহারকারীদের তুলনায় তাদের উল্লেখযোগ্যভাবে দীর্ঘ ফসফোরেসেন্স জীবনকালের কারণে খুব কম অক্সিজেন ঘনত্ব পরিমাপ করার সুবিধা রয়েছে। যাইহোক, সাধারণভাবে, স্টার্ন-ভোলমার সমীকরণ ব্যবহার করে গণনা করা ফসফোরেসেন্সের উপর ভিত্তি করে একটি পরিমাণগত অক্সিজেন পরিমাপ, কম O2 রেঞ্জে ভাল কার্যকারিতা রয়েছে (পাপকোভস্কি এবং ঝডানোভ, 2016)। পূর্ববর্তী বেশ কয়েকটি গবেষণায় Ir(III) জটিল-ভিত্তিক অক্সিজেন টেনশনের পরিমাপ দেখানো হয়েছে যা প্রায় 10 mmHg (আকিয়ামা এট আল।, 2018; ইয়োশিহারা এট আল।, 2015)। অতএব, আমরা বিশ্বাস করি যে HIF রিংয়ের অক্সিজেন টান পরিসীমা একটি সুনির্দিষ্ট ফলাফল হওয়া উচিত।

5|উপসংহার

সংক্ষেপে, আমরা দেখতে পেয়েছি যে CKD-তে HIF-1 শারীরবৃত্তীয় অবস্থা বোঝার জন্য অক্সিজেন এবং pH উভয়ের ভূমিকা বোঝা অপরিহার্য, এবং হাইপোপারফিউশন সহ টিউবুলার কোষগুলি তদন্ত করে লাভ করা যেতে পারে। মিডিয়ার প্রবাহের সীমাবদ্ধতা সহ কভারস্লিপ মডেলটি ভিভোতে হাইপোপারফিউশনের একটি ভাল মডেল ছিল, বিশেষ করে CKD-এর টিউবুলে, যেহেতু পেরিটুবুলার কৈশিকগুলির বিরলতা CKD-এর একটি প্রধান বৈশিষ্ট্য (মিমুরা এবং নাঙ্গাকু, 2010; নাঙ্গাকু, 2006)। এই হাইপোপারফিউশন মডেলটি ভিভোতে অক্সিজেন এবং পিএইচ গ্রেডিয়েন্টের অনুকরণ করতে পারে, যেমন টিউমার এবং ইস্কেমিক ক্ষত। মডেলটি এই জৈবিক প্রক্রিয়াগুলির ব্যাখ্যা করার জন্য একটি প্রতিশ্রুতিবদ্ধ পদ্ধতি সরবরাহ করে।

স্বার্থের সংঘাত

সমস্ত লেখকের ঘোষণা করার স্বার্থের কোন দ্বন্দ্ব নেই।

লেখকদের অবদান

সমস্ত লেখক সামগ্রিক ধারণা গঠনে অবদান রেখেছেন। TH সামগ্রিক পরীক্ষা-নিরীক্ষা করেছে। TH এবং YH ফলাফল বিশ্লেষণ করে পরিসংখ্যান তৈরি করেছে। TH মূল পাণ্ডুলিপি লিখেছেন। কেএম, টিওয়াই এবং এসটি একটি ফসফোরেসেন্স লাইফটাইম কৌশল ব্যবহার করে পরীক্ষাটি করেছে এবং পাণ্ডুলিপির অংশটি সম্পাদনা করেছে। YH, TT, এবং MN সামগ্রিক পাণ্ডুলিপি সম্পাদনা করেছে। সমস্ত লেখক চূড়ান্ত পাণ্ডুলিপি পড়েছেন এবং অনুমোদন করেছেন।

রেফারেন্স

Akiyama, H., Takahashi, I., Shimoda, Y., Mukai, R., Yoshihara, T., & Tobita, S. (2018)। Ir(iii) একটি গেটেড ICCD ক্যামেরা সহ জীবন্ত কোষ এবং অকুলার ফান্ডাসের জটিল-ভিত্তিক অক্সিজেন ইমেজিং। ফটোকেমিক্যাল এবং ফটোবায়োলজিক্যাল সায়েন্স, 17(6), 846-853।

Akizawa, T., Nangaku, M., Yamaguchi, T., Arai, M., Koretomo, R., Maeda, K., Miyazawa, Y., & Hirakata, H. (2019)। হেমোডায়ালাইসিস রোগীদের রক্তাল্পতার জন্য এনারোডুস্ট্যাট, রূপান্তর এবং রক্ষণাবেক্ষণ থেরাপি: একটি এলোমেলো, প্লেসবো-নিয়ন্ত্রিত ফেজ 2b ট্রায়াল দীর্ঘমেয়াদী ট্রায়াল দ্বারা অনুসরণ করা হয়। নেফ্রন, 143(2), 77-85।

আমেরি, কে., বার্ক, বি., লুইস, সিই, এবং হ্যারিস, এএল (2002)। হাইপোক্সিয়া এবং অ্যানোক্সিয়ায় মানুষের স্তন ক্যান্সার কোষে একটি ইঁদুর VL30 উপাদানের নিয়ন্ত্রণ: HIF এর ভূমিকা-1। ব্রিটিশ জার্নাল অফ ক্যান্সার, 87(10), 1173-1181।

Asai, H., Hirata, J., Hirano, A., Hirai, K., Seki, S., & Watanabe- Akanuma, M. (2016)। অ্যারিল হাইড্রোকার্বন রিসেপ্টর সক্রিয়করণ ইন্ডোক্সিল সালফেট দ্বারা হাইপোক্সিয়া-ইনডিউসিবল ফ্যাক্টর-নির্ভর এরিথ্রোপয়েটিন এক্সপ্রেশনকে দমন করে। আমেরিকান জার্নাল অফ ফিজিওলজি। সেল ফিজিওলজি, 310(2), C142–C150।

Burke, TJ, Malhotra, D., & Shapiro, JI (1999)। কিডনির মধ্যে পিএইচ গ্রেডিয়েন্ট বজায় রাখার কারণগুলি: ভাস্কুলেচার আর্কিটেকচারের ভূমিকা। কিডনি ইন্টারন্যাশনাল, 56(5), 1826-1837।

Carrera, S., Senra, J., Acosta, MI, Althubiti, M., Hammond, EM, de Verdier, PJ, & Macip, S. (2014)। শারীরবৃত্তীয় অক্সিজেন টেনশনে কোষ বিভাজন বৃদ্ধিতে HIF-1আলফা ট্রান্সক্রিপশন ফ্যাক্টরের ভূমিকা। PLOS One, 9(5), e97938।

চেন, এন., হাও, সি., পেং, এক্স., লিন, এইচ., ইয়িন, এ., হাও, এল., তাও, ওয়াই., লিয়াং, এক্স., লিউ, জেড., জিং, সি., চেন, জে., লুও, এল., জুও, এল., লিয়াও, ওয়াই., লিউ, বিসি, লিওং, আর., ওয়াং, সি., লিউ, সি., নেফ, টি., … ইউ, কেএইচপি (2019 )

কিডনি রোগে আক্রান্ত রোগীদের রক্তাল্পতার জন্য Roxadustat ডায়ালাইসিস গ্রহণ করে না। নিউ ইংল্যান্ড জার্নাল অফ মেডিসিন, 381(11), 1001-1010।

চেন, এন., কিয়ান, জে., চেন, জে., ইউ, এক্স., মেই, সি., হাও, সি., জিয়াং, জি., লিন, এইচ., ঝাং, এক্স., জুও, এল., তিনি, কিউ., ফু, পি., লি, এক্স., নি, ডি., হেমরিচ, এস., লিউ, সি., স্জেক, এল., বেসরাব, এ., নেফ, টিবি, … ভ্যালোন, এফ.

H. (2017)। চীনে রক্তাল্পতার চিকিত্সার জন্য মৌখিক হাইপোক্সিয়া-ইনডিউসিবল ফ্যাক্টর প্রোলাইল হাইড্রোক্সিলেজ ইনহিবিটর এফজি-4592 এর ফেজ 2 অধ্যয়ন। নেফ্রোলজি, ডায়ালাইসিস, ট্রান্সপ্লান্টেশন, 32(8), 1373–1386।

চিয়াং, সিকে, তানাকা, টি., ইনাগি, আর., ফুজিতা, টি., এবং নাঙ্গাকু, এম. (2011)। ইন্ডোক্সিল সালফেট, একটি প্রতিনিধি ইউরেমিক টক্সিন, এইচআইএফ-নির্ভর পদ্ধতিতে এরিথ্রোপয়েটিন উত্পাদনকে দমন করে। ল্যাবরেটরি ইনভেস্টিগেশন, 91(11), 1564-1571।

চুন, ডাব্লুজে, নাহ, ডিওয়াই, বে, জেএইচ, চুং, জেডব্লিউ, লি, এইচ., এবং মুন, আইএস(2015)। গ্লুকোজ-ইনসুলিন-পটাসিয়াম দ্রবণ একটি ইন ভিট্রো কভারস্লিপ ইস্কেমিয়া/রিপারফিউশন মডেলে নবজাতক ইঁদুরের ভেন্ট্রিকুলার মায়োসাইটকে রক্ষা করে। কোরিয়ান সার্কুলেশন জার্নাল, 45(3), 234–241।

Coyne, DW, Goldsmith, D., & Macdougall, IC (2017)। দীর্ঘস্থায়ী কিডনি রোগের রক্তাল্পতার জন্য নতুন বিকল্প। কিডনি ইন্টারন্যাশনাল সাপ্লিমেন্ট, 7(3), 157-163। চুম্বন.2017.09.002

ডেং, এ., আর্ন্ডট, এমএ, স্যাট্রিয়ানো, জে., সিং, পি., রিগ, টি., থমসন, এস. এট আল (2010)। দীর্ঘস্থায়ী কিডনি রোগে রেনাল সুরক্ষা: হাইপোক্সিয়া-ইনডিউসিবল ফ্যাক্টর অ্যাক্টিভেশন বনাম অ্যাঞ্জিওটেনসিন II ব্লকেড। আমেরিকান জার্নাল অফ ফিজিওলজি। রেনাল ফিজিওলজি, 299(6), F1365–F1373।

Filatova, A., Seidel, S., Bogurcu, N., Graf, S., Garvalov, BK, & Acker, T. (2016)। গ্লিওমায় এইচআইএফ ফাংশন এবং স্টেম সেল রক্ষণাবেক্ষণের জন্য অ্যাসিডোসিস HSP90-এর মাধ্যমে Ph.D./VHL- স্বাধীন পদ্ধতিতে কাজ করে। ক্যান্সার গবেষণা, 76(19), 5845–5856। পারে-15-2630

Goldfarb, M., Rosenberger, C., Abassi, Z., Shina, A., Zilbersat, F., Eckardt, KU, Rosen, S., & Heyman, SN (2006)। ইঁদুরে তীব্র-অন-দীর্ঘস্থায়ী রেনাল ব্যর্থতা: কার্যকরী ক্ষতিপূরণ এবং হাইপোক্সিয়া সহনশীলতা। আমেরিকান জার্নাল অফ নেফ্রোলজি, 26(1), 22-33।

Heyman, SN, Rosenberger, C., Rosen, S., & Khamaisi, M. (2013)। কেন ডায়াবেটিস মেলিটাস কনট্রাস্ট-প্ররোচিত নেফ্রোপ্যাথির জন্য একটি ঝুঁকির কারণ? বায়োমেড রিসার্চ ইন্টারন্যাশনাল, 2013, 123589।

Hirakawa, Y., Mizukami, K., Yoshihara, T., Takahashi, I., Khulan, P., Honda, T., Mimura, I., Tanaka, T., Tobita, S., & Nangaku, M. (2018)। রেনাল কর্টেক্সের ইন্ট্রাভিটাল ফসফোরেসেন্স লাইফটাইম ইমেজিং সঠিকভাবে রেনাল হাইপোক্সিয়া পরিমাপ করে। কিডনি ইন্টারন্যাশনাল, 93(6), 1483–1489।

Hirakawa, Y., Tanaka, T., & Nangaku, M. (2017)। CKD-তে রেনাল হাইপোক্সিয়া; প্যাথোফিজিওলজি এবং সনাক্তকরণ পদ্ধতি। ফ্রন্টিয়ার্স ইন ফিজিওলজি, ৮, ৯৯।

রোগ নির্ণয়ের সময় রেনাল হিস্টোপ্যাথলজিকাল এবং ক্লিনিকাল ল্যাবরেটরি ভেরিয়েবল ব্যবহার করে লুপাস নেফ্রাইটিস সাবঅপ্টিমাল রেসপন্স প্রেডিকশন টুলের বিকাশ

লিপিডোমিক্স: কিডনি রোগের নতুন অন্তর্দৃষ্টি